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Mecanismo de Colorao de Grann

A colorao de Gram um mtodo de colorao de bactrias desenvolvido


pelo mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em
1884, e que consiste no tratamento sucessivo de um esfregao bacteriano,
fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e
fucsina bsica. Essa tcnica permite a separao de amostras bacterianas em
Gram-positivas e Gram-negativas e a determinao da morfologia e do
tamanho das amostras analisadas.
O mtodo da colorao de Gram baseado na capacidade das paredes
celulares de bactrias Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no
citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as
paredes celulares de bactrias Gram-negativas no o fazem.
A colorao de Gram um dos mais importantes mtodos de colorao
utilizados em laboratrios de microbiologia e de anlises clnicas, sendo quase
sempre o primeiro passo para a caracterizao de amostras de bactrias. A
tcnica tem importncia clnica uma vez que muitas das bactrias associadas a
infeces so prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas
ou Gram-negativas em esfregaos de pus ou de fluidos orgnicos. Essa
informao permite ao clnico monitorar a infeco at que dados de cultura
estejam disponveis. possvel a anlise de vrios esfregaos por lmina, o
que facilita a comparao de espcimes clnicos. As lminas podem ser
montadas de forma permanente e preservadas como documentao.
Gram-Positiva:
membrana citoplasmtica:
fosfolipdeos
protenas
parede celular:
peptidoglicano - polmero poroso e insolvel, em grande quantidade nestas
bactrias (50% ou mais do peso seco da clula), tornando a parede bem
espessa
cido teicico - polmero de glicerol e ribitol fosfato; carregados negativamente
pode ajudar no transporte de ons + para dentro e fora da clula; e no
armazenamento de fsforo. Se encontram ligados ao peptidoglicano ou
membrana citoplasmtica
polissacardeos - ligados ao peptidoglicano

Gram-Negativa:
membrana citoplasmtica:
fosfolipdeos
protenas
parede celular - localizada no espao periplasmtico, ou seja, entre as
membranas citoplasmtica e externa.
peptidoglicano - representa 10% do peso seco da clula
lipoprotenas
membrana externa - presente apenas nestas bactrias, serve para distingui-las.
lipopolissacardeos - tpicos destas bactrias, ocorrem somente na
membembrana externa; formados de lpideos, cerne de polissacardeo e
antgenos O. Podem atuar como um veneno (LPS ou endotoxina)
trmeros de porina
Aula Prtica de Microbiologia
Colorao de Gram
A colorao de Gram usada para classificar as bactrias em relao forma,
tamanho, morfologia celular e propriedade tintorial. A colorao de Gram foi
originalmente descrita por Christian Gram em 1884 e modificada por Hucker
em 1921, comumente usada na prtica bacteriolgica devido proporcionar uma
melhor estabilidade dos reagentes e melhor diferenciao dos microrganismos.
O mtodo de Gram se baseia no fato de que quando certas bactrias so
coradas pelo o cristal violeta (corante azul) e depois tratadas pela soluo de
iodoiodetada (lugol),forma-se um composto de colorao escura entre o iodo
e o corante, que fortemente retido por um grupo de bactrias e no pode ser
removido pelo descoramento subseqente com o lcool gram positiva. Outras
bactrias, denominadas gram negativas, deixam-se descorar facilmente pelo
lcool. Ento, as bactrias gram negativas aparecero coradas em vermelho,
ao passo que as gram positivas aparecero coradas em roxo .O mecanismo da
colorao de Gram est baseado na diferena de permeabilidade da parede
celular. As bactrias gram negativas apresentam uma elevada concentrao de
lipdeos e uma delgada parede celular quando comparadas com as bactrias
gram positivas. Sugere-se que quando h o tratamento com lcool, os lipdeos
das bactrias gram negativas so retirados da parede celular, aumentando a
permeabilidade da mesma e fazendo com que estas bactrias percam o
primeiro corante (cristal violeta). As bactrias gram positivas, por possurem
uma menor concentrao de lipdeos, se tornam desidratadas
com o tratamento pelo lcool, diminuindo a permeabilidade da parede celular e
retendo o primeiro corante. TCNICA DA COLORAO DE GRAM
1. Fazer um esfregao do material desejado em uma lmina;
2.Fixar o material , com o fogo, na lmina;
3.Cobrir o esfregao com cristal violeta (1 corante) por 1 minuto;
4.Escorrer o corante. Cobrir com lugol (mordente) por 1 minuto;
5.Lavar em gua corrente de baixa presso;
6.Descorar com lcool-cetona por 1 5 segundos;
7.Lavar em gua corrente de baixa presso;
8.Cobrir o esfregao com fucsina de Ziehl-Neelsen 1:10 (2 corante) por 30
segundos;
9.Lavar em gua corrente de baixa presso;
10.Deixar secar espontaneamente;
11.Observar ao microscpio com objetiva de imerso.

A tcnica de colorao de Gram uma tcnica de colorao diferencial que permite
distinguir os dois principais grupos de bactrias por microscopia ptica.
Foi descoberta pelo fsico dinamarqus Hans Christian Gram em 1884. Este cientista
obteve com a colorao realizada uma melhor visualizao das bactrias em amostras de
material infectado. Verificou, no entanto, que nem todas as bactrias coravam com este
mtodo o que o levou a sugerir a possibilidade de ser usado um contrastante. Gram
morreu em 1935 sem ter conseguido que fosse reconhecida a devida importncia ao seu
mtodo de colorao. Atualmente, esta tcnica fundamental para a taxonomia e
identificao das bactrias, sendo utilizada como tcnica de rotina em laboratrios de
bacteriologia.



A tcnica de colorao de Gram consiste em expor as clulas bacterianas
seguinte sequncia:

Corante primrio violeta de cristal: cora o citoplasma de prpura,
independentemente do tipo de clula.
Mordente soluo de iodo: aumenta a afinidade entre o violeta de cristal e a
clula e forma com o corante um complexo insolvel dentro da clula.
Agente descolorante lcool, acetona ou ambos: solvente lipdico.
Contrastante safranina ou fucsina bsica: cora o citoplasma de vermelho.



O que se verifica, quando se observam as diferentes bactrias
sujeitas a esta colorao ao microscpio, que estas tm um comportamento
diferente face colorao de Gram, o que permite classific-las em:

Bactrias Gram-
positivo (apresentam cor
prpura)

Bactrias Gram-
negativo (apresentam cor
vermelha)





Estudos de microscopia electrnica e anlises bioqumicas
permitiram concluir que a parede celular bacteriana a estrutura responsvel
pelo diferente comportamento das bactrias colorao de Gram.


As bactrias Gram-positivo
apresentam uma parede
espessa, homognea,
geralmente no estratificada e
predominantemente constituda
por peptidoglicano. Deste modo,
o precipitado insolvel que se
forma por ao do mordente, fica
retido no interior da clula pela
camada espessa de
peptidoglicano, logo, estas
clulas no so descoradas
permanecendo com a colorao
conferida pelo corante primrio
(prpura).

As bactrias Gram-negativo apresentam
uma parede estratificada constituda por
uma membrana externa e por uma
camada mais interna que contm
peptidoglicano e que mais fina que a
das Gram-positivo. Deste modo, o
precipitado insolvel, que se forma por
ao do mordente, removido (camada
de peptidoglicano mais fina que a das
Gram-positivo e a membrana externa
parcial ou totalmente solubilizada pelo
agente descolorante), pelo que as
clulas ficam descoloradas, corando de
vermelho pelo contrastante.



Desta forma, a diferente estrutura da parede bacteriana e, em particular
a espessura da camada de peptidoglicano, a responsvel pelo diferente
comportamento das bactrias face colorao de Gram.



O peptidoglicano um
heteropolmero rgido e
insolvel na gua, constitudo
por cadeias lineares de dois
acares aminados NAG
(cido n-acetilglucosamina) e
NAM (cido n-
acetilmurmico) ligados
entre si por ligaes
glicosdicas. As cadeias
lineares ligam-se entre si
atravs de cadeias de quatro
aminocidos

A tcnica de gran ou a colorao de gran uma colorao de preparaes
histolgicas para observao ao microscpio ptico, utilizada para corar
diferencialmente microorganismos com base na composio qumica e
integridade da sua parede celular. Consoante a cor que adquirem, so
classificados em gram positivos (roxo) ou gram negativos (vermelho). Tal
mtodo se deve ao mdico dinamarqus Hans Christian Joachim Gram (1853-
1938). Geralmente as bactrias de "gram negativo" so mais patognicas,
possuindo ainda lipopolissacardeos na sua membrana exterior, que agravam a
infeco.
Resultados: Gram (+) coram de roxo, gram (-) coram de rosa.
Pseudomonas aeruginosa: Bacilos gram-negativos. As caractersticas
estruturais da parede bacteriana esto na base da tcnica de Gram que
funciona da seguinte forma.

O primeiro corante (cristal-de-metila) penetra na bactria assim como o
mordente (Soluto de Lugol). Intracelularmente forma-se um complexo corante-
iodo, insolvel em gua, que vai corar o protoplasma e a parede celular.

A lavagem com alcool 99,5 GL dissolve o complexo corante-iodo, e se a
parede celular for permevel a este, arrasta-o para fora da clula. As bactrias
capazes de preservar a colorao roxa do 1 corante, o violeta de Genciana,
designam-se por Gram positivas. As bactrias que, aps a diferenciao com
lcool-acetona, so incapazes de reter o violeta de Genciana, designam-se por
Gram negativas, corando pela fucsina diluda que se fixa apenas nas bactrias
Gram-negativas. Resumindo, as bactrias Gram positivas coram de roxo e as
Gram negativas coram de vermelho. Esta tcnica de colorao permite ento a
distino entre bactrias com parede celular mais ou menos rica em
peptidoglicanos. De referir que embora uma bactria Gram negativa nunca
possa corar positivamente pelo Gram, uma bactria estruturalmente Gram
positiva pode corar negativamente se a sua parede de peptidoglicano for
destruda ou danificada (ex. envelhecimento celular ou ao de lisozimas).

Mtodos de Respirao
Quanto respirao, as bactrias podem ser aerbias ou anaerbias.
Chamam-se aerbias as que fazem uso do oxignio. As anaerbias vivem na
ausncia desse gs, e so encontradas principalmente no sedimento (fundo)
de ambientes aquticos. ou tambm na ferrugem (por exemplo a bactria que
vive l, morre ao tocar no oxignio por isso elas vivem em constante momento
com a ferrugem, que libera oxignio)
A respirao aerbica um conjunto de reaes bioqumicas em que
o oxignio um aceptor final de eltrons e ao longo do qual
a energia de molculas orgnicas , em parte, transferida para molculas
de ATP. Organelas responsveis: mitocndrias em paralelo com o sistema
golgiense.
Os tecidos vivos libertam dixido de carbono gasoso que resulta da reao de
descarboxilao de metabolitos por ao de enzimas especificas - as
descarboxilases. Simultaneamente, ocorrem reaes de oxidao por
desidrogenao. As desidrogenases catalisam a desidrogenao do substrato
que fica assim oxidado. A presena desse hidrognio pode ser detectada
experimentalmente, utilizando uma substncia que facilmente se combine com
ele, como o azul-de-metileno.
O azul-de-metileno pode encontrar-se sob duas formas: oxidado (cor azul) e
reduzido (incolor).
Durante a respirao os compostos orgnicos, nomeadamente a glicose, so
oxidados, sendo o hidrognio recebido por um aceptor, que neste processo
experimental ir ser o azul-de-metileno.
Nas condies naturais da clula viva, o oxignio desempenha a funo do
azul-de-metileno na experincia, ou seja, o aceptor do hidrognio, formando
com ele gua. Essas clulas podem ser encontradas nas costas de um
rinoceronte velho.
Estes fenmenos so realizados ao longo de cadeias de reaes complexas,
controladas por enzimas, havendo simultaneamente um aproveitamento
progressivo de energia que vai sendo transferida.
Respirao anaerbia ou anaerobiose o processo metablico celular
condicionado em ambientes caracterizados pela ausncia de gs oxignio
(O2). Muitas ...
Respirao celular o processo de converso das ligaes qumicas de
molculas ricas em energia que podero ser usadas nos processos vitais. Ela
pode ser de dois tipos,respirao anaerbia (sem utilizao de oxignio)
e respirao aerbia (com utilizao de oxignio).
Eis a sua equao: C6H12O6 + 6O2 ---> ao das enzimas ---> 6CO2 + 6H20
+ energia
A respirao celular o processo de obteno de energia mais utilizado pelos
seres vivos. Na respirao, ocorre a liberao de dixido de carbono, energia e
gua e o consumo de oxignio e glicose, ou outra substncia orgnica, tal
como lipdios. A organela responsvel por essa respirao a mitocndria.
Do ponto de vista da fisiologia, o processo pelo qual um organismo vivo troca
oxignio e dixido de carbono com o seu meio ambiente chamado de
ventilao, respirao ocorre apenas na clula, operao executada pela
mitocondria.
Do ponto de vista da bioqumica, respirao celular o processo de converso
das ligaes qumicas de molculas ricas em energia que possa ser usada nos
processos vitais. A respirao celular processa-se nas seguintes etapas:
Gliclise Ciclo de Krebs Cadeia respiratria Fosforilao oxidativa
O processo bsico da respirao celular a quebra da glicose ou Gliclise, que
se pode expressar pela seguinte equao qumica: C6H12O6 + 6O2 6CO2 +
6H2O + energia
Nutrientes (energia qumica) + O2 CO2 + H2O + Energia(alguma que se
perde sob a forma de calor e outra parte armazena-se sob a forma de ATP)
Este artigo centra-se nos fenmenos da respirao celular, que se processa
segundo duas sequncias bsicas:
Gliclise(ocorrida no citosol) e Oxidao do piruvato(ocorrida na matriz
mitocondrial) atravs de um de dois processos: Respirao
aerbia ou Respirao anaerbia
1 Oxidao do piruvato 1.1 Respirao aerbia 1.2 Respirao anaerbia 2 Ver
tambm
Oxidao do piruvato
De acordo com o tipo de metabolismo, existem duas sequncias possveis para
a oxidao do piruvato proveniente da gliclise:
1. Neste primeiro processo, a oxidao do pruvato ocorre em uma respirao
aerbia, produzindo em seguida Acetilcoenzima A, iniciando assim o Ciclo de
Krebs, como demonstrado abaixo: Piruvato --> Acetil-Coa
Nesta etapa ocorre a entrada de NAD e CoA-SH.
O piruvato gerado na gliclise
sofre desidrogenao e descarboxilao catalisado pelo complexo piruvato-
desidrogenase, durante essas reaes adicionada a coenzima A, desta forma
a partir de cada piruvato produz-se um acetil-CoA, iniciando logo em seguida
o Ciclo de Krebs
Durante a gliclise pode ocorrer a falta de O2 gerando outras reaes:
2.Nesta etapa a oxidao do piruvato ocorre em uma reao anaerbia
Oxidao Incompleta da Glicose: Glicose --> Piruvato --> cido
lctico uo[necessrio esclarecer] no podem ser oxidados. Assim fica
faltando NAD e FAD para as reaes de desidrogenao. Com isso, o ciclo de
Krebs no pode ocorrer ficando totalmente bloqueado, na falta de O2. Se
houvesse uma forma de repor NAD e FAD sem o envolvimento da cadeia
respiratria o ciclo poderia continuar ocorrendo. Na oxidao da glicose na
ausncia de O2, o NADH produzido no ir para a cadeia respiratria; da
mesma forma, o piruvato no dara origem ao acetil-CoA. Assim fica acumulado
NADH e piruvato. Para que a gliclise mantenha-se, o NADH acumulado
transfere seus eltrons e P+ para o piruvato, originando cido lctico e
renegerando o NAD. Isto representa uma via alternativa de oxidao do NADH.
Na oxidao incompleta o rendimento de ATP cai para apenas dois.
Respirao aerbica
A respirao aerbia requer oxignio. Na gliclise, formado o piruvato
(tambm chamado de cido pirvico) bem como 2 ATP. Cada piruvato que
entra na mitocndria e oxidado a um composto com 2 carbonos (acetato) que
depois combinado com a Coenzima-A, com a produo de NADH e libertao
de CO2. De seguida, inicia-se o Ciclo de Krebs. Neste processo, o grupo acetil
combinado com compostos com 4 carbonos formando o citrato (6C). Por
cada ciclo que ocorre liberta-se 2CO2, NADH e FADH2. No ciclo de
Krebs obtm-se 2 ATPs. Numa ltima fase - cadeia transportadora de eltrons
(ou fosforilao oxidativa) os eltrons removidos da glicose so transportados
ao longo de uma cadeia transportadora,criando um gradiente protnico que
permite a fosforilao do ADP. O aceptor final de eltrons o O2, que, depois
de se combinar com os eltrons e o hidrognio, forma gua. Nesta fase da
respirao aerbia a clula ganha 26 molculas de ATP. Isso faz um total
ganho de 32 ATP durante a respirao celular em que intervm o oxignio.
Respirao anaerbia
A respirao anaerbia envolve um receptor de eltrons diferente do oxignio e
existem vrios tipos de bactrias capazes de usar uma grande variedade de
compostos como receptores de eltrons na respirao: compostos
nitrogenados, tais como nitratos e nitritos, compostos de enxofre, tais
como sulfatos, sulfitos, dixido de enxofre e mesmo enxofre elementar, dixido
de carbono, compostos de ferro, de mangans, de cobalto e at de urnio.
No entanto, para todos estes , a respirao anaerbia s ocorre
em ambientes onde o oxignio escasso, como
nos sedimentos marinhos e lacustres ou prximo de nascentes hidrotermais
submarinas.
Uma das sequncias alternativas respirao anaerbia a fermentao, um
processo em que o piruvato apenas parcialmente oxidado, no se segue
o ciclo de Krebs e no h produo de ATP numa cadeia de transporte de
elctrons. No entanto, a fermentao til paraa clula porque regenera
o dinucletido de nicotinamida e adenina (NAD), que consumido durante
a gliclise.
Os diferentes tipos da fermentao produzem vrios compostos diferentes,
como o etanol (o lcool das bebidas alcolicas, produzido por vrios tipos
de leveduras e bactrias) ou o cido lctico do iogurte.
Outras molculas, como NO2, SO2 so os aceptores finais na cadeia de
transporte de eltrons.

Qdo um organismo apresenta respirao facultativa significa que ele pode fazer
tanto respirao aerbia (c/ participao de O2), qto anaerbia.
Caso contrrio (s possa fazer um dos dois tipos) diz-se que ele anaerbio
restrito, ou aerbio restrito.
Um exemplo de organismo anaerbio facultativo a levedura, um fungo cuja
fermentao produz vinho, cerveja, pes, bolos, etc... Ele faz fermentao
alcolica na ausncia de O2 e respirao aerbia na presena de O2.
Um exemplo de organismo anaerbio restrito, a bactria causadora do ttano
(clostridium tetani), que sobrevive em presena de O2.
Um exemplo de organismo anaerbico restrito, a bactria causadora do
ttano (clostritium tetani), que sobrevive em presena de 02.
Membrana externa: Responsvel pela preveno da perda de protenas periplasmticas e
evitar o acesso de enzimas hidrolticas e de certos antibiticos ao peptidioglicano.
Significado de periplasma . O que periplasma: Espao fluido entre a membrana
plasmtica e a membrana externa de bactrias gram-negativas.
O compartimento periplasmtico oespao que rodeia o citoplasma em algumas
clulas procariotas , tais como bactrias em bactrias gram-negativas .Aparece entre
a membrana plasmtica , no interior, e a membrana exterior do exterior gram-
negativa. Desempenha um papel importante no metabolismo da energia, com base no
fornecimento de processos activos diferenas na composio qumica, de concentrao e
carga osmtica entre este compartimento e o citoplasma.
O espao inter de mitocndrias e espao periplastidial de plastdeos , organelas que
evoluram a partir de endossimbiose , so homlogos do espao periplasmtico.
Membrana citoplsmtica serve para proteger a clula e permite a troca de substncias do
interior para o exterior da celula e vice versa.
E o ncleo a parte que controla o metabolismo da clula, e contem sua identidade ou seja o
material gentico!




Protenas sobiomolculas de grande dimenso, ou macromolculas, constitudas por
uma ou mais cadeias de resduos de aminocidos. As protenas desempenham um
vasto conjunto de funes no organismo, entre as quais a catlise de reaes
metablicas, a replicao de ADN, a resposta a estmulos e o transporte de molculas
de um local para outro. As protenas diferem entre si fundamentalmente na sua
sequncia de aminocidos, a qual determinada pela sua sequncia gentica, e que
geralmente provoca
O enovelamento da protena numa estrutura tridimensional especfica que determina a
sua atividade.
lipdeos oulpides so biomolculas compostas por carbono (C), hidrognio (H) e
oxignio (O), fisicamente caracterizadas por serem insolveis em gua, e solveis em
solventes orgnicos,1 como olcool, benzina,ter, clorofrmio e acetona. A famlia de
compostos designados por lipdios muito vasta. Cada grama de lipdio armazena 9
quilocalorias de energia, enquanto cada grama de glicdio ou protena armazena
somente 4 quilocalorias.1
Neste captulo estudaremos 3 porinas. Porinas so protenas de grande peso
molecular encontradas tipicamente em membranas externas de bactrias. Estas
membranas, compostas de lipdeos e peptideoglicanos, so bastante impermeveis.
Para permitir a entrada de nutrientes hidroflicos, as membranas apresentam as
porinas.
Polissacardeos so molculas grandes, formadas de centenas ou milhares de
motiossacardios. Exemplos de polissacardeos so amido, glicognio, celulose,
quitina, entre outros.
Os fosfolpideos so steres do glicerofosfato - um derivado fosfrico do glicerol. O
fosfato um dister fosfrico, e o grupo polar do fosfolipdio. A um dos ... carboidratos
e protenas de silagens de milho, sorgo e girassol, com a finalidade .... e glutelinas),
B3 a protena associada parede celular e de degradao ...

As paredes celulares das bactrias Gram-positivas so espessas, formadas por cerca
de vinte camadas de peptidoglicano (20 a 40 nm de espessura) que responde por 50%
ou mais do peso seco da clula (Figura 1). Apesar disso, essas paredes permitem a
difuso de muitas molculas.

Embebidas na matriz de peptidoglicano dessas bactrias encontram-se pequenas
quantidades de cidos teicicos. cido teicico um termo funcional para uma ampla
variedade de diferentes polmeros contendo acares, fosfato e glicerol. Existem duas
classes de cidos teicicos: o cido lipoteicico, embebido no peptidoglicano e ligado
membrana plasmtica e o cido teicico associado somente ao peptidoglicano.

Os cidos teicicos conferem carga negativa superfcie exterior da clula podendo
ajudar no transporte de ons positivos para dentro e fora da clula. Essas substncias
em conjunto com protenas presentes na superfcie da parede celular so
responsveis pela determinao antignica das bactrias Gram-positivas por diferirem
entre distintas
cido lipoteicico de bactrias de cido ltico e seu uso para modular respostas
imunes mediadas por bactrias gram-negativas, potenciais bactrias gram-positivas
patognicas
"cido lipoteicico de bactrias de cido ltico e seu uso para modular respostas
imunes mediadas por bactrias gram-negativas, potenciais bactrias gram positivas
patognicas". A inveno refere-se a... (ver
O peptidoglicano, por vezes denominadomurena, umheteropolissacardeo ligado
a pptidos presente na parede celular de procariontes1 .
formado por dois tipos de acares (o cido N-acetilmurmico e a N-
acetilglucosamina) e algunsaminocidos. O peptidoglicano a estrutura que confere
rigidez parede celular de bactrias, determina a forma da bactria e protege da lise
osmtica, quando em meio hipotnico.