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Anlisis de componentes celulares especficos con

doble marcaje fluorescente de una lnea celular


transformada (293 HEK) despus de un tratamiento
con un agente quelante.

Resumen:
Con el siguiente experimento, estudiaremos el efecto de la mimosina sobre la proliferacin
celular. Para ello, llevaremos a cabo un doble marcaje fluorescente, empleando tres fluorocromos
que marcarn histonas fosforiladas en serina 10 (FITC), ADN (DAPI) y microfilamentos de actina
(Faloidina). La hiptesis que demostramos con esta tcnica ser que la mimosina impide la divisin
celular. Gracias a la microscopa de fluorescencia no observaremos en las clulas tratadas con
mimosina la emisin correspondiente al FITC, por lo que deducimos que no presentan histonas
fosforiladas en serina 10 (correspondientes a la mitosis).
Objetivos:
Los agentes quelantes son sustancias capaces de secuestrar iones de metales pesados. En
este experimento, mediante la aplicacin de un doble marcaje fluorescente, estudiaremos el efecto
de un agente quelante, como es la mimosina, sobre clulas transformadas (clulas modificadas para
que presenten caractersticas similares a clulas tumorales).
Nuestra hiptesis sostiene que la mimosina afecta a la proliferacin celular de forma que si la
aadimos a nuestras clulas transformadas estas no tendrn la capacidad de dividirse.
Para ello trabajaremos con clulas tratadas y no tratadas con mimosina e inmunofluorescencia para
compararlas con el fin de estudiar si son capaces de iniciar y completar la divisin.

Materiales y Mtodos:
En este apartado vamos a enumerar el material a utilizar en el experimento y explicaremos
de forma breve las tcnicas empleadas.
El protocolo seguido en el experimento se encuentra en un archivo adjunto.

Materiales utilizados:

Placas de Petri con cubre con clulas, parafilm y papel de filtro.


Pipetas Pasteur
Vaso de precipitados
Micropipetas
Tubos de ensayo
Tubos Eppendorf
Cuadraditos de parafilm
Papel de aluminio

Pinzas y aguja

Reactivos

PBS 1x
PBS-Tritn X-100 0.5%
Anti-fosfo-histona 3 Ser10 de ratn
PBS-Tween-20 0.05%
Anti-mouse Ig-FITC 1:100de conejo mezclado con Faloidina-TX-RED (1:500 PBS)
PBS.DAPI (1:1000 PBS)
Lquido de montaje Fluoromount G

La tcnica que vamos a utilizar para verificar nuestra hiptesis ser un doble marcaje fluorescente.
En inmunofluorescencia indirecta se utiliza un primer anticuerpo que reconozca la protena de
inters y un secundario marcado con un fluorocromo de una especie distinta al primario, que se una
a la fraccin constante de este.
Con esta tcnica marcaremos la Ser 10 de la fosfo-histona 3 con FITC, que veremos en color verde
en el microscopio de fluorescencia.
Adems usaremos otros marcadores fluorescentes como la Faloidina-TX-RED y DAPI para marcar
los microfilamentos de actina (en rojo) y el DNA (en azul) de nuestras clulas.
Es importante escoger los fluorocromos lo ms separados posible en lo que a espectro de emisin se
refiere.
Se nos entreg una placa de Petri con un cultivo de clulas HEK293 en un cubre sobre una capa de
parafilm (para impedir que el papel de filtro interfiera en el experimento). Tenamos dichos cultivos
tratados con mimosina y otros sin tratar.
Posteriormente iniciamos el inmunomarcaje. El primer da lavamos la muestra con PBS y a
continuacin procedimos a permeabilizarla con un detergente suave (PBS-Tritn X-100 0.5%): La
finalidad del detergente es abrir poros en la membrana plasmtica con el fin de permitir la entrada
del anticuerpo primario anti-fosfo-histona 3 Ser 10 de ratn que posteriormente aplicamos.
Al final de este da dejamos la muestra en cultivo con el anticuerpo a 4C cubierta con parafilm para
que no se evapore.
El segundo da lo dedicamos a aadir el anticuerpo secundario y el resto de marcadores indicados
anteriormente.
A continuacin montamos con Fluoromount G con ayuda de aguja y pinzas cuidando que la capa de
clulas quede entre el porta y el cubre.
Al da siguiente observamos la muestra tratada y la no tratada con microscopa de fluorescencia
obteniendo los siguiente resultados:

Resultados:
1) Cultivos no tratados con mimosina
En los cultivos no tratados podemos observar los tres tipos de fluorescencia aplicados con
caractersticas propias de clulas en divisin. Nos fijamos en el DAPI y en el FITC ya que es donde
se aprecian diferencias con ms claridad.
Con la Faloidina tambin se aprecian diferencias en la forma de las clulas, siendo las estrelladas

las correspondientes a las clulas tratadas y las redondeadas las correspondientes a las no tratadas
en divisin.

Foto 1: El DAPI es un agente intercalante, por lo que observamos que todas las clulas en la
foto emiten fluorescencia. Sin embargo, en la clula en divisin la fluorescencia es mucho ms
intensa, debido a la condensacin del DNA. Los cromosomas se encuentran en polos opuestos de la
clula, por lo que deducimos que est en anafase.

Foto 2: Apreciamos una clula que emite fluorescencia verde debido al FITC, fluorocromo
que se asocia a las histonas fosforiladas en la Ser 10. En esta foto slo observamos la clula en
divisin puesto que es el nico momento en el ciclo celular en que dicha histonia se encuentra
fosforilada en la Ser 10. Corresponde a una Anafase temprana (cromosomas en proceso de
emigracin a los polos opuestos).

Foto 3: Al excitar la Faloidina observamos en rojo el citoesqueleto de actina. Las muestras


no tratadas en divisin (como es el caso) presentan forma redondead debido a que pierden su forma
para que el reparto pueda ser equitativo.

| No tratada vista con DAPI (clula en anafase).

| No tratada vista con FITC (clula en anfase temprana).

| No tratada vista con Faloidina- TX Red (forma redondeada)

2) Cultivos tratados con mimosina:


En estos cultivos observaremos emisin azul (DAPI) y roja (Faloidina) pero no la correspondiente al FITC
(verde) debido a que las histonas no se llegan a fosforilar puesto que las clulas no entran en divisin.

| Tratada (DAPI)

| Tratada (FITC)

| Tratado (Faloidina TX-Red)

Foto 1: En el cultivo no tratado con mimosina, al excitar DAPI, no observamos clulas en divisin
(no presentan un aumento de emisin fluorescente, debido a que el ADN se encuentra en forma de cromatina)

Foto 2: Al excitar FITC, no deberamos observar ninguna emisin caracterstica. Debido a un defecto
en la tcnica (se excit FITC despus de DAPI) quedar patente la presencia de un artefacto, una
coloracin que debera ser inexistente.

Foto 3: Cuando excitamos Faloidina TX-Red al microscopio de fluorescencia, observaremos clulas


con contornos estrellados, ya no ovalados (no estarn en divisin).

Discusin
Una vez finalizado el experimento, podemos proceder a evaluar el grado de acierto de nuestras
hiptesis iniciales. Uno de los miembros del grupo, asever que Un tratamiento con mimosina dar lugar a
la fosforilacin de la serina 10 de la histona H3. Su hiptesis es completamente errnea, pues el efecto del
quelante es impedir la divisin celular, por lo que la histona no llegar a fosforilarse.
Otra de las hiptesis iniciales errneas sostena que La mimosina es capaz de estabilizar la
proliferacin incontrolada de las clulas cancerosas. El fallo reside en afirmar que la proliferacin se
estabiliza, pues no lo hace, sino que se detiene. Tambin cay en un error lingstico: las clulas
transformadas mantienen su propio equilibrio, aunque difiera del de las clulas no tratadas.
El error en la tercera hiptesis inicial fue tambin de trminos. El tercer miembro afirmaba que La
mimosina inhibe la proliferacin de clulas tumorales. El trmino tumoral debera haber sido sustitudo
por transformadas.
Conclusin
El tratamiento con mimosina impide la proliferacin celular.

Bibliografa

Protocolo e informacin acerca de la prtica entregados en clase.

Wikipedia y otras pginas web para bsquedas concretas para fijar algunos conocimientos
relacionados con la prctica.

Informe de prctica

Anlisis de componentes celulares especficos con


doble marcaje fluorescente de una lnea celular
transformada (293 HEK) despus de un tratamiento
con un agente quelante.

2 Biotecnologa
Biologa Celular

Amaro Saco Beiroa


Fernando Snchez Senz
Alejandro Gmez del Pulgar