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Pontificia Universidad Catlica de Chile

Facultad de Ciencias Biolgicas


Departamento de Gentica Molecular y Microbiologa
Biologa de Microorganismos
BIO 151E-1

Informe N1
Procedimientos bsicos y caracterizacin de
microorganismos

Nombre: Diana Fuentes Castillo


Profesores: Dras. Beatriz Diez y Carolina Serrano
Jefe de Ayudantes: Daniela Ruiz
Ayudante: Gabriela Gmez Lillo
Fecha de entrega: 1 de Octubre de 2014

Introduccin
Los microorganismos comprenden a los organismos microscpicos
unicelulares y a los virus. La ciencia que estudia estos microorganismos es la
microbiologa, que se basa en entender cmo ellos funcionan y en la aplicacin de
esto en beneficio de la humanidad (1). Para generar el conocimiento acerca de los
microorganismos se requiere de instancias experimentales que permitan
vislumbrar acerca de los procesos bioqumicos que ocurren en ellos a lo largo de
su vida.
A lo largo de las experiencias prcticas, se ha trabajado principalmente con
bacterias, organismos unicelulares, sin organelos y que poseen un tamao de 1-5
um de longitud en general (2). Las bacterias se desarrollan en una gran cantidad
de medios, incluso en nuestro organismo, siendo parte importante de nuestra flora
intestinal y de otros tejidos. Se trabajar con estos organismos en distintos medios
de cultivo, que permitirn la siembra y el aislamiento de estos microorganismos, ya
sea sosteniendo su crecimiento (agar sangre y corriente), seleccionndolos (agar
MacConkey, que solo permite el crecimiento de bacterias gram positivas) o
diferencindolos (agar sangre y MacConkey), bajo las medidas de esterilizacin y
bioseguridad correspondientes.
Un punto bsico, pero no menos importante en el estudio de las bacterias,
es su caracterizacin, de manera macroscpica y microscpica. El anlisis
macroscpico se basa en la forma, margen, elevacin, textura (i.e. superficie y
brillo) y color de la colonia bacteriana (3). Por otro lado, el anlisis microscpico
permite observar a cada clula por separado, mediante el uso de tinciones,
logrndose un contraste que no existira naturalmente, lo que nos habilita para
clasificar las bacterias segn su forma, agrupacin y afinidad tintorial. La forma
puede ser coco, cocobacilo, bacilo, vibrio (i.e. bacilo curvo), espirilo y espiroqueta.
La agrupacin en cocos puede ser diplococo, estreptococo, ttrada, sarcina y
estafilococo, mientras que en bacilos solo puede ser diplobacilo y estreptobacilo
(4). Existe una gran variedad de tinciones, pero en las experiencias solo se
emplearn tres: Gram, verde de malaquita y tinta china.
Sin embargo, el anlisis macroscpico y microscpico no son suficientes
para dar identidad a la bacteria. Para esto se aplica una diversidad de pruebas en
medios diferenciales
(batera bioqumica), siguiendo los protocolos
correspondientes al tipo de bacteria. Otra manera es mediante sistemas de
identificacin estandarizados, que tienen un enfoque ms amplio pero permiten
una identificacin ms rpida (5).
Cabe destacar que el trabajo en laboratorio, a pesar de todos los beneficios
que genera a partir del conocimiento obtenido mediante la prctica, conlleva una
serie de riesgos. Ms acotadamante, con respecto a la prctica de la
microbiologa, se ha sealado que han emergido nuevos agentes infecciosos y

enfermedades, ha aumentado el trabajo con agentes infecciosos y se han


registrado nuevas amenazas de bioterrorismo (6), lo que hace trascendental la
bioseguridad para el estudio de los microorganismos.
Los trabajos prcticos se han realizado con el objetivo de:
1. Adquirir las competencias necesarias para un desempeo correcto en el
laboratorio, de manera de poder acatar las reglas de seguridad y seguir los
protocolos fundamentales en la prctica de la microbiologa.
2. Identificar las caractersticas de una colonia bacteriana, mediante anlisis a
nivel microscpico y macroscpico.
3. Caracterizar la microbiota presente en el ser humano, proveniente de
distintos tejidos del cuerpo.
4. Obtener la identidad de una bacteria Gram (+) mediante pruebas
bioqumicas, basadas en la diversidad de actividad metablica entre cada
especie.

Materiales y mtodos
Trabajo Prctico N1:
El procedimiento se realiz de acuerdo a lo estipulado en la gua de trabajo
(7), siguiendo los protocolos correspondientes presentados en (8), con la
excepcin de que la preparacin N 107 tena un nombre distinto en el
portaobjetos del que sala en la gua y en la caja que lo contena.
Lista de materiales:
-Asa de platino
-Pipeta pasteur
-Placas de Petri (con el medio de cultivo correspondiente)
-Tubos de cultivo (con el medio de cultivo correspondiente)
-Medios de cultivo
Slido
o Agar corriente
o Agar sangre
o Agar MacConkey
-Plumn permanente
-Preparaciones ya teidas
-Mechero
-Microscopio Olympus CX21
-Aceite de inmersin

Trabajo Prctico N2
El procedimiento se realiz de acuerdo a lo estipulado en la gua de trabajo
(8)
Lista de materiales:
-Asa de platino convencional (en argolla)
-Pipeta pasteur
-Placas de Petri (con los medios preparados en el prctico anterior)
-Tubos de cultivo (con los medios preparados en el prctico anterior)
-Batera para tinciones
Cristal violeta
Lugol
Solucin de alcohol-acetona

Safranina al 1%
Tincin verde malaquita
Tinta china
Fucsina
-Plumn permanente
-Portaobjetos
-Mechero
-Microscopio Olympus CX21
-Aceite de inmersin
*Prximo prctico:
-Medios de cultivo
Slido
o Agar corriente
o Agar sangre
o Agar MacConkey
Lquido
-Trula estril
-Suero fisiolgico
Trabajo prctico N3
El procedimiento se realiz de acuerdo a lo estipulado en la gua de trabajo
(9), pero en la seccin del anexo solo se pudo realizar los 2 primeros puntos (10).
Adems, no se utiliz asa en punta.
Lista de materiales:
-Asa de platino convencional (en argolla)
-Asa de platino convencional adaptada para simular asa en punta
-Pipeta pasteur
-Placas de Petri (con muestras de zonas anatmicas)
Orofaringe
Nasofaringe
Boca
Piel
Fosas nasales
-Tubos de cultivo
-Batera de medios de cultivo
Semitendidos
Tendidos
Lquidos

Semislidos
-Galera API 10S
-Plumn permanente
-Portaobjetos
-Mechero
-Microscopio Olympus CX21
-Aceite de inmersin

Resultados
Observacin de preparaciones tipo
Al observar las preparaciones proporcionadas en el laboratorio, fue posible
identificar las siguientes caractersticas microscpicas (Tabla I)
Tabla I. Caractersticas microscpicas de preparaciones recibidas.

Muestra
N 101 Gram
positivo
N 102 Gram
negativo
N 103
Mezcla Gram
positivo y
negativo
N 105
Estafilococos
N 106
Levadura
N 107
Estreptococos
N 109
Esporas
N 110
Cpsula

Tincin

Forma
Bacilo

Bacilo

Agrupacin
Afinidad tintorial
Mayoritariamente Gram (+)
cadenas,
algunas aisladas.
Aisladas
Gram (-)

Coco

Aisladas

Gram (+) y Gram (-)

Coco

Racimos

Gram (+)

Gram

Ovalada Aisladas
Coco

Racimos

Verde de
malaquita

Vibrio

Aisladas

Tinta china

Bacilo

Difusa

Gram (+) (no aplica


clasificacin Gram)
Gram (+)
Bacteria: safranina
Espora: verde de
malaquita
Bacteria: fucsina
Cpsula: sin tincin

Simbologa: +; positivo. -; negativo.


Las muestras fueron observadas mediante microscopa de luz, con un aumento de 100x.

Morfologa bacteriana
En cuanto a la morfologa bacteriana, con el fin de un acercamiento a la
identificacin de los gneros bacterianos, se realiz un anlisis macroscpico de 6
cultivos en diferentes medios (Tabla II)
Tabla II. Caractersticas macroscpicas de los cultivos realizados

Especie

Medio de
cultivo
E. coli
Agar
corriente
S. aureus
Agar
sangre
B.cereus
Agar
sangre
Agar
MacConkey
R.
Agar
pneumoniae MacConkey
S.
Agar
agalactiae
sangre

Cr.

Forma

Borde

Elevacin

Puntiforme

Liso

Plana

Puntiforme

Liso

Levantada

Irregular

Liso

Levantada

Superficie Caractersticas
fsicas
Lisa
Blanco,
brillante
Lisa
Amarillo,
brillante
Lisa
Beige, opaco

No

--

--

--

--

--

Circular

Liso

Levantada

Lisa

Puntiforme

Liso

Plano

Lisa

Rosado, muy
brillante
Rodeado de
halo blanco

Simbologa: Cr; Crecimiento. --; no hay caractersticas que mencionar.


Las muestras fueron observadas directamente, sin aumento.

Por otro lado, para poder tener una aproximacin ms cercana a la


identidad de las bacterias, se realiz un anlisis microscpico (Tabla III)
Tabla III. Caractersticas microscpicas de los cultivos realizados

E. coli
S. aureus
B. cereus

Forma
Coco
Coco
Bacilo

Agrupacin
Aisladas
Racimo
Cadenas

Afinidad tintorial
Gram (-)
Gram (+)
Gram (-)

Simbologa: +; positivo. -; negativo.


Las muestras fueron observadas mediante microscopa de luz, con un aumento de 100x

Anlisis de microbiota presente en distintas zonas anatmicas


Se tom muestras de diferentes partes del cuerpo, para evaluar la
microbiota presente normalmente en nuestro organismo. Se realiz un anlisis
tanto macroscpico (Tabla IV) como microscpico (Tabla V).
Tabla IV. Anlisis macroscpico de muestras obtenidas

Procedencia Medio de
cultivo
Fosa nasal
Agar
sangre

CP

Orofaringe

Circular

Liso

Superficie Caractersticas
fsicas
Levantada Lisa
Amarillo, creo
Convexa
Lisa
Anaranjado,
creo
Levantada Lisa
Beige

No

Circular

Liso

Levantada Rugosa

Caf claro

No

Circular

Liso

Levantada Lisa

--

--

--

Blanco
invierno,
amarillo,
creos
--

Nasofaringe
Piel de la
mueca

Boca

Agar
corriente
Agar
sangre
Agar
corriente

Forma

Borde Elevacin

No* Puntiforme Liso


Circular
Liso

Agar
-MacConkey

--

Simbologa: CP; Cultivo puro. --; no hay datos que mostrar (no hubo crecimiento). *; presencia de
hongos filamentosos.
Las muestras fueron observadas directamente, sin aumento.
Tabla V. Anlisis microscpico

Procedencia
Nasofaringe

Forma
Cocos

Orofaringe
Fosa nasal
Piel de la mueca

Coco
Coco
Coco

Agrupacin
Racimos y
cadenas
Racimos
Aislados
Racimos

Afinidad tintorial
Gram (+)*
Gram (+)*
Gram (+)*
Gram (+)*

Simbologa: +; positivo. -; negativo. *; exista una cantidad considerable de bacterias sin tincin
gram.
Las muestras fueron observadas mediante microscopa de luz, con un aumento de 100x

Identificacin de bacteria gram positiva


Adems, se realizaron las pruebas bioqumicas para identificacin de
cocceas gram positivas: las pruebas de catalasa y coagulasa (Tabla VI) Estas
pruebas se realizaron en cultivos provenientes de dos personas distintas. La
prueba de catalasa busca la presencia de la enzima catalasa, que descompone
H2O2 en H2O y O2. La prueba de coagulasa, por su parte, busca la presencia de
la enzima coagulasa, producida por S. aureus.
Tabla VI. Pruebas bioqumica de catalasa y coagulasa

Cultivo 1
Cultivo 2

Presencia de catalasa
+
+

Presencia de coagulasa
-

Simbologa: +; positivo. -; negativo.

No se obtuvo resultados de la batera bioqumica, los que quedan


pendientes para el otro informe.

Discusin
Los resultados obtenidos en cuanto a la morfologa de preparaciones ya
identificadas (Tabla I) dan cuenta de que existe un cierto grado de fidelidad en la
tincin Gram, ya que hubo correspondencia entre los rtulos y los resultados; por
otro lado, con respecto a la observacin de caractersticas como forma y
agrupacin, existe una gran subjetividad, dada por el ojo humano y por la
concentracin de bacteria empleada. Se debe destacar que la levadura (Tabla I)
dio como resultado gram positivo, lo que se debe a que el grosor de su pared
celular tendra el mismo efecto que el de una bacteria gram positiva (12).
En la seccin de morfologa bacteriana, se vuelve a repetir lo de la
subjetividad con respecto al anlisis macroscpico. Por otro lado, en cuanto a la
tincin gram, ocurri que para el caso de B. cereus, este no creci en MacConkey
(Tabla II), por lo que cabra esperar que el organismo fuese gram positivo, pero la
tincin gram dio negativo (Tabla III). Esto ha sido documentado en casos en donde
se ha mantenido a las bacterias en suspensin por periodos de 2 horas a varios
das (13), lo que podra explicar este resultado.
En cuanto a la microbiota, se tiene que es muy diversa, ya sea al cambiar
de zona anatmica o incluso en la misma zona anatmica (Tabla IV). Es de
extraar que el cultivo obtenido a partir de una muestra de la boca no haya
mostrado crecimiento en el medio MacConkey, ya que esto significara que no
existen bacterias gram positivas, siendo que existen bacterias del gnro
Streptococcus (14), que son gram positivas (15), lo que pudo haber ocurrido por
una mala inoculacin, o una mala maniobra en el proceso de sembrar el cultivo. La
existencia de bacterias no teidas (Tabla V) puede deberse a lo mencionado
anteriormente con respecto a la desaparicin de la tincin gram (13)
Por ltimo, con respecto a la identificacin de bacterias gram positivas, se
tuvo que la reaccin a la coagulasa fue negativa en ambos cultivos (Tabla VI), a
pesar de haber corroborado que ambos eran gram positivos (Tabla V). Esto puede
haber ocurrido, a una falla en el procedimiento tcnico, que podra consistir en el
uso de protocolos anticuados o de no adherencia al protocolo involuntaria (16).

Conclusin
En funcin de los resultados obtenidos, se puede afirmar que el
seguimiento riguroso y estandarizacin de los protocolos, ya sea en cuanto a
procedimientos bsicos o a tcnicas ms compleja, es fundamental para obtener
resultados confiables y una buena experiencia en trminos de seguridad.
Adems, se puede concluir que la identificacin certera y precisa de un
organismo no se puede realizar mediante el anlisis bacteriano macroscpico y
microscpico, pero s estos anlisis permiten un resultado preliminar que permita
dirigir las pruebas bioqumicas adecuadas segn el tipo de bacteria. Sin embargo,
queda pendiente evaluar la confiabilidad de este ltimo mtodo, ya que no se pudo
tener acceso a los resultados.
En cuanto a la microbiota presente en los humanos, se tiene que es muy
diversa y su variedad depende de la zona anatmica a analizar.
A modo de resumen, a partir de las experiencias realizadas se pudo
verificar la utilidad e importancia de los procedimientos prcticos realizados en
microbiologa, claro ejemplo de esto es la identificacin bacteriana, ya que puede
ser usada para detectar una enfermedad o la causa de un problema ambiental.

Bibliografa
1. Biology of Microorganisms. Madigan, M.T, Martinko J.M, Stahl D.A y Clark
D.P, 13 edicin, Mc Graw-Hill, 2012, pg. 2.
2. Referencia 1, pg. 32-33.
3. Microbiology Laboratory Theory and Application, Brief Edition! Laboffe,
M.J, Pierce, B.E, 2a edicin, Morton Publishing, 2012, pg 59.
4. Referencia 3, pg. 153.
5. Referencia 3, pg. 475.
6. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. CDC/NIH. U.S.
Department of Health and Human Services, Public Health Service, 5a
edicin, 2009, pg. 1.
7. Gua de trabajos prcticos: Biologa de los microorganismos (BIO151E).
Segundo semestre, 2014, pg. 30-31.
8. Referencia 7, pg. 23-29.
9. Referencia 7, pg. 49-51.
10. Referencia 7, pg. 57-58.
11. Referencia 7, pg. 63.
12. Gram Stain: Looking Beyond Bacteria to Find Fungi in Gram Stained
Smear. Mohan, S.K, 1a edicin, AuthorHouse, 2009, pg. 13.
13. The Gram Stain. Bartholomew, J.W y Mittwer, T, Bacteriol Rev., 1952,
pg. 12.
14. Referencia 1, pg. 789.
15. Referencia 1, pg. 781
16. Cumitech 41, Detection and Prevention of Clinical Microbiology LaboratoryAssociated Errors, Amsterdam et al, ASM Press, 2004, pg. 3.