PRACTICA 2.

DETERMINACIN DE LACTOSA
MRQUEZ- ROA L. M. Maestra en Ciencia y Tecnologa Agroalimentaria. Qumica de la leche. 12 generacin

INTRODUCCIN
La lactosa es el principal carbohidrato de la leche, es un
disacrido que est compuesto de galactosa y glucosa, ligado
por un enlace glicosdico 1-4. Su concentracin varia de 0~10
%w/w, y la leche es la nica fuente significativa.
La concentracin de la lactosa en leche de bovinos es de 4.8
% w/w. Est inversamente relacionada con la concentracin de
lpidos y con la de casena. La funcin principal de la lactosa y
de los lpidos en la leche es ser una fuente de energa; como
los lpidos son ~ 2.2 veces ms energticos que la lactosa,
cuando requiere una leche altamente calrica esto se logra con
un aumento de grasa. La relacin inversa con la casena se
debe que la sntesis de lactosa arrastra agua en la vescula de
Golgi, diluyendo la concentracin de casena.
La lactosa es sintetizada en las clulas epiteliales de la
glndula mamaria de dos molculas de glucosa absorbidas de
la sangre. Una molcula es glucosa es convertida a galactosa
por va de Leloir que ocurre en tejidos animales y en clulas
bactrianas.
La lactosa cumple dos funciones importantes: es un recurso de
energa listo para usarse para el recin nacido (provee el 30%
del valor de caloras de la leche de bovino) y es responsable
del 50% de la presin osmtica de la leche y es en esencia
constante.
La lactosa tiene una relacin inversa con las sales inorgnicas,
ya que sirven para mantener la presin osmtica.
Las propiedades de la lactosa son generalmente similares a las
de otras azcares pero difiere en su importancia tecnolgica.
Como todos los azcares reductores, a lactosa pude participar
en a reaccin de Maillard.
La lactosa es un azcar reductor, tiene un grupo carbonilo libre
o potencialmente libre. La titulacin por reduccin usando
CuSO4 alcalino (solucin de Feling) o Cloramia-T, es el
principal mtodo estndar de determinacin cuantitativa de
lactosa, en muchos laboratorios actualmente es usual
determinarla por espectrofotometra de infrarrojo. Puede
tambin determinarse por polarimetra, espectrofotometra

como una longitud de onda visible despus de una reaccin

con fenol o antrona en solucin fuertemente cida,
enzimticamente o por HPLC (Fox y McSweeney, 2009).
METODOLOGA
Se midi el contenido de lactosa en tres productos lcteos
utilizando diferentes mtodos. Por el mtodo volumtrico y el
de ultrasonido (equipo Lactoscan), se evalu el contenido de
lactosa en leche UHT Alpura , mientras que en el alimento
lcteo fermentado marca Soful se hizo nicamente por
volumetra. En leche entera sin pasteurizar se aplic el mtodo
de infrarrojo (equipo MIlkoscan FT1) y el mtodo polarimtrico.
a) Mtodo Polarimtrico
Se utiliz el mtodo AOAC 896.01.
Se prepar la muestra pesando por duplicado 65.8 g de leche y
se colocaron en matraces volumtricos de 100 mL y 200 mL.
Se agregaron 20 mL de solucin cido_Hg(NO3)2. El matraz de
100 mL se afor con cido Fosfotngstico, mientras que al
matraz de 200 mL se adicionaron 15 mL de solucin de cido
fosfotngstico y se afor con agua destilada. Se agitaron
ambos matraces con agitador magntico. Finalmente paso por
papel filtro.
Se detect el error del polarmetro tomando como referencia al
agua destilada, el valor de ajuste para el tubo de 100 mL fue de
-0.75 y para el de 200 mL fue de -0.60.
La solucin del matraz volumtrico de 100 mL se coloc en el
tubo del polarmetro de 100 mmm y se tom la lectura.
La solucin del matraz volumtrico de 200 mL se coloc en el
tubo del polarmetro de 200 mm y se tom la lectura.
Finalmente se calcul la concentracin de lactosa mediante la
siguiente frmula:

b) Mtodo Volumtrico
Se adicion 5 mL de solucin A y B en un matraz Erlenmeyer
de 250 mL. Se aadieron 50 mL de agua, se calent a

ebullicin con agitacin constante y se agreg poco a poco la

solucin patrn de lactosa hasta la casi reduccin. Se agreg 1
mL de azul de metileno y se continu con la titulacin, hasta la
desaparicin total del color azul de la solucin. Se calcularon
los miligramos de lactosa que se necesitan para titular la
solucin A-B. Este valor correspondi al factor (F) del reactivo.
Se colocaron 10 mL de leche en un matraz volumtrico de 100
mL con 25 mL de agua. Se aadi 6 mL de solucin saturada
de acetato de plomo, 10 mL de sulfato de sodio y 1 mL de
cido actico glacial. Se dej reposar por una hora.
Posteriormente, se diluy a la marca con agua destilada, se
filtr y se coloc ste en una bureta. Y se procede a realizar la
titulacin de la misma manera que se describe para la solucin
patrn.
Se realiz el clculo mediante la siguiente frmula:

100

Donde F= factor del reactivo en mg de lactosa

V= mL de filtrado que se necesitaron para titular la
solucin A-B.
c) Mtodo De Ultrasonido (Equipo Lactoscan) 1
La muestra no requiri preparacin previa.
Cuando el analizador est listo para el trabajo, un pitido se
escucha y la pantalla muestra: "Listo Comenz". El analizador
est listo a hacer anlisis en el modo 1 (normalmente Vaca)
Para nuestro caso requerimos pasar al modo UHT por lo que
se apret el botn Enter y se mantuvo as hasta que apareci
el mensaje siguiente aparece en la pantalla:
Soltar boton
iniciar menu
Se Liber el botn Entrar. La pantalla muestra los modos
posibles trabajo:
Select deModo
Cal1 - Cava
Cal2 - Oveja
Cal3 - UHT

Limpieza
Limpieza Final

Usando los botones arriba y "abajo" se escogi el modo de

trabajo y se presion Entrar
Para nuestro caso se seleccion UHT.
Para comenzar la medicin:
- Se puso la muestra previamente preparada en el
compartimiento de muestra.
El tubo de entrada del analizador es una junta de rodilla
(mvil). Se movi hacia el frente para poder colocar el
recipiente con la muestra de leche de prueba y se dej
descansar ste sobre el soporte en el hueco del analizador.
- Se presiona el botn Entrar
El analizador aspira la leche, hace la medicin y la muestra de
leche usada es vertida por los agujeros de la rejilla debajo del
tubo de entrada del analizador y entra en la zona para recoger
lquidos de desecho
Finalmente se realiza la limpieza del aparato.

d) Mtodo De Infrarrojo (Equipo Milkoscan)2

La muestra no requiri preparacin previa.
Se coloc la muestra el analizador. Se asign un nombre en el
programa del equipo instalado en la computadora para la
muestra que fue analizada y se selecciona READ. La muestra
es analizada y los valores aparecen en el programa, arroja tres
lecturas y el promedio de las mediciones por cada muestra.
Terminando la medicin se realiza la limpieza del equipo por lo
que es necesario que se coloque la solucin limpiadora.
MilkoScan FT2 utiliza el anlisis con infrarrojos por
transformada de Fourier (FTIR). Escanea todo el espectro de
infrarrojos permitiendo la medicin de nuevos parmetros,
incluso en productos lcteos complejos. Y como todos los
instrumentos de FTIR estn estandarizados, las calibraciones
pueden transferirse sin que haya prdida de precisin.

http://lactoscan.com/spain/pdfs/LactoscanLA_Esp.pdf

Este equipo puede mejorar la seguridad de los alimentos con

una deteccin por espectro integrada. Se pueden detectar las
anomalas en la leche (adulteracin de la leche, grasa,
protena, lactosa, slidos totales y slidos no grasos, urea,
densidad, descenso crioscpico, acidez total, cidos grasos

2
http://www.foss.es/industry-solution/products/milkoscan-ft2

libres, casena)a la vez que se realizan otras comprobaciones .

No se precisan ni equipos ni tiempo adicional. Se utiliza utilizar
en: Industrias lcteas en lnea o en el laboratorio
Las muestras que pude detectar son leche, nata, leche
concentrada, batidos, mezclas de helados, yogur, postres
lcteos, suero, concentrado de protena de suero y queso
quark. Sin embargo, la medicin de material muy viscoso y
denso puede provocar el taponamiento de las vlvulas.
Actualmente su empleo en el laboratorio donde utiliz
nicamente lo emplea para leche de diferentes regiones y se
estn realizando las calibraciones correspondientes.
RESULTADOS
Figura 1. Concentracin de lactosa en diferentes productos
lcteos
MUESTRA

MTODO

Leche Alpura

Volumtrico
Lactosan
(Ultrasonido)

CONTENIDO
DE LACTOSA
(% W/V)

CONTENIDO
DE LACTOSA
(% W/V)
segn
literatura

4.6

4.7 a 5.2 %

4.23 0.20

4.7 a 5.2 %

Soful

Volumtrico

3.31

Leche entera
sin pasteurizar

Polarimtrico
Infrarrojo
(Milcoskan)

4.87

20% menos
de la
concentracin
inicial
4.7 a 5.2 %

4.29

4.7 a 5.2 %

Los valores de concentracin de lactosa encontrados en la

leche por el mtodo polarimtrico y volumtrico, se encuentran
dentro de los lmites reportados por Keating (1999), que van de
4.7 a 5.2 %, mientras que los resultados obtenidos utilizando
el Lactoscan y el equipo Milcoskan estn por debajo de esta
referencia. Para el caso de la concentracin medida por el
lactoscan en la Leche Alpura la diferencia observada con lo
reportado por el mtodo volumtrico, puede deberse a que el
equipo no est calibrado, segn lo informado por el tcnico
responsable del equipo, adems de que el manual del equipo
menciona que para la medicin de lactosa tiene una exactitud
de 0.20 %. Est variacin tambin puede deberse a que el
mtodo volumtrico depende de la habilidad y experiencia del
experimentador para percibir el cambio de color en la titulacin
adems de que esta tcnica no diferencia entre los diferentes
carbohidratos que estn presentes en la leche (Kouaouci,
2013).

En cuanto al producto lcteo fermentado, el valor disminuido de

la lactosa (3.31) se debe principalmente al efecto de las
bacterias lcticas (BAL), quienes se alimentan de lactosa
generando cido lctico, disminuyendo as cerca de un 20% de
la lactosa presente inicialmente, esta disminucin no se realiza
hasta la eliminacin total de la lactosa debido a que el
resultado de la fermentacin da como resultado la acidificacin
del medio que inhibe el crecimiento de las BAL (Prez y
Snchez, 2013).
Para la leche entera sin pasteurizar los valores reportados por
el mtodo polarimtrico resultaron ser superiores en 0.58% a
los encontrados al utilizar el equipo Milcoskan, lo que puede
deberse a que en el primer mtodo la determinacin depende
de la habilidad y la experiencia para para compaginar
visualmente las sombras de un color. Debido a lo anterior,
sera posible tomar como referencia el valor de 4.29% w/v
encontrado por el mtodo de infrarrojo ya que presenta mayor
confiabilidad. Cabe sealar que El-Salam et al., (1985)
encontraron que el Milkoscan fue capaz de analizar leche de
vaca con exactitud comparable a la que se obtiene por los
mtodos analticos, para el caso particular de la cuantificacin
de lactosa el mtodo de referencia fue el volumtrico con una
desviacin estndar de 0.008 en la repetitividad y de 0.05 en la
exactitud.
Al comparar los valores encontrados en la leche Alpura y en
la leche entera sin pasteurizar, es relevante observar que
presentan concentraciones similares de lactosa al emplear los
equipos de ultrasonido y el de infrarrojo, de 4.23 0.20 y 4.29
respectivamente. Tambin es evidente que los mtodos
analticos arrojan concentraciones ms altas de lactosa.
Debido a que la lactosa es el componente ms constante en la
leche, una disminucin en su concentracin puede ser
referencia a la presencia de calostro (Corbellini, 2013) o de
leches mastticas (Fox et al. 2000).
CONCLUSIONES
La determinacin de lactosa en productos lcteos puede
hacerse mediante mtodos analticos en los que se incluyen la
determinacin por volumetra y polarimetra, que requieren de
mayor tiempo y experiencia y la habilidad del investigador para
realizarlos que los mtodos en los que se utilizan equipos
como el Lactoscan y el Milkoscan.

La determinacin de la concentracin de lactosa puede dar

informacin de la presencia de mastitis y de calostro.
Los mtodos rpidos son tiles cuando se requiere el anlisis
de la calidad de la leche en empresas que procesan este
alimento.
El empleo del equipo Milkoscan est aprobado para la
realizacin de investigacin, pues su mtodo se ha validado
utilizando como referencia los mtodos analticos.
El empleo del equipo Lactoscan (ultrasonido) no est permitido
para la realizacin de trabajos de investigacin; sin embargo,
es muy til cuando se requiere evaluar la calidad de la leche de
manera rpida y fcil, el inconveniente es el alto costo de los
equipos.
La fermentacin realizada por las BAL disminuye el contenido
de lactosa en leche, por lo que su presencia ser menor en
leches y productos lcteos fermentados.

CUESTIONARIO
PRINCIPIO DE LA DETERMINACIN DE LA LACTOSA POR
EL MTODO POLARIMTRICO

FACTORES
QUE
PUEDEN
INFLUIR
EN
LA
DETERMINACIN DE LACTOSA POR EL MTODO DE
POLARIMETRA
Dependiente de:
La longitud de onda de la luz utilizada.
Longitud de la celda
Naturaleza de la sustancia activa y su concentracin
Temperatura
Se mide el grado de rotacin requerido.
Si un compuesto tiene simetra la luz polarizada no ser
afectada.
PRINCIPIO DE CUANTIFICACIN DE LACTOSA POR EL
MTODO VOLUMTRICO
Por poseer un grupo aldehdo libre, la lactosa es un azcar
reductor. Reduce especialmente al licor cupro-alcalino de
Fehling, principio en que se basa la valoracin (Alais, 1970).
SOLUCIN DE FEHLING
Dos soluciones:

POLARIMETRA

Solucin A: Sulfato de cobre cristalino

FUNDAMENTO

Solucin B: Tartrato de sodio y potasio (o citrato de sodio) +

hidrxido de sodio (o hidrxido de potasio o carbonato de
sodio)

Si se puede hacer que todos los rayos tengan orientados sus

componentes elctricos y magnticos en la misma direccin, la
radiacin ser polarizada en plano. Esto se puede lograr
mediante el uso de un filtro polarizador.
Cuando la luz polarizada brilla en una molcula asimtrica (un
compuesto que no puede producir una imagen al espejo). La
luz es rotada. Esto es llamado compuesto pticamente activo
(e.g. Glucosa).
El segundo filtro es rotado manualmente para compaginar
visualmente las sombras de un color. Esto rota al rayo de luz
polarizada de regreso a su posicin original.
Magnitud de la rotacin
Polarmetro: usa luz monocromtica y lee en grados angulares
(se debe relacionar con la concentracin de azcar).

El citrato o tartrato evita la precipitacin del hidrxido cprico

El lcali enoliza a los azcares y provoca su rompimiento en
fragmentos reactivos que pueden oxidarse inmediatamente:
Cu++ (CPRICO) es reducido A Cu+ (el ion cuproso)
A medida que los iones Cu++ se reducen por los fragmentos
de azcar, los iones Cu+ se combinan con los iones hidroxilo
para formar hidrxido de cobre (de color amarillo, Cu+).
El CuOH reducido pierde H2O en presencia de calor para dar
como resultado xido cuproso insoluble (Cu2O)
La determinacin del cobre reducido se puede llevar a cabo por
gravimetra, volumetra, o por mtodos electrolticos (Lpez,
2013).
La volumetra comprende un conjunto de tcnicas analticas en
las que la cantidad de analito (A) presente en una muestra es

calculada a partir del volumen de una solucin de reactivo (B),

de concentracin exactamente conocida, necesario para
reaccionar estequiomtricamente con una cantidad
exactamente conocida de muestra.
Para ello una cantidad de muestra exactamente medida es
colocada en un matraz Erlenmeyer y disuelta en agua, si se
trata de un slido. Entonces, desde una bureta se agrega a
gotas una solucin del reactivo de concentracin CB sobre la
solucin de la muestra, agitando constantemente, hasta que la
reaccin
a A + b B Productos
se produzca estequiomtricamente, o sea hasta que hayamos
agregado b mmoles de B por cada a
mmoles de A. Designemos VB,pe al volumen de reactivo
necesario para alcanzar ese punto; entonces aplicamos el
siguiente razonamiento estequiomtrico elemental:
b mmoles de B a mmoles de A
VB,peCB mmoles de B x = (a/b) VB,peCB mmoles de A
La operacin recibe el nombre de titulacin, y el punto de la
titulacin en que hemos adicionado el volumen de reactivo
necesario para reaccionar estequiomtricamente con el analito
se llama punto de equivalencia (pe).
De lo hasta ahora dicho surgen los siguientes requisitos
bsicos para un mtodo volumtrico:
a. Seguridad acerca de la estequiometra de la reaccin, o sea
conocer con certeza total cuantos
mmoles de reactivo reaccionan con cada mmol de analito.
b. Disponer de un mtodo para detectar en que punto de la
titulacin hemos adicionado el volumen de reactivo
correspondiente al punto de equivalencia. Es evidente que el
punto de equivalencia es un valor puramente terico: para
calcularlo deberamos conocer la cantidad de analito presente,
que casualmente es nuestra incgnita. Lo que se hace en la
prctica es crear condiciones experimentales tales que en el
punto de equivalencia, o al menos en su proximidad inmediata,
se produzca un cambio brusco en alguna propiedad de la
solucin en que ocurre la reaccin, como puede ser un cambio
de color, o la aparicin de un precipitado, o alguna seal
generada por un instrumento que mide constantemente alguna
propiedad de la solucin. El momento de la titulacin en que se
produce esa seal se llama punto final (pf). El punto final es un
valor exclusivamente experimental, y en consecuencia no

coincide exactamente con el valor terico, o sea con el punto

de equivalencia.
Requisitos a reunir por la reaccin qumica
No todas las reacciones qumicas pueden ser utilizadas para
desarrollar un mtodo volumtrico; existen una serie de
requisitos que deben ser cumplidos.
a. La reaccin entre analito y reactivo debe ocurrir de acuerdo
con una ecuacin qumica bien definida, no deben ocurrir
reacciones secundarias.
b. La reaccin debe ser rpida, el equilibrio debe alcanzarse
instantneamente luego de la adicin de cada gota de reactivo;
de otro modo la titulacin se tornara excesivamente lenta. En
algunos casos en que no hay otra solucin puede recurrirse a
reacciones lentas aplicando una titulacin por retorno: se
agrega un exceso conocido de reactivo, se espera y da las
condiciones para que la reaccin alcance el equilibrio, y luego
se titula la porcin de reactivo que sobr con un segundo
reactivo que acta instantneamente.
c. La reaccin debe transcurrir hasta completarse, es decir, la
conversin del analito en producto de reaccin debe ser
completa, la constante de equilibrio de la reaccin debe ser
alta.
d. Deben darse las condiciones para producir un punto final, ya
sea por aparicin de un color, o de un precipitado, o generando
alguna seal perceptible por medio de un instrumento
adecuado (UNAP, 2013).
FACTORES
QUE
PUEDEN
INFLUIR
EN
LA
DETERMINACIN DE LACTOSA POR EL MTODO
VOLUMTRICO
El peso del Cu2O slo es aplicable a muestras relativamente
puras.
La reduccin del cobre y la oxidacin de los azcares no es
estequiomtrica .
La produccin de xido cuproso vara, dependiendo del
reactivo lcali, la velocidad y tiempo de calentamiento y la
concentracin de azcares en la muestra
Los azcares difieren en su habilidad para reducir la solucin
cprica, por tanto, la titulacin (o peso o absorbancia) deben
ser convertidos en (mg de cobre) y posteriormente se recurrir

a tablas para determinar la concentracin de azcar presente

en la muestra (Lpez, 2013).

Keating, P. F. y Gaona H. 1999.Introduccin a la lactologa.

Editorial Limusa S.A. De C.V. Mxico. 316 p.

El poder reductor de la lactosa es considerablemente ms dbil

que el de la glucosa (70 partes de glucosa reducen al licor de
Fehling lo mismo que 100 de lactosa). Si se hidroliza la lactosa,
el poder reductor aumenta considerablemente (x 1.37). Pero
esta hidrlisis no se produce en condiciones de la inversin de
la sacarosa. Las nociones expuestas deben tenerse en
consideracin para el anlisis de los productos lcteos
azucarados. (Alais, 1970).

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Fecha