PRACTICA 2.

DETERMINACIÓN DE LACTOSA
MÁRQUEZ- ROA L. M. Maestría en Ciencia y Tecnología Agroalimentaria. Química de la leche. 12ª generación

INTRODUCCIÓN
La lactosa es el principal carbohidrato de la leche, es un
disacárido que está compuesto de galactosa y glucosa, ligado
por un enlace glicosídico β1-4. Su concentración varia de 0~10
%w/w, y la leche es la única fuente significativa.
La concentración de la lactosa en leche de bovinos es de 4.8
% w/w. Está inversamente relacionada con la concentración de
lípidos y con la de caseína. La función principal de la lactosa y
de los lípidos en la leche es ser una fuente de energía; como
los lípidos son ~ 2.2 veces más energéticos que la lactosa,
cuando requiere una leche altamente calórica esto se logra con
un aumento de grasa. La relación inversa con la caseína se
debe que la síntesis de lactosa arrastra agua en la vesícula de
Golgi, diluyendo la concentración de caseína.
La lactosa es sintetizada en las células epiteliales de la
glándula mamaria de dos moléculas de glucosa absorbidas de
la sangre. Una molécula es glucosa es convertida a galactosa
por vía de Leloir que ocurre en tejidos animales y en células
bactrianas.
La lactosa cumple dos funciones importantes: es un recurso de
energía listo para usarse para el recién nacido (provee el 30%
del valor de calorías de la leche de bovino) y es responsable
del 50% de la presión osmótica de la leche y es en esencia
constante.
La lactosa tiene una relación inversa con las sales inorgánicas,
ya que sirven para mantener la presión osmótica.
Las propiedades de la lactosa son generalmente similares a las
de otras azúcares pero difiere en su importancia tecnológica.
Como todos los azúcares reductores, a lactosa pude participar
en a reacción de Maillard.
La lactosa es un azúcar reductor, tiene un grupo carbonilo libre
o potencialmente libre. La titulación por reducción usando
CuSO4 alcalino (solución de Feling) o Cloramia-T, es el
principal método estándar de determinación cuantitativa de
lactosa, en muchos laboratorios actualmente es usual
determinarla por espectrofotometría de infrarrojo. Puede
también determinarse por polarimetría, espectrofotometría

como una longitud de onda visible después de una reacción
con fenol o antrona en solución fuertemente ácida,
enzimáticamente o por HPLC (Fox y McSweeney, 2009).
METODOLOGÍA
Se midió el contenido de lactosa en tres productos lácteos
utilizando diferentes métodos. Por el método volumétrico y el
de ultrasonido (equipo Lactoscan), se evaluó el contenido de
lactosa en leche UHT Alpura ®, mientras que en el alimento
lácteo fermentado marca Soful® se hizo únicamente por
volumetría. En leche entera sin pasteurizar se aplicó el método
de infrarrojo (equipo MIlkoscan FT1) y el método polarimétrico.
a) Método Polarimétrico
Se utilizó el método AOAC 896.01.
Se preparó la muestra pesando por duplicado 65.8 g de leche y
se colocaron en matraces volumétricos de 100 mL y 200 mL.
Se agregaron 20 mL de solución ácido_Hg(NO3)2. El matraz de
100 mL se aforó con ácido Fosfotúngstico, mientras que al
matraz de 200 mL se adicionaron 15 mL de solución de ácido
fosfotúngstico y se aforó con agua destilada. Se agitaron
ambos matraces con agitador magnético. Finalmente paso por
papel filtro.
Se detectó el error del polarímetro tomando como referencia al
agua destilada, el valor de ajuste para el tubo de 100 mL fue de
-0.75 y para el de 200 mL fue de -0.60.
La solución del matraz volumétrico de 100 mL se colocó en el
tubo del polarímetro de 100 mmm y se tomó la lectura.
La solución del matraz volumétrico de 200 mL se colocó en el
tubo del polarímetro de 200 mm y se tomó la lectura.
Finalmente se calculó la concentración de lactosa mediante la
siguiente fórmula:

b) Método Volumétrico
Se adicionó 5 mL de solución A y B en un matraz Erlenmeyer
de 250 mL. Se añadieron 50 mL de agua, se calentó a

Se colocó la muestra el analizador.foss. grasa. se diluyó a la marca con agua destilada. Posteriormente.ebullición con agitación constante y se agregó poco a poco la solución patrón de lactosa hasta la casi reducción. Para comenzar la medición: . densidad.pdf Este equipo puede mejorar la seguridad de los alimentos con una detección por espectro integrada. las calibraciones pueden transferirse sin que haya pérdida de precisión. El tubo de entrada del analizador es una junta de rodilla (móvil).Se puso la muestra previamente preparada en el compartimiento de muestra. proteína. sólidos totales y sólidos no grasos. El analizador está listo a hacer análisis en el modo 1 (normalmente Vaca) Para nuestro caso requerimos pasar al modo UHT por lo que se apretó el botón Enter y se mantuvo así hasta que apareció el mensaje siguiente aparece en la pantalla: Soltar boton iniciar menu Se Liberó el botón Entrar. Se dejó reposar por una hora. d) Método De Infrarrojo (Equipo Milkoscan)2 La muestra no requirió preparación previa. 10 mL de sulfato de sodio y 1 mL de ácido acético glacial. La pantalla muestra los modos posibles trabajo: Select deModo Cal1 . Escanea todo el espectro de infrarrojos permitiendo la medición de nuevos parámetros. Cuando el analizador está listo para el trabajo. descenso crioscópico.Oveja Cal3 . . lactosa. Y se procede a realizar la titulación de la misma manera que se describe para la solución patrón. arroja tres lecturas y el promedio de las mediciones por cada muestra.Cava Cal2 . Se asignó un nombre en el programa del equipo instalado en la computadora para la muestra que fue analizada y se selecciona READ. Y como todos los instrumentos de FTIR están estandarizados.                                                               http://lactoscan. Se movió hacia el frente para poder colocar el recipiente con la muestra de leche de prueba y se dejó descansar éste sobre el soporte en el hueco del analizador. Se realizó el cálculo mediante la siguiente fórmula: 100 Donde F= factor del reactivo en mg de lactosa V= mL de filtrado que se necesitaron para titular la solución A-B. c) Método De Ultrasonido (Equipo Lactoscan) 1 La muestra no requirió preparación previa. Este valor correspondió al factor (F) del reactivo.com/spain/pdfs/LactoscanLA_Esp. Se pueden detectar las anomalías en la leche (adulteración de la leche. ácidos grasos                                                              2  http://www. urea. acidez total. hace la medición y la muestra de leche usada es vertida por los agujeros de la rejilla debajo del tubo de entrada del analizador y entra en la zona para recoger líquidos de desecho Finalmente se realiza la limpieza del aparato. Se agregó 1 mL de azul de metileno y se continuó con la titulación. hasta la desaparición total del color azul de la solución. Se añadió 6 mL de solución saturada de acetato de plomo.Se presiona el botón Entrar El analizador aspira la leche. Se calcularon los miligramos de lactosa que se necesitan para titular la solución A-B.UHT ……………………………… Limpieza Limpieza Final Usando los botones “arriba” y "abajo" se escogió el modo de trabajo y se presionó Entrar Para nuestro caso se seleccionó UHT. Terminando la medición se realiza la limpieza del equipo por lo que es necesario que se coloque la solución limpiadora. La muestra es analizada y los valores aparecen en el programa.es/industry-solution/products/milkoscan-ft2     1 . MilkoScan™ FT2 utiliza el análisis con infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR). un pitido se escucha y la pantalla muestra: "Listo Comenz". Se colocaron 10 mL de leche en un matraz volumétrico de 100 mL con 25 mL de agua. se filtró y se colocó éste en una bureta. incluso en productos lácteos complejos.

libres. Para el caso de la concentración medida por el lactoscan en la Leche Alpura ® la diferencia observada con lo reportado por el método volumétrico.58% a los encontrados al utilizar el equipo Milcoskan. Cabe señalar que El-Salam et al. Al comparar los valores encontrados en la leche Alpura ® y en la leche entera sin pasteurizar. Debido a lo anterior.008 en la repetitividad y de 0. lo que puede deberse a que en el primer método la determinación depende de la habilidad y la experiencia para para compaginar visualmente las sombras de un color. la medición de material muy viscoso y denso puede provocar el taponamiento de las válvulas. según lo informado por el técnico responsable del equipo.23 ± 0.7 a 5. de 4.20 4.29 respectivamente. sería posible tomar como referencia el valor de 4. Debido a que la lactosa es el componente más constante en la leche.20 y 4.6 4. CONCLUSIONES La determinación de lactosa en productos lácteos puede hacerse mediante métodos analíticos en los que se incluyen la determinación por volumetría y polarimetría. nata. Actualmente su empleo en el laboratorio donde utilizó únicamente lo emplea para leche de diferentes regiones y se están realizando las calibraciones correspondientes. RESULTADOS Figura 1. esta disminución no se realiza hasta la eliminación total de la lactosa debido a que el resultado de la fermentación da como resultado la acidificación del medio que inhibe el crecimiento de las BAL (Pérez y Sánchez. puede deberse a que el equipo no está calibrado. se encuentran dentro de los límites reportados por Keating (1999).7 a 5. una disminución en su concentración puede ser referencia a la presencia de calostro (Corbellini..2 %  Los valores de concentración de lactosa encontrados en la leche por el método polarimétrico y volumétrico.7 a 5. Se utiliza utilizar en: Industrias lácteas en línea o en el laboratorio Las muestras que pude detectar son leche. yogur. postres lácteos.7 a 5. mientras que los resultados obtenidos utilizando el Lactoscan y el equipo Milcoskan están por debajo de esta referencia. Está variación también puede deberse a que el método volumétrico depende de la habilidad y experiencia del experimentador para percibir el cambio de color en la titulación además de que esta técnica no diferencia entre los diferentes carbohidratos que están presentes en la leche (Kouaouci. caseína)a la vez que se realizan otras comprobaciones .2 %.31 Leche entera sin pasteurizar Polarimétrico Infrarrojo (Milcoskan) 4. (1985) encontraron que el Milkoscan fue capaz de analizar leche de vaca con exactitud comparable a la que se obtiene por los métodos analíticos. También es evidente que los métodos analíticos arrojan concentraciones más altas de lactosa.87 20% menos de la concentración inicial 4. . quienes se alimentan de lactosa generando ácido láctico. el valor disminuido de la lactosa (3. Para la leche entera sin pasteurizar los valores reportados por el método polarimétrico resultaron ser superiores en 0. No se precisan ni equipos ni tiempo adicional. 2013) o de leches mastíticas (Fox et al.20 %.7 a 5. En cuanto al producto lácteo fermentado. que van de 4. disminuyendo así cerca de un 20% de la lactosa presente inicialmente.29 4. mezclas de helados. Sin embargo. concentrado de proteína de suero y queso quark.29% w/v encontrado por el método de infrarrojo ya que presenta mayor confiabilidad. 2013). 2000). 2013). es relevante observar que presentan concentraciones similares de lactosa al emplear los equipos de ultrasonido y el de infrarrojo.2 %  4. Concentración de lactosa en diferentes productos lácteos MUESTRA MÉTODO Leche Alpura ® Volumétrico Lactosan (Ultrasonido) CONTENIDO DE LACTOSA (% W/V) CONTENIDO DE LACTOSA (% W/V) según literatura 4. para el caso particular de la cuantificación de lactosa el método de referencia fue el volumétrico con una desviación estándar de 0. además de que el manual del equipo menciona que para la medición de lactosa tiene una exactitud de ± 0. suero. que requieren de mayor tiempo y experiencia y la habilidad del investigador para realizarlos que los métodos en los que se utilizan equipos como el Lactoscan y el Milkoscan.2 %  4. batidos.05 en la exactitud.31) se debe principalmente al efecto de las bacterias lácticas (BAL).2 %  Soful ® Volumétrico 3.23 ± 0. leche concentrada.

principio en que se basa la valoración (Alais. el inconveniente es el alto costo de los equipos. volumetría. los iones Cu+ se combinan con los iones hidroxilo para formar hidróxido de cobre (de color amarillo. El segundo filtro es rotado manualmente para compaginar visualmente las sombras de un color.La determinación de la concentración de lactosa puede dar información de la presencia de mastitis y de calostro. Los métodos rápidos son útiles cuando se requiere el análisis de la calidad de la leche en empresas que procesan este alimento. pues su método se ha validado utilizando como referencia los métodos analíticos. Reduce especialmente al licor cupro-alcalino de Fehling. por lo que su presencia será menor en leches y productos lácteos fermentados. 2013). Esto es llamado “compuesto ópticamente activo” (e. Esto se puede lograr mediante el uso de un filtro polarizador. La fermentación realizada por las BAL disminuye el contenido de lactosa en leche. El citrato o tartrato evita la precipitación del hidróxido cúprico El álcali enoliza a los azúcares y provoca su rompimiento en fragmentos reactivos que pueden oxidarse inmediatamente: Cu++ (CÚPRICO) es reducido A Cu+ (el ion cuproso) A medida que los iones Cu++ se reducen por los fragmentos de azúcar. Cu+).g. o por métodos electrolíticos (López. SOLUCIÓN DE FEHLING Dos soluciones: POLARIMETRÍA • Solución A: Sulfato de cobre cristalino FUNDAMENTO • Solución B: Tartrato de sodio y potasio (o citrato de sodio) + hidróxido de sodio (o hidróxido de potasio o carbonato de sodio) Si se puede hacer que todos los rayos tengan orientados sus componentes eléctricos y magnéticos en la misma dirección. • Longitud de la celda • Naturaleza de la sustancia activa y su concentración • Temperatura • Se mide el grado de rotación requerido. La luz es rotada. PRINCIPIO DE CUANTIFICACIÓN DE LACTOSA POR EL MÉTODO VOLUMÉTRICO Por poseer un grupo aldehído libre. Esto rota al rayo de luz polarizada de regreso a su posición original. • Si un compuesto tiene simetría la luz polarizada no será afectada. El CuOH reducido pierde H2O en presencia de calor para dar como resultado óxido cuproso insoluble (Cu2O) La determinación del cobre reducido se puede llevar a cabo por gravimetría. El empleo del equipo Lactoscan (ultrasonido) no está permitido para la realización de trabajos de investigación. El empleo del equipo Milkoscan está aprobado para la realización de investigación. sin embargo. Glucosa). Cuando la luz polarizada brilla en una molécula asimétrica (un compuesto que no puede producir una imagen al espejo). la lactosa es un azúcar reductor. La volumetría comprende un conjunto de técnicas analíticas en las que la cantidad de analito (A) presente en una muestra es . es muy útil cuando se requiere evaluar la calidad de la leche de manera rápida y fácil. la radiación será polarizada en plano. Magnitud de la rotación Polarímetro: usa luz monocromática y lee en grados angulares (se debe relacionar con la concentración de azúcar). CUESTIONARIO PRINCIPIO DE LA DETERMINACIÓN DE LA LACTOSA POR EL MÉTODO POLARIMÉTRICO FACTORES QUE PUEDEN INFLUIR EN LA DETERMINACIÓN DE LACTOSA POR EL MÉTODO DE POLARIMETRÍA Dependiente de: • La longitud de onda de la luz utilizada. 1970).

agitando constantemente. c. o la aparición de un precipitado. La reacción debe transcurrir hasta completarse. Lo que se hace en la práctica es crear condiciones experimentales tales que en el punto de equivalencia. se produzca un cambio brusco en alguna propiedad de la solución en que ocurre la reacción.peCB mmoles de A La operación recibe el nombre de titulación. de concentración exactamente conocida. de otro modo la titulación se tornaría excesivamente lenta. necesario para reaccionar estequiométricamente con una cantidad exactamente conocida de muestra. y en consecuencia no coincide exactamente con el valor teórico. El momento de la titulación en que se produce esa señal se llama punto final (pf). De lo hasta ahora dicho surgen los siguientes requisitos básicos para un método volumétrico: a. ya sea por aparición de un color. o alguna señal generada por un instrumento que mide constantemente alguna propiedad de la solución. Designemos VB. La reacción debe ser rápida. o sea con el punto de equivalencia. d. la titulación (o peso o absorbancia) deben ser convertidos en (mg de cobre) y posteriormente se recurrirá . el equilibrio debe alcanzarse instantáneamente luego de la adición de cada gota de reactivo. Seguridad acerca de la estequiometría de la reacción. En algunos casos en que no hay otra solución puede recurrirse a reacciones lentas aplicando una titulación por retorno: se agrega un exceso conocido de reactivo. hasta que la reacción a A + b B → Productos se produzca estequiométricamente. Requisitos a reunir por la reacción química No todas las reacciones químicas pueden ser utilizadas para desarrollar un método volumétrico. o generando alguna señal perceptible por medio de un instrumento adecuado (UNAP.calculada a partir del volumen de una solución de reactivo (B).peCB mmoles de B x = (a/b) VB. no deben ocurrir reacciones secundarias. la conversión del analito en producto de reacción debe ser completa. como puede ser un cambio de color. b. FACTORES QUE PUEDEN INFLUIR EN LA DETERMINACIÓN DE LACTOSA POR EL MÉTODO VOLUMÉTRICO El peso del Cu2O sólo es aplicable a muestras relativamente puras. Es evidente que el punto de equivalencia es un valor puramente teórico: para calcularlo deberíamos conocer la cantidad de analito presente. Deben darse las condiciones para producir un punto final. la constante de equilibrio de la reacción debe ser alta. y luego se titula la porción de reactivo que sobró con un segundo reactivo que actúa instantáneamente. o al menos en su proximidad inmediata. o sea conocer con certeza total cuantos mmoles de reactivo reaccionan con cada mmol de analito. o de un precipitado. la velocidad y tiempo de calentamiento y la concentración de azúcares en la muestra Los azúcares difieren en su habilidad para reducir la solución cúprica. es decir. El punto final es un valor exclusivamente experimental. que casualmente es nuestra incógnita.pe al volumen de reactivo necesario para alcanzar ese punto. dependiendo del reactivo álcali. La reducción del cobre y la oxidación de los azúcares no es estequiométrica . Entonces. Disponer de un método para detectar en que punto de la titulación hemos adicionado el volumen de reactivo correspondiente al punto de equivalencia. si se trata de un sólido. La producción de óxido cuproso varía. 2013). La reacción entre analito y reactivo debe ocurrir de acuerdo con una ecuación química bien definida. b. se espera y da las condiciones para que la reacción alcance el equilibrio. y el punto de la titulación en que hemos adicionado el volumen de reactivo necesario para reaccionar estequiométricamente con el analito se llama punto de equivalencia (pe). entonces aplicamos el siguiente razonamiento estequiométrico elemental: b mmoles de B a mmoles de A VB. o sea hasta que hayamos agregado b mmoles de B por cada a mmoles de A. a. desde una bureta se agrega a gotas una solución del reactivo de concentración CB sobre la solución de la muestra. por tanto. Para ello una cantidad de muestra exactamente medida es colocada en un matraz Erlenmeyer y disuelta en agua. existen una serie de requisitos que deben ser cumplidos.

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