Ántrax esporas de detección mediante un ensayo Luminex basado en anticuerpos monoclonales

que reconocen anthrose - que contienen oligosacáridos
La similitud de endosporas antígenos de superficie entre las bacterias de grupo cereus theBacillus
complica el desarrollo de sistemas de detección basados en anticuerpos ántrax selectivos. La
superficie de B. anthracis endosporas expone un tetrasacárido que contiene el anthrose
monosacárido. Los anticuerpos anti-tetrasacárido monoclonales (MAb) y disacáridos MAbs antianthrose-ramnosa fueron producidos y probados por sus especificidades finas en una espora
directo ligado a enzima (ELISA) con esporas inactivadas de un amplio espectro de B..
anthracisstrains y especies afines del Bacillusgenus. Aunque los dos conjuntos de MAbs tenían
diferentes especificidades finas, todos ellos reconocido los probados B. anthracisstrains y mostró
sólo una reactividad cruzada limitada con dos B. cereusstrains. Los MAbs se ensayaron
adicionalmente por su capacidad para ser implementado en un ensayo altamente sensible y
específico basado en perlas Luminex. Este ensayo detecta esporas de diferentes cepas de B.
anthracis y dos de reacción cruzada B. cereusstrains, en correlación con los resultados obtenidos
en esporas ELISA directo. El ensayo Luminex (límite de detección 03 10-04 10 esporas por ml) fue
mucho más sensible que el ELISA sándwich correspondiente. Aunque no es estrictamente
específica para B. anthracisspores, el ensayo Luminex desarrollado representa una herramienta de
detección de primera línea útil para la detección de B. anthracisspores
El ántrax es una enfermedad zoonótica aguda causada por la bacteria Bacillus anthracis
formadoras de esporas. Afecta principalmente herbívoros en muchos países del sur de Europa,
América del Sur, Asia, y África (24). Las endosporas son el agente infectante y muy resistentes al
calor extremo, la sequedad, productos químicos o radiación, lo que garantiza la supervivencia a
largo plazo. Los principales factores de virulencia son una cápsula y dos exotoxinas producidas por
la forma vegetativa de crecimiento. Las principales fuentes de infección de ántrax humano son el
contacto directo o indirecto con animales infectados. Una identificación fiable de B. anthracisis un
reto, debido a la naturaleza monomórfica de la B. cereus group, que comprende B. cereus, B.
anthracis, B. thuringiensis, B. mycoides y (10).
La similitud de los antígenos de la superficie celular de las esporas de las bacterias de este grupo
hace que sea difícil crear sistemas de detección selectivas, fiables, basados en anticuerpos.
Ensayos basados en ADN y fenotipificación tradicional de bacterias son los sistemas de detección
más precisos, pero también son complejos, costosos, o lento. El uso de las esporas de B. anthracis
como arma biológica ha insistido en la necesidad de aprender más acerca de los componentes de
esporas que pueden ser utilizados para las vacunas eficientes y sistemas de detección rápida.
El B. anthracis endospora comprende un compartimiento de núcleo que contiene el genoma y tres
capas de protección llamada corteza, capa, y exosporium (8). La proteína similar a colágeno
Bacillus anthracis de glicoproteína (BCLA) es un componente estructural inmunodominante de la
exosporium que está ampliamente glicosilada con dos carbohidratos O-enlazados, un
tetrasacárido-715 Da y un disacárido 324-Da (6). El tetrasacárido contiene tres residuos de
ramnosa y un terminal de azúcar inusual, 2-O-metil-4- (3-hidroxi-3-methylbutanamido) -4,6didesoxi-D-glucopiranosa, llamado anthrose. Como anthrose no se encontró en esporas de cepas
relacionadas de bacterias, se ha considerado un biomarcador potencial para la detección de ántrax
(6). En este estudio, la detección de B. anthracis spores se logró mediante un ensayo basado en la
tecnología Luminex con anticuerpos monoclonales (MAbs) derivadas de ratones inmunizados con
anthrose - que contiene oligosacáridos sintéticos.

4 placas de microtitulación Immulon (Dynex Technologies Inc. Para ambos métodos de inactivación.ensayo de inmunoabsorción ligado (ELISA) . Desde el ratón sacrificado. Los ratones con inmunoglobulina humana C? 1 segmentos de genes de cadena pesada y ligera C? (16) se inmunizaron con un disacárido-anthrose ramnosa conjugado con hemocianina de lapa californiana (KLH) y formulado en Immun Fácil adyuvante (Qiagen AG. y una suspensión de células de bazo en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) se mezcló con células de mieloma de ratón PAI como una pareja de fusión. el sedimento se mezcla con glicol de polietileno de 1 ml de solución estéril precalentada 1500. La producción de anti-tetrasacárido MAbs se describe en la referencia 21. Tres días antes de la fusión celular. Para la detección de sacárido . Suiza) a 37 ° C durante 1 a 2 días. Las células secretoras de disacárido-IgG específica fueron seleccionados utilizando albúmina de suero-disacárido bovina (BSA) ensayo de inmunoabsorción (ELISA) placas ligados a enzimas recubiertas. La producción de esporas y la inactivación. timidina y suero bovino fetal al 20% y se cultivaron en placas de 96 pocillos. La aprobación para la experimentación animal se ha obtenido de las autoridades responsables. el bazo asépticamente fue eliminado. Entonces. esporas se trataron con 65% Temperatura de for1hatroom isopropanol y posteriormente se lavaron con agua estéril hasta que el sobrenadante aparecía claro. clonaron dos veces mediante dilución limitante. Las cepas de Bacillusspp. Después de 60 s.Materiales y métodos Generación de anticuerpos anti . Para Yersinia pestis (ICM 1/41) y Brucella melitensis (NCTC 10094. y todos los experimentos se llevaron a cabo en estricta conformidad con las Reglas y Regulaciones para la Protección de los Derechos de los Animales establecido por el Bundesamt für Veterinärwesen suizo.The anthrose que contiene hidratos de carbono sintéticos se prepararon como se ha descrito previamente (20. Para eliminar las células vegetativas. biotipo 1). Hombrechtikon. (Tabla 1) se cultivaron en agar triptona soja (Oxoid.disacárido ramnosa MAbs. posteriormente se lavaron con PBS. y nombraron a MTD1 MTD6. Material de la colonia se suspendió en agua estéril.B contando Thoma. después se desechó el sobrenadante. Suiza). VA) se recubrieron a 4 ° C durante la noche con 50 l de un 10 g /?? ml . la esterilidad se verificó por el cultivo. la inactivación se realiza esencialmente como se ha descrito anteriormente. El cultivo y la inactivación del grupo de riesgo 3 bacterias se realizaron en un laboratorio BSL-3. La alimentación de laboratorio convencional y agua potable ilimitada se proporcionaron a los ratones. un ratón recibió una inyección de refuerzo por vía intravenosa con 40? G de conjugado en solución salina con fosfato (PBS). las células se suspendieron en IMDM que contiene hipoxantina. Se identificaron seis líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales-disacárido específico. utilizando 3% de formaldehído. Después de 10 min. Basilea. Todas las manipulaciones con animales se realizaron en condiciones de laboratorio controladas por personal específicamente cualificado en plena conformidad con las normas suizas y europeas.anthrose . Enzyme . Los animales fueron alojados en habitaciones con temperatura controlada (22 ° C? 3 ° C). y se contaron. Las esporas lavadas se almacenan en agua estéril a 4 ° C. las placas de cultivo se mantuvieron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 4 semanas. 23). y las esporas se recogieron por centrifugación a 5000? Gfor 30 min a 4 ° C. Chantilly.. Los ratones recibieron 3 dosis de 40? G conjugado a intervalos de 3 semanas. se añadieron 10 ml de medio de cultivo. y las concentraciones se determinaron usando un chamber.anticuerpos de unión. anthracisspores fueron inactivados mediante la suspensión de esporas en 10 8 1 ml 10% de paraformaldehído durante 1 h. 22. aminopterina. Bazo y células de mieloma en una proporción de 1: 1 fueron centrifugadas.

Austin. Se añadieron y se incubaron durante 1 h MAbs de detección biotinilado (5? G / ml). Las esporas fueron bloqueadas con solución de bloqueo que contiene 100 mg / albúmina de suero bovino libre de ácidos grasos ml en PBS. MO). Para la detección de anticuerpos de unión de esporas.05% de Tween 20. los pocillos se incubaron con diluciones de esporas en PBS. las placas de microtitulación Maxisorp (Nunc / Thermo Fisher Scientific. St. 0. West Grove. montados con prolongar Antifade oro reactivo (Invitrogen AG. Suspensiones de esporas inactivadas se mezclaron con 2 volúmenes de una solución que contiene 4% de paraformaldehído. La inmunotinción se realizó incubando los pocillos con 25? L de una dilución apropiada MAb en solución de bloqueo en una cámara húmeda para la temperatura ambiente 1 sombrero.. las placas se incubaron con anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina de cabra anti-IgG de ratón (cadena beta-específico) (Sigma. St. 0. La densidad óptica (OD) del producto de reacción se registró después de un tiempo apropiado a 405 nm utilizando un lector de microplacas (Salida del sol [Tecan Trading AG.14% Na 2CO3.azinobis (ácido)] sustrato 3-ethylbenzthiazolinesulfonic. Después de ser lavado. placas de microtitulación se recubrieron con / ml solución 100? Lofa 10? G de anticuerpos monoclonales no marcados en PBS. Suiza). y se cubren con un cubreobjetos. Después de ser bloqueada con 3% de BSA en PBS y se lavaron. Los pocillos se incubaron con mAb a una concentración de 1? G / ml durante 1 h.2. Los pocillos se bloquearon a continuación con 5% de leche en polvo en PBS durante 1 hatroom temperatura seguido por tres lavados con PBS que contenía 0. La unión del anticuerpo se evaluó mediante microscopía de fluorescencia Ensayo Luminex.05% de Tween 20 y 0. pH 7.6]) y se incubó a temperatura ambiente. los pocillos se lavaron cinco veces. Basilea. se diluyó en solución de bloqueo. Ensayos de inmunofluorescencia (IFA). Gotitas de 40? L de la suspensión celular se añadieron a cada pocillo de un portaobjetos de microscopio de diagnóstico (Flow Laboratories. Louis. Gaithersburg. Wohlen. Baar. Después de ser lavado.5% de leche en polvo para 2 h a temperatura ambiente. Después de cinco lavados con solución de bloqueo. La biotinilación se realizó usando el sulfo-NHS-biotina kit de marcaje de EZ-Link (Pierce / Thermo Fisher Scientific Inc. Rockford. En la captura de antígeno ELISA. TX) según las instrucciones del fabricante y se diluyó en tampón de bloqueo (1% BSA en PBS). conjugado de polímero-estreptavidina peroxidasa (1? G / ml) se añadió y se reveló con el sustrato ABTS (Sigma.de solución de sacárido-BSA conjugado en PBS. las placas se incubaron con conjugado de peroxidasa IgG de cabra anti-ratón de anticuerpos específicos (-cadenas-?) (KPL Inc. En la reacción de acoplamiento. Después de lavado repetido. MO) for1hatroom temperatura y luego se lavan. Para el ensayo.05% de Tween 20. Por último. se utilizaron perlas .3% NaHCO3. Louis. MA) según las instrucciones del fabricante.6). Las placas se incubaron a continuación con diluciones en serie de anticuerpos monoclonales en PBS que contenía 0. Los pocillos se bloquearon entonces con 3% de BSA en PBS y se lavaron con PBS que contenía 0.05 M de tampón carbonato-bicarbonato (pH 9.02% de MgCl 2 [pH 9. Suiza]). Suiza) se recubrieron a 4 ° C durante la noche con 100? L de una suspensión de esporas en 0. MTA1 anticuerpo (21) se acopló a microesferas MagPlex (Luminex Corporation. Suiza) y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Se añadió sustrato de fosfatasa (1 mg / ml de fosfato de p-nitrofenil) en tampón (0. MD) durante 1 h y finalmente desarrollan con el ABTS [2.2 . PA). 25? Lof5-? G / ml de tinte conjugado indocarbocianina afinidad puro F (ab?) 2 fragmento cabra anti-ratón IgG anticuerpos de cadena pesada (Jackson ImmunoResearch Laboratories. se aplicó 6? G de anticuerpo a 5? 10 5 perlas. se añadió a los pocillos y se incubaron for1hatroom temperatura.

Los análisis de los perfiles de subclases de IgG de los anticuerpos monoclonales de disacáridoespecífica inducida mostraron un predominio del isotipo IgG1 de ratón (). Después de ser lavado con PBS que contenía 0. eran reactivos con los anticuerpos monoclonales. Qiagen).reactividad de los MAbs-disacárido específico con tetrasacárido endógena expresadas por B. lisados anthracisendospore (no mostrados). Después del lavado. Cross . probados anthracisstrains pero también mostraron reactividad cruzada con theb. anthracisstrain Ba 4 se estableció mediante el ensayo de inmunofluorescencia indirecta (Fig. RESULTADOS Generación y caracterización de anticuerpos monoclonales anti-disacárido anthrose-ramnosa. La unión de los MAb anti-disacárido recién generados.05% de Tween 20. y los resultados representativos con la MTA1 MAb anti-tetrasacárido y el anti-MAb MTD6 disacárido se muestran (Tabla 1) . Los datos se informan como intensidades medias de fluorescencia. MAbs MTD1 y MTD3 mostraron afinidades más bajas para los antígenos sintéticos que los otros MAbs y por lo tanto no fueron seleccionados para el desarrollo adicional de ensayo. ambos conjuntos de MAbs reconocen las esporas de B. El ensayo se analizó en un instrumento BioPlex 200 (Bio-Rad Laboratories. Las esporas de ninguno de los otros Bacillusspp. Independientemente de sus diferentes especificidades finas. El fracaso de los anticuerpos monoclonales de ratones inmunizados tetrasacárido para unirse a anthrose (Fig.de 2000 en un volumen de 50? L por pocillo de microtitulación. CA) mediante el recuento de 100 cuentas por región. sólo MTD6 era del isotipo IgG2b (). cereusstrains Bc1 y Ac4. 1B) indicó que los azúcares de ramnosa unidas a anthrose eran esenciales para el reconocimiento. 1A). Hercules. 50? L de un ficoeritrina estreptavidina-R repetida (ProZyme Inc. y la placa se colocaron en el agitador durante 1 min. se analizó en un ELISA directo usando placas recubiertas con una suspensión de esporas. anthrose . Disacárido químicamente sintetizado (Fig. anticuerpos monoclonales generados contra el mismo antígeno exhiben especificidades finas similares. Las perlas se resuspendieron en 125? L de tampón de bloqueo. seis anticuerpos monoclonales anti-disacárido (nombre MTD1 a MTD6) se generaron que reaccionó con un conjugado sintético disacárido-BSA en ELISA (Fig. Se añadieron cincuenta microlitros de muestras bacterianas mixtas así a cada uno que contiene perlas y se incubaron for2honashaker a 37 ° C. Después de repetidas inmunizaciones de ratones con el conjugado disacárido entregado con un adyuvante a base de CpG (Immun Fácil. así como de los MAbs anti-tetrasacárido a esporas de un amplio espectro de diferentes Bacillusspp. 1B).y tetrasacáridos específica diferían. Mientras que los patrones de unión de los anticuerpos monoclonales disaccharide. 1A) y para el disacárido (Fig.MAbs específicos de disacáridos ramnosa se generaron básicamente de la misma manera que el MAb-tetrasacárido específico descrito anteriormente MTA1 a MTA3 (20. Las placas se incubaron durante 30 min como se describió anteriormente y se lavó.21). 1E) se une covalentemente a la hemocianina de lapa californiana (KLH) proteína portadora mediante aminación reductora. 50? L de anticuerpo de detección biotinilado MTD6 diluido en tampón de bloqueo se añadieron a cada pocillo y se incubaron durante 1 h. 2) y con immunoblottedB.. Todos los MAbs probados mostraron patrones de reactividad uniformes. CA) se añadió una solución. Hayward. 1C) y el monosacárido anthrose (Fig. como se describió anteriormente. lo que demuestra que los restos de ramnosa no eran elementos estructurales cruciales de sus epítopos. Todos los MAbs anti-disacárido mostró reactividad cruzada con el tetrasacárido (Fig.

los láseres excitan los colorantes internos que identifican cada partícula de perla y también cualquier colorante informador capturado durante el ensayo. 3). Desde el monosacárido anthrose no se encontró en las esporas de la cepa B. anthracis endospores nativas en el análisis de inmunofluorescencia confirma el análisis estructural del tetrasacárido y su expresión en la superficie endospora (21). Después de la primera síntesis química de la tetrasacárido que contiene anthrose (23). kurstakistrain (6). Cada subconjunto de talón se puede recubrir con un reactivo específico para un analito particular. cereus. anthracis endospores se ha visto obstaculizada por la presencia de antígenos de reacción cruzada en esporas estrechamente relacionadas. 17. 3). cereusstrains (7). se ha considerado un potencial antígeno diana para la detección de B. Para las cepas de B. Aquí. La sensibilidad del ensayo basado en perlas desarrollado se determinó mediante el análisis de una dilución en serie de las esporas de B. donde al menos 5? 10 3 esporas por 50? L se requiere volumen de la muestra para una detección precisa. anthracis. BC3. se han reportado varios enfoques sintéticos de la tetrasacárido o secuencias correspondientes (1. La unión covalente del tetrasacárido sintético con una proteína portadora produjo un conjugado de proteína-carbohidrato que fue inmunogénica en ratones (21). el ensayo fue capaz de detectar de 50 a 500 esporas en un volumen de muestra de 50? L. ya que todos los anticuerpos monoclonales mostraron patrones de reactividad similares en esporas directo ELISA. thuringiensis. El límite de detección (LOD) se define por la concentración de esporas produciendo una señal de dos veces tan alta como la intensidad media de fluorescencia de los blanco (líneas de trazos en la Fig. El ensayo Luminex detecta los diferentes B. El ensayo Luminex desarrollado para la detección de esporas de ántrax se evaluó en muestras mixtas que combinan tres especies de bacterias inactivadas. cereus T y un subsp B. y el anti-MAb biotinilado disacárido MTD6 se utilizó como anticuerpo de detección. MR-4 y en los . anthracisspores. las estructuras similares a anthrose se encontraron en el polisacárido capsular de Shewanellaspp. anthracis y B. las esporas de ántrax fueron detectados con precisión. se utilizaron los anticuerpos monoclonales anti-carbohidrato para el desarrollo de un ensayo de sándwich de Luminex. 15.Desarrollo de un ensayo de Luminex para la detección rápida de esporas de ántrax. DISCUSIÓN Los anticuerpos pueden servir de base para inmunoensayos específicos y sensibles para el diagnóstico de enfermedades infecciosas (2. Además. Proyección de MAbs antitetrasacárido para reactividad cruzada con lisados de esporas inmunotransferencia de paneles de B. 4).. Dependiendo de la cepa de ántrax probado. anthracisstrains probados y en algunas cepas de B.19). La reactividad cruzada de anticuerpos monoclonales antitetrasaccharide con B. En estas muestras complejas. y BC5. 3). Dentro del analizador de BioPlex. La sensibilidad del ensayo Luminex era de 10 a 100 veces mayor que la de una captura de antígeno correspondiente ELISA (Fig. El desarrollo de ensayos inmunoquímicos específicos para B. el MAb anti-MTA1 tetrasacárido se acopló a perlas magnéticas y se utiliza como anticuerpo de captura. 4. en correlación con los resultados obtenidos en esporas directa ELISA (Tabla 1). en particular. las señales de fluorescencia de fondo eran débiles a muy altas concentraciones de esporas (? 1? 10 6 esporas / ml) y estaban ausentes dentro de una etapa de registro inferior de esporas (no mostrado). cereusstrains demostró la presencia de anthrose en ALLB. 9. Un análisis genómico reciente demostró la presencia del operón biosintético anthrose INB. lo que permite la captura y detección de este analito de una muestra compleja. cereus (20). cereus BC1 y FC4. La tecnología Luminex se basa en cuentas fluorescentes que están codificados por color. anthracisstrains y las cepas de B. en B. Para desarrollar un ensayo altamente sensible y específico para la detección de esporas de ántrax de muestras complejas. y no se observaron reacciones cruzadas (Fig. Otras combinaciones de anticuerpos no fueron adaptados para el ensayo Luminex. cereus Bc2.

y actualmente estamos evaluando la detección simultánea de diferentes bacterias biothreat en muestras mixtas. cepas correlacionados con los resultados obtenidos en el ELISA directo de esporas. como también se observó previamente (14). Por lo tanto. El uso del ensayo para detectar esporas individuales de una amplia gama de Bacillusspp. A pesar de que los MAbs generados contra las estructuras que contienen anthrose no eran estrictamente específica para B. Kuehn y colegas (14) generan un anticuerpo policlonal contra el tetrasacárido que contiene anthrose-que no mostró reactividad cruzada con otherBacillusstrains en ELISA de captura. que aún puede representar una base para el desarrollo de plataformas de cribado FIRSTLINE útiles. 14). Además. con la detección de marzo 10 hasta 04 10 esporas por ml.. Además. La sensibilidad de la detección de esporas por el ensayo Luminex se incrementó sustancialmente en comparación con la captura correspondiente ELISA. Ambos tipos de MAbs reconocen las cepas de B. Contención de Bioseguridad requiere una inactivación de sondas que contienen esporas de B. La inactivación por tratamiento paraformaldehído no destruct los epítopos reconocidos por los anticuerpos específicos de carbohidrato. el epítopo diana podría ser mejor accesible para los MAbs anti-disacárido. ya que se demostró que los métodos de inactivación pueden afectar a la sensibilidad de los ensayos basados en anticuerpos acidand nucleico para la detección de B. cereusstrains (20). Por lo tanto. MAbs anti-tetrasacárido (21) y MAbs anti-disacárido anthrose-ramnosa descritos en este estudio se ensayaron para determinar sus especificidades en un ELISA directo utilizando placas recubiertas con esporas de B. el azúcar también se conservó sobre las esporas irradiadas. anthracis probadas pero también mostraron reactividad cruzada con dos cepas de B. Curiosamente. La plataforma también puede usarse en ensayos multiplex. MAbs MTA1 y MTD6 se ensayaron adicionalmente como componentes de un ensayo de inmunodetección muy sensible basado en la plataforma de tecnología Luminex. En contraste. el monosacárido anthrose sintético incluía los motivos estructurales ya esenciales necesarios para la unión de los MAb anti-disacárido. 12. Actualmente los sistemas de detección inmunológicos disponibles ofrecen límites de detección superiores (11. cereus. anthracis. estamos probando los anticuerpos monoclonales anti-hidratos de carbono generados con muestras de campo de diferentes países donde el ántrax es endémica de incorporar una diversidad genética más amplia de cepas dentro theb. demostrando la idoneidad de la plataforma beadbased para capturar y detectar partículas de esporas. compuesto de los cuatro residuos de azúcar del tetrasacárido. Conservación de antígeno no es evidente por sí mismo.flagelos de Pseudomonas syringae (13). probablemente. los MAbs antitetrasacárido reconocen epítopos más complejos que. grupo cereus . lo que confirma la reactividad cruzada observada previamente con lisados de esporas inmunotransferencia de las mismas B. anthracis cepas y especies afines del género Bacillus. anthracis endosporas (5). anthracis.