Rol del Grupo B antígeno de Streptococcus agalactiae: peptidoglicano-Anclado

polisacárido involucrados en la biogénesis de la pared celular
Abstract
Streptococcus agalactiae (grupo B streptococcus, GBS) es una importante causa de
infecciones en neonatos y un emergente patógeno en adultos. El carbohidrato
Lancefiel grupo B (GBC) es un antígeno peptidoglicano-anclado que define esta
especie como un Streptococcus grupo B. Aquí, inactivamos el gen gbcO (gen dentro
del GBC) que codifica un putativo UDP-N-acetilglucosamina-1-fosfato: lípido fosfato
transferasa pensado para catalizar la primera etapa de la síntesis de GBC. En efecto,
el gbcO mutante era incapaz de sintetizar el polímero GBC, y se observó un
importante defecto de crecimiento in vitro. Estudio de microscopía electrónica de la
cepa de GBC-carente de S. agalactiae, reveló una serie de anomalías relacionadas
con el crecimiento: colocación aleatoria de los septos, defectuosos proceso de división
y separación celular, y aberrante morfología celular. Además, el etiquetado
vancomicina y análisis de la estructura de peptidoglicano demostraron que, en
ausencia de GBC, las células fracasan en iniciar la normal síntesis de PG y no pueden
completar la polimerización del sáculo de mureína. Finalmente, la localización celular
de la PG hidrolasa PCSB, que tiene un papel crítico en la división de celular de los
streptococos, se alteró en el gbcO mutante. En conjunto, estos hallazgos muestran
que GBC es un componente esencial para la pared celular de S. agalactiae cuya
función es reminiscente de la de los ácidos teicoicos de una pared convencional
encontrados en Staphylococcus aureus o Bacilus subtilis. Además, nuestros hallazgos
aumentan la posibilidad que GBC-like moléculas desempeñen un papel importante en
el crecimiento de la mayoría, sino todos , los beta-hemolyticstreptococci.
Introducción
El Streptococcus agalactiae = patógeno que causa la mastitis veterinaria en el
ganado y las infecciones neonatales graves en humanos
Si bien sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en recién
nacidos, S.agalactiae es un comensal humano que coloniza el recto y la mucosa
vaginal de 15 a 30% de las mujeres [3,5]. Rebecca Lancefield definió originalmente
dos antígenos de carbohidratos de la pared celular en S.agalactiae: el grupo B
antígeno específico (GBC), común a todas las cepas y el antígeno capsular que define
actualmente 10 serotipos diferentes (Ia, Ib, II a IX) [6] . La compleja estructura
multiantenaria de GBC en base a la disposición de cuatro oligosacáridos diferentes
(ramnosa, galactosa, N-acetilglucosamina, y glucitol) (Figura 1A) se resolvió en una
serie de estudios seminales.[7,8]. Más recientemente , el polisacárido capsular y el
hidrato de carbono del grupo B mostraron ser unida covalentemente al peptidoglicano
(PG) en sitios separados, es decir, N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico
respectivamente [9]. Sobre la base de una predicción inicial realizado a partir del
análisis del genoma [10], una completa reconstrucción en silico de la ruta biosintética
de GBC fue propuesta recientemente por Sutcliffe y sus colaboradores [10,11]. A
pesar de la importancia de GBC en la microbiología médica, el papel biológico de este

respectivamente. El mutante Delta gbcO muestra la morfología celular aberrante y los principales defectos de la división celular debido a i) una distribución anormal de los sitios de síntesis de PG activo. En conclusión. nuestros resultados demuestran que GBC juega un papel esencial en la morfología estreptocócica y el crecimiento bacteriano y sugieren fuertemente que este ramnosa rica en polisacárido aniónico PG-anclado debe ser considerado como un homólogo funcional de la WTA Results/Discussion GbcO se requiere para la biosíntesis de la pared celular anclado-gen GBC antígeno El GEN gbcO del S.agalactiae NEM316 de tipo salvaje (WT) cepa. se presenta el análisis detallado de un mutante de deleción gbcO de S. se inactivó para investigar su papel en la biosíntesis de GBC (Figura 1B). el análisis del genoma de S. aureus. y iii) una localización inadecuada de PCSB.agalactiae.agalactiae no reveló la presencia de genes ortólogos tagABDEF o tarABFKL implicados en la biosíntesis de pAdoP-WTA en B.polisacárido de superficie es desconocida y la base genética de su biosíntesis no se abordó experimentalmente. hemos identificado un gen TagO / TarO ortólogos en todas las cepas de GBS secuenciados (gbs0136 en el NEM316 cepa) que podría codificar una enzima que cataliza la transferencia de Nacetilglucosamina-1-fosfato a bactoprenil fosfato. Como todos los intentos de construir un marco de supresión mutante de gbcO no tuvieron éxito.13].18]. En las bacterias Gram-positivas. o ribitol-fosfato en S. Sin embargo. agalactiae como la primera cepa carente-GBC de S. WTA están hechas de cadenas lineales de fosfato de glicerol en B. ii) una marcada disminución de reticulación peptidoglicano. hemos suprimido un reemplazo alélico . que se unen a la C-6 de los residuos MurNAc de PG a través de una unidad de enlace de azúcar que contiene la edad [16].17.agalactiae [9. Aquí. Las dos clases principales de polímeros aniónicos son los ácidos lipoteicoicos (LTA) asociados a la membrana plasmática y los ácidos teicoicos de la pared (WTA) covalentemente anclados al PG. que se han estudiado ampliamente en Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus.15]. Consistentemente. Presencia de Gen que codifica un ortólogo de Taro en GBS genoma ( gbcO) sugiere que un glicoconjugado de la pared celular ligado se sintetiza en GBS hipótesis de una relación entre gbcO y la biosíntesis del antígeno del grupo B . en el primer paso la ruta biosintética de la WTA. Curiosamente. subtilis o de S. no hay ningún informe de la presencia de tipo similar de poli fosfato de alditol WTA (pAdo P-WTA) en la pared celular de los estreptococos incluyendo S. la envoltura celular contiene polímeros aniónicos basados en carbohidratos juegan papel importante en las interacciones extracelulares y como andamios para las enzimas necesarias en el metabolismo de la pared celular [12. se informó que es esencial para la correcta división celular y la morfología [14. subtilis. un importante hidrolasa PG estreptocócica . aureus. WTA. que codifica un ortólogo de TagO / tarO (Figura S1).

Para demostrar que la molécula inmunoreactivada se asoció a PG. Esta serie de experimentos proporcionan evidencias inmunológicas de que GBC estaba ausente de la superficie de la mutante Delta gbcO. y las cepas complementarias. y la cepa complementaria con el plásmido fue probada en un anticuerpo policlonal antiGBC de conejo [22]. y que el antisuero GBC específicamente reconoce un material no proteínico asociado a la PG. Como se ha mencionado anteriormente (véase la Figura 1A). En la muestra Delta gbcO. Delta gbcO. también se observó un disminución fuerte (85%) en el contenido de fosfato. Las micrografías electrónicas de inmunoetiquetado muestrar la presencia de GBC (puntos negros) en la periferia y septos de células de WT y complementa las cepas. S. se trataron extractos de mutanolisina con pronasa. al confirmar la ausencia de GBC en el mutante Delta gbcO por una alternativa enfoque. se determinó que la ausencia de GBC en la pared celular del Delta gbcO aumentó la cantidad relativa de peptidoglicano (medido como un aumento en ácido murámico) en la muestra analizada.agalactiae NEM316 WT. se transfirieron en nitrocelulosa. mientras que no se detectaron partículas de oro en las células mutantes gbcO. Como la misma masa se analizó para las tres cepas. También se midió en las mismas muestras del contenido ácido murámico procedentes de la cadena de glicano del PG. Gracias a la utilización de este sistema de selección positiva. restaurada en la cepa complementada. El papel esencial de GbcO en la síntesis de GBC fue confirmada por experimentos de microscopía electrónica de transmisión de inmunooro (TEM) (Figura 2B).con un promotor y terminador inferior marcador kanamicina [20. agalactiae. mostrando que GBC es una fuente de fosfato importante en este compartimento celular. Para validar el papel de gbcO en la biosíntesis de GBC. y probaron con el suero antiGBC. la cepa NEM2772 (Delta gbcO) que lleva un gen gbcO inactivado se aisló y una cepa complementadaria (Delta gbcOpTCV omega gbcO) se construyó mediante la reintroducción de un gen funcional gbcO clonado en plásmido de número de copia bajo. Por lo tanto. Como se muestra en la Figura 2C. se realizó un análisis cuantitativo de ramnosa y fosfato presente en las fracciones de pared celular insolubles (asociado-PG) de NEM316 WT.21]. Este resultado demuestra que gbcO restaura la exposición de GBC en la superficie de la bacteriana La cuantificación de los datos de inmunofluorescencia de citometría de flujo de uso sencillo immunoetiquetado con el GBC antisuero indica diferencias significativas entre la naturaleza y tipo complementa las cepas (datos no presentados). el mutante Delta gbcO isogénica. El análisis de Microscopía de inmunofluorescencia (IFM) utilizando Germen de Trigo Agglutinina etiqueta en el conjunto de las bacterias y el antisuero específico GBC reveló la presencia de GBC en la superficie de la cepa WT y su ausencia en la Delta gbcO mutante (Figura 2A). la molécula GBC tiene un alto contenido de fosfato y ramnosa y es probable que la mayor fuente de estos dos compuestos en sobre S. la señal de GBC aparece como una sola banda en WT y extractos Delta gbcOpTCV omega gbcO que en la muestra Delta gbcO estaba ausente. se separó en SDS-PAGE. El resultado más sorprendente de estos análisis fue la desaparición de ramnosa en la pared celular del Delta gbcO mientras que el nivel WT fue restaurado en la cepa complementaria (Figura 2D). como se esperaba para el antígeno de superficie del GBC [9] y que el suero anti-GBC no reacciona de forma cruzada con las proteínas. El aumento del ácido murámico en NEM2772 muestra (Delta gbcO) mostró . Este defecto se complementó en el mutante Delta gbcO transformada con el plásmido pTCV omega gbcO.

aureus [15]. un valor en buen acuerdo con el análisis anterior [17]. . Figura 1: Estructura del GBC y propuesto esquema de síntesis GBC. un componente de la PG. estos datos inmunológicos y bioquímicos sugieren fuertemente que GbcO cataliza la primera etapa enzimática de la síntesis de GBC. Curiosamente. estos valores están en buen acuerdo con la cantidad de WTA presente en la pared celular de B.que GBC es un importante constituyente de la pared celular de S. (A) El multiantenarios GBC está demostrado vinculado a una fracción de N-acetilmurámico (NAM). (B) La figura representa los primeros pasos de la síntesis GBC donde GbcO es propuesto para catalizar la transferencia de UDPGlcNAc a un portador de fosfato lípidos. subtilis o de S. Tomados en conjunto. agalactiae que representa más de 60% del peso seco de PG en la pared celular WT.

GbcO es un UDP-GlcNAC:Transferasa de fosfato de lípidos y un homólogo funcional de TarO en S.GlcNAC: transferasa de fosfato de lípidos. El tiempo de generación estimado fue de 48 minutos para la cepa de WT v/s 138 minutos para la mutación ᐃgbcO. agalactiae. aureus. Nuestra hipótesis era que la tunicamicina debía inhibir el crecimiento de las cepas que expresan GbcO pero no la cepa defefctuosa para GbcO. Una examinación microscópica del crecimiento de células de NEM316 WT en presencia de tunicamicina mostró cambios morfológicos similares a los resultantes de la deleción de gbcO (Figura S2). realizamos la extracción y el analisis del WTA en tres cepas de estreptococos siguiendo los protocolos establecidos. La tunicamicina fue recientemente usada para inhibir la sintesis de WTA en S.aureus eran corregidos por la expresión del gen gbcO de estreptococos. un fenotipo que fue corregido en las cepas complementarias (Figura 4A). Esta observación mostró que GBC y WTA. Para probar que la complementación heterologa del ᐃtarO era completamente funcional. el primer paso de su síntesis involucra la misma reacción enzimática. Este experimento complementario reveló que la morfología y los defectos en la tinción de GRAM en la mutación ᐃtarO de S. un inhibidor específico de UDP-GlcNAc para transferasas carriers de fosfato de lípidos. (Figura 4A). estructural y genéticamente no están relacionados. Consistentemente observamos que la tasa de crecimiento relativa de NEM316 WT y las cepas complementarias de ᐃgbcO disminuyen por sobre el 70% mientras que la mutación ᐃgbcO permanecía inalterada en el rango de concentraciones de antibiótico probadas (Figura 3B). aureus y el impacto de la droga en la tasa de crecimiento fue en el mismo orden de magnitud que el observado para S. están directa o indirectamente involucradas en la retención del complejo cristal violeta-yodado en el citoplasma bacterial y sugiere que la presencia de un glicopolimero cargado en la pared celular . La tasa de crecimiento máxima fue medida en cultivos de TH en presencia de concentraciones cada vez mayores de tunicamicina. aureus fue anormal. La secuencia homóloga entre las proteínas del estreptococo GbcO y el estreptococo TarO sugiere que ellas catalizan la misma reacción enzimática (Figura S1). Estos resultados son totalmente compatibles con el GbcO actuando como un UDP-GlcNAC: transferasa de fosfato de lípidos involucrada en la primera etapa de la síntesis de GBC. Estos resultados demuestran que. a pesar de que los polimeros anionicos de la pared celular GBC y “poliribitol WTA” . la tinción GRAM del ᐃgbcO en S. Para determinar si GbcO realmente codifica a UDP. Los resultados mostrados en la figura 4B inequívocamente demuestran que la producción de WTA en RN422 WT y en ᐃtarOTCV(omega)gbcO se complementan pero no en la mutación de RN4220ᐃtarO. aureus. El hecho que el GbcO pueda funcionalmente complementar a TarO provee apoyo adicional para la hipótesis que GbcO es un UDP-GlNAC : transferasa de fosfato de lípidos. Para comprobar esta hipótesis. se introdujo el plásmido complementario pTCV(omega)gbcO en la mutación RN4220ᐃtarO en S. agalactiae como la ᐃtarO en S. Sorprendentemente. medimos el crecimiento de las tres cepas en presencia de tunicamicina. La mutación gbcO de GBS tiene una constante de velocidad de crecimiento exponencial lento en el cultivo de TH en comparación con NEM316 WT (Figura 3A). mientras que el de las copas complementarias fue restablecido al valor de WT.

Delta gbcO mutantes y complementadas (Delta gbcO pTCV omega gbcO) cepas. Figura 2. (B) la microscopía inmunoelectrónica (IEM) de NEM316 WT. Las vistas representativos muestran el antígeno GBC expuesta en la superficie de NEM316 WT y complementadas (Delta gbcOpTCV omega gbcO) cepas. (A) IFM de bacterias recogidas en fase estacionaria y etiquetados con suero anti-GBC y Aglutinina de germen de trigo de lectina para detectar GBC (rojo) o PG (verde). se transfirieron sobre nitrocelulosa y . (C) La inmunodetección de GBC en extractos de pared celular mutanolisina obtenidos a partir de cultivos cosechados en la fase estacionaria. GbcO se requiere para la síntesis de GBC. marcado con suero anti-GBC y revelado con partículas coloidales de oro (puntos negros). Los puntos negros son claramente visibles en la periferia y los tabiques de las células de las cepas WT y complementados. Extractos de pared celular se trataron con pronasa. La localización subcelular de GBC se analizó utilizando IEM sobre delgada secciones (menor a 100 nm) de células congeladas. pero no en la superficie del mutante Delta gbcO. respectivamente. separados en SDS-PAGE.de una bacteria GRAM-positiva es un mejor determinante del procedimiento de tinción de GRAM que el espesor del peptidoglicano. no etiquetado puede ser detectado con la cepa Delta gbcO.

aunque su composición no fue formalmente establecida. Delta gbcO (barras de color gris claro). Esta observación indica que el proceso de separación celular del S. no se detectó en la pared celular de la cepa Delta gbcO. Esta estructura de pared celular. el proceso de “membranización” (?) fue incompleto y las celular fueron pobremente individualizadas explicando el anormal modo de crecimiento observado en los experimentos en lapsus de tiempo. Para cada compuesto la GC-MS resultado del análisis se presenta como un porcentaje del valor de WT. Así parece que.07 nm) que no fue observada en las células ᐃgbcO (ver flechas en figura 6C). el azúcar principal GBC. Como control de carga. Como era esperado. mientras que las cepas de WT forman cadenas individuales cortas (Ver Video S1 para NEM316 WT y video S2 para información anexa de ᐃgbcO). Además. Para confirmar esta observación.03+/. de dos experimentos independientes. 6. como se muestra en L. las cepas de mutaciones ᐃgbcO tienden a flocular rapidamente (Figura 5A) y observaciones de microscopía de contraste de fases revelaron la presencia de agregados celulares largos de pequeñas cadenas tipicas de ovococci (Figura 5B). fue nombrada “pellicle” en Lactococus lactis y. En este experimento. Ramnosa.E. de la cual se desconoce la función. 6B y Figura S3). la señal asociadaGBC apareció como un única banda que era indetectable en los extractos de pared celular de Delta gbcO. Esta estructura no debe ser confundida con la capsula de polisacaridos de la S. el agotamiento de un . Como en muchos estreptococos. Una examinación exhaustiva de los racimos celulares de ᐃgbcO (Figura 5B) sugiere que cada uno es originado de una unica cadena.la membrana se incubó con suero anti-GBC. fosfato. extractos de la pared celular antes del tratamiento pronasa se probaron con la lectina biotinilada Malii. Las barras de error representan Más o menos S. S3).1. En antiguas culturas. (D) Análisis de ácido murámico. La célula y la morfología de cadena de WT. patrones no regulares de división pueden ser observados por la mutación ᐃgbcO: las celulas eran heterogeneas en tamaño y forma y la ubicación de la membrana parecía ocurrir aleatoriamente (Figura 6A. seguimos el crecimiento de las celulas mutagenas de ᐃgbcO en experimentos por lapsus de tiempo bajo la luz del microscopio. de la mutación y de las cepas complementarias fueron entonces examinados por microscopía de escaner electronico (SEM) y microscopía de transmisión electronica (TEM).agalactiae que no puede ser detectada por el procedimiento convencional de tinción de metales pesados usado aquí. en las cepas mutantes. 6B. y el contenido de ramnosa de la pared celular de WT (barras negras). agalactiae fue fuertemente alterando en la ausencia de GBC. ubicación de membranas y separación celular se ven afectadas en la mutación de GBC agotado. con membranas formado en sucesivos planos pararelos perpendiculares al eje de la cadena (Ver Figura 6A. WT y las cepas complementarias muestran una zona de densidad electrónica periferica (principal grosor. y complementarias (barras grises oscuros) de las cepas recolectadas en la fase estacionaria (véase el texto S1 en la información de apoyo). presenta correlación con la sintesis de un polisacarido de superficie. el NEM316 WT y las cepas complementarias muestran un tamaño regular y fueron montadas en una tipica cadena de ovococci. En contraste. La morfología celular. Este experimento reveló que los racimos de células mutagenicas de ᐃgbcO surgen del crecimiento de una cadena que no se quiebra. lactis.

agalactiae permite la desaparición del pellicle. un inhibidor general de UDP-GlcNAc: actividad transferasa portadora de fosfato lípidos. La tunicamicina. Las densidades ópticas se registraron a 600 nm en un aparato de Tecan M200 con 5 segundos de agitación antes de ser medidas. Finalmente. . es decir. DgbcO mutante (círculos) y DgbcOpTCVΩgbcO (cuadrados vacíos). Las barras de error representan el 6 S. por triplicado de experimentos. como fue observado con los estreptococos. (A) Curvas de crecimiento de cepas NEM316 WT (cuadrados sólidos). lo que sugiere que GbcO realiza esta actividad. GBS WT y las cepas complementarias a ᐃgbcO exhiben anillos ecuatoriales (EqR).polisacarido asociado a una pared celular en S.E. Esta estructura nunca fue observada en la mutación ᐃgbcO sugiriendo que la estructura de peptidoglicano puede ser alterada en ausencia de GBC. una pared celular consecuencia de una asociación con una subyacente invaginación de la membrana (Ver triangulos en Figura 4C) donde la división celular (Proteinas Fts) y los mecanismos de síntesis de peptidoglicano (proteinas de unión a penicilina) se ensamblan para preparar el montaje de una pared nueva. Disminución de la tasa de crecimiento y la falta de sensibilidad a tunicamicina (antibiotico) de DgbcO mutante. inhibe el crecimiento de las cepas WT y complementados pero no el de DgbcO mutante. Figura 3. Los experimentos se realizaron en triplicado y los resultados se reportan como un porcentaje de la tasa de crecimiento en ausencia de tunicamicina. DgbcO (círculos negros) y DgbcOpTCVVgbcO (cuadrados vacíos). Los cultivos se realizaron en medio TH sin antibióticos en 37°C en 96 placas por triplicado. (B) Curva del efecto de diversas concentraciones de tunicamicina sobre la tasa de crecimiento de cepas WT (cuadrados sólidos). Los valores promedio del experimento están presentados.

aureus es visualizado con el protocolo de tinción azul-plata alcyan.Figura 4: GbcO complementa funcionalmente TarO de S. agalactiae. (A) Cepas de S. en ambas especies. . El gel muestra la producción de WTA en RN4220WT (primer carril). la tinción de Gram y los fenotipos morfológicos se restauran mediante la introducción del plásmido a pTCVVgbcO que lleva un gen gbcO funcional de S. agalactiae DgbcO o de S. aureus TarO (segundo carril) y la restauración de la síntesis WTA cuando la deficiencia de TarO es complementada en trans con el gen gbcO estreptocócico (tercer carril). (B) El análisis PAGE de WTA extraída de S. La punta de la flecha indica el frente de migracion de bromofenol azul. la ausencia de WTA en la cepa de S. aureus DtarO no toman la tinción de Gram. aureus.

floculación y agregación de fenotipos de DgbcO mutante. (B) vistas de contraste de fase que ilustran el cambio morfológico de pequeñas cadenas individuales a grandes grupos de bacterias propias de DgbcO mutante (barra de escala. 5 mm). (A) cultivos de una noche muestran la no floculación NEM316 WT y cepa complementada (DgbcOpTCVVgbcO) y la floculación de mutante DgbcO.Figura 5. .

pero ausente en las células mutantes DgbcO. Un triángulo blanco representa el anillo ecuatorial (EQR). Las bacterias fueron cultivadas en fase semi-log (OD 600 nm = 0. y no resueltos oligómeros de alto peso molecular) fue menor (Figura 7C fila superior). mientras que su sensibilidad a la lisozima no se ve afectada (Figura 7A y 7B). El análisis cuantitativo de los cromatogramas confirmó esta observación y reveló que el índice de reticulación se . C) Imágenes de microscopia de transmisión electrónica de delgadas criosecciones teñidas con acetato de uranilo. y preparadas como se describe en el apartado de Materiales y Métodos (véase el texto S1). y la división celular) debido a la inactivación de gbcO. la cantidad de las categorías restantes (dímeros. DgbcO mutante. en dos aumentos (ver barras de escala). fijadas. y complementarias. Se requiere en la pared de la célula anclado GBC para la estructura normal de PG y el correcto posicionamiento de los sitios de síntesis de PG En línea con esta última hipótesis. (A) vistas representativas de análisis de microscopia electrónica de barrido muestran las alteraciones morfológicas (anomalías tamaño. se observó consistentemente que el mutante GBS DgbcO era más susceptible a la lisis inducida por mutanolisina que las células WT. Imágenes de microscopia electrónica de cepas NEM316 WT. DgbcO mutante. La presencia de la película (capa externa densa en electrones) en la superficie de cepas WT y complementarias observadas en el mayor aumento se resalta con flechas negras. .Figura 6. Se hizo una Separación RP-HPLC de los muropeptidos derivados de PG . (B. Para probar esta hipótesis. Los cromatogramas revelaron que mientras que las formas monoméricas de PG fueron más abundantes en los extractos de la cepa mutante en comparación con el WT (Figura 7C medio fila). una zona activa de la síntesis del peptidoglicano se ve en casi todas las células WT y complementarias. para WT.5). y complementa. forma. Más de 50 picos se analizaron por MALDI-TOF espectrometría de masas para deducir la estructura de los muropeptides separados (Figura 7C).

se realizaron experimentos de MFI para localizar PCSB en la superficie de células bacterianas recolectadas en la fase exponencial de crecimiento (Figura 8). . En esta especie. anthracis. pneumoniae R6 [31]. en ausencia de GBC. ningún patrón regular de etiquetado se puede distinguir en DgbcO mutante y señales PcsBassociated se distribuye de forma desigual en la superficie celular y en algunos casos acumulados en los focos. la tinción de la vancomicina se limitaba principalmente a las regiones ecuatoriales y septal de NEM316 WT y complementado células (Figura 7D y la Figura S4 superior e inferior filas). se observó una tinción uniforme de baja intensidad sobre toda la superficie de las células DgbcO (Figura 7D y la Figura S4 filas mediana). Para corroborar la hipótesis de una incorporación anormal de precursores PG en la pared celular de los mutantes DgbcO.33-35]. La falta de EQR (véase la Figura 6C) junto con la desaparición de la vancomicina indicado que. una autolisina que participan en la separación celular.31]. Este fenotipo se puede correlacionar con un mislocalization de BslO. Por el contrario. PCSB (proteína necesaria para la separación de la pared celular) es una superficie celular situado putativo hidrolasa PG que tiene ortólogos en todas las especies de la familia Streptococcaceae. y cuya localización de la pared celular es SCWP dependiente [37]. Los componentes PG altamente reticulado acumulados en un pico no resuelto que eluye entre 180-220 min. GBC privación conduce a una mislocalization de la hidrolasa putativa PG PCSB Las consecuencias de la inactivación del gen gbcO en la morfología celular y la división recordaban a los observados para un mutante PCSB-nula de S.33]. anthracis alterando la morfología celular y des localizando la síntesis de PG deslocaliza [25]. Esta localización se observó recientemente para la proteína PCSB ortólogos en Streptococcus pneumoniae [36]. Como ya se ha observado en S. Para probar esta hipótesis. un gen Tago está implicado en la unión del polisacárido pyruvylated de la pared celular (SCWP) a la superficie y el tratamiento de las culturas de tunicamicina de B. lo que sugiere que está implicado en remodelación PG. Por lo tanto. Defectuosa. Este resultado indica que GBC está implicado en la localización adecuada de PCSB. una proteína de la pared celular bacteriana implicada en la división bacterial y la biosíntesis de PG. Como el área de el pico se redujo fuertemente en el mutante DgbcO. una bacterias que crecía exponencialmente se tiño con vancomicina fluorescente para etiquetar la zona activa de la síntesis de PG [30. agalactiae cepa 6313 [32. la hipótesis de que la privación GBC podría afectar la localización de PCSB y la actividad asociada hidrolasa PG. Estos resultados pueden ser paralelas a las que informó recientemente en B. Esta proteína posee un dominio de cisteína-histidina-dependiente de la amidohidrolasa-peptidasa (CHAP) y se requiere para la síntesis de la pared celular y eficiente de separación de células en S. la disminución del PG entrecruzamiento fue probablemente subestimada.desplomó de 34% (cepas WT y complementarias) a 24% (DgbcO mutante) (véase la Tabla S3 en el apoyo de información del fichero Texto S1). agalactiae y otros estreptococos [31. la maquinaria de biosíntesis de la pared celular no estaba correctamente situado llevando a un modo disperso de la síntesis de PG y a una reticulacion dePG. Una señal de PCSB-específico ubicado en la zona ecuatorial de las células en división que corresponde al sitio de la síntesis de PG activo se observó en NEM316 WT y complementa las cepas. En contraste.

C. proporcionamos la primera evidencia genética de que la síntesis de GBC es iniciada por la transferencia de fosfato GlcNAc a un lípido portador de fosfato a través de la actividad de GbcO.que están anclados covalentemente a la PG que sugiere una estrecha coordinación de su síntesis con el de PG. En estas especies de estreptococos. agalactiae y su ausencia fue asociada con una pérdida sustancial de fitness (aptitud). subtilis o S. Del mismo modo. Es probable que su función es . La precisa estructura del antígeno Lancefiel se ha determinado para GBC solamente. las rutas biosintéticas y funciones biológicas de los glicopolímeros de la pared celular no han sido investigados aún. análisis inmunoquímicos y de composición de Grupo A. E y G de glicopolímeros de la pared celular han puesto de manifiesto de manera similar un alto contenido de ramnosa 44–48]. Por otra parte. segundo.aureus [1213]. Estos hallazgos indican que la ruta de biosíntesis GBC podría constituir un objetivo valioso para el desarrollo de nuevos antibióticos. subtilis y S. Mutantes S. un importante factor de virulencia de GBS [38–40]. GBC parecía ser crucial para la organización de la pared celular de S. mutans. un cercano homólogo de las enzimas (TagO/TarO) catalizan el primer paso de la síntesis de WTA en B. y defectos de división del mutante GbcO-null S. ser considerada como un equivalente funcional de la convencional WTA encontrada en B. aureus [24] WTAcarentes. el agotamiento de WTA fue asociado con la deslocalización de dos proteínas involucradas en el metabolismo de PG: la proteína PBP4 penicilinavinculante involucrada en la reacción de transpeptidación [13] y la autolisina Atl [12]. Este análisis suguiere que polisacaridos ricos en ramnosa anclados a PG estan muy extendidos entre los estreptococos inlcuyendo importantes patogenos humanos estreptococal (como S. bovis. galactiae y S. Aunque la ramificada estructura polisacárida rica en rhamnose de GBC es totalmente diferente de la de pAdoP-WTA presente en B. los cuales nos revelan una importante función biológica vinculada a la biosíntesis de PG y a la división celular. En este estudio. Sin embargo. GBC puede.Observaciones finales La pared celular de S. Mientras que ortólogos genes de la convencional WTA sintetizadora no fueron detectados. aureus (Figure 1B). mitis y anginosus grupos) reveló la presencia de un gbcO ortólogo junto con loci que se cree participan en la síntesis de un exopolisacárido contenedor de ramnosa. se demuestra que el agotamiento de GBC causa la deslocalización de PcsB. estos polímeros compartes dos importantes propiedades: primero. Es importante destacar que la aptitud del mutante GBC-carente se redujo drásticamente in vitro y observamos que la aptitud de la cepa WT se redujo similarmente a cuando GbcO fue inhibido con tunicamycin. agalactiae contiene dos polisacáridos PG anclados: la cápsula. Además. En S.aureus. subtilis [41-43] y S.agalactiae no encapsulados pueden ser fácilmente construidos in vitro and que no muestran ningún crecimiento o defectos morfológicos mientras es severamente afectado por la virulencia en el modelo de ratón [40]. aureus. pyogenes). aureus. agalactiae eran una reminiscencia de los reportados B. y el GBC. una importante enzima de la pared celular (Figure 8). por lo tanto. El crecimiento. ambos presentan un carácter aniónico conferido por su alto contenido en fosfato. salivarius. la disminución de PG cross-linking medido en la cepa NEM2772 (ᐃgbcO) era también observado recientemente en mutantes TarO-null S. morfológico. Un examen cuidadoso de los genomas de especies representativas de los principales linajes filogenéticos estreptocócidas (el llamado piógenos. subtilis o S.

Figura 7.ᐃgbcO mutante (cuadrados blancos) y Δ gbcO pTCVΩ gbcO complementadas (diamantes negros) fue grabada por espectrofotometría a 600 nm. La lisis de cepas de NEM316 WT (círculos negros). Alteraciones de las propiedades del sáculo de mureína y de la síntesis de PG en células GBC-carentes.similar a la de GBC y la inactivación de los ortólogos gbcO estreptocócicas constituye un enfoque simple y directo para validar esta hipótesis.B) Ensayos de lisis celular: células de crecimiento exponencial se recogieron y se resuspendieron en buffer PBS (DO600 nm = 1) que contiene (A) 1 mg / ml de lisozima o (B) 20 unidades / ml mutanolisina. Las barras de erros representan ± S.E de tres experimentos independientes (C) El análisis comparativo de los muropeptides resultantes de peptidoglicano mutanolisina-digerido (véase el texto S1) de NEM316 . (A.

los cubreobjetos fueron incubados por Alexa fluor A488-conjugados goat antirabbit (GBC) o goat anti rabbit (PcsB) inmunoglobulina G (IgG) (invitrogeno) (1/5000) y DAPI (invitrogeno) (1/5000). Materiales y metodos Las cepas bacterianas. La Kanamicina fue usada a concentraciones de 20 mg/ml y 500 mg/ml para E. se fijaron. Escherichia coli DH5a (invitrogen) usado para clonar experimentos crecieron en Luria-Bertani (LB) medio. . La suspencion bacterial (50 microlitros) fue aplicado en cubreobjetos de vidrio recubierto de polilisina por 5 minutos a temperatura ambbiente. Vancomicina fluorescente (2 mg / ml) se añadió a los cultivos en fase exponencial durante 10 min a 37uC. se transfirieron a portaobjetos de vidrio. Los ensayos de las detecciones por microscopia de inmunofluorescencia (IFM) del GBC y PcsB Los cultivos recolectados en exponencial (OD600=0. Muropeptides se separaron por RP-HPLC y los picos se recogieron y se analizaron por MALDI-TOF. coli y 10 mg/ml para S. La eritromicina fue usada a 150 mg/ml para E. (D) tinción fluorescente vancomicina de crecimiento exponencial NEM316 WT. medios de comunicacion y condiciones de crecimiento Las cepas bacterianas utilizadas estan listadas en las tablas S1 en el texto S1. DgbcO mutante y complementa las cepas. agalactiae NEM316 es una cepa serotipo III ST-23 cuyo genoma ha sido secuenciado [10]. OD600=1. Las cepas Gram fueron realizadas usando el kit bioMérieux sepas gram según las instrucciones de los fabricantes. y se observaron por microscopía de fluorescencia como se describe en Materiales y Métodos de apoyo (véase el texto S1).5) o fase estacionaria (cultivos de 6-horas. y complementados (panel inferior) de las cepas. S. agalactiae.5) como se indica en las leyendas de las cifras se volvieron a suspender en PBS a OD600=1 luego de tres lavados PBS. Las cepas de E. las celulas bacteriales fueron recolectados en fase exponencial e incubados con suero de raton levantados contra PcsB (1:100) obtenidos como se describe en el texto S1. S. Detroit. galactiae.Para la deteccion de GBS. Se recogieron las células. lavado dos veces con PBS y fijados por 15 minutos con 3% de paraformaldehido. Luego de 3 lavados con PBS. respectivamente.WT (panel superior). DgbcO (panel medio). coli crecieron en Luria-Bertani (LB)-broth o en LB-agar. Todas las incubaciones estaban a 37uC. agalactiae fue cultivado en Todd-Hewitt (TH) broth (frascos llenos permanentes) o agar (laboratorios Difco. MI) en 37uC. coli y S.

Veinte microlitros (OD. inmunolocalización fluorescente de la hidrolasa putativa PCSB peptidoglicano. Sedimento bacteriano se lavaron dos veces en PBS y se resuspendieron a una OD600 final = 100 nm en 50 mM Tris-HCl (pH 7. MFI con anti-suero PCSB y tinción DAPI se realizaron como se describe en Materiales y Métodos. glicina 39 mM. 2 unidades) fueron cargados en un 12% SDS-PAGE para electroforesis. pH 9. mutanolisina (200 U / ml) (Sigma). La transferencia se realizó en membrana de nitrocelulosa en una célula de transferencia electroforética semiseca (Bio-Rad) a 20 V durante 20 min en 48 mM Tris.5) que contiene sacarosa (1 M). Para mejorar la resolución de la banda de GBC. Crecimiento exponencial NEM316 WT. GBC inmunodetección después de SDS-PAGE y transferencia de nitrocelulosa Extractos de pared celular mutanolisina se prepararon a partir de cultivos en fase estacionaria. DgbcO mutante y las cepas DgbcOpTCVVgbcO complementados fueron cosechadas. La membrana se incubó con suero anti-GBC (1/1000) durante una hora y luego con IgG de AlexaA488 conjugado y cabra anti-conejo . transferido a portaobjetos de vidrio.2. y se fija. y se incubaron durante 60 min a 37°C. La suspensión se centrifugó a 5000 g durante 15 min a 4°C.Figura 8. 20% de etanol. Se recogió el sobrenadante correspondiente a la extracto de pared celular. los extractos de la pared celular se trataron con pronasa a 2 mg / ml durante 90 min a 60°C.

seguido por la digestión proteolítica y catalizada por una base (NaOH) WTA.5) y se lavaron dos veces con PBS. SEM. agalactiae se diluyeron (1/100) en TH y se cultivó a 37 ° C hasta DO600 nm <0. en presencia de xylose adicionado como un estandar adicional. Las membranas fueron digitalizadas en un FLA-3000 sistema de imagen fluorescente Fuji.agalactiae durante 10 min. La suspensión bacteriana se aplicó en cubreobjetos y se trató como se describe anteriormente Las condiciones de crecimiento para las muestras de microscopía electrónica Cultivos de una noche de S.1. El análisis PAGE nativa en el sistema de gel de C6% T20% se ejecutó como se describe [25].5. y IEM como se describe en el apoyo de información del fichero de texto S1. 0. El crecimiento se registró por triplicado en placas de 96 pocillos en un lector de placas TECAN M200 a 600 nm. 0. Las muestras . Las muestras se prepararon entonces para TEM.25. La hidrolisis de los ejemplos de la pared celular fueron realizados por tratamiento en 4 M TFA a 110˚C por 3 horas.(1/10000). Tasas de crecimiento máximas se calcularon e informaron sobre la gráfica como un porcentaje de la tasa de crecimiento en ausencia de tunicamicina. Ensayos de lisis bacteriana Las bacterias se cosecharon en la fase exponencial (OD600 = 0.5. Luego del secado. una mezcla 1: 1 de vancomicina y BODIPY FL vancomicina (gen invitro) a una concentración final de 2 mg / ml fue añadido a cultivos crecientes exponencialmente de S. Curvas de crecimiento en presencia de tunicamicina Crecimiento de cepas de S. lactis [49] sin HF y tratamientos TCA para preservar los polisacaridos anclados a la pared celular. como se describe [31]. agalactiae en la presencia de tunicamicina (Sigma) se ensayó en TH a 37 ° C en las siguientes concentraciones finales: 0. Las células se resuspendieron a DO600 = 1 en PBS y se incubaron a 37 ° C en presencia de lisozima (1 mg / ml) o mutanolisina (20 unidades / ml). Análisis de la composición de las paredes celulares por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas Las paredes celulares de los cultivos de la fase estacionaria fueron preparados como se describieron para L. La lisis fue seguida por cambios en la densidad óptica a 600 nm en los tiempos indicados. aureus WTA La preparación de material insoluble de la pared celular mediante el procedimiento SDS-de ebullición. la escisión se realizó esencialmente como se describe [25]. 0. Las bacterias se recogieron y se lavaron tres veces con PBS y después se resuspendieron en PBS a DO600 = 1. Extraction and native PAGE analysis of S. exepto la proteinasa K que fue reemplazada por pronasa (2 mg / ml). Tinción de Vancomicina Para la tinción. los productos de la hidrolisis del TFA fueron resuspendidos en piridina y derivado con Nmetil-N-(trimetil-sylil) trifluorocetamida (MSTFA) por 30 minutos a 25˚C. y 2 mg / ml. Las bandas de la WTA se tiñeron con el protocolo de tinción azul-plata alcyan utilizando el kit de tinción de plata de Bio-Rad como se describe [25].

Las proteínas de Swiss-Prot fueron Tago de B.5nmol/mg para rhamnosa 215. aureus N315 (Q7A6R9) y sus ortólogos GbcO (Gbs0136) de S. La cromatografia de gas fue realizado en una columna ZB-50 de 30m con 0. El helio fue usado como el gas cargador y fue puesto con una velocidad de flujo constante de 1. m / z. Informacion de apoyo Figura S1 Múltiples secuencia de alineamiento putativo UDPN-GlcNAc: transferasas undecaprenilo-fosfato (PNUD) GlcNAc-1-fosfato. seguido por una rampa de temperatura de horno de 20˚C/min a 300˚C.7 nmol/mg para acido muramico. y RgpG de S. y un final de calefaccion de 3min a 300˚C. Las muestras fueron inyectadas con un inyectador automatico (Gerstel PAL). agalactiae pertenece al grupo A3a con L-Ala-D-iGln-L-LysD-Ala-D-Ala como péptido tallo y los dipéptidos L-Ala-L-Ala o L-Ala-L-Ser como puentes interpeptídicos que conectan L-Lys de un péptido de vástago a la D-Ala en la posición 4 de la subunidad vecina [53].2 Strimers) / S todos muropeptides.8 nmol/mg para fosfato. Ringoes. Las masas determinadas por MALDI-TOF se compararon con las masas teóricas de clasificar los muropeptides HPLC separados como monómeros (m / z. subtlis 168 (O34753). La cuantificacion fue hecha usando unas curvas de calibracion estandar externo para cada molecula (2. Taro de S. PG purificado se digirió con mutanolisina se analizaron (300 U / mg PG) a partir de Streptomyces globisporus (Sigma-Aldrich) y las muropeptides resultantes después de la reducción NaBH4 por RP-HPLC y MALDI-TOF espectrometría de masas.51]. El promedio NEM316 valores wild-type fueron: 518. pyogenes SF370 / M1 (Q9A1G6).5-25 nm inyectado) establecidos con el area peak de on especifico y expresao en nmol/mg pared celular. Purificación y análisis estructural de PG Paredes celulares de S. tecnologias Agilent). RgpG de S. Se recogieron fracciones y se analizaron 1 ml de los que contienen los principales picos por MALDI-TOF espectrometría de masas con un espectrómetro de masas Voyager DE STR (Applied Biosystems) y un-ciano-4hidroxicinámico. como se informó anteriormente [52]. Para el proposito de claridad. Se calcularon las masas teóricas de los muropeptides con las posibles variaciones estructurales esperados. La temperatura programada era de calefaccion isotermal de 5 min a 80˚C. agalactiae NEM316 (Q8E7L8). dímeros (1803. mutans UA159 (Q8CZF2).fueron analizadas por cromatografia de gas junto a espectrometria de masa (GC-MS) con un sistema Agilent (GC 6890+ y MS 5973 N. NJ.5 ml/min.5) como se describe previamente para Lactococcus lactis [49] y Lactobacillus plantarum [50] con la siguiente modificación: se realizó un tratamiento ácido con TCA al 5% (24 h a 4 ° C) antes de que el tratamiento con ácido fluorhídrico. Las cajas negras y grises con . La estructura de PG de S. USA). 459.55 mm de diametro interno y 0. Índice de reticulación (Cl) se calculó con la fórmula de acuerdo con Glauner (1988) [54]: Cl = (media Sdimers + 3. agalactiae se prepararon a partir de cultivos en fase exponencial (DO600 = 0. 1568). 2647) o trímeros (0.2647). Los componentes fueron indentificados por el tiempo de retencion y la comparacion de sus perfiles de espectro de masa de ionizacion de electron con sus NIST 05 libreria masa espectral (servicios cientificos instrumentales. para eliminar el polisacárido capsular [17. los resutados fueron expresados para cada componente como porcentaje de valores wild-type (figura 2B).5um de espesor de pelicula (phenomenex).

carta blanca: 100% y el 80% de identidad de secuencia. (TIF) Figura tinción fluorescente S4 vancomicina. Fila inferior muestra una imagen de NEM2772 (DgbcO) que pone de relieve las similitudes morfológicas con las células WT tunicamycin cultivada. (TIF) Figura S2 aberraciones morfológicas inducidas por tunicamicina. Contraste de fase y de imagen de epifluorescencia de bacterias que crecen exponencialmente etiquetados con DAPI (marcador de ADN) y vancomicina fluorescente (marcador de sitios de síntesis de PG) como se indica en Materiales de apoyo y métodos (véase el texto S1). caja gris con la letra negro. agalactiae NEM316 WT (fila superior) se cultivó en TH en 37uC con las concentraciones indicadas de tunicamicina. El etiquetado vancomicina regular se pierde en la cepa DgbcO. (Las barras de escala 1 mm). (TIF) Figura S3 de exploración vistas de microscopía electrónica de S. Cepa de S. Barra de escala: 1 mm.5).agalactiae NEM316 WT. Las bacterias se cultivaron en TH en 37uC y se cosechan en la fase exponencial (DO600 nm = 0. el 60% de identidad de secuencia. respectivamente. La microscopía óptica de formación de imágenes se realizó en células vivas en fase estacionaria. (TIF) . DgbcO mutante y complementa las cepas. Los diferentes campos en tres escalas diferentes (ver barras de escala) revelaron que la mutante DgbcO ya no mostrar cadenas típicas de ovococci.