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INTRODUCCION

as micotoxinas son sustancias txicas producidas en el metabolismo secundario de los


hongos, que aparecen como contaminantes naturales en los alimentos cuando las
condiciones climticas son propicias.

Se conocen cientos de micotoxinas, y una veintena aparecen como residuales en los alimentos.
Ellas estn distribuidas en diferentes familias tales como: aflatoxinas, ocratoxinas, tricotecenos,
fumonisinas y alcaloides del ergot, entre otras.
Conocer el efecto que provocan las micotoxinas en la salud humana y animal, as como el impacto
econmico que provocan las mismas, constituye una preocupacin continua de todos los pases
del rea. Sin embargo, los materiales de estudio en espaol que permiten adentrarse en el
fascinante campo de las micotoxinas son pocos, lo que contrasta con lo que ocurre en pases
desarrollados donde la informacin acerca de la peligrosidad de estas sustancias txicas y en
especial de las aflatoxinas, se ha realizado en ocasiones a travs de la prensa, dndole gran
difusin a esta problemtica.
En los ltimos 30 aos se ha puesto empeo en estudiar los orgenes, la naturaleza, la distribucin
y los posibles riesgos que para la salud humana y animal tienen las micotoxinas presentes en los
alimentos y los piensos.
Con la presente publicacin por series para cada familia de micotoxinas se pretende ofrecer una
informacin til para los profesionales tcnicos de la salud humana y animal, para los bilogos y
para aquellos agentes que estn responsabilizados con la produccin o elaboracin de alimentos
en el campo de la industria.
1-Resea histrica de las Aflatoxinas.
En 1960, en el oeste de Inglaterra, ocurri la muerte de ms de 100000 pavos de una enfermedad
desconocida (enfermedad X de los pavos). Aqu se vio que el hgado era el rgano principalmente
afectado, presentaba necrosis de los hepatocitos, proliferacin biliar y fibrosis, entre otros signos.
Los sntomas clnicos de esta enfermedad ya haban sido descritos por Wanop (1960), quien
observ en 1957, en el campo de Bedfordhere, la muerte de un gran nmero de pavos. Brotes
adicionales ocurrieron en la primavera y verano de 1958 y 1959, respectivamente (Austwick,
1978).
Producto de investigaciones realizadas, se concluy que la causa de esta enfermedad de origen
desconocido fue la ingestin por las aves de un lote de man importado de Brasil, que estaba
contaminado con una toxina producida por Aspergillus flavus. Este episodio fue el que llev al
hombre a la identificacin de toxinas producidas por hongos, que fueron denominadas
genricamente micotoxinas.
El descubrimiento de las propiedades hepatotxicas y carcinognicas, as como la elucidacin de
la estructura de las toxinas de A. flavus (aflatoxinas) modific la estrategia de lucha en toda la

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esfera de las micotoxinas y es a partir de este momento que se inicia un estudio sistemtico de las
toxinas producidas por hongos.
Las enfermedades producidas por las micotoxinas en los hombres y los animales se conocen como
micotoxicosis; sin embargo, los trminos de micotoxinas y micotoxicosis no fueron establecidos
hasta despus de la dcada del 60 del presente siglo, poca en la que estos metabolitos
comenzaron a tener identidad propia.
2-Biosntesis y produccin de aflatoxinas.
2.1-Biosntesis de las aflatoxinas.
La biosntesis de las aflatoxinas ocurre en el metabolismo secundario de los hongos. Este tipo de
metabolismo, al no ser indispensable para los hongos es especie especfico, explica la variabilidad
en su produccin, aun entre cepas de la misma especie y la gran variedad de metabolitos
producidos por esta va. La biosntesis de las aflatoxinas ocurre por la va metablica de los
polictidos, la ms importante en el metabolismo secundario de los hongos. Este proceso
involucra la condensacin del acetil CoA con el malonil CoA en un proceso cclico similar en
algunos aspectos al de la biosntesis de cidos grasos de cadena larga (Ellis et al, 1991).
Estudios metablicos realizados con precursores (acetato) marcados isotpicamente, han
demostrado que los carbonos del esqueleto carbonado de la aflatoxina provienen en su totalidad
del acetato y el grupo metilo proviene del aminocido metionina (Zaika y Buchanan, 1987). En la
va biosinttica del acetato a la aflatoxina han sido reconocidos seis metabolitos intermediarios
(figura 1). El decactido lineal formado (polictido) sufre un proceso de ciclizacin a compuestos
de la familia de las antronas hasta llegar a la aflatoxina.
Este proceso biosinttico ocurre en el citoplasma soluble (extramitocondrial) y utiliza los
equivalentes reducidos (NADPH, H+) producidos en la va de las pentosas.

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2.2-Produccin de aflatoxinas en el campo y almacenes.
El origen de las micotoxinas est indisolublemente ligado al crecimiento fngico. Las aflatoxinas,
por ser un producto del metabolismo secundario de los hongos, como anteriormente se mencion,
no pueden aparecer o desarrollarse en los alimentos sin una previa contaminacin de los mismos
por hongos de las especies A. flavus o A. parasiticus. Sin embargo, la presencia de estos hongos
en un producto no indica que automticamente debe estar presente la aflatoxina.
Especies de A. flavus y A. parasiticus han sido aisladas de una gran diversidad de productos
vegetales como son: man, semilla de algodn, arroz, maz, higos, trigo, entre otros (Vedanayagan
et al, 1987; Carballo y de Miguel, 1987; Elamin et al, 1988; Vesonder, 1991). Conjuntamente con
las anteriores existen otras especies que producen aflatoxinas en condiciones in vitro, aunque en
menores concentraciones (Cavalherio, 1981). En la tabla 1 se muestran las diferentes especies de
hongos productores de aflatoxinas.
Tabla 1. Especies productoras de aflatoxinas.
Aflatoxinas
Especie
B1
A. flavus
A. parasiticus
A. oryzae
A. niger
A. wentii
A. ruber
P. paberulen
P. variable
P. frecuenutans
P. citrinum
Rhizopus sp

x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x

B2
x
x
x

G1
x

G2
x

Cuatro factores estn vinculados estrechamente a la contaminacin fngica de los alimentos en el


campo, as como durante el almacenamiento. Estos son: humedad, temperatura, oxgeno y tiempo.
Otros factores que influyen en el crecimiento de los hongos son: la calidad del grano, la
composicin del sustrato (Jones, 1977; Gonzlez et al, 1989), la capacidad gentica del hongo
(Stubblefield et al, 1967; Dorner et al, 1984), la presencia de insectos (Barry et al, 1986; Albin y
Bilbao, 1987) y el empleo de sustancias qumicas (sales inorgnicas) durante el almacenamiento
(Thanaboripat et al, 1992).

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De los factores antes mencionados, la temperatura y la humedad estn muy ligadas entre s y
tienen un efecto crucial sobre el crecimiento de los hongos y la formacin de aflatoxinas en los
alimentos.
La especie A. flavus puede crecer en un intervalo de temperatura entre 7.5-40 C; sin embargo,
todos los resultados publicados coinciden en que el mayor crecimiento y posterior aumento en la
produccin de toxinas se encuentra entre los 25-30 C. Algunos hongos pueden desarrollarse con
ms lentitud a 0 C (A. flavus, Cladosporium spp y Fusarium spp) y por otra parte, hay especies
que crecen a temperaturas superiores a los 55 C como A. fumigatus .
El crecimiento del hongo y la produccin de toxinas se ven influenciados por la humedad relativa
del ambiente, resulta el 85% la ptima, aunque puede oscilar entre 83-99% (Diener y Davies,
1968). Christensen (1978)(citado por Snchez, 1987), inform que los hongos pueden crecer bajo
diferentes intervalos de humedad relativa (65-100%) y distintos contenidos de agua (12-24 %) en
los cereales y granos de soya.
Sinha (1979) refiere como temperaturas lmites para el crecimiento de hongos en granos postcosecha entre 5 y 45C, con un intervalo ptimo entre 25 y 30 C, humedad relativa entre 65-90%
y lmites de pH de 2.0 a 10.2.
En la tabla 2 se resumen los factores ya comentados y otros que influyen en la formacin de
micotoxinas en las diferentes etapas de la produccin de los cereales.
Tabla 2. Factores que influyen en la contaminacin por hongos y produccin de micotoxinas en
los cereales.
Factores

Campo

Recoleccin

Almacenamiento

Fsicos

Humedad
Temperatura
Dao mecnico
Tiempo
Mezclado del grano

x
x
x
x

x
x
x
x
x

x
x
x
x
x

Qumicos

Oxgeno
Dixido de carbono
Comp. del Sustrato
Minerales
Tto. Qumico

Biolgicos

Insectos
Infeccin fngica
Capacidad Gentica
Dif. en las variedades de plantas

x
x
x
x
x
x

x
x
x
x
x
x
x
x
x

5
2.3-Produccin de aflatoxinas en el laboratorio.
Las cepas de A. flavus y A. parasiticus varan en su toxigenicidad. Algunas cepas no producen
cantidades detectables de aflatoxinas, y entre las productoras puede haber mucha diferencia en la
cantidad de toxina sintetizada.
Los principales factores que afectan directamente la produccin de aflatoxina in vitro son:
potencial gentico de la cepa, concentracin del inculo, sustrato, nutrientes, intensidad de la luz,
pH, temperatura y. gases atmosfricos.
2.3.1-Potencial gentico de la cepa.
Las cepas de A.flavus producen, principalmente, las aflatoxinas del tipo B, mientras las cepas de
A.parasiticus producen las cuatro aflatoxinas. Estas producciones se pueden afectar por la
presencia de otros hongos en el cultivo. Mislivec et al (1988) reportaron que la capacidad gentica
de A. flavus no se vio afectada por la presencia de otras especies de Aspergillus (A.ochraceus y
A.versicolor. Sin embargo, la presencia de Penicillium spp. disminuy la produccin de
aflatoxina de 0.7 a 30%, en dependencia de la especie de Penicillium contaminante.
2.3.2-Concentracin del inculo.
Existe un vnculo entre la produccin de aflatoxinas y la ramificacin micelial, donde a bajas
concentraciones de esporas (103-104/mL) se aumenta dos veces la produccin de aflatoxinas
(Sharma et al, 1980). Bennett (1983) refiri que la fusin hifal, comn en Deuteromyces, es ms
rpida cuando la concentracin de esporas es mayor; por tanto el metabolismo secundario queda
inhibido por los procesos de diferenciacin y reproduccin fngica. Esto puede explicar los
resultados de Batt (1983) y los de Gonzlez et al (1989), donde se obtuvieron superiores
concentraciones de aflatoxinas con los inculos de baja concentracin. Karanuratne y Bullerman
(1990) informaron que la mxima produccin de aflatoxina ocurre con una concentracin de
esporas de 103/mL, y menores o mayores concentraciones de esporas a esta, provocaban una
disminucin en la produccin de aflatoxinas en la temperatura ptima de crecimiento.
2.3.3-Sustrato
Pueden ser sintticos o naturales, lquidos o slidos y de diferente naturaleza qumica. Esta ltima
puede desempear una funcin importante, ya que hay productos ms susceptibles que otros a ser
contaminados por un moho determinado; sin embargo, la mayor parte de los mohos pueden
invadir numerosos sustratos pues, en general, tienen pocas exigencias nutricionales. Sus
necesidades se limitan al carbono, nitrgeno y sales. Los carbohidratos y cidos grasos, en los
medios de cultivo, aumentan la produccin de toxina.
La produccin de aflatoxinas es mnima en productos de origen animal (jamn) y en otros
productos como el t y especias. Por el contrario, esta produccin puede ser muy alta en cereales y
semillas oleaginosas, y dentro de estass, la soya es un mal sustrato ya que se demostr que posee
una cierta resistencia a la produccin de aflatoxinas (Erlich y Ciegler, 1985).

6
2.3.4-Nutrientes
Anteriormente se mencion que sustratos ricos en carbohidratos y cidos grasos aumentaban la
produccin de toxinas, sin embargo, todos no influyen de la misma manera: la glucosa, fructosa y
sacarosa son adecuados para la produccin de aflatoxinas cuando se emplea A.flavus, mientras la
manosa y xilosa se usan con xito con A.parasiticus (Davies y Diener, 1968).
Existen otros nutrientes tales como aminocidos (glicina, glutamato, aspartato, prolina y alanina)
y cationes bivalentes (cadmio, magnesio y cinc) que en forma de sales incrementan la produccin
de aflatoxinas. Hay otros compuestos qumicos que inhiben la produccin de aflatoxinas, ellos
son: cafena (Buchanan y Lewis, 1984), nitrito de sodio (Obioha et al, 1983), cloruro de sodio
(Thanaboripat et al, 1992), cido propinico e hidrxido de amonio (Thanaboripat et al, 1992),
bicarbonato de potasio (Montville y Goldstein, 1987) y selenito de sodio (Badii et al, 1986). En la
tabla 3 se muestra un resumen de los porcentajes de inhibicin de cada uno de los compuestos
antes mencionados.
Tabla 3. Porcentajes de inhibicin en la produccin de aflatoxina in vitro.
Compuesto

concentracin

Cepa

Cloruro de sodio
Ac. propinico
Amonaco
Cafena
Bicarbonato de potasio
Selenito de sodio

120 mg/g
2.5 mg/g
1.5 %
2 mg/mL
0.022 %
40 g/mL

7
7
7
7
20
3

Nitrito de sodio

40 g/mL

A.flavus
A.flavus
A.flavus
A.parasiticus
A.parasiticus
A.flavus
A.parasiticus
A.parasiticus

100
78
100
100
100
13
20
100

D: das de incubacin
%: porcentajes de inhibicin.
2.3.5-Intensidad de la luz
La incidencia de la luz en el cultivo para la produccin de aflatoxinas ha sido ampliamente
debatida y depende del resto de los factores externos e internos del proceso fermentativo. Bennett
et al (1981) obtuvieron resultados superiores cuando el cultivo estuvo bajo luz blanca perenne a
25C; pero a 30C, la mayor produccin de aflatoxina fue en la oscuridad. Ya formada la
aflatoxina, puede degradarse en el cultivo en presencia de la luz en funcin de su intensidad, el
tiempo de exposicin y la temperatura (Nkama et al, 1987; Nkama y Muller, 1988).
2.3.6-pH
Durante el crecimiento de los hongos los valores de pH del medio pueden variar entre 4 y 5, como
resultado de su metabolismo. El mximo crecimiento de A.flavus y A. parasiticus ocurre entre los
pH 5-8. Gonzlez et al (1989), en un estudio con diferentes sustratos, no encontraron diferencias

7
significativas en la produccin de aflatoxinas cuando variaron los pH entre 4 y 7. Tsai et al
(1984) hallaron que en medio YES los resultados diferan cuando el pH utilizado era de 6.5, en
comparacin con 4.5 y 5.5, de donde se puede inferir que el pH est muy relacionado con el
sustrato que se est utilizando al no existir un comportamiento homogneo.
2.3.7-Temperatura
Desde 1973, cuando West et al evaluaron varias temperaturas de incubacin utilizando arroz, se
evidenci que hay diferencias significativas en la produccin de aflatoxinas en relacin con este
factor. Nandi y Haggblom (1984) informaron como ptima la temperatura de 30C en sustratos
naturales, sin embargo, Hill et al (1983) y Park y Bullerman (1983) obtuvieron resultados
superiores con temperaturas inferiores. Por otra parte, Tuason y Madamba (1980) y Koehler et al
(1985) lograron resultados similares de produccin de aflatoxinas con temperaturas entre 20 y 21
C, iguales a las obtenidas en nuestro medio (901 g/kg)(Gonzlez et al, 1989).
2.3.8-Gases atmosfricos
La oxigenacin constituye otro aspecto a tener en consideracin en el crecimiento fngico, puesto
que los hongos micotoxignicos son organismos aerbicos. Se ha comprobado que bajas
concentraciones de oxgeno y/o altas concentraciones de dixido de carbono pueden deprimir el
crecimiento fngico y la consecuente formacin de micotoxinas (Hesseltine, 1976). Sander et al
(1968) obtuvieron altas concentraciones de aflatoxinas con un 21% de oxgeno y 0.033% de
dixido de carbono.
Un estudio realizado en el almacenamiento de man en condiciones de atmsfera controlada
65:35) con diferentes clases de empacamiento (ASI, ASII y ASIII) mostr una
(CO2:N2
reduccin en la produccin de aflatoxinas por A. flavus con concentraciones inferiores al mximo
lmite permisible (20 ng/g), sin embargo el efecto de las concentraciones de los gases fue
dependiente del tipo de empacamiento y la temperatura de almacenamiento (Ellis et al, 1994 a,b).
3-Caracterizacin fsico-qumica y efectos txicos de las aflatoxinas.
3.1-Propiedades fsico-qumicas.
Se conocen 18 tipos de aflatoxinas, pero solo cuatro aparecen como contaminantes de los
alimentos. Estas son: B1, B2, G1 y G2 (figura 2). El nombre genrico de aflatoxinas proviene de su
principal especie productora (A.flavus) y la denominacin B y G se debe al color de la
fluorescencia que exhiben cuando son colocadas bajo la accin de la luz ultravioleta, donde B
corresponde al azul (blue) y G al verde (green), mientras que los subndices se refieren a la
movilidad cromatogrfica (Jones 1977).
Existen otras aflatoxinas naturales que se producen en el metabolismo celular, como la M1, M2,
B2a y G2a (figura 2) que tambin han sido aisladas de cultivos de A.flavus y A.parasiticus, en
bajas concentraciones (Stubblefield et al, 1970; OPS-OMS, 1983; Dutton et al, 1985 ). Las
aflatoxinas M1 y M2 pueden encontrarse en la leche y en la orina, as como la AFP1 y AFQ1
(figura 2). El parasiticol (AFB3) y el aflatoxicol (R0), compuestos que estn estrechamente

8
relacionados con la biosntesis de la aflatoxina B1, se han aislado de cultivos de A.flavus (Jones
1977). Algunas de la aflatoxinas antes mencionadas pueden ser obtenidas, adems, mediante
sntesis qumica. Ellas son: la aflatoxina M1, que ha sido sintetizada a partir de la oxidacin de la
aflatoxina B1 con el dixido de selenio (Christou et al, 1985); las aflatoxinas B2a y G2a, que se
sintetizan por la adicin de una molcula de agua al doble enlace vinlico de las aflatoxinas B1 y
G1 respectivamente, en un medio cido (Pohland et al, 1968) y la AFB3, que puede obtenerse por
hidrlisis de la aflatoxina G1 en la posicin 5 del anillo lactnico seguido por una
descarboxilacin (Jones, 1977).
Existen otras aflatoxinas no naturales, como la aflatoxina B1S que se produce por la accin del
metabisulfito de sodio sobre el grupo vinilo de la molcula de la aflatoxina B1 y es muy poco
txica. Otra no natural es la aflatoxina D1, producida por el empleo de amonaco en su estado
gaseoso o lquido, actuando sobre el anillo lactnico de la aflatoxina B1. Las aflatoxinas RB1 y
RB2 son producidas por la reaccin de las AFB1 y AFB2 con borohidruro de sodio como resultado
de la ruptura del anillo de lactona, seguido de una reduccin del grupo cido de la ciclo pentanona
(Jones, 1977).

Las aflatoxinas son solubles en solventes orgnicos tales como: clorofomo, metanol, acetonitrilo,
benceno, entre otros. Estos son usados para su extraccin a partir de los medios de cultivo o de los
alimentos contaminados. Las toxinas disueltas en cloroformo o en una mezcla de
benceno:acetonitrilo (98:2 v/v) son estables durante aos si se mantienen en lugares oscuros y
fros (Merck Index, 1983; AOAC, 1990); no obstante, cuando se mantienen en metanol su

estabilidad disminuye con el tiempo. En la tabla 4 se muestran las principales propiedades fsicoqumicas de las aflatoxinas.

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3.1.l-Espectroscopa Infrarroja (IR), Resonancia Magntico Nuclear (RMN) y Espectroscopa de Masa
(EM).

El anlisis estructural de las aflatoxinas se ha basado, en parte, en sus espectros infrarrojos (IR).
Aunque este es caracterstico de la molcula entera, siempre ciertos grupos en ella dan lugar a
bandas un determinado intervalo de frecuencia, independientemente de la naturaleza del resto de
la molcula. La permanencia de estas bandas, caractersticas de grupos funcionales, permite una
amplia utilizacin de la espectroscopa IR en la obtencin de informacin estructural por simple
inspeccin del espectro y el uso de tablas de frecuencia de grupos caractersticos.
Existen otras bandas de menor frecuencia como son:
1632 cm-1
1598 cm-1
1562 cm-1

2850 cm-1
1600 cm-1
1130 cm-1

(-O-CH3)
(-HC=CH-)
(C-O-C)

Estas bandas aparecen en la mayora de las aflatoxinas y en el caso de los compuestos


hidroxilados se encuentra otra en la regin de 3400 cm-1, correspondiente al grupo OH (Asao et
al, 1965; Jones, 1977).
Un estudio estructural (IR) del aflatoxicol revel que este no presenta las bandas a 1760 y 1684
cm-1 provenientes de la estructura cumarnica de las aflatoxinas, debido a que esta molcula no
tiene el grupo carbonilo en el anillo de ciclo-pentanona. En su lugar aparecen dos bandas a 1070 y
1020 cm-1, indicativas de la presencia de un alcohol secundario y de un grupo carbonilo en el
anillo saturado de la lactona (Detroy y Hesseltine, 1969). Conjuntamente, en la regin de 3400
cm-1 presenta una banda de absorcin ancha, correspondiente al grupo hidroxilo.
La resonancia magntico-nuclear (RMN) juega un papel importante en la elucidacin estructural
de cualquier compuesto, conjuntamente con la espectroscopa infrarroja (IR). Esta se fundamenta
en las propiedades magnticas de los ncleos atmicos. La frecuencia de resonancia de un
conjunto de protones (H+) que forman parte de un sistema molecular depende del entorno
electrnico de los mismos. Estudios estructurales de las aflatoxinas por RMN han sido realizados
por David et al (1987). En la tabla 5 se muestran algunos datos espectrales de la aflatoxina B1
obtenidos por RMN.
La espectroscopa de masa permite identificar una muestra, inferir la estructura de un compuesto
desconocido, estudiar la pureza de una muestra y analizar cualitativa y cuantitativamente una
mezcla. Este procedimiento puede ser de ionizacin qumica positiva o ionizacin qumica
negativa, y es especfico para cada compuesto. Los fragmentos de aflatoxina que se han
encontrado con mayor frecuencia relativa son el in molecular (M-), la prdida de un hidrgeno
(M-H-) y la prdida del grupo metoxi (M-CH3) (Brumley et al, 1981). En las tablas 6 y 7 se
muestran los diferentes iones moleculares y sus fragmentos de las principales aflatoxinas.

10
Tabla 4. Propiedades fsico-qumicas de las aflatoxinas
PF C

L.O
(nm)

2,56
1,34
2,18

268 269

425

263
265
362

1,70
1,10
2,08

286 289

425

C17H12O7

243
257
264
362

1,15
0,99
1,00
1,61

244-246

450

330

C17H14O7

226
265
363

2,81
1,16
2,04

237-239

450

M1

328

C17H12O7

226
265
357

2,31
1,16
1,90

299

425

B2a

330

C17H14O7

228
256
357

1,76
1,03
2,10

240

----

P1

298

C16H10O6

267
342
362

1,12
1,49
1,59

>320

-----

Q1

328

C17H12O7

223
267
366

1,90
1,14
1,75

295

-----

R0

314

C17H14O6

254
261
325
335

0,679
1,08
1,41
1,37

230 -234

425

D1

286

C17H9O5

227
324

1,592
1,244

220-224(*)

----

G2a

346

C17H14O8

223
242
262
365

1,86
1,01
0,87
1,80

190

----

Aflatoxina

PM

Frmula
Qumica

Mxima
Absorcin

x 104

B1

312

C17H12O6

263
265
362

B2

314

C17H4O6

G1

328

G2

PM = Peso molecular
PF = punto de fusin (*) Sublimacin

= Coeficiente de extincin molar.


L.O = Longitud de onda de emisin (nm)
-1
-1

La aflatoxina B1 presenta dos bandas de frecuencias 1760 cm y 1684 cm


Tabla 5. Datos espectrales de la aflatoxina B1 obtenido por RMN.

11

Protn

ppm

Multiplicidad

Hz

Asignacin

1
2
3
4
5
6
7
8

6,47
5,48
4,76
6,81
6,42
3,95
3,40
2,66

dd
dd
ddd
d
s
s
m
m

J 1,2=2,9
J 1,3=2,2
J 2,3=2,4
J 3,4=7,1

Bifurano
Bifurano
Bifurano
Bifurano
Aromtico
O-CH3
ciclo pentanona
ciclo pentanona

Tabla 6. Relacin masa-carga de los iones moleculares y sus fragmentos de las principales aflatoxinas.
Ion molecular

B1

B2

G1

G2

M1

M2

(M-)

312
(100)

314
(100)

328
(100)

330
(100)

328
(57)

330
(61)

(M-H-)

311
(48)

313
(60)

327
(28)

324
(39)

327
(28)

329
(41)

(M-CH3-)

297
(82)

299
(99)

313
(46)

315
(98)

313
(100)

315
(100)

Temp. de la fuente:130 C (ionizacin negativa con metano)


Presin 1.0 Torr
Los nmeros entre parntesis indican el % de la intensidad relativa
(Brumley et al, 1981)

3.2-Efectos txicos de las aflatoxinas.


3.2.1-Metabolismo
La aflatoxina B1 se absorbe, fundamentalmente, en el duodeno (Kumagai, 1989) y el principal
rgano donde se realizan las transformaciones metablicas es el hgado. La aflatoxina B1 se
metaboliza, principalmente, por el sistema microsomal de oxidasas de funcin mixta (MFO), que
es una organizacin compleja de enzimas de las clulas hepticas NADPH dependientes, unidas al
citocromo P-450 (Busby y Wogan, 1981).

12
Tabla 7. Relacin masa-carga de los iones moleculares y sus fragmentos de las principales aflatoxinas por
ionizacin qumica positiva y negativa.
Ionizacin

B1

B2

G1

G2

M1

Positiva

313(100)
285(29)
270(6)
269(7)
257(5)
241(12)
214(4)
183(3)

315(100)
299(1)
297(6)
287(23)
272(6)
271(8)
259(30)

329(100)
311(18)
300(1)
283(16)
269(4)
257(3)
243(62)
225(3)
215(16)

331(100)
313(18)
303(3)
285(6)
275(5)
257(6)
245(11)
229(3)
217(4)

329(47)
301(11)
285(4)
283(5)
273(100)
259(49)
229(18)
216(5)

312(1)
297(100)
269(4)
253(1)
209(1)

314(1)
299(100)
271(6)
243(8)

328(-)
313(33)
269(100)
241((16)

330(-)
315(28)
271(100)
243(11)
215(3)

328(1)
313(100)
270(1)
269(1)

MH+

Negativa
M-

En la figura 3 se resumen las principales vas metablicas de la aflatoxina B1, y en la figura 4 se


muestran sus posibles transformaciones estructurales. Como se observa, las hidroxilaciones en (e)
y (c) dan las aflatoxinas M1 y Q1, respectivamente; la o-desmetilacin (b), da la aflatoxina P1 y la
8,9 oxidacin (2,3 oxidacin, en el antiguo sistema de numeracin) (a), llamada tambin reaccin
de activacin metablica, da el 8,9-xido de aflatoxina B1. La formacin de aflatoxicol es
catalizada por una 17-OH-esteroide deshidrogenasa citoplasmtica, siendo esta reaccin
reversible (d). El aflatoxicol, adems, puede experimentar una reaccin de oxidacin en el sistema
MFO que da por resultado el aflatoxicol H1. Este metabolito puede ser reducido en el citoplasma a
AFQ1 (Wei y Hsieh, 1980). Como se observa, el metabolismo de la aflatoxina B1 produce tanto
metabolitos destoxificados como activados. El predominio de una u otra va metablica depende,
en parte, de la especie animal (Gorelick, 1990). En la tabla 8 se muestran los porcentajes de
produccin relativa de los diferentes metabolitos de aflatoxina B1 de forma comparativa entre
especies.
No solo los factores genticos determinan la produccin de los porcentajes relativos de los
metabolitos de aflatoxina B1. Se ha demostrado que algunos productos qumicos inducen una
relativa mayor produccin de algunos metabolitos, por ejemplo, los bifenilos policlorinados
(PCB) o polibrominados (PBB) y el metil colantreno aumentan la produccin de AFM1 y AFQ1
en el sistema MFO de ratas y hamsters, mientras que el fenobarbital deprime la produccin de
AFM1 y aumenta la de AFQ1 (Shepherd et al, 1984; Fukuhara et al, 1990).

13
En general, la destoxificacin heptica de las aflatoxinas se realiza por el mecanismo de
formacin de productos ms polares que puedan ser conjugados con aminocidos, cido

glucurnico, sulfatos o cidos biliares que ayuden a su excrecin, tal como se realiza para otros
xenobiticos. El 8,9-xido de AFB1 se excreta conjugado al glutatin (Swick, 1984; Cole et al,
1985).
Tabla 8. Metabolismo in vitro de la afaltoxina B1 en diferentes especies. (Distribucin porcentual de los
productos metablicos).
AFM1

Ro

AFB2a

4.0

2.0

3.3

8.3

4.0

0.6

0.4

35.1

1.6

1.1

6.0

0.4

humano

33.3

8.5

3.8

0.7

0.7

ratn

21.6

1.7

2.8

1.8

1.3

0.4

rata

18.7

1.3

0.9

1.5

0.2

Especie

AFB1

AFQ1

AFP1

mono

48.3

10.1

hmster

40.5

pato

(Patterson,1977)

Las aflatoxinas P1 y Q1 son consideradas poco txicas, debido a que son rpidamente conjugadas
con sustancias hidrosolubles (Swick, 1984), lo que les permite una rpida excrecin. Como se ve
(tabla 8), estas aflatoxinas son los metabolitos que predominan en el ratn y en el mono, especies
resistente y poco sensible respectivamente, a los efectos carcinognicos (Tulpule, 1981; Swick,

14
1984). La aflatoxina M1 (AFM1) mantiene una considerable toxicidad y sus propiedades
carcinognicas (OPS-OMS, 1983). Los primeros estudios que se realizaron de la toxicidad de la
AFM1 revelaron que esta posea similar toxicidad a la AFB1, pero actualmente se conoce que es
menos txica (Ferrando et al, 1984) y menos hepatocarcinognica que su antecesora metablica
(2-10 % de la AFB1) (Hsieh et al, 1986). La mayor importancia toxicolgica de la AFM1 radica
en que al poder encontrarse en la leche o productos lcteos y no ser un producto destoxificado,
constituye un peligro para la salud pblica. El aflatoxicol es tambin txico. Debido a la
reversibilidad de la reaccin de formacin, se considera una reserva metablica de aflatoxina B1.
El 8,9 xido de aflatoxina B1 es el metabolito activado. Su principal caracterstica es la capacidad
de unirse a las macromolculas (protenas, ADN y ARN) formando aductos (figura 5). Los
primeros en ser descubiertos fueron los aductos AFB1-ADN. Posteriormente fue comprobado que
despus de una dosis nica de AFB1, del 1 al 3% de esta toxina se une a la albmina srica
formando aductos AFB1:albmina, que pueden tambin ser observados en la exposicin crnica.
Existe una relacin constante entre los aductos hepticos (AFB1-ADN) y los plasmticos AFB1albmina (Wild et al, 1986).
3.2.2-Efectos bioqumicos.
Las acciones xicas de la aflatoxina B1 a nivel bioqumico se ejercen en el metabolismo de las
protenas, lpidos y carbohidratos, en el transporte electrnico de la cadena respiratoria y en las
membranas celulares y subcelulares (Patterson, 1977). Sin embargo, uno de sus efectos txicos
ms importantes es el relativo a su interaccin con el cido desoxirribonucleico (ADN), por los
efectos mutagnicos y carcinognicos que esta implica.

15

En una revisin realizada por Patterson (1977) se plantea que entre los principales efectos
bioqumicos est la inhibicin de la sntesis del cido ribonucleico (ARN) ADN dependiente, en
el ncleo de las clulas hepticas. Ello provoca rpidamente una inhibicin de la biosntesis de las
protenas nucleares, mientras que posteriormente es inhibida la sntesis de protenas en el sistema
microsomal (protenas de exportacin). En cuanto a sus efectos en el metabolismo de los
carbohidratos, se plantea que la AFB1 disminuye las actividades UDP glucosa-glucgeno
transglucosilasa y glucosa 6-fosfatasa (G-6-Pasa), trastornos bioqumicos que se relacionan con la
deplecin de las reservas de glucgeno heptico y los cambios morfolgicos observados en el
retculo endoplasmtico, respectivamente, teniendo en cuenta que la G-6-Pasa es especfica del
retculo endoplasmtico. Los cambios grasos hepticos observados en la intoxicacin por
aflatoxina B1 han sido explicados por los efectos que esta ejerce en el transporte de los lpidos del
hgado. Se ha encontrado tambin que esta toxina inhibe la actividad tioquinasa, esencial para la
activacin del acetato en acetil CoA. Otra alteracin bioqumica relacionada con el metabolismo
de los lpidos es el trastorno del metabolismo de los carotenoides observado en las aves
(Tyczkowski y Hamilton, 1987). Los efectos txicos metablicos de la aflatoxina B1, a nivel de
los organelos celulares, han sido descritos como un aumento en la permeabilidad de las
membranas mitocondriales, que interrumpe el transporte de electrones de la cadena respiratoria y
tambin el aumento en la permeabilidad de las membranas lisosomales con salida al exterior de
las hidrolasas cidas (OPS-OMS, 1983). Hay que destacar que las alteraciones bioqumicas
descritas son las causantes de los efectos adversos que se observan en la intoxicacin aflatoxnica
en el hombre y en los animales, que en estos ltimos provoca una disminucin de sus capacidades
productivas.
3.2.3-Carcinogenicidad.

16
La carcinogenicidad de la aflatoxina B1 fue probada por primera vez por Lancaster et al (1961),
quienes produjeron hepatomas en ratas a las que se les suministr el mismo alimento de man,
implicado en la enfermedad X de los pavos, con anterioridad a descubrirse la verdadera identidad
de esta toxina. Posteriormente, se probaron experimentalmente, sus efectos carcinognicos en
otras especies de animales, tales como patos, (Carnaghan, 1965), trucha arco iris (Salmo
gardneri) (Halver, 1967), monos (Gopalan et al, 1972), entre otras.
Boutibonnes et al (1984) realizaron un estudio de la actividad genotxica de 33 micotoxinas
utilizando la prueba de reparacin del ADN o efecto "REC" y encontraron que la AFB1 presenta
una actividad genotxica potente. Martin y Garner (1977) postularon que la capacidad de producir
mutaciones de la aflatoxina B1 podra deberse a la habilidad de un metabolito activado de unirse
covalentemente a la guanina del ADN en la posicin N-7 (aductos) (figura 5), adems de que esta
reaccin podra ser importante en la iniciacin del cncer. Hoy est bien establecido que los
carcingenos qumicos, como es el caso de la aflatoxina B1, se unen covalentemente al ADN
formando aductos (Modali y Yang, 1986; Yu et al, 1990) y que el mecanismo de produccin de la
mutagnesis de AFB1 es el mismo que el de los agentes alquilantes, produciendo mutaciones
puntuales (Modali y Yang, 1986) (figura 6). Estos mismos autores plantearon un posible
mecanismo de la iniciacin oncognica en el cual tambin est involucrado el 8,9 xido de AFB1
a travs de la activacin qumica de un proto-oncogen (figura 7).

17

3.2.4-Teratogenicidad
Los efectos teratognicos de la AFB1 se informaron, por primera vez, por Elis y DiPaolo (1967)
en hamsters que recibieron una dosis de 4 mg AFB1/kg de peso el octavo da de gestacin. Las
principales lesiones encontradas estuvieron a nivel del sistema nervioso central. Otros autores
(Ong, 1975) tambin han informado estos efectos. Por otra parte, Llewellyn et al (1977)
encontraron que la AFB1 retarda el proceso de blastulacin y gastrulacin en Medaka Japonesa
(Oryzias latipes) en forma proporcional a la dosis utilizada, as como produce efectos
teratognicos variados a nivel del sistema circulatorio, vejigas urinaria y natatoria y en el sistema
ptico. Sin embargo, no pudo demostrarse la aparicin de malformaciones groseras en embriones
de pollo a los que se les administr dosis subletales de AFB1, que mostraron solo retardo en el
crecimiento (Shibko et al, 1968). Otras acciones txicas de la AFB1 relacionadas con la
teratogenicidad, son la relativa a la induccin de aberraciones cromosomales que esta toxina
produce en clulas humanas (Promchainant et al, 1972) y de ratones (Krishnamurthy, 1986) y el
efecto que ocasiona en el ndice meitico en curieles (Ranjan y Sinha, 1989).
3.2.5-Inmunodepresin
En la dcada del 70 comenzaron los estudios relacionados con el efecto negativo de las
aflatoxinas en el sistema inmunolgico (Pier et al, 1977). As, numerosos autores han informado
que el consumo de bajas dosis de aflatoxinas afecta la resistencia natural o adquirida a
enfermedades infecciosas en animales de experimentacin (Wei y Hsieh, 1980) y en animales
productivos (pollos) (Ilgaz, 1985), que la AFB1 afecta el sistema inmune humoral y celular en
pollos (Giambrone, 1978), que las inmunoglobulinas sricas en terneros disminuyen por la accin
txica de la AFB1 (Balaraman y Arora, 1987), que la actividad del complemento se ve reducida y
que retarda la produccin de interfern (Wei y Hsieh, 1980). Todos estos hechos, unidos a la
tambin disminuida capacidad de los linfocitos y fagocitos producida por la ingestin de
aflatoxinas, reducen las defensas contra los microorganismos (Wei y Hsieh, 1980; Slowick et al,
1985; Raisuddin et al, 1990; Pier, 1992).

18
3.2.6-Efectos txicos en animales
A pesar de las diferencias en susceptibilidad, prcticamente en todas las especies animales, se han
informado los efectos txicos de las aflatoxinas. Entre estas, la de mayor toxicidad aguda es la
aflatoxina B1, lo que puede apreciarse por las bajas DL50 que presentan (Tabla 9).
Tabla 9. Toxicidad aguda de la Aflatoxina B1 en diferentes especies.
Especie

DL50
(mg/kg)

Especie

DL50
(mg/kg)

patico
conejo
pavo
gato
cerdito
perro
curiel
ovejas

0.3 - 0.6
0.3 - 0.5
0.5 - 1.0
0.55
0.62
1.0
1.2 - 2.0
2.0

cerdo
caballo
mono
pollo
rata
ratn
hmster
trucha

2.0
2.0
2.0
2.0 - 6.3
5.5 - 18.0
9.0
10.0
0.8

Pequeas variaciones en la estructura de las aflatoxinas implican tambin variaciones en su


toxicidad. En la tabla 10 se muestra la dosis txica de varias aflatoxinas en paticos de un da de
nacidos (Applebaum et al 1982).
Tabla 10. Toxicidad relativa de las diferentes aflatoxinas en patos.
aflatoxina
B1
B2
G1
G2
M1
M2

DL50 (mg/kg)
0.36
1.7
0.8
2.5
0.8
3.1

El principal efecto txico crnico de las aflatoxina B1 es la carcinogenicidad. La susceptibilidad a


estos efectos entre especies est relacionada con la velocidad de su metabolismo en general y con
el predominio de una u otra ruta metablica. Tulpule (1981) plantea que las especies que
metabolizan rpidamente la aflatoxina son ms susceptibles a los efectos agudos y las que la
metabolizan ms lentamente, lo son ms a los efectos carcinognicos (tabla 11).
Tabla 11. Velocidad metablica comparativa del metabolismo de la aflatoxina B1 (in vitro).

19

Especies

Tiempo*

Velocidad

conejo

39.6 seg

rpidos

patico

49.8 seg

mono (Rhesus)

6.4 min

cobayo

11.8 min

humano

13.3 min

pollo

32-97 min

ratn

1.57 h

cerdo

2.50 h

carnero

4.26 h

intermedios

rata
0.8-2.6 das
lentos
(Tulpule 1981)
* Tiempo para metabolizar una DL50
Los sntomas de la intoxicacin por aflatoxinas son inespecficos y son similares para todas las
especies de animales: prdida de apetito y disminucin de sus capacidades productivas en general,
segn la especie; disminucin en la ganancia en peso y disminucin en la conversin alimentaria
(Dieckman y Green, 1992), como disminucin en la puesta de huevos en las gallinas (Iqbal et al,
1983); disminucin en la produccin de leche en las vacas (Key, 1978); trastornos reproductivos y
hormonales (Guthrie, 1979; Clarke y Ottinger, 1984) y disminucin de la resistencia
inmunolgica (Pier et al, 1977). Los signos clnicos ms frecuentes son los relacionados a la
disfuncin heptica: incremento en la actividad srica de enzimas hepticas y trastornos en la
coagulacin. En todas la especies el hgado se encuentra congestionado, con infiltracin de grasa
y al examen microscpico pueden observarse, hemorragias centrolobulillares y proliferacin de
los conductos biliares que pueden llevar a la atrofia del rgano. En la tabla 12 se muestra un
resumen de los principales sntomas de aflatoxicosis en animales de importancia productiva.
3.2.7-Relacin de las aflatoxinas con algunas enfermedades en el hombre.
Entre las enfermedades que han sido relacionadas con la ingestin de alimentos contaminados con
aflatoxinas estn en primer lugar, el carcinoma hepatocelular (CHC), el cncer de pulmn y de
colon, el sndrome de Reye, el kwashiorkor y la hepatitis txica.
Para los estudios de los efectos cancergenos de la aflatoxina B1 en el hombre, ha sido utilizado,
principalmente, el mtodo estadstico que relaciona el nivel de contaminacin encontrado en los
alimentos con los porcentajes de aparicin de carcinoma hepatocelular y otros tumores en ciertas
poblaciones. Tambin se ha dosificado la aflatoxina B1 con sus metabolitos (Fukal y Reisnerova,
1990) y sus aductos (Wild et al, 1990) en fluidos biolgicos (orina, sangre, leche) de pacientes, en
poblacin normal, y en los rganos internos (hgado) de fallecidos en enfermedades oncolgicas u

20
otras en las que fue sospechada su relacin con la aflatoxicosis (Dvorackova et al, 1977, Harrison
et al 1993).
Los informes iniciales de la relacin de la ingestin de aflatoxina B1 y la aparicin de CHC fueron
realizados en Uganda, en Swazilandia, en Tailandia, Kenya y en Mozambique durante la dcada
del 70 (OPS-OMS, 1983). Un estudio realizado en Filipinas por Bulatao-Jayme et al, (1982)
demostr una fuerte asociacin entre la ingestin de cantidades crecientes de aflatoxina y el riesgo
de desarrollar CHC, habindose encontrado tambin que el consumo de alcohol y el tabaquismo
son factores de riesgo asociados. Ms modernamente se conoce que el virus de la hepatitis B es
otro factor de riesgo al CHC (Austin et al, 1986; Wild et al, 1993).

21
Tabla 12. Sntomas de aflatoxicosis por especies.
Especies

Sntomas afaltoxicosis

Referencia

Aves

-Disminucin en la ganancia de peso.


-Hgado graso.
-Incremento de la actividad de las enzimas hepticas en el
suero.
-Disminucin de la solidez sea.
-Hipocarotenoidemia y esteatorrea.
-Trastornos reproductivos y hormonales.
-Trastornos en la incubabilidad de los huevos.

Doerr et al, 1983


Dalvi y McGowan, 1984
Chan et al, 1985
Washbur et al, 1985
Halama, 1981
Tyczkowski y Halmitton,
1987
Clarke y Ottinger 1984
Parkinson et al, 1989

Bovino

-Disminucin de la motilidad ruminal.


-Inapetencia.
-Sequedad del contenido ruminal con
constipacin.
-Hemorragias centrolobulillares con infiltracin de
linfocitos.
-Incremento de la actividad de las enzimas hepticas en el
suero.
-Disminucin de la produccin de leche.

Cook et al, 1986


Wyatt et al, 1985.

Ovino

-Inapetencia.
-Diarrea.
-Salivacin.
-Atona ruminal.
-Hgado congestionado.
-Aumento de la actividad de las enzimas hepticas en el
suero.

Sulliman et al, 1987


Miller et al, 1984

Cerdos

-Inapetencia.
-Ictero.
-Proliferacin de conductos biliares
-Infiltracin de grasa en el hgado
-Disminucin de la resistencia inmunolgica.
-Hepatitis hemorrgica.
-Disminucin en la conversin alimentaria.

Armbrecht, 1978
Wilson et al, 1984
Panangala et al, 1986

22
Los estudios de la relacin entre la ingestin de alimentos contaminados con aflatoxinas y la
presentacin del carcinoma hepatocelular siguen realizndose en Zimbabwe (Nyathi et al, 1987),
en Swaziland (Peer et al, 1987), Africa del Sur (Lotter y Krohn, 1988), en norteamrica
(Groopman et al, 1988), Tailandia (Wild et al, 1989) y China (Groopman et al 1993).
Recientemente se ha planteado que entre los consumidores de herona existe una alta probabilidad
de adquisicin de aflatoxinas por va endovenosa provenientes de la contaminacin de la planta,
lo que provoca que estos sean ms susceptibles a contraer SIDA y hepatitis a virus B por estar
inmunodeprimidos. De hecho, la aflatoxina B1 se encontr en nueve muestras de orina
procedentes de trece heroinmanos callejeros (9616 pg/g) y en el 20% de 113 adictos de
Inglaterra y Holanda (Hendrickse et al, 1989).
En el monitoreo del riesgo a CHC por aflatoxinas y en investigaciones de sus causas, se
recomienda utilizar la medicin de los aductos AFB1-ADN en el hgado de pacientes fallecidos de
CHC (Garner et al, 1988 a) y en la orina (Groopman et al, 1985), la de los aductos AFB1albmina en el suero (Wild et al, 1990), los cuales reflejan la exposicin a aflatoxinas en los
cuatro a seis das anteriores al estudio (Xavier y Muoz, 1987). Las tcnicas que ms
ampliamente se utilizan para medir exposicin a aflatoxinas son los procedimientos
inmunolgicos RIA (Sizaret et al, 1982; Fukal y Reisnerova, 1990) o ELISA (Denning et al,
1988; Garner et al, 1988 b). Otra forma de determinar exposicin a las aflatoxinas es medir la
aflatoxina M1 en leche materna. En un estudio realizado en Zimbabwe, en mujeres durante el
perodo de lactacin se encontr la presencia de aflatoxina M1 en muestras de leche materna
(Wild et al, 1987), lo que constituye un riesgo enorme para los bebs.
Los individuos que trabajan en procesadoras de alimentos tambin estn expuestos a una
contaminacin por aflatoxinas, debido a sus propiedades electrostticas. Autrup et al (1993)
encontraron la presencia de aductos de aflatoxina B1-albmina en el suero de 7 trabajadores de un
total de 45 muestreados que trabajaban en compaas procesadoras de alimentos para el consumo
animal en Dinamarca.
En cuanto a las otras enfermedades que han sido relacionadas a la aflatoxina B1, existen
evidencias al respecto, tales como las de Dvorackova et al (1981), quienes encontraron aflatoxina
B1 en pulmones de dos pacientes fallecidos de cncer del pulmn; las de Stora et al (1982)
relacionadas con el cncer de pulmn con aspiracin de polvo contaminado con A. flavus, y las de
Deger (1976), quien encontr relacin entre el cncer de colon y la ingestin de aflatoxinas. En
cuanto al sndrome de Reye, Shank et al (1971), Dvorackova et al (1977) y Stora et al (1983) han
notificado la presencia de aflatoxinas en los rganos de nios fallecidos de esta enfermedad. Por
otra parte, la relacin aflatoxinas-kwashiorkor fue sealada por Hendrickse et al (1983), Apeagyei
et al (1986) y Hendrickse (1991), quienes tambin encontraron aflatoxinas en los hgados de nios
con esta enfermedad. Otras enfermedades hepticas han sido asociadas a las aflatoxinas: la
cirrosis infantil de la India (Yadgan et al, 1970) y la hepatitis txica, ocurrida tambin en la India
(Krishmamachari et al, 1975).

23
En Cuba un estudio realizado por Alvarez et al (1991) informaron la presencia de aflatoxina B1
en orina de pacientes peditricos, donde el 56% de los positivos correspondieron a pacientes
diagnosticados con hepatitis crnica y portadores de antgeno de superficie del virus de la
hepatitis B, mientras que en personas sanas se encontr solo un 7,5% de positividad. Tambin en
1988 se haba reportado un 58% (140 muestras analizadas) de positividad a aflatoxina B en la
orina de pacientes peditricos con enfermedades hepticas provenientes del municipio de San
Cristbal en Pinar del Ro (Perguero, 1988).
4-Mtodos de anlisis.
El xito en la determinacin de un residual en los alimentos, o en materiales biolgicos, se debe a
un conjunto de procedimientos que hacen posible una determinacin ms precisa y exacta
independientemente del mtodo analtico. Entre las etapas a considerar para llevar a cabo la
deteccin de aflatoxinas en los alimentos estn: muestreo, extraccin, purificacin o limpieza y
deteccin.
4.1-Muestreo.
El muestreo implica una seleccin de una muestra representativa de un lote (la cantidad de
producto o granos entregados o recibidos, en un determinado momento que tiene propiedades
comunes o caractersticas uniformes) que posibilita un anlisis ms preciso de la sustancia objeto
de estudio.
La distribucin de micotoxinas en los productos tiene un carcter discreto o heterogneo, y es
posible que solo un pequeo porcentaje de partculas de un lote est contaminado con niveles
extremadamente altos de toxina. Un estudio realizado por Whitaker et al (1979) de un lote de
man con una concentracin de aflatoxina B1 de 1 mg/kg, evidenci variaciones en el contenido
de esta en granos individuales de 106 mg/kg.
En los resmenes realizados por Campbell et al (1986) y Jewers et al (1989) sobre el muestreo, se
hace referencia a la variabilidad que existe en la concentracin de aflatoxina B1 en diferentes
muestras de un lote nico (tabla 13). Estos resultados nos indican que si la muestra de prueba no
es representativa, el resultado obtenido en el laboratorio caracteriza solamente a la muestra
enviada y no al lote completo, por lo que el muestreo constituye la principal fuente de error en la
determinacin de micotoxinas.

24
Tabla 13. Concentracin de aflatoxina en diferentes muestras colectadas a partir de un lote nico
de varios productos.
Cosecha

total de
muestras

<5-50

50-100

100-200

200-300

>300

g/kg

g/kg

g/kg

g/kg

g/kg

264

214

21

11

10

96

76

11

harina de man

96

33

38

11

torta de

130

75

47

man

165

50

semillas de algodn
semillas
de palmas
maz

Tejada, 1992
Whitaker et al (1979) plantearon que el error total en la determinacin de aflatoxinas en alimentos
era la suma de todos los errores durante el muestreo y el anlisis (figura 8). Ellos obtuvieron
coeficientes de variacin de 21, 8, 11, y 26% para la muestra (4.55 kg), submuestra gruesa y fina
(1 kg) y la muestra de anlisis, respectivamente, con una concentracin promedio de 20 g/kg. En
un estudio similar realizado en un lote de man con una concentracin de 20 g/kg se obtuvieron
coeficientes de variacin de 55, 19 y 16 % para una muestra de 21,8 kg, submuestra de 1.1 kg y el
anlisis de dos porciones de la muestra, respectivamente, con un error total del 80%. Otro factor
que influye en la determinacin de micotoxinas es el tamao del lote y este vara en dependencia
del producto (tabla 14).
Para disminuir los errores durante la preparacin de la muestra se han desarrollado muestreadores
que operan continuamente durante la pulverizacin y homogeneizacin, lo que permite un
proceso ms eficiente, esos son: el mezclador separador cortante vertical Hobbart y los molinos
Dickens-Satterwhite y Rommer.
Figura 8. Pasos tpicos empleados para estimar la concentracin de aflatoxinas en granos
asociados a la fuente de variacin.

25
Tabla 14. Tamao del lote y de las muestras primaria, bruta y contra actual que deben tomarse
para la determinacin de aflatoxina B1.
Cosecha

Semillas largas

(copra)

Lote

Muestra

Muestra

Muestra de

(ton)

primaria

Bruta

anlisis

(kg)

(kg)

(kg)

500

200

500

0.5

100

100

0.1

20

Semillas medianas
(maz,man)
Semillas pequeas
(sorgo ajonjol)
Tejada, 1992
Los muestreos pueden realizarse de diferentes formas: en el campo, en el almacn (granel o sacos)
o en los silos. El muestreo de campo es poco eficiente debido a la complejidad de tomar una
muestra representativa. En un estudio realizado en un campo sembrado con maz se obtuvieron
altos valores de coeficientes de variacin (133, 83, 62, 48 y 29%) durante la determinacin de
aflatoxinas en los granos, cuando se analizaron 33, 100, 400, 800 mazorcas y el campo completo,
respectivamente (Davies, 1980).
Con vistas a evaluar los planes de muestreos se han desarrollado modelos estadsticos que
permiten describir la distribucin de las aflatoxinas en los productos agrcolas. Los principales
son: la distribucin binomial negativa, la distribucin Poison Gamma (Waibel, 1974), la
distribucin normal de Gauss para el logaritmo de los niveles de aflatoxina distintos de cero
(Brown, 1984) y la distribucin de Weibull (Jewers et al, 1986), la cual es la ms aplicada (Jewers
et al, 1989).
Los planes de muestreo y los lmites mximos permisibles de micotoxinas en los alimentos son
establecidos por cada pas, esto se observa cuando el tamao del lote para el diagnstico de
aflatoxina en man puede variar desde 7,5 kg hasta 21,8 kg por unidades de muestreo; adems, los
lmites admisibles de aflatoxina en alimentos para Estados Unidos, Inglaterra y Alemania son 15,
10 y 3 pg/kg respectivamente (Whitaker et al, 1995).
4.2-Extraccin
La extraccin se refiere a remover la sustancia objeto de estudio de una muestra para su posterior
deteccin y cuantificacin. El proceso de extraccin tiene que ser eficiente, cuantitativo, no debe
modificar la estructura de la sustancia y debe mantener sus propiedades biolgicas (Ellis et al
1991).

26
Las primeras extracciones de aflatoxinas de los alimentos se realizaron con una previa
delipidacin con n-hexano o ter de petrleo (Beljaars et al, 1972). Sin embargo, fue comprobado
que la extraccin no se afecta por la presencia de lpidos o pigmentos. Asimismo, si se considera
que los lpidos son solubles en los mismos solventes que se emplean en la extraccin de
aflatoxinas, parte de ellas se arrastraran con la delipidacin y conllevara pasos adicionales para
realizar una extraccin selectiva, lo que en lugar de reducir pasos en el anlisis para simplificarlo,
lo complica y lo hace menos eficiente (Chu 1992).
Los procedimientos ms empleados en la extraccin de aflatoxinas de los alimentos y que han
sido oficializados por la AOAC, son: Contaminates Bureau (CB) y Best Food (BF) que emplean
cloroformo y metanol : agua (55:45 v/v) respectivamente. Existen otros que tambin se han
aprobado como es acetona:agua (85:15 v/v) (AOAC, 1990; Richard et al, 1993). No todos los
solventes presentan la misma eficiencia de extraccin y esto vara en dependencia del sustrato y la
relacin del extrayente con la muestra (Cole y Doner, 1994; Bradburn et al, 1995).
Cuando se analizan fluidos biolgicos, la extraccin de la aflatoxina se puede realizar de forma
directa adicionando un solvente a una muestra acidificada o desproteinizada previamente
(Shepherd et al, 1986; Castegnaro et al, 1990). As se alcanza un recobrado de la toxina entre 6080 %; sin embargo, cuando la extraccin de la toxina se realiza a travs de columnas de Sep-Pak
(C10 o slica) (Ferguson-Foos y Warren, 1984; Bijl y vanPeteghem, 1985) o de afinidad
(Groopman y Donahue, 1988; Fremy y Chu 1989) los recobrados oscilan entre 90-100%.
No existe un mtodo de aplicacin general a la extraccin de aflatoxinas, ya que este vara en
dependencia del producto (tabla 15). Los tipos de solventes ms comnmente empleados durante
la extraccin se muestran en la tabla 15.
4.3-Purificacin.
La purificacin previa de las toxinas en el extracto del material analizado es necesaria cuando se
emplean procedimientos fsico-qumicos en la deteccin, pero cuando se utilizan procedimientos
inmunolgicos, el paso de purificacin se omite analizndose solamente el extracto diluido
(Escobar et al, 1991b).
Mientras ms pasos se usen para la purificacin, ser menor el recobrado de las toxinas. La
eficiencia en el recobrado de la toxina durante la purificacin de la muestra aumenta con el
empleo de columnas pre-empacadas, debido a que se eliminan pasos de la purificacin como son:
la rotoevaporacin, particin con otros solventes para lograr una extraccin selectiva y el empleo
de grandes volmenes de solventes, que dificultan su manipulacin. Las columnas ms empleadas
para la purificacin de la aflatoxinas en los alimentos son: Sep-Pak (Chu, 1991), Bond Elut (Scott
y Lawrence, 1988), Ciano (Cohen y Lapointe, 1986), Fenil (Bradburn et al, 1990a), Chem Elut
(Hutchins et al, 1989) y de afinidad (Kaveri et al, 1987).
Con los procedimientos anteriores se logran los mximos recobrados de las aflatoxinas presentes
en el medio con un grado de pureza mayor de 90%; sin embargo, con el empleo de columnas de
inmunoafinidad se logran extracciones selectivas de las diferentes aflatoxinas, pero el recobrado

27
de la toxina est en dependencia de la calidad del anticuerpo inmovilizado en el soporte (Shepherd
et al, 1987).
En un estudio interlaboratorio donde participaron nueve laboratorios de diferentes pases Nrdicos
evaluaron una columna de inmunoafinidad (aflatest) para la determinacin de aflatoxinas B y G
en diferentes muestras obteniendo buenos ndices de repetibilidad y reproductividad para todos
los tipos de muestras analizadas, aunque presentaron dificultades con el recobrado a partir de
algunas muestras en los distintos laboratorios, donde el valor de Horrat para la aflatoxina G fue
muy alto debido al bajo recobrado de esta toxina (Barmark y Larsson 1994).
Tabla 15. Solventes de extraccin empleados para el anlisis de aflatoxinas en los alimentos.
Alimentos

Solventes de Extraccin

Mtodo

Semillas de algodn

Acetona:Agua (85:15 v/v)

975.36 d

Maz
Man y sus derivados

980,20 d
-Cloroformo:Agua (10:1v/v)

CB

-Metanol:Agua (55:45 v/v)

968.22 d

Cacao

-Hexano, Cloroformo

Caf y Coco

-Cloroformo:Agua (91:9 v/v)

BF 970.45 d

Huevo

-Sol. saturada NaCL

978.15 c

Sol. Acetato de plomo


Cloroformo
Leche

-Acetona:Agua 70:30 v/v),

980.21 c

Cloroformo

986.16 d

-Sep-Pak C18
AOAC (1990)
Kaveri et al (1987) emplearon columnas de afinidad con un anticuerpo monoclonal de un ttulo de
1:6000 para analizar muestras de leche con un nivel mximo de 0,1 ng de aflatoxina M1/mL y
obtuvieron un 85% de recobrado de la toxina. Farjam et al (1991) prepararon columnas de
inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales y policlonales y obtuvieron diferentes capacidades
de unin de la aflatoxina M1, en un rango dinmico de concentracin entre 0,04-1,5 ng/mL y
0,02-10 ng/mL para columnas con anticuerpos policlonales y monoclonales respectivamente.
Ambas columnas pueden reutilizarse hasta un mximo de 10 corridas con recobrados por encima
del 80% cuando se eluyen con dimetilsulfxido al 75%. Las columnas de afinidad comerciales
(Biocode y Aflatest) estn preparadas de tal manera que pueden detectar hasta un mximo de 50

28
ng de aflatoxina por gramo de muestra para ser usadas en una sola ocasin, ya que se eluyen con
metanol o acetonitrilo para obtener el mximo de recobrado.
Una columna multifuncional para la purificacin de aflatoxina a partir de diferentes muestras fue
validada en un estudio interlaboratorio, la columna multifuncional est preparada con una mezcla
de diferentes soportes (fase reversa, exclusin e intercambio inico) con la finalidad de retener
interferencia tales como: grasa, pigmentos, carbohidratos y protenas, los recobrados obtenidos
para todas las aflatoxinas fueron superiores al 95% (Trucksess et al, 1994).
4.4-Deteccin.
Los mtodos de deteccin pueden dividirse en biolgicos y fsico-qumicos (Buckle y Sanders,
1990). Las varias divisiones y subdivisiones de los mtodos de determinacin de aflatoxinas en
cada grupo se muestran en la figura 9.
4.4.1-Cromatografa de capa delgada.
La cromatografa en capa delgada (CCD) es la tcnica ms utilizada en el anlisis de aflatoxinas y
otras micotoxinas. El xito de su aplicacin depende del tipo de adsorbente, del sistema de
solventes y del mtodo de deteccin. Los adsorbentes ms comunes son: la slica gel G60 y la
slica gel F 254, que pueden estar sobre soporte de cristal, plstico o metal (5x20 cm, 10x20 cm
20x20 cm) con un grosor que vara desde 0,1 hasta 1mm.

Para las aflatoxinas, el soporte ms usado es el de slica gel G 60 (Miguel y de Andrs, 1982) y
los solventes ms utilizados son: cloroformo, metanol, benceno, acetona y ter etlico, preparados
en diferentes proporciones. En la tabla 16 se muestran algunos de los sistemas de solventes y los
Rf de las principales aflatoxinas. El sistema de deteccin de las aflatoxinas se basa en la

29
fluorescencia que ellas emiten, aunque su confirmacin se realiza por su reaccin con una
sustancia qumica (Nesheim y Brumley, 1981). La sensibilidad, exactitud y resolucin del anlisis
de aflatoxinas por cromatografa de capa delgada se vieron mejoradas con la introduccin de la
cromatografa de capa delgada de alta resolucin (HPTLC) (Bradburn et al, 1989, 1990 b), donde
el soporte de los platos empleados pueden ser de fase normal (slica) o de fase reversa (Abramson
et al, 1989).
Tabla 16. Solventes empleados en cromatografa de capa delgada y valores de Rf para las
principales aflatoxinas.

Sistema de solvente

B1

B2

G1

G2

Cloroformo:acetona (9:1v/v)

44

37

34

29

Benceno:metanol:ac. actico (90:5:5 v/v/v)

26

23

20

19

Cloroformo:acetona:hexano

48

43

36

30

Tolueno:etil-acetato: ac. frmico (6:3:1


v/v/v).

35

28

25

15

Benceno:etanol (95:1 v/v)

25

23

23

20

(85:15:20)

Los valores numricos corresponden a los Rf x 100


(Isaaq y Cutchin 1981)
En un estudio comparativo de diferentes mtodos, Bradburn et al (1990a) encontraron que el
procedimiento de HPTLC bidimensional con una fase estacionaria modificada (fenil) present los
mejores recobrados de aflatoxinas, con respecto a las tcnicas de CB, BF y Rommer. En otro
estudio comparativo de los procedimientos de HPTLC, HPLC y ELISA en la determinacin de
aflatoxinas en mantequilla de man se encontr que la exactitud y la reproducibilidad por HPTLC
y HPLC fueron similares, sin embargo, el ELISA present coeficientes de variacin (CV) mucho
mayores y menor reproducibilidad con respecto al HPTLC (Dell et al, 1990).
Un procedimiento que combina las ventajas del HPTLC y la cromatografa lquida (HPLC) fue
desarrollado para aumentar la resolucin entre las muestras y el nmero de muestras a analizar.
Este mtodo se fundamenta en el desarrollo de una cromatoplaca en forma horizontal sometida a
una sobrepresin y se conoce en ingls como OPLC (Overpressure Layer Chromatography). En
un estudio donde se compararon diferentes procedimientos cromatogrficos se encontr que la
resolucin entre las aflatoxinas G1/B2 aument de 0,82 a 1,25 cuando se analizaron por HPTLC y
OPLC respectivamente. Lo mismo sucedi para las combinaciones B2/B1 (1,12 a 1,6) y G2/G1
(1,12 a 1,45), adems el tiempo de desarrollo de la cromatoplaca disminuy de 40 minutos a 12
minutos con HPTLC bidimensional y OPLC respectivamente (Vradi et al, 1986).

30
4.4.2-Minicolumnas.
La determinacin de aflatoxinas en alimentos por el mtodo de minicolumnas (AOAC, 1990)
conlleva menos gasto de reactivos y tiempo que la CCD. Para esto se utilizan tubos de cristal de 6
mm de dimetro y 190 mm de largo que se llenan con almina, florisil y sulfato de sodio. Las
aflatoxinas se detectan por la aparicin de una banda fluorescente entre las capas de almina y
florisil que ser mayor con mayores concentraciones de aflatoxina. Con este mtodo pueden
detectarse concentraciones de 5 g/kg en almendras y 10 g/kg en man (AOAC, 1990).
Juegos comerciales de la Oxoid (Koeltzow y Tanner, 1990) y Biocode (Bisson et al, 1994)
emplean minicolumnas de florisil y almina para la determinacin de la aflatoxina B1, en
extractos purificados por afinidad. Otra firma comercial Terratek emplea minicolumnas con
soportes de aluminosilicatos para la determinacin de diferentes micotoxinas como son
aflatoxinas, fumonisinas y vomitoxina con lmites de deteccin de 20 g/Kg, 5 mg/Kg y 1 mg/Kg
respectivamente.
4.4.3-Cromatografa Lquida de alta resolucin (CLAR o HPLC).
La cromatografa lquida de alta resolucin o alta presin (CLAR) constituye otro de los mtodos
de determinacin de aflatoxinas en diferentes medios. Esta tcnica presenta una serie de ventajas
con respecto a la cromatografa de placa y minicolumnas, ellas son: aumento de la sensibilidad,
exactitud, precisin y resolucin, adems que el sistema puede ser automatizado muy fcilmente.
El xito de este mtodo radica en el tipo de columna, detector y sistema de solventes que se
utilicen. En la determinacin de aflatoxinas se utilizan las columnas de slica gel y de fase reversa
(Stubblefield y Shotwell, 1977; Gilbert y Shepherd, 1985; Beaver 1989; Wilson 1989) y entre los
detectores, los ms usados son el ultravioleta y el de fluorescencia (Seiber y Hsieh, 1973; Gilbert
y Shepherd, 1985). Los detectores de fluorescencia tienen mayor sensibilidad, y puede ser
mejorada por el uso de una celda empaquetada con slica gel (Panalaks y Scott, 1977) y la
incorporacin de cido frmico a la fase mvil que evita el "quenching" en la fluorescencia de las
aflatoxinas B1 y B2 (Manabe et al, 1978; Francis et al, 1982).
La formacin de los derivados hemiacetlicos de las aflatoxinas B1 y G1 (B2a y G2a) aumenta su
fluorescencia y su polaridad y permite detectar concentraciones en el orden de los ng y pg (Tarter
et al 1984; Shepherd et al, 1986; Yen y Bidasee, 1993).
La derivacin de la toxina con iodo o bromo, despus de la separacin por columna (Tuinstra y
Haasnoot, 1983; Dorner y Cole, 1988) o el empleo de una precolumna de derivatizacin (Chu,
1991), tambin incrementan la fluorescencia de las aflatoxinas.
Una de las desventajas de la CLAR es que requiere de una purificacin previa de la muestra, lo
que encarece la determinacin. Shepherd et al (1986) evaluaron seis mtodos de extraccin y
procedimientos de limpieza qumica para la determinacin de aflatoxina M1 en leche y
encontraron que el mtodo que utiliza columna Sep-Pak fue el que present los mejores resultados
en trminos de velocidad, costo y limpieza del producto a analizar.

31
Se han desarrollado diferentes protocolos que automatizan los anlisis en los alimentos. Ellos
incluyen lneas de dilisis y concentracin (Tuinstra et al, 1990) o cromatografa de
inmunoafinidad (Carmen et al, 1989; Sharman y Gilbert, 1991), como paso de limpieza o
purificacin seguido de una separacin y cuantificacin por CLAR.
4.4.4-Cromatografa Gaseosa.
La alta polaridad, baja volatilidad e inestabilidad trmica de las molculas de aflatoxinas ha
limitado el uso de la cromatografa gaseosa para la determinacin de estas sustancias (Beaver
1986). Sin embargo, el empleo de columnas capilares de slica fundida y el uso de detectores de
espectrmetros de masa ha permitido detectar aflatoxina B1 en maz y mantequilla de man por
este mtodo (Rosen et al, 1989).
Con el empleo de detectores de ionizacin de llama con columnas capilares de slica fundida de
diferentes tamaos, se han podido separar las cuatro aflatoxinas naturales (B1, B2, G1 y G2), sin
embargo, cuando se emplearon columnas mayores la sensibilidad para las aflatoxinas del tipo G
fue menor que para las del tipo B (Goto et al, 1988).
4.4.5-Otros mtodos de deteccin.
Los mtodos instrumentales complementan a los procedimientos antes mencionados para
aumentar el poder resolutivo y deteccin de las sustancias.
Densitmetros (200-800 nm): Se aplican en la deteccin y cuantificacin de aflatoxinas u otras
micotoxinas una vez realizada la CCD y visualizada con anisaldehdo o algn otro reactivo
qumico (Sydenham et al, 1990) o por la fluorescencia que emite la propia sustancia al hacer
incidir la luz ultravioleta (Wu et al, 1990).
Espectrmetro de masa: Puede utilizarse solo o en combinacin con la cromatografa gaseosa
(Plattner et al, 1984; Mirocha et al, 1989) o lquida (Kostiainen, 1991; Kostiainen y Kurone,
1991; Hurst et al, 1991; Capiello et al 1995).
Los espectrmetros de masa pueden ser de ionizacin qumica positiva o negativa (Park et al,
1985; Kostiainen, 1988) y detectan iones moleculares. Adems existen otros mtodos de
ionizacin como la desorcin y bombardeo atmico rpido (Ackermann et al, 1987).
Entre los espectrmetros de masas ms usados, se encuentran los TANDEM, que son dos
espectrmetros de masa acoplados entre s. Su principio se fundamenta en una separacin
primaria de las diferentes sustancias y posteriormente la identificacin de estas (Uyakual et al,
1989).
4.4.6-Mtodos biolgicos.
Los bioensayos se emplean como mtodos complementarios de los procedimientos fsicoqumicos para determinar la actividad biolgica de las aflatoxinas (teratogenicidad y

32
mutagenicidad) y son tcnicas simples, inespecficas y poco sensibles.
Los bioensayos incluyen procedimientos de:
Cultivos de tejidos: Embrin de pollo, clulas de fibroblasto de ratn (Abbas et al, 1984) y clulas
de rin de hmster (Senter et al, 1991). Prelusky et al (1987) optimizaron el ensayo de
embriones de pollo y encontraron la menor variacin cuando se suministraba la toxina en los
sacos areos del huevo. Este mtodo ha sido oficializado por la Asociacin Oficial de Qumicos
Analistas (AOAC) para la confirmacin de la toxicidad de la aflatoxina B1 (AOAC, 1990).
Animales de laboratorio: Larvas de camarn, larvas de pescado cebra, planaria carmelita
(Lewelly, 1973), paticos de un da de nacidos y truchas, entre otros. La trucha es una de las
especies ms sensibles en exhibir los cambios patolgicos que ocurren en el hgado durante el
ensayo de la aflatoxina B1.
Microorganismos: Bacillus megaterium, B.brevis, Escherichia coli, B. subtilis, B. mycoides y
Brevibacterium spp. Discos impregnados con B. megaterium se han utilizado como mtodo
confirmatorio para el diagnstico de las aflatoxinas, similar al empleado en la determinacin de la
sensibilidad de los antibiticos.
4.4.7-Mtodos inmunolgicos.
El descubrimiento de la tcnica inmunolgica por Yalow y Berson (1959) y el desarrollo ulterior
de los procedimientos inmunoenzimticos por Engvall y Perlman (1971) y van Weemen y
Schuurs (1971) permitieron que estos mtodos sean de gran aceptacin por diversos laboratorios
para la determinacin de sustancias txicas en los alimentos y fluidos biolgicos.
Las tcnicas inmunolgicas se fundamentan en la reaccin antgeno anticuerpo y en dependencia
del compuesto marcado se clasifican. Si es un radioistopo se denominan Radioinmunoanlisis
(RIA) y si es una enzima se le llaman Enzimoinmunoensayos (EIA).
La reaccin inmunolgica se caracteriza por su alta especificidad y su capacidad de poder detectar
concentraciones en el orden de los ng y pg por mililitro de muestra.
4.4.7.1-Antgeno o Hapteno.
En las reacciones inmunolgicas intervienen un grupo de molculas que en dependencia de su
peso molecular son antgenos o haptenos. Las sustancias de alto peso molecular (PM> 5 000
daltons) que son portadoras de signos de extraeza gentica que al ser introducidas en el
organismo provocan el desarrollo de reacciones inmunolgicas especficas (respuesta humoral o
celular), reciben el nombre de antgenos. Estas sustancias deben presentar una estructura estable y
la posibilidad de ser degradadas (Petrov, 1987; Tizard, 1989). Los haptenos son molculas
extraas, pero de bajo peso molecular (PM< 5000 daltons) y no pueden por s solas iniciar una
repuesta inmunolgica. Las aflatoxinas pertenecen a este ltimo grupo, por lo que se hace
necesario unirlas a una macromolcula (protena) que les d carcter antignico. La protena que

33
se acopla al hapteno para estos fines se denomina portadora o "carrier".
Para llevar a cabo el acoplamiento entre el hapteno y la protena es necesario que la estructura del
hapteno presente grupos funcionales libres (carboxilos o aminos) capaces de reaccionar con los
grupos carboxilos, aminos, tioles o fenoles presentes en la protena para formar un enlace
covalente.
Como protenas portadoras, las ms usadas son: albmina de suero bovino (BSA), ovoalbmina
(OVA), gamma globulina (BGG), key hole limpet hemocianina (KLH) y polmeros sintticos
como la polilisina.
La conjugacin entre el hapteno y la protena puede realizarse de forma directa o indirecta, en
dependencia de las caractersticas estructurales del hapteno. La aflatoxina B1, al no presentar un
grupo carboxilo en su estructura, es necesario realizar una derivacin qumica que permita obtener
una aflatoxina ms reactiva que pueda acoplarse de manera directa a la protena. En la figura 10 se
muestran diferentes estrategias para lograr un compuesto reactivo de aflatoxina B1 (Wilkinson et
al, 1992). La ms utilizada es la introduccin de un carboxilo en el grupo ceto del anillo de la
ciclopentanona a travs de la reaccin con hidrocloruro de carboximetiloxima (Chu et al, 1977).
Los diferentes procedimentos que se emplean para la conjugacin covalente entre la protena y el
hapteno modificado se relacionan a continuacin.
Anhdrido mezclado.
La conjugacin tiene lugar en dos etapas. En la primera se forma el anhdrido mezclado en
condiciones anhidra y alcalina entre el grupo carboxilo del hapteno y el isobutilcloroformato. En

34
la siguiente etapa el anhdrido reacciona con los grupos aminos de los residuos de lisina de la
protena portadora disuelta en una mezcla de agua:dioxano con la formacin de un enlace
covalente entre la dos sustancias (Escobar et al, 1991a).
Carbodiimida.
Utiliza como principal agente acoplante el 1 etil propil amino carbodiimida (EDPC). Ocurre en
dos etapas: primero se forma el anhdrido con el grupo carboxilo del hapteno y una urea
disustituida a pH 5,5 6, y despus ocurre una reaccin entre el ster de la isourea y los grupos
aminos de la protena formando un enlace amida (Chu et al, 1982).
Mtodo del ster N-hidroxisuccinimida.
Es una variante del mtodo de carbodiimida. El grupo carboxilo del hapteno y la nhidroxisuccinimida (NSH) reaccionan con la diciclohexil carbodiimida para formar un ster activo
que posteriormente se acopla a la protena a travs de un enlace amida, con la posterior liberacin
de la n-didroxisuccinimida. Una de las ventajas de este procedimiento es que permite obtener el
derivado y conservarlo en forma slida para su posterior utilizacin, y aumenta los rendimientos
en la conjugacin.
Condensacin de Manish .
Se fundamenta en la formacin de un in fenolato por la apertura del anillo furnico de la
aflatoxina B2a en condiciones alcalinas, que posteriormente se une al grupo amino de la protena
formando una base de Schiff en presencia de formaldehdo. El enlace formado se estabiliza por
reduccin con borohidruro de sodio (Jackman, 1985).
Los conjugados obtenidos se pueden clasificar en dependencia de la funcin que realizan.
Conjugados inmunognicos.
Son aquellos que se emplean en la inmunizacin de los animales para obtener una repuesta
especfica al antgeno o hapteno objeto de anlisis. Deben presentar una relacin molar superior a
los 20 moles de haptenos por mol de protena (Morgan 1985).
Conjugado de sensibilizacin o cubrimiento.
Es aquel que se emplea para ser inmovilizado en una fase slida para la deteccin de anticuerpos.
Esta inmovilizacin puede ser pasiva o qumica.
Conjugados enzimticos.
Se emplean como marcadores en los ensayos para poder detectar la sustancia objeto de anlisis.
Los conjugados pueden ser enzima-hapteno (Escobar et al, 1986) o enzima-inmunoglobulina

35
(Catty y Raykundalia, 1989) y deben mantener las propiedades inmunolgicas y enzimticas de
sus componentes.
4.4.7.2-Anticuerpos.
Los anticuerpos son protenas que se refieren a una u otra clase de inmunoglobulinas producidas
por las clulas plasmticas como consecuencia de la interaccin entre los linfocitos B sensibles y
el antgeno. Las inmunoglobulinas presentan su mxima concentracin en el suero sanguneo
donde constituyen cerca del 2,5% (residuo seco), es decir ms de 1/3 de todas las protenas.
Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales en dependencia de la cantidad de clones
celulares que lo produzcan. El anticuerpo policlonal es producido por distintos clones de linfocitos
de un solo animal como el resultado de una inmunizacin con el antgeno, mientras el anticuerpo
monoclonal es derivado a partir de un solo clon de linfocitos producidos por un hibridoma, como
el resultado de la unin de linfocitos normales de animales inmunizados con clulas mielmicas
cultivadas en un medio nutritivo (Gavilondo, 1987).
La obtencin de los anticuerpos policlonales con fines de diagnstico se realiza en diferentes
especies y de diversas formas, y no existe un esquema general para la obtencin de los mismos.
Compuestos de alto peso molecular pueden producir antisueros con altos ttulos en conejos,
mientras que para aquellos de bajo peso molecular se han obtenido las mejores respuestas en
cabras y carneros (Morris, 1985).
Recientemente se obtuvieron anticuerpos especficos para la micotoxinas a partir de la
inmunizacin de gallinas ponedoras obteniendo las inmunoglobulinas especficas a partir de la
yema del huevo (Clarke et al, 1993; Li et al, 1994), este procedimiento presenta la ventaja con
respecto a los sistemas convencionales de obtencin de anticuerpos que no requiere de una
extraccin de sangre, se alcanzan altos rendimientos de las inmunoglobulinas y las mismas son
altamente especficas al antgeno estudiado.
Otros aspectos que influyen en la produccin y rendimientos de los anticuerpos es el empleo de
sustancias que permitan la liberacin lenta del antgeno. Estas sustancias se conocen con el
nombre de adyuvantes. Los adyuvantes de Freund (completo e incompleto) son los ms
empleados, aunque existen otros como la saponina (Quil-A) y los geles de aluminio, que se
utilizan muy poco en inmungenos de haptenos.
La inmunizacin puede llevarse a cabo por diferentes vas que incluyen, la intraperitoneal,
intramuscular, intradrmica, subcutnea, o la combinacin entre ellas. La frecuencia de
inmunizacin depende de la repuesta del animal y de la experiencia prctica obtenida en cada
laboratorio. El esquema ms empleado son las inmunizaciones intradrmicas a los tiempos 0, 28,
38 das, con una extraccin de sangre a los 10 das despus de la ltima inmunizacin (Wilkinson
et al, 1992).
4.4.7.3-Reaccin antgeno anticuerpo.

36
Como ya se mencion, los mtodos inmunolgicos se basan en la reaccin antgeno (Ag)
anticuerpo (Ac). Esta reaccin puede ser dividida en reacciones primarias y secundarias. (Buttler,
1987).
Reacciones primarias: ocurren rpidamente (milisegundos), son macroscpicamente invisibles y
la molcula de Ac presenta sitios combinantes.
Reacciones secundarias: ocurren lentamente debido a la multivalencia del Ag, adems son
microscpicas o parcialmente visibles al humano a travs de una reaccin de precipitacin.
La reaccin Ag:Ac es reversible, obedece a la ley de Accin de las masas y se puede expresar de
la siguiente manera:
Ag + Ac ===== Ag : Ac
[Ag:Ac]
K = --------------[Ag][Ac]
donde: K es la constante de equilibrio.
[Ag:Ac], [Ag] y [Ac] representa la concentracin del complejo y de los reactivos libres en la
mezcla final del equilibrio.
Las fuerzas que unen al Ag con el Ac son interacciones no covalentes. Estas proporcionan, en los
sistemas biolgicos, una manera rpida y reversible de formar complejos que permiten reutilizar
las molculas de anticuerpos de una forma que no sera posible en las uniones covalentes. Las
uniones no covalentes se forman con distancias intermoleculares relativamente pequeas, por eso,
la unin ms fuerte entre Ag y Ac se produce cuando las formas del eptope (caracterstica de un
antgeno que define el patrn de reconocimiento de un anticuerpo) y del lugar de combinacin del
Ac se adaptan de manera muy estrecha, como sistema de llave/cerradura.
Las fuerzas que contribuyen a la interaccin Ag-Ac son los enlaces electrostticos, los enlances de
hidrgeno, los enlaces hidrfobos y las fuerzas de van der Waals. Las ms importantes son las
uniones hidrfobas.
Las fuerzas de la unin entre un eptope y una molcula de inmunoglobulina (Ac) recibe el
nombre de afinidad y se calcula por la Ley de Accin de las Masas a travs de la curva de
Scatchard Plot y se refiere al antgeno. Otro trmino, que es frecuentemente usado como sinnimo
de la afinidad, es la avidez; pero en este caso se refiere al anticuerpo. En ambos trminos reflejan
la energa con la cual se combinan los sitios de unin del anticuerpo con el antgeno especfico.
4.4.8-Clasificacin de los inmunoensayos.
4.4.8.1-Radioinmunoensayos o radioinmunoanlisis (RIA).

37
El principio de este ensayo se fundamenta en la competencia del hapteno marcado (135I, 3H o 14C)
y el hapteno no marcado por los sitios de unin del anticuerpo. Posteriormente se separan el
hapteno libre del unido por una tcnica apropiada(tabla 17) y la radioactividad de estas fracciones
se determina por contadores gamma o beta, en dependencia del istopo empleado como marcador.
La concentracin del hapteno de la muestra desconocida se determina a travs de una curva de
calibracin, la cual se establece por la relacin de la fraccin unida y la libre contra el logaritmo
en base 10 de la concentracin del hapteno no marcado (patrn de referencia).
El primer informe de un anlisis de aflatoxina B1 por RIA fue hecho por Langone y Vunakis
(1976) quienes emplearon la aflatoxina B1 marcada con H3 y anticuerpos policlonales obtenidos
en conejos por la inmunizacin con un conjugado de polilisina-aflatoxina B1. Resultados similares
fueron obtenidos por Chu y Ueno (1977), con el uso de un inmungeno de albmina bovinaaflatoxina B1. La sensibilidad de ambos antisueros oscil entre 0.2-2 ng/mL y se concluy que
esta poda ser mejorada aumentando la actividad especfica del compuesto marcado (Chu y Ueno
1977).
Tabla 17. Mtodos empleados para la separacin de fases por RIA
Principio

Tcnicas

Cromatografa

-Electroforesis
-Filtracin en gel
-Capa delgada de papel oslica

Precipitacin qumica

-Sulfato de sodio o amonio


-Etanol
-Polietilenglicol

Absorcin

-Carbn activado
-Spherosil
-Talco

Inmunologa

-Protena A o G
-Doble anticuerpo

Fase slida

-Inmuno Adsorbente (tubos)


-Partculas magnticas

En la tabla 18 se muestran algunas aplicaciones del radioinmunoensayo para la determinacin de


aflatoxina B1 en alimentos y fluidos biolgicos, con un lmite de deteccin de 0.1 a 5 g/kg o
g/L.

38
Tabla 18. Aplicaciones del radioinmunoensayo en el diagnstico de aflatoxinas en alimentos y
fluidos biolgicos.
Aflatoxina

Aplicacin

Referencia

Aflatoxina B1

Man

Fukal et al 1987

Aflatoxina B1

Tejido de hgado

Stora y Dvorackova 1987

Aflatoxina B1 y metabolitos.

Orina

Dragsted et al 1988

Aductos de aflatoxina B1

Suero

Gan et al 1988

Los procedimientos de RIA presentan la desventaja que los juegos de reactivos tienen una vida
limitada en dependencia del istopo, y adems, el costo del equipamiento es alto y se requiere de
regulaciones especiales para el personal que trabaja con istopos radioactivos.
4.4.8.2-Enzimoinmunoensayos (EIA).
En los enzimoinmunoensayos, el compuesto marcador es una enzima que debe reunir un grupo de
requisitos (Sauer et al, 1985):
1- Debe ser econmica y poder obtenerse con un alto grado de pureza.
2- Elevada actividad especfica.
3- Estable en condiciones de almacenamiento y prueba.
4- Soluble.
5- Sencilla, sensible y medible con gran rapidez.
6- No debe estar presente en el medio analizado.
7- Los sustratos inhibidores y factores de interferencia procedentes del material a examinar no
deben interferir en el ensayo.
8- No debe perder totalmente la actividad cuando se conjuga.
9- La actividad debe conservarse en las condiciones del ensayo.
Las enzimas que se emplean con mayor frecuencia para los enzimoinmunoensayos son: la
fosfatasa alcalina, la peroxidasa y la galactosidasa provenientes de la mucosa de ternero, de
rbano y de Escherichia coli, respectivamente (Catty y Raykundalia, 1989).
Los enzimoinmunoensayos pueden clasificarse en homogneos y heterogneos (Sauer et al, 1985.
4.4.8.2.1-Enzimoinmunoensayo homogneo.
El enzimoinmunoensayo homogneo, conocido en ingls como EMIT (enzyme mediatedimmunoassay-technique), debe su nombre a que no hay separacin de fases. Su fundamento es la
competencia del hapteno marcado y el no marcado presentes en la muestra o patrn por el
anticuerpo, donde la actividad enzimtica se inhibe por la interaccin especfica con el anticuerpo

39
(Bastiani et al, 1973).
El ensayo homogneo solo puede ser usado en la determinacin de sustancias de bajo peso
molecuar (haptenos). Es muy rpido y puede ser automatizado, pero es poco sensible debido a que
la inhibicin de la actividad enzimtica es tan escasa que tan solo pueden medirse pequeas
diferencias de extincin (100-200 ME) entre una reaccin inhibida y otra no inhibida. Esta
dificultad puede ser superada en parte usando heterologa de puente en los conjugados haptenosprotena (BSA) (Mella et al, 1988).
Existen otras variantes del mtodo homogneo (Ngo y Lenhoff, 1985). En lugar de usar una
enzima como marcador pueden emplearse otros tipos de marcadores tales como:
-Un sustrato fluorescente o precursor de sustratos (SLFIA).
-Un inhibidor enzimtico (EMMIA).
-Un grupo prosttico (ARIS).
-Un liposoma que contenga enzima.
4.4.8.2.2-Enzimoinmunoensayo heterogneo.
El enzimoinmunoensayo heterogneo, conocido en ingls como ELISA (enzyme linked
immunosorbent assay), se diferencia del procedimiento anterior en que siempre se realiza una
separacin de complejo antgeno-anticuerpo, no fijado despus de una incubacin inicial.
Para lograr esta separacin es necesario haber inmovilizado con anterioridad los anticuerpos o los
antgenos a la fase slida o emplear algn mtodo de centrifugacin, sedimentacin o
precipitacin con segundos anticuerpos. En el primer caso las fases slidas ms empleadas son:
las placas de 96 huecos de poliestireno o polivinilo o tiras reactivas de nitrato de celulosa.
El ensayo heterogneo se clasifica en ensayos directos e indirectos, directo cuando se marcan los
reactivos primarios (antgeno o anticuerpo) e indirecto cuando se utilizan segundos anticuerpos
(antiinmunoglobulina) marcados. En ambos procedimientos hay dos variantes competitivo y no
competitivo.
A continuacin se muestra como pueden ser clasificados estos ensayos en dependencia de qu y
cmo se determina:
-Competivo directo: Determinacin de antgenos utilizando un antgeno marcado o un anticuerpo
marcado con una enzima.
-No competitivo indirecto: Determinacin de anticuerpos empleando una antiinmunoglobulina
marcada con una enzima.
-Competitivo indirecto: Determinacin de antgenos utilizando una antiinmunoglobulina marcada
con una enzima.
-Doble anticuerpo o "two site": Determinacin de antgeno, donde uno de los anticuerpos est
marcado y los otros pueden ser de diferentes especies.
-USERIA (Ultrasensitive-Enzymatic-Radioimmunoassay): Determinacin de antgenos

40
empleando dos anticuerpos
Recientemente ha comenzado a utilizarse la vinculacin de procedimientos inmunolgicos con
procedimientos qumicos, tales como la cromatografa de capa delgada, surgiendo as el
denominado ELISAGRAM (Pestka, 1991). Este se fundamenta en el principio de transferencia
donde se vincula la sensibilidad y especificidad del ELISA con el poder resolutivo de la
cromatografa. Otra tcnica cromatogrfica que se ha vinculado al inmunoanlisis es la CLAR que
aumenta su potencialidad porque se emplea un anticuerpo genrico que reconoce diferentes
haptenos de un mismo grupo (Chu y Lee 1989).
5-Validacin de un ensayo.
Antes que un ensayo pueda ser aplicado a un anlisis de micotoxinas en alimentos o fluidos
biolgicos, debe reunir las siguientes caractersticas (Barnes, 1992; Ward et al, 1993):
- El ttulo de los anticuerpos policlonales y monoclonales a utilizar debe ser mayor de 1:10 000 y
1:100, respectivamente.
- El lmite de deteccin debe ser menor de 10 pg/ensayo.
- Especificidad adecuada para el ensayo segn la toxina.
- Extraccin y efecto matriz.
- Recobrado.
- Reproducibilidad.
- Correlacin con otros mtodos.
Adems de las caractersticas anteriores que debe reunir un juego de reactivos, la AOAC ha
establecido, como requisito fundamental para oficializar un mtodo de anlisis su validacin a
travs de estudios interlaboratorios donde se incluye los siguientes acpites (Chu, 1990).
a) Sensibilidad (rango de desplazamiento de la curva patrn; mximo color de patrn cero;
cambio de color por unidad de concentracin y concentracin al 50% de inhibicin).
b) Exactitud (reproducibilidad intra e inter ensayo, efecto matriz, especificidad del antisuero y
comparacin con otros procedimientos).
c) Simplicidad (fcil manipulacin, pocos pasos de ejecucin y rapidez)
d) Estabilidad de los reactivos
e) Costos
5.1-Titulacin de los antisueros.
La dilucin ptima de un antisuero debe ser determinada en el tipo de formato que se emplee
durante el anlisis, ya que este depende de la concentracin de los inmunoreactivos, el tiempo de
incubacin y la temperatura.
La dilucin ptima del antisuero se determina cuando existe una diferencia en densidad ptica de
1.5 entre la seal y el ruido, y se calcula a travs de experimentos cruzados con diferentes

41
variables (Wilkinson et al, 1992 y Ward et al, 1993).
5.2-Sensibilidad.
Diferentes son los criterios que se emplean para determinar la sensibilidad de un ensayo. El ms
utilizado es el que la determina a travs de la curva de calibracin donde existe una relacin entre
la medida y la concentracin (C) de un analtico (x=fc). Este define la sensibilidad como el ms
pequeo cambio de concentracin que puede ser medido por un procedimiento analtico, es decir
como la pendiente de la curva (m=dx/dc) (FAO 1990). La sensibilidad de un ensayo tambin se
ha expresado como la concentracin que se detecta al 50% de la curva de calibracin o al 95%
(Feldman y Rodbar, 1971).
La sensibilidad de un ensayo tiende a confundirse y se informa a veces como el lmite de
deteccin, que es la concentracin ms pequea de sustancia que puede ser detectada con un alto
grado de confianza por un mtodo analtico. En la prctica este valor se calcula como la media del
primer punto (patrn cero) menos dos o tres desviaciones estndar de la media. Este valor puede
coincidir con la sensibilidad del ensayo.
La sensibilidad depende de las concentraciones de los inmunoreactivos, en particular del
antisuero. Una mayor constante de afinidad del antisuero favorece que el ensayo sea ms sensible.
5.3-Especificidad.
La especificidad de un antisuero (reaccin cruzada), no es ms que la habilidad que tienen algunas
sustancias de enlazarse al anticuerpo con mayor o igual facilidad que el antgeno que le dio
origen. Tales sustancias pueden ser precursores naturales, productos degradados del antgeno o
sustancias de estructuras similares.
La reaccin cruzada de un antisuero policlonal vara en dependencia de la respuesta inmune del
animal. Diferentes laboratorios, que emplean el mismo inmungeno (aflatoxina B1:CMO-BSA),
han obtenido antisueros con especifidades diferentes para las distintas aflatoxinas (Chu, 1984).
Incluso cuando se obtienen anticuerpos monoclonales, estos pueden reconocer con gran afinidad a
otros metabolitos. Dixon-Holland et al (1988) obtuvieron un anticuerpo monoclonal que present
mayor afinidad por la aflatoxina B1, mientras otro anticuerpo monoclonal contra la aflatoxina B1
reconoca de igual manera a la aflatoxina G1 (Lee et al, 1992).
5.4-Efecto matriz.
Para poder realizar el ensayo es necesario que el extracto de la muestra no interfiera en el anlisis.
Esta determinacin del efecto matriz se realiza a travs de dos curvas de calibracin, donde el
patrn se encuentra disuelto en solucin tampn fosfato salina (PBS) y otra en el extracto de una
muestra negativa o blanco. No existe interferencia cuando las dos curvas se superponen, o las
pendientes de ambas curvas no difieren entre s.

42
Si existe interferencia entre la curva de calibracin blanco y la de extracto, entonces se requiere de
purificar la muestra o buscar un sistema de extraccin selectivo que permita igualar las dos
curvas. Si las curvas son paralelas, pueden igualarse por la adicin de pequeas concentraciones
del solvente de la matriz a la curva patrn con PBS (Mills et al, 1988) o desarrollar la curva en un
extracto control negativo (Wilkinson et al, 1988a; Escobar et al, 1991b).
La linealidad es otro indicador que se emplea para determinar si existe interferencia en la reaccin
antgeno-anticuerpo. Se obtiene a partir de las concentraciones del analtico en diferentes
volmenes de un extracto positivo. No existe interferencia cuando no se produce desviacin de la
linealidad y se obtiene una correlacin alta (>0.90).
5.5-Exactitud y Precisin.
La exactitud es la fidelidad de la concordancia entre el valor real del compuesto analizado y la
media de los resultados obtenidos al aplicar el procedimiento.
La exactitud de un ensayo se determina por el recobrado de la toxina de una muestra
artificialmente contaminada (Wilkinson et al, 1992; van Egmond et al, 1994) o a partir de una
muestra certificada por un laboratorio de referencia como: International Agency for Research on
Cancer (IARC), Community Bureau of Reference Brussels (BCR), FAPAS y otros.
Los recobrados se consideran adecuados cuando sus valores se aproximan al 100 % ( 5 %). Si el
mismo se desva bastante del valor real, entonces es necesario corregir el clculo final (van
Egmond y Wagstaffe, 1990). En las tcnicas inmunolgicas, que no requieren de una limpieza
total de la muestra, se obtienen recobrados cercanos al 100 % cuando se emplean sistemas de
solvente metanol:agua 65:35 v/v (Escobar et al, 1991b) o acetonitrilo:agua 55:45 v/v (Morgan et
al, 1986a).
Una vez establecido el recobrado de la toxina a partir de la muestra, se procede a determinar la
precisin, que es la fidelidad de concordancia entre los resultados obtenidos por un mtodo
estndar, sobre un material idntico y bajo determinadas condiciones.
La precisin se determina a travs de la repetibilidad y reproducibilidad (Thielmann, 1973). Los
trminos de intraensayo, interensayo e interlaboratorio tambin son utilizados como medida de
precisin y pueden ser de 15, 25 y 50 %, respectivamente (Heitzman, 1984). Es recomendable que
los estudios de precisin se realicen con ms de una muestra contaminada.
5.6-Estudios de correlacin.
La correlacin con otros mtodos nos indica la exactitud de la tcnica investigada en lo que
respecta a verdaderos positivos y verdaderos negativos de un conjunto de muestras analizadas
paralelamente con un mtodo de referencia. A partir de los datos obtenidos por el procedimiento
de referencia y el mtodo propuesto pueden determinarse los indicadores de calidad (sensibilidad,
especificidad, prevalencia, eficacia y valor predictivo positivo o negativo).

43
La validacin de procedimientos inmunolgicos en la deteccin de aflatoxinas en alimentos y
fluidos biolgicos se ha realizado con distintos mtodos convencionales, en la tabla 19 se
muestran algunas de estas correlaciones.

44
Tabla 19. Estudios de correlacin entre los procedimientos inmunolgicos y los mtodos
convencionales.
Aflatoxina

Muestra

Mtodo
investigado

Mtodo de
referencia

correlacin

Referencia

M1

Leche

ELISA

HPLC

----

Fremy y Chu,
1989

B1

Mantequil
la de man

ELISA
(Biokits)

HPTLC

r>0,90

Dell et al, 1990

B1

Materia
primas

ELISA

HPLC

r=0.90

Adachi et al,
1991

B1

Suero

RIA

HPLC

----

Tsuboi et al,
1984

B1

Higo seco

ELISA

TLC

r=0,97

Reichert et al,
1988

B1

Man

ELISA

HPLC

98,6%

Cole et al, 1988

B1

Man

EZ-Screen
Afla cup

HPLC

82,5%
81,5%

Dorner y Cole,
1989

B1

Maz

Afla cup
Afla test
Agri Screen
EZ-Screen
Oxoid
Sam-A

TLC
Minicolumna

r=0,91
r=0,75
r=0,98
r=0,80
r=0,56
r=0,97

Koeltzow y
Tanner, 1990

Conjuntamente con los estudios de correlacin, se ejecutan experimentos interlaboratorios para el


pesquisaje y la determinacin cuantitativa de aflatoxina B1 en alimentos. Este ltimo aspecto es
indispensable para que un mtodo pueda ser reconocido internacionalmente por la Asociacin
Oficial de Qumicos Analistas y debe realizarse por las orientaciones generales establecidas en la
AOAC. Se ha recomendado adoptar el ELISA (Agri-Screen y Afla cup) como mtodos oficiales
de anlisis para el pesquisaje de aflatoxina B1 en semillas de algodn, maz, man y productos
derivados del man cuando la concentracin de aflatoxina es superior a los 15, 20 y 30 g/kg
respectivamente (Park et al, 1989 a y b; Trucksess et al, 1989; AOAC, 1990; Trucksess, 1995).
Un ensayo cuantitativo para el diagnstico de aflatoxina B1 por ELISA (Biokits Aflatoxin
Kit(Cortecs)) fue sometido a un experimento internacional y aprobado por la AOAC como
primera accin oficial para el diagnstico cuantitativo de aflatoxina B1 en mantequilla de man en
un intervalo de concentracin de 9-90 g/kg (Patey et al, 1992).
La aplicacin de los inmunoensayos para el anlisis de aflatoxinas en alimentos y fluidos

45
biolgicos se resume en la tabla 20. Se observa que en un futuro muy cercano los procedimientos
inmunolgicos se realizarn como rutina para el diagnstico cuantitativo de aflatoxinas u otras
micotoxinas.
Tabla 20. Aplicacin de los inmunoensayos de aflatoxinas en alimentos y fluidos biolgicos.
Aflatoxina

Tipo de muestra

Tipo de ensayo

referencias

M1
M1
M1
M1
M1
B1
B1

ELISA
CA
ELISA
ELISA
ELISA
ELISA
ELISA

Wild et al, 1987


Mortimer et al, 1987
Pestka et al, 1981
Li y Chu, 1982
Fremy y Chu, 1984
Margolles et al,1990b
Park et al, 1988

B1

Leche
Leche
Leche
Leche
Leche
Leche
Maz y productos de
man
Mantequilla

ELISA

Aflas
B1
Aductos
Aductos
Aductos
Aductos

Alimentos
Maz
Suero
Fluidos biol.
Hgado
Suero

ELISA
ELISA
ELISA
ELISA y CA
ELISA y CA
ELISA y CA

B1 y M1
aflas
B1

Alimento y orina
Orina y suero
Suero

ELISA
ELISA
ELISA

B1

Alimentos

IMMUNOBLOT

B1
B1,B2 y G1

Maiz
Maiz

ELISA
ELISA-CUP

Morgan et al, 1986a


Mortimer et al, 1988
Patey et al, 1992
Truksess et al, 1989
Wilcke et al, 1990
Okoye y Neal, 1988
Wild et al, 1988
Garner et al, 1988a
Groopman y Donahue,
1988.
Yu et al, 1989
Autrup, 1989
Denning et al, 1988
Wilkinson et al,1988a
Wilkinson et al,1988b
Wilkinson et al, 1989
Abouzied y Pestka, 1994
Hirano et al, 1991
Trucskess y Stack, 1994

46
En la actualidad existe una gran oferta de juegos de reactivos para la determinacin de aflatoxina
B1 en alimentos por parte de diversas casas comerciales (tabla 21), que facilitan los planes de
prevencin y control establecidos para el diagnstico de esta micotoxina en los alimentos.
En la tabla 22 se muestra un resumen de las caractersticas generales de los mtodos analticos
discutidos anteriormente.
Tabla 21. Casas comerciales que ofertan juegos de reactivos para el diagnstico de aflatoxinas.
Casa comercial
Chemopolt Ltd
(Checolovaquia)
Cortecs Diagnostic (UK)

Afaltoxina
B1
M1/B1
B/G

Environmental Diagnostic
(USA)
Genego SPa (Italia)

B/G
M1
B1
M1
B1
M1
B/G

Idexx (USA)
International diagnostic
(USA)
Neogen Corp (USA)
Noak (Austria)
Oxoid Ltd (UK)
Penicillins Assays Inc
(USA)
Rhne-Poulenc Diagnostic
(USA)
Riedel-de Han (Alemania)
Transia Ltd (Francia)

B/G
M1
B/G
M1
B/G
M1
B/G
M1/M2
B1
B/G
B1
M1
B1
M1
B/G

Principio
RIA

Card

Aplicacin
Cuantitativo
(cuant.)
Cuant.
Cualitativo
Cualitativo

ELISA

Cuant.

Cup

Cualitativo

Cup

Cualitativo

ELISA

Cualitativo

ELISA
Afinidad

Cuant.
Cualitativo
Cualitativo

RIA

Cuant.

ELISA
Afinidad
ELISA

Cuant.
Cualitativo
Cuant.

ELISA
CARD

Cuant.
cualitativo

ELISA

47
Tabla 22 Resumen de las caractersticas generales de los mtodos de anlisis.
Ensayo

Rango de
aplicacin

Precisin

Lmite de
deteccin

Costo de
equipamiento

Posible
automatiza
cin

Bioensayo
Minicolumna
TLC
HPLC
RIA
ELISA

limitado
limitado
amplio
amplio
limitado
limitado

baja
moderada
alta
alta
alta
alta

mg/kg
g/kg a mg/kg
ng/kg a g/kg
ng/kg a g/kg
pg/kg a g/kg
pg/kg a g/kg

bajo
bajo
bajo
alto
alto
moderado

no
no
no
parcial
si
si

6. Descontaminacin de aflatoxinas
Despus de conocerse la potencia txica de las aflatoxinas y en especial de la aflatoxina B1, la
forma de eliminarla de los alimentos una vez contaminados, eliminar su produccin por los
hongos e incluso eliminar o aminorar sus efectos txicos in vivo con el uso de sustancias
adsorbentes, ha sido un objetivo humano. Las aflatoxinas en estado seco son qumicamente muy
estables, debido a su alto punto de fusin (268-269C), pero en presencia de humedad y altas
temperaturas ocurre la destruccin parcial de estas sustancias (Jones, 1977), as por ejemplo ha
sido informada su destruccin parcial en el tostado del man, en la fabricacin del pan y durante el
tratamiento alcalino del maz para hacer tortillas (OPS-OMS, 1983). La aflatoxina M1 es
tambin difcil de ser descontaminada, por ser termorresistente (Destro y Gelosa, 1986).
Munch y Stein (1985) plantean que los principales mtodos de descontaminacin de aflatoxinas
en piensos u otros productos alimenticios son los fsicos y qumicos, mencionado tambin los
microbiolgicos. Los mtodos fsicos incluyen la separacin mecnica, los procesos trmicos, las
irradiaciones y los pulsos elctricos, mientras que los qumicos se fundamentan en la reaccin
entre la molcula de aflatoxina y una sustancia qumica que puede ser un agente oxidante o
reductor, un cido o una base fuerte. Cuando se utilizan procesos fsicos para destruir las
aflatoxinas en productos alimenticios suele ocurrir simultneamente la destruccin de otras
sustancias nutritivas. Al utilizar las radiaciones ultravioletas para descontaminar piensos u otros
alimentos slidos, adems de nos ser muy efectivas por el poco poder de penetracin que tienen,
se produce el deterioro del valor nutritivo del alimento. En la descontaminacin de aflatoxina M1
en leche pasteurizada y sin pasteurizar por radiaciones UV, se redujeron la cantidad de aflatoxina
hasta un 56,2% y 53,9% respectivamente (Yousef y Marth, 1986). La luz visible descontamina el
arroz hasta un 10% de la contaminacin inicial con una dosis de 112 mw/cm2 (Nkama et al,
1987). Las radiaciones gamma, a pesar de tener un poder de penetracin muy grande,
descontaminan la aflatoxina B1 en soluciones y en alimentos solo a altas dosis. Escobar y
Fernndez-Miranda (1989) obtuvieron solo un 50% de descontaminacin de un pienso usando
dosis de 60 kgrey y Patel et al (1989) requirieron usar 400 kgrey + 5% H2O2 para la total
descontaminacin de 100 g de AFB1; sin embargo, estas radiaciones producen un efecto
beneficioso en la inhibicin de la produccin, tal como fue probado por Rodrguez y Rodrguez
(1983) y Sharma et al (1990).

48
Dentro de las sustancias qumicas, el agente destoxificante ms empleado ha sido el amonaco en
su estado gaseoso y acuoso, que forma la aflatoxina D1, la cual es 130 veces menos txica que
su antecesora (Pival et al, 1981). Este tratamiento ocasiona la destruccin de sustancias
nutritivas como la de algunos aminocidos.
Otro agente qumico que se ha utilizado en la descontaminacin de aflatoxinas es el
metabisulfito de sodio (Hagler et al, 1982). Echevarra y Escobar (1989) realizaron un estudio
comparativo del poder de destoxificacin de la aflatoxina B1 entre el amonaco y el
metabilsulfito, utilizando el mtodo inmunoenzimtico para la determinacin de la residualidad
de la aflatoxina B1 y encontraron que el primero tiene mayor poder de destoxificacin que el
segundo y adems caracterizaron el metabolito que se produce (aflatoxina B1S). Otra desventaja
de la destoxificacin con agentes qumicos es la prdida de las propiedades organolpticas del
producto destoxificado. Mucho mejores resultados en este sentido se han obtenido con la
inhibicin de la produccin de las aflatoxinas con ozono (Gonzlez et al, 1990), quienes
probaron que se mantenan las propiedades organolpticas y el poder nutritivo de los alimentos
ozonizados.
Con el objetivo de prevenir el crecimiento de los hongos y por tanto la produccin de aflatoxinas
en los alimentos, se han empleado agentes qumicos como son: ortofenilfenato de sodio, el
dixido de sulfuro, la sal de amonio del cido propinico y el thiabendazole. A partir de los
estudios realizados por Fonseca et al (1994) con las sustancias anteriormente mencionadas se
encontr que el tratamiento con la sal de amonio del cido propinico (5000 mg/Kg) fueron los
ms eficientes, donde las concentraciones de aflatoxina no sobrepasaron los 30 g/kg, mientras
en los otros tratamientos, incluyendo los controles, las concentraciones de aflatoxinas variaron
desde de 150 hasta 108,333 g/kg.
Tambin han sido utilizados agentes adsorbentes para destoxificar los alimentos de las
aflatoxinas, cuyos resultados son comprobados in vivo. Ademoyero y Dalvi (1983) adicionaron
carbn activado en alimento contaminado para pollos y ms recientemente, han comenzado a
emplearse con xito los almino-silicatos hidratados de sodio y calcio con estos mismos fines en
los alimentos destinados a: pollos (Phillips et al, 1988), cerdos (Colvin et al, 1989; Beaver et al,
1990; Schell et al, 1993 a,b) y bovino (Veldman, 1992).
En Cuba, se ha ensayado con algunas rocas zeolticas y se encontr que estass tienen poder
adsortivo a la aflatoxina B1 in vitro, donde dos tipos de bentonitas (clcica y sdica) y las
zeolitas del tipo moderntico presentaron un poder de adsorcin a las aflatoxinas por encima del
80% superior al producto comercial usado como referencia (Margolles et al, 1993). El empleo de
almino-silicatos en piensos con la finalidad de disminuir los efectos txicos de las aflatoxinas
fueron evaluados de forma directa en el pienso a travs de un ELISA (Margolles et al, 1994) y
con animales in vivo (Margolles et al, 1992).
El estudio directo en pienso corrobor la alta efectividad de las zeolitas del tipo mordentico y
las bentonitas para adsorver aflatoxinas (>77%); sin embargo las zeolitas modificadas mostraron
una menor efectividad (19%), la zeolita de referencia mostr un 39% de adsorcin a las

49
aflatoxinas (Margolles et al, 1994), mientras el estudio en ocas comprob el efecto protector de
los almino-silicatos, cuando el grupo que consumi alimento contaminado con aflatoxina +
zeolita, present un comportamiento similar a los grupos controles (pienso; pienso + zeolita), no
as el grupo que se alimentaba con el pienso contaminado (Margolles et al, 1992).

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Autor: Arturo Escobar Dr.C.


Departamento de Inmunoqumica
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