TÉCNICAS DE PRE-SEPARACIÓN EN EXTRACTOS METANOLICOS DE CONIFERAS (PICEA ABIES

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Dr. Gloria Cosco Salguero S.G.S. del Perú S.A.C, Ing. Jorge Cosco Grimaney jcoscog@yahoo.es coscosag@yahoo.com

Introducción Las coniferas como el pino, (Picea abies (L) Karst) ha sido extendidamente estudiado desde varios puntos de vista a fin de trazar una posible relación entre la calidad del ecosistema y las propiedades específicas de estos árboles. La presencia de un gran número de otros compuestos ha sido reportado in la literatura, pero su identificación con las condiciones cromatográficas comunes representan un problema difícil a causa de la falta de disponibilidad de estándares. El fin de este estudio es simplificar la composición metanolica del extracto a través de una adecuada pre-separación cromatográfica. Han sido estudiados 2 métodos con potencial para separar extractos a fracciones conteniendo componentes de distinto tipo químico. Primero, cromatografía de ion exclusión, el cual podría separar compuestos ionizados de neutrales. Segundo, cromatografía de interacciones hidrofilicas que parece lograr un tipo de separación selectiva. La parte experimental evaluara las cromatografías de exclusión e interacciones hidrofilicas como potencial herramientas de pre-separación para el análisis de compuestos fenolicos.
Parte experimental Separación basada en el principio de Ion Exclusión El comportamiento de retención de ácidos fenolicos y compuestos neutrales fue estudiado en una columna de fase reversa C-18, 7um, 150 x 3.2 mm con fases móviles consistentes de metanol: soluciones de dodecilsulfato de sodio a diferentes concentraciones 0.01, 0.1, 5, 10, 20 y 30 mmol.L-1 in la relación 80:20. Separación basada en el principio de interacciones hidrofilicas El comportamiento de retención de ácidos fenolicos, fenoles, glicerol, etilenglicol y alcohol bencilico y otros compuestos con grupos OH, fue estudiado en una columna de fase normal silica, 5um, 150 x 3.2mm con fases móviles: 100%, 98%, 95%, 80% y 50% acetonitrilo acuoso.

Resultados y discusión de resultados Evaluación de Cromatografía de Ion Exclusión El mecanismo de ion exclusión fue aplicado para fraccionar ácidos fenolicos y compuestos neutrales como p-hydroxyacetofenona y catechina. La figura A muestra la dependencia del tiempo de retención de compuestos fenolicos seleccionados en las varias concentraciones de dodecilsulfato de sodio en el componente acuoso de la fase mobil. Como es observado los ácidos son excluidos de los poros de la fase estacionaria reversa solo cuando bajas concentraciones de dodecilsulfato de sodio están presentes in la fase mobil metanol: agua 80:20. El volumen de retención de los ácidos fenolicos fue mas bajo que el volumen muerto de la columna mientras que los compuestos neutrales fueron eluídos igual que el volumen muerto o fueron retenidos en la columna de forma usual.

Fig. A Retención de compuestos fenolicos bajos condiciones de ion exclusión.

3.5

A

3.0

B
2.5

C
c

D
2.0

K
1.5 0 1 2 3 4 5

c(SDS) , mmol L

1 2

6 1 2

p-hydroxyacetofenona (A), floroglucinol (B), catechina (C), acido p-hydroxybenzoico (D), acido p-cinámico (E), acido vainillico (F), acido p-cumárico (G), acido protocatechuico (H), acido benzoico (I), acido ferulico (J), acido m-cumárico (K). Columna 150 x 3.2 mm, fase reversa C18, 7 µm, fase mobil methanol-agua SDS, c (SDS) = 0.1 a 30 mmol L-1, flujo 0.3 mL min-1 SDS = Dodecilsulfato de sodio

Este sistema fue aplicado a un extracto 80% metanolico de los árboles. El análisis cromatográfico confirmó la presencia de acido p-hydroxybenzoico y acido vainillico y también catechina y p-HAF. Experimentos adicionales son necesarios para optimizar la recolección de las fracciones.

Evaluación de Cromatografía con interacciones hydrofilicas
La cromatografía de interacciones hydrofilicas en una columna de silica puede separar ácidos fenolicos de compuestos sin grupos carboxilo cuando acetonitrilo es usado como fase mobil (Tabla A). Para aplicar el método de pre-separación, la muestra debe ser extraída con acetonitrilo (o solvente con propiedades similares) o transferir a este solvente por evaporación del solvente original y reconstitución del residuo con acetonitrilo. Fue probado que los ácidos fenolicos (protocatechuico, p-hydroxybenzoico, vanillico, pcumarico, ferulico) y catechina muestran buenas recuperaciones sobre 92% por evaporación del solvente metanolico usando rotavapor hasta sequedad a 40°C. Table A Retención de compuestos fenolicos y alcoholes bajo condiciones de interacciones hydrofilicas. Compuestos 50:50 1.27 1.22 >15 >15 1.82 1.83 1.88 1.86 2.03 1.86 1.96 1.98 Tiempo de retencióna, min Acetonitrilo – Agua 80:20 95:5 98:2 1.58 2.81 8.59 1.53 3.01 9.57 10.88 12.52 8.4 9.94 >15 >15 1.92 2.09 1.89 2.04 2.10 1.98 2.05 2.17 1.99 2.02 -

Acido p-Hydroxybenzoico Acido p-Cumarico Acido p-Ferulico Acido Vainillico Acido Benzoic Quercetina Rutina Catechina p-Hydroxyacetofenona Fenol Floroglucinol Pirocatechol Resorcinol Hydroquinona Glicerol

100:0 >15 >15 >15 >15 >15 >15 2.30 2.05 2.23 2.35 2.11 2.17 -

Etilen glicol Alcohol Benzilico
a

1.94 1.93

-

3.66 2.00

-

7.58 2.33

Columna fase normal Silica, 7 µm, 150 x 3.2 mm, fase mobil acetonitrilo-agua, 0.4 mL min-1 Este método de pre-separación fue verificado en una mezcla modelo de acido ferulico (40µ m) y acido protocatechuico (40µm) usando una microcolumna (extracción en fase sólida) conteniendo 300 mg de silica. Después del cargado de la muestra en la microcolumna, esta fue lavada con 10 mL del mismo solvente y los ácidos fueron recuperados con 2 – 10 mL de la mezcla acetonitrilo:agua (80:20). El procedimiento aplicado a los extractos mostró resultados similares a los obtenidos en la tabla A. El protocolo propuesto es contenido en la tabla B. Tabla B Condiciones propuestas para el fraccionamiento de muestras disueltas en acetonitrilo Extracción en fase sólida basada en el principio de interacciones hydrofilicas Sorbente Silica Acetonitrilo o solvente de similar polaridad (Después Aplicación de la muestra de ser usado otro sorbente, la columna debe ser secada haciendo pasar nitrógeno a través de la misma) Lavado, remoción de Acetonitrilo impurezas Elución Acetonitrilo:Agua (80:20) Este método es sensible a la presencia de agua, la retención de los ácidos rápidamente decrece con el incremento del contenido del agua.