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CENTRO DE BIOCIENCIAS

CAMPUS IV
AISLAMIENTO, SELECCIN Y USO DE BACTERIAS
DIAZOTRFICAS DE LA RIZSFERA DE Jatropha

curcas
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TTULO DE INGENIERO
BIOTECNLOGO

PRESENTA
JALSEN IVN TECO BRAVO
DIRECTOR DE TESIS:
Dra. Ma. DE Lourdes Adriano Anaya
ASESORES:
Dr. Miguel Salvador Figueroa
MC. Isidro Ovando Medina

TAPACHULA, CHIAPAS.

MAYO DE 2010.

Este trabajo fue realizado en el laboratorio de biotecnologa del Centro de Biociencias


bajo la direccin de la Dra. Mara de Lourdes Adriano Anaya y asesorado por el Dr.
Miguel Salvador Figueroa y MC. Isidro Ovando Medina, con el financiamiento del
Subsistema Nacional de Recursos Genticos- SAGARPA

AGRADECIMENTOS

A Dios
Por concederme la oportunidad de existir y con ello descubrir y llevar a cabo tantas cosas,
entre ellas, este trabajo y por darme las fuerzas que para esto se necesita, porque con el hay
sabidura y podero, el tiene consejo y entendimiento.
A mi madre
Por su incansable esfuerzo, por todo lo que ha hecho por mi, por el ejemplo que para mi
representa, por ser el motor de mis aspiraciones y sueos porque simple y sencillamente sin
ella no habra sido posible este y otros logros.

Al Dr. Miguel Salvador Figueroa


Por su inagotable paciencia y su incontable ayuda, por guiarme en ese camino que para mi
era desconocido, por ayudarme a encontrar la salida en aquellos momentos de ofuscacin,
por ser el punto de apoyo para mover este trabajo.
A la Dra. Mara de Lourdes Adriano Anaya
Por darme la oportunidad de realizar este trabajo, por abrirme las puertas, por la confianza
depositada, porque: no solo se necesita inters por contribuir sino oportunidades para
hacerlo.

NDICE
Presentacin...........1

Resumen.........2
Introduccin...3
Materiales y Mtodos....5
Resultados y Discusin..9
Referencias...................19

Presentacin

Los biocombustibles surgen como alternativas limpias a los actuales combustibles fsiles.
Algunos de estos combustibles se obtienen de una serie de vegetales, los que requieren
cultivarse masivamente. Se ha convenido que la produccin de biodiesel preferentemente se
realice a travs del aceite de las semillas de Jatropha curcas. Por lo anterior, el cultivo a
gran escala de dicha planta requiere cumplir con los criterios actuales de sustentabilidad. En
este sentido, el empleo de fertilizantes de sntesis qumica durante dicho proceso no debera
ser un insumo contemplado. Atendiendo a lo anterior, el uso de inoculantes microbianos
como biofertilizantes resulta una alternativa sustentable para dicho propsito, puesto que se
ha comprobado que estas promueven el crecimiento de las plantas a travs de mecanismos
como la fijacin biolgica de nitrgeno, el transporte de minerales y la sntesis de
precursores de fitohormonas, entre otras funciones. Aunque los biofertilizantes ya se
encuentran en el mercado, su procedencia es una limitante de su eficacia. Por lo anterior es
necesario desarrollar inoculantes apropiados que estn adaptados a las condiciones
ambientales en que J. curcas se desarrolla. De esta forma se puede garantizar la eficacia
del biofertilizante al ser aplicado en campo y que la biofertilizacin tenga efecto en el
desarrollo de las plantas. Por lo tanto, el aislamiento de rizobacterias promotoras del
crecimiento de las plantas de la rizsfera de esta misma planta para la produccin de
inoculantes, parece ser la solucin que cumple con los requerimientos mencionados para su
viabilidad, puesto que estas bacterias se encuentran adaptadas tanto a las condiciones micro
como macro ambientales de sta.

Aislamiento, seleccin y uso de bacterias diazotrficas de la rizsfera de


Jatropha curcas
Jalsen Ivn Teco Bravo, Isidro Ovando Medina, Miguel Salvador Figueroa y Mara de Lourdes
Adriano Anaya*
Centro de Biociencias. Universidad Autnoma de Chiapas, carretera a Puerto Chiapas Km 2.0, Tapachula,
Chiapas, Mxico.
*Autor para correspondencia: msalvad@hotmail.com

Resumen
Jatropha curcas ha recibido especial inters en varios pases por el alto contenido de
aceite de sus semillas el cual puede utilizarse para la produccin de biodiesel. La
adaptabilidad de esta planta a suelos marginales permite pensar que la microbiota asociada
a su rizsfera desempea un papel importante en su nutricin y desarrollo. En el presente
trabajo se aislaron rizobacterias diaztrofas, ecto y endorizosfricas de J. curcas de 29
diferentes sitios del estado de Chiapas, Mxico. Las cepas se caracterizaron en funcin de
la produccin de indoles y se evalu su efecto en la germinacin y desarrollo de plntulas
de J. curcas. Un total de 524 morfoespecies fueron aisladas en medios de cultivo libres de
nitrgeno, 52.5% de la ectorizsfera y las restantes de la endorizsfera. Quince
morfoespecies, 14 de ellas ectorizosfricas, produjeron indoles en el intervalo de 1525g.ml-1 las cuales adems del diaztrofo 11B, se emplearon para la inoculacin de
semillas de J. curcas. No se observ efecto en la germinacin. En cuanto a las variables de
desarrollo de las plntulas, se encontr diferencias significativas (P0.05) en la longitud y
dimetro del tallo, peso seco y porcentaje de humedad.
Palabras clave: Jatropa curcas. Biodiesel. Biofertilizantes. Rizobacterias. cido Indol Actico.

Introduccin
El empleo de recursos renovables para la produccin de carburantes lquidos resulta en la
actualidad necesario para sustituir a los combustibles fsiles (Ginwal et al. 2005). Por tener
propiedades semejantes a las del diesel de petrleo, el biodiesel, se ha colocado como la
principal alternativa puesto que su uso no requiere modificaciones tecnolgicas en los
motores donde se utiliza (Agarwal 2007). Atendiendo a lo anterior, se estn investigando
plantas con alto potencial para la produccin de aceites no comestibles, tales como
Jatropha curcas, la cual ha recibido especial atencin por el alto contenido de aceite en
sus semillas (48%) (Kochhar et al. 2008). Adems, es reconocida por su adaptabilidad a
suelos marginales; es nativa de Mesoamrica y actualmente crece de manera amplia en
muchos pases tropicales y subtropicales (Tong et al. 2006). En busca de asegurar la
disponibilidad de semillas de J. curcas, se requerir del cultivo masivo de esta planta, sin
embargo, ste no debera llevarse a cabo en suelos de buena calidad pues competira con la
produccin agrcola, ni ser dependiente de fertilizantes elaborados a partir de petrleo
puesto que se elevaran los costos de produccin adems de impactar al ambiente, por lo
tanto, resulta necesario el desarrollo de alternativas sustentables que solventen dicha
problemtica (Kun et al. 2007; Ovando-Medina et al. 2009a). En este contexto, se ha
comprobado que el uso de Rizobacterias Promotoras del

Crecimiento de las Plantas

(PGPR, por sus siglas en ingls) como biofertilizantes, promueve el crecimiento, ya sea
directamente a travs de la fijacin biolgica de nitrgeno, sntesis de fitohormonas y
solubilizacin de compuestos insolubles, o indirectamente, mediante mecanismos de
biocontrol como la sntesis de antibiticos, enzimas lticas, siderforos e iniciacin de la
Resistencia Sistmica Inducida (ISR) por parte de la planta (Curatti et al. 2005; Wu et al.
2005; Caballero-Mellado 2006; Ribaudo et al. 2006).

Diversas investigaciones empleando PGPR

han reportado resultados positivos en la

promocin del crecimiento de cultivos de importancia agrcola tales como, sorgo (AdrianoAnaya et al. 2006), maz (Mehnaz y Lazarovits 2006), lechuga (Pea y Reyes 2007), trigo
(Mahmoud y Mohamed 2008) y tomate (Huerta et al. 2007) entre otros; expresados en
incremento significativo en el peso fresco de brotes, plntulas, races, longitud del tallo;
pelos radicales y superficie de la raz, promocin de formacin

de races laterales;

incremento en la concentracin de N, P, K en la planta, as como disminucin en las


cantidades aplicadas de fertilizantes qumicos.
En J. curcas, Desai et al. (2007) reportaron efectos significativos en el crecimiento de
plntulas, inoculando semillas con Bacillus pumilus. Sin embargo, estudios sobre
aislamiento y uso de PGPR propias de J. curcas an no se han realizado, por lo que el
objetivo del presente trabajo fue aislar, seleccionar y evaluar PGPR en la germinacin y
desarrollo de plntulas de J. curcas.

Materiales y mtodos
Muestreo
Se tomaron muestras de rizsfera de Jatropha curcas de 29 diferentes sitios del estado de
Chiapas, Mxico, previamente georreferenciados por Ovando et al. (2009b). Se
seleccionaron tres plantas de entre 1 y 1.5 m de altura, separadas por una distancia
aproximada de 25 m, procurando obtener el total de las races, principalmente las de menor
dimetro, para ello la planta fue extrada en su totalidad, las races fueron colocadas en
bolsas de plstico con suelo propio suficiente para cubrirlas, transportadas en hielo y
conservadas a 10 C.
Cuantificacin de bacterias diazotrficas
Para determinar la cantidad de bacterias diazotrficas presente en las races de J. curcas
primeramente la rizsfera de plantas del mismo sitio, se mezcl para conformar una
muestra compleja. Las races presentes en la mezcla compleja se colocaron en un tamiz y se
lavaron con agua corriente para eliminar el exceso de suelo. Diez gramos de races
terciarias se colocaron en un matraz y se aforaron a 100 ml con agua destilada estril. La
suspensin se agit durante 20 min a 200 rev.min-1. Despus de la sedimentacin de los
slidos, con el sobrenadante se hicieron diluciones seriadas hasta 1x10-7. De las tres ltimas
diluciones se inocularon 100 l por picadura en tubos de ensayo que contenan medio de
cultivo semigelificado. Los tubos se incubaron a temperatura ambiente hasta observar
crecimiento. Se utilizaron tres medios de cultivo especficos para bacterias diazotrficas:
Nfb, LG y LGI (Dbereiner et al. 1995). Se hicieron tres rplicas por cada dilucin
empleada. La poblacin de diaztrofos se estim a travs de la tcnica del nmero ms
probable (NMP) (Woomer, 1994).
5

Aislamiento y cuantificacin de morfoespecies


Para cuantificar y aislar las morfoespecies se seleccionaron aquellos tubos donde se
observ abundante crecimiento. De los tubos seleccionados se tom con un asa una muestra
representativa (a lo largo de la columna de crecimiento) y se sembr en placas de Petri que
contena el medio de cultivo de procedencia de la muestra. La siembra se realiz por la
tcnica de estriado. Las cajas de Petri inoculadas se incubaron bajo las mismas condiciones
de la etapa anterior hasta observar crecimiento. Tomando como criterio, la diferencia en la
forma, el color y el tamao de las colonias se determin el nmero de morfoespecies de
bacterias de cada sitio. Cabe aclarar que las morfoespecies observadas no se contrastaron
entre sitios por lo que es posible encontrar morfoespecies iguales entre ellos. Una colonia
de cada morfoespecie se someti a proceso de purificacin (no todas se pudieron purificar)
y posteriormente se conservaron en medio de cultivo semigelificado.

Determinacin de la produccin de precursores de cido Indol Actico por las


morfoespecies
Para determinar la capacidad de produccin de precursores de AIA cada morfoespecie
purificada se pre-cultiv en 5 ml del respectivo medio de cultivo lquido durante 24 h a
30 C y 200 rev.min-1. El precultivo se emple para inocular matraces Erlenmeyer de 125
ml que contenan 50 ml del mismo medio y se cultiv bajo las condiciones previamente
mencionadas. Despus de 24 h se tomaron 10 ml del medio de cultivo y se centrifug a
8000 rev.min-1 durante 5 min a temperatura ambiente. La concentracin de grupos indlicos
en el sobrenadante se determin de acuerdo al mtodo especificado por Hartmann et al.
(1983) empleando el reactivo de Salkowski. Las morfoespecies fueron agrupadas en
intervalos de acuerdo a la produccin de indoles y aquellas que produjeron la mayor

concentracin fueron evaluadas en la germinacin de semillas y desarrollo de plntulas de


J. curcas bajo condiciones de invernadero.

Evaluacin del efecto de los inoculantes microbianos


Para determinar el efecto de las morfoespecies de diaztrofos sobre la germinacin y
desarrollo de plntulas de J. curcas se emplearon contenedores de 250 ml como unidad
experimental. Los contenedores se llenaron con suelo no estril y en cada uno se coloc una
semilla de J. curcas sin aseptizacin, sobre sta se inocul 1 ml de medio de cultivo
fermentado durante 24 h de cada una de las cepas. Se estableci un Diseo Completamente
al Azar (DCA) y se utilizaron 50 repeticiones para cada tratamiento, el tratamiento control
consisti en unidades experimentales sin inculo bacteriano. Como contraste se emple la
cepa 11B, un diaztrofo facilitado por el Laboratorio de Investigacin del Centro de
Biociencias de la Universidad Autnoma de Chiapas. Las unidades experimentales se
irrigaron con agua corriente todos los das. Despus de 30 das se evalu el efecto de los
inoculantes microbianos bajo los siguientes criterios: velocidad y porcentaje de
germinacin, contenido de clorofila, nmero de hojas verdaderas, longitud y dimetro de
los tallos, peso seco y porcentaje de humedad de las plntulas.

Medicin de las variables de respuesta


La velocidad de germinacin se obtuvo calculando la pendiente de la fase exponencial de
germinacin para cada tratamiento. El contenido de clorofila se midi en hojas verdaderas y
en cotiledonares para los casos en que las primeras no existan, utilizando un medidor
electrnico de clorofila marca Konica Minolta modelo Spad 502.
7

La longitud de los tallos se midi con una cinta graduada, desde la superficie del suelo
hasta el pice de la plntula y el dimetro de estos a travs de un vernier a la altura de la
superficie del suelo. El peso fresco y seco de las plntulas fue medido en una balanza
analtica, para el ltimo caso, las plntulas fueron colocadas en un horno a 60C durante
72h. Mientras que el porcentaje de humedad se obtuvo mediante la siguiente frmula:
( /)100; donde: = Peso fresco; = Peso seco.

Anlisis de los datos


Con la finalidad de conocer posibles correlaciones entre la riqueza de morfoespecies y la
abundancia, se hizo un anlisis de correlacin entre el nmero de las primeras y la
poblacin de diaztrofos de cada sitio. Los datos obtenidos del experimento de invernadero
fueron sometidos a ANOVA para determinar diferencias entre tratamientos y
posteriormente la prueba de Tukey (P = 0.05) para identificar entre que tratamientos
existieron dichas diferencias. Para lo anterior se utiliz el Software estadstico InfoStat
Versin 2009.

Resultados y Discusin.
Abundancia y nmero de morfoespecies de bacterias diazotrficas
La poblacin de clulas de diaztrofos de la rizsfera de J. curcas estuvo en el intervalo de
3.6 x 107 hasta > 11 x 109 clulas.ml-1 (Cuadro 1).
Cuadro 1 Abundancia de bacterias diaztroficas [clulas.ml-1 (x108)] ectorizosfricas y endorizosfricas de
Jatropha curcas aisladas de diferentes sitios del estado de Chiapas, Mxico.
Ectorizosfricas
Endorizosfricas
Ectorizosfricas
Endorizosfricas
Sitio
Sitio

LG
Nfb
LGI
LG
Nfb
LGI
LG
5.3
29
> 110 110
ND
ND
ND
ARR
> 110 LACO 110
3.5
24
> 110
2.7
1.9
110
110
40
110
110 > 110 110
RIZ
0.92 CHIC > 110 > 110 > 110
> 110 > 110 110
16
110 > 110 > 110
> 110 > 110
21
TYL
> 110 VCR
16
> 110
5.3
2.7
> 110
40
110
> 110
5.3
2.9
VCO > 110 > 110 > 110
16
5.3
> 110 > 110
PUJ > 110 > 110 > 110
40
21
2
110
2
2.7
CCR > 110
110 CDCU > 110 110
40
29
> 110 > 110
21
110
110
15
> 110 > 110
40
VIF
2
9.3
2
1.9
1.5
1.9
1.5
RV
> 110 COM
15
7.5
2.7
2
9.3
1.5
> 110 VLR
21
> 110 110
2
12
0.79
21
110
ND
ND
ND
TON > 110
Nfb, LGI, LG: medios de cultivo; ND: No Determinado; SCH: Suchiate, PC: Puerto Chiapas, CAC: Cacahoatn, MAP:
Mapastepec, PIJ: Pijijiapan, ACA: Acapetahua, HUX: Huixtla, TON: Tonal, ARR: Arriaga, SIM: Simojovel, IXT:
Ixtapa, TUX: Tuxtla, BER: Berriozabal, JIQ: Jiquipilas, OZC: Ocozocuautla, CIN: Cintalapa, LACO: Lagos de Coln,
RIZ: Rizo de Oro, CHIC: Chicomuselo, TYL: Tierra y Libertad, VCR: Venustiano Carranza, VCO: Villa Corzo, PUJ:
Pujiltic, CCR: La Concordia, CDCU: Ciudad Cuauhtmoc, VIF: Villa Flores, RV: Revolucin Mexicana, COM:
Comalapa, VLR: Villa Las Rosas.
SCH
PC
CAC
MAP
PIJ
ACA
HUX
SIM
IXT
TUX
BER
JIQ
OCZ
CIN

Nfb
110
> 110
> 110
> 110
> 110
> 110
> 110
40
> 110
> 110
> 110
110
> 110
> 110

LGI
110
21
21
> 110
15
15
2
> 110
> 110
21
> 110
21
29
> 110

LG
110
15
> 110
0.36
0.36
2.7
1.1
21
> 110
21
11
7.5
> 110
> 110

Nfb
> 110
> 110
> 110
1.5
3.5
> 110
> 110
> 110
> 110
> 110
> 110
7.5
21
29

LGI
29
> 110
110
0.36
40
7.5
1.1
> 110
> 110
2.4
> 110
> 110
5.3
110

Respecto al nmero de morfoespecies de bacterias diazotrficas (sin discriminar entre


sitios), se lograron cuantificar 524 de las cuales 52.5% correspondieron a microorganismos
de la ectorizsfera y el resto de la endorizsfera (Cuadro 2). El nmero de morfoespecies
por sitio estuvo en el rango de 10 a 24, siendo 15, 17, 18, 19, 21, 22 y 24 las ms
frecuentes, mientras que el promedio fue de 18.06. El nmero de morfoespecies
9

ectorizosfricas que crecieron en los diferentes medios de cultivo estuvo en el rango de 3 a


8, de 1 a 5 y de 1 a 2 para los medios Nfb, LGI y LG, respectivamente, mientras que en la
endorizsfera fue de 1 a 8, de 1 a 5 y de 1a 3.

Cuadro 2 Nmero de morfoespecies de diaztrofos ectorizosfricos y endorizosfricos de Jatropha curcas


aislados de diferentes sitios del estado de Chiapas, Mxico.
Ectorizosfricos
Endorizosfricos
Ectorizosfricos
Endorizosfricos

Sitio

SCH
PC
CAC
MAP
PIJ
ACA
HUX
SIM
IXT
TUX
BER
JIQ
OCZ
CIN
TON

Nfb
3
7
5
4
5
4
6
7
6
4
4
7
4
6
8

LGI LG
3
2
5
2
2
2
1
2
4
1
1
1
4
2
1
2
2
2
3
1
5
2
3
2
4
1
4
1
3
1

Nfb
5
6
8
3
2
7
3
4
2
1
7
3
3
5
ND

LGI
5
2
3
5
2
3
3
3
3
1
2
4
3
4
ND

LG
3
2
1
1
1
3
1
1
2
2
2
2
2
2
ND

Sitio

ARR
LACO
RIZ
CHIC
TYL
VCR
VCO
PUJ
CCR
CDCU
VIF
RV
COM
VLR

Nfb
5
3
6
8
4
3
4
4
3
5
5
5
6
4

LGI LG
3
2
2
2
3
1
4
2
2
2
4
1
3
2
5
1
4
2
2
1
2
1
1
1
3
1
2
2

Nfb
ND
5
6
5
6
6
4
6
4
6
4
3
3
4

LGI LG
ND ND
2
1
4
2
3
2
2
2
3
1
5
1
5
3
2
2
4
2
3
1
1
2
1
1
3
2

Nfb, LGI, LG: medios de cultivo; ND: No Determinado; SCH: Suchiate, PC: Puerto Chiapas, CAC: Cacahoatn, MAP:
Mapastepec, PIJ: Pijijiapan, ACA: Acapetahua, HUX: Huixtla, TON: Tonal, ARR: Arriaga, SIM: Simojovel, IXT:
Ixtapa, TUX: Tuxtla, BER: Berriozabal, JIQ: Jiquipilas, OZC: Ocozocuautla, CIN: Cintalapa, LACO: Lagos de Coln,
RIZ: Rizo de Oro, CHIC: Chicomuselo, TYL: Tierra y Libertad, VCR: Venustiano Carranza, VCO: Villa Corzo, PUJ:
Pujiltic, CCR: La Concordia, CDCU: Ciudad Cuauhtmoc, VIF: Villa Flores, RV: Revolucin Mexicana, COM:
Comalapa, VLR: Villa Las Rosas.

La composicin y diversidad de las comunidades bacterianas del suelo estn determinadas


por un amplio rango de factores biticos y abiticos (Buckley y Schmidt 2001). Las
bacterias diazotrficas pueden encontrarse en varios hbitats colonizando la rizsfera y
asociadas tanto a la superficie como dentro de las races de varias especies de plantas,
siendo stas ltimas quienes controlan el desarrollo de la microbiota rizosfrica a travs de
los exudados radicales (Jones y Darrah 1995).
10

Por lo tanto, la cantidad de morfoespecies que se aslen de una determinada rizsfera


depender, en gran medida, del tipo de planta en la que se realice dicho aislamiento.
En plantas anuales, Tejera et al. (2005) y Carcao-Montiel et al. (2006) aislaron 27 y 18
morfoespecies de la rizsfera de la caa de azcar y maz, respectivamente; mientras que
Abbas et al. (2007) aislaron, en promedio, ocho cepas de Azospirillum sp. de races de
trigo, maz, cebada y centeno. Por otra parte, en plantas perennes, Barreto et al. (2007)
aislaron ocho morfoespecies de diaztrofos de la rizsfera de A. excelsum. El rango de
morfoespecies aisladas de la rizsfera de las diferentes accesiones de J. curcas empleadas
en este trabajo, estuvo dentro del intervalo de lo previamente reportado. Por otro lado, dado
que el aislamiento de las morfoespecies se realiz con procedimientos similares a los
empleados en dichos trabajos es predecible que el gnero predominante sea Azospirillum.
El anlisis de correlacin entre la abundancia y el nmero de morfoespecies de bacterias
diazotrficas no mostr correlacin alguna (R= 0.263). La falta de correlacin entre las
variables pudiera ser resultado tanto del mtodo empleado para definir morfoespecies, ya
que en este interviene la capacidad de discriminar caractersticas morfolgicas, como de no
haber tomado en consideracin morfologas de colonias similares en la contabilizacin.
Habra que emplear un mtodo ms sensible, como la secuenciacin del gen 16s rRNA,
para definir con certeza cuales morfoespecies son similares (Fierer y Jackson 2006).

11

Produccin de grupos indlicos por las morfoespecies aisladas


Se midi la produccin de indoles a 403 morfoespecies. La produccin oscil entre 3.5 a
24.6 g.ml-1 de medio de cultivo. El 57.8% de las morfoespecies produjeron en el intervalo
de 7 - 10.5 g.ml-1 mientras que, el 3.7% produjeron ms de 14.1 g.ml-1. El arreglo por
intervalos de produccin de grupos indol (Figura 1) ubic a 15 morfoespecies en los tres
intervalos mayores de produccin.

233

Nmero de morfoespecies

250
200
150

113

100
39

50

12

0
0-3.5

3.6-7

7.1-10.5

10.6-14 14.1-17.5 17.6-21

24.5-28

Concentracin (g.ml-1)
Figura 1 Intervalos de produccin de grupos indol por las morfoespecies diaztrficas aisladas de la rizsfera
de Jatropha curcas de diferentes sitios del estado de Chiapas, Mxico.

Las mayores concentraciones de indoles se obtuvieron con las morfoespecies PIJEXB,


RVEXD, SIMEXA, CACEXC, ACAEXA, PIJENB, ACAENC, HUXEXC, SIMEXC,
IXTEXE, ARREXD, CCREXC, BERREXD, ARREXA Y LACOENC,con 14.1, 14.2,
14.3, 14.5, 14.5, 14.7, 14.9, 15.4, 15.6, 16.5, 17.2, 17.5, 18.6, 18.7 y 24.6 g.ml-1
respectivamente. Todas las morfoespecies previamente nombradas fueron aisladas en
medio de cultivo Nfb y nicamente dos de ellas fueron aisladas de la endorizsfera.
12

La sntesis de fitohormonas y especficamente de la auxina cido Indol-3-Actico (AIA),


ha sido reconocida como una caracterstica importante de las PGPR ya que dicha auxina
promueve el crecimiento de las plantas (Somers et al. 2005). Es por ello que diversas
investigaciones se han enfocado a la caracterizacin de rizobacterias en cuanto a su
capacidad metablica de produccin de grupos indlicos, los cuales son precursores del
AIA. En este contexto, Hernndez et al. (2004) evaluaron la produccin de AIA por
rizobacterias aisladas de maz, encontrando valores de 5.30 a 21.53 g.ml-1 siendo 7 de 42
aislados los que produjeron ms de 15 g.ml-1 sin embargo, dichos autores emplearon un
medio de cultivo enriquecido con triptfano, una molcula precursora de la sntesis de AIA.
As mismo, Pazos et al. (2000) reportaron que la mayora de las cepas de Azospirillum sp.
aisladas de dos tipos de suelo rizosfrico de arroz, utilizando medio de cultivo libre de
nitrgeno, produjeron en el intervalo de 10 a 12.6 g.ml-1, destacando una cepa que produjo
33 g.ml-1. Por otro lado, Rodrguez et al. (2005) reportaron que la produccin de grupos
indlicos por cepas no identificadas endfitas de caa de azcar, estuvo en el intervalo de
1.8-2.5 g.ml-1. Mientras que Acebo et al. (2007) obtuvieron produccin de 2.75-8.6
g.ml-1 en cepas de Azospirillum sp. aisladas de la rizsfera de arroz, cultivadas en medio
con triptfano.
De acuerdo a los resultados citados, la produccin de indoles por las morfoespecies aisladas
en el presente trabajo puede considerarse como alta si tomamos en cuenta que estas fueron
cultivadas en medio sin precursores de AIA, contrario a algunos de los casos anteriores
donde los autores emplearon medio de cultivo enriquecido con triptfano y donde la
produccin de indoles fue igual o inferior a los presentes.

13

Efecto de la inoculacin en la germinacin


En el Cuadro 3 se muestran los resultados del efecto de la inoculacin con cepas
seleccionadas de diaztrofos, en la germinacin de semillas de J. curcas. Ningn
tratamiento present 100% de germinacin.
El porcentaje mnimo de germinacin fue de 40% (tratamientos, HUXEXC y BERREXD),
mientras el mximo de 74% (tratamiento ARREXD). Tres de los tratamientos presentaron
porcentaje mayor al del tratamiento CONTROL, tres ms el mismo porcentaje y los
restantes valores inferiores al de ste. Las velocidades de germinacin estuvieron en el
intervalo de 1.037 a 1.324 das-1, correspondiendo la mxima al tratamiento IXTEXE y la
mnima a SIMEXA.
Cuadro 3 Porcentaje y velocidad de germinacin de Jatropha curcas inoculadas con diferentes cepas de
diaztrofos.

Tratamiento Germinacin (%)


ARREXD
CCREXC
ACAENC
IXTEXE
PIJEXB
CONTROL
LACOENC
CACEXC
11 B

74
72
72
70
70
70
70
66
64

Velocidad de
germinacin
(das -1)
1.275
1.318
1.25
1.324
1.314
1.314
1.24
1.233
1.198

Tratamiento Germinacin (%)


PIJENB
SIMEXC
ACAEXA
RVEXD
ARREXA
SIMEXA
BERREXD
HUXEXC

62
62
58
58
56
52
40
40

Velocidad de
germinacin
(das -1)
1.237
1.213
1.303
1.299
1.199
1.037
1.244
1.097

Los tratamientos IXTEXE y CCREXC presentaron velocidades de germinacin mayores a


la del tratamiento testigo, sin embargo, nicamente el segundo present tanto mayor
velocidad como porcentaje de germinacin, mientras que 13 de los tratamientos restantes
presentaron valores menores al del tratamiento control
14

Efecto de la inoculacin en el desarrollo de plntulas


En el Cuadro 4 se puede observar las medidas de las variables evaluadas para determinar el
efecto de la inoculacin de semillas con bacterias diazotrficas en el desarrollo de plntulas
de J. curcas bajo condiciones de invernadero.
Cuadro 4 Valor promedio de las variables determinadas en plntulas de Jatropha curcas 30 das despus de inoculadas
las semillas con diferentes aislados de diaztrofos.
Tratamiento

Longitud del
tallo (cm)

Hojas
verdaderas
(n+1)

Dimetro del
tallo (cm)

Contenido de
clorofila
(spad)

Longitud de
la raz (cm)

Peso seco de la
plntula (g)

Humedad (%)

HUXEXC

10.871.85 b

1.450.21 a

0.550.06 abc 39.024.4 a

13.9515.96a

0.510.11 b

83.422.04 def

BERREXD

11.971.21 ab

1.470.19 a

0.560.06 abc 38.074.47 a

10.572.63 a

0.640.11 ab

81.773.59 f

IXTEXE

12.212.07 ab

1.510.15 a

0.570.06 a

10.712.83 a

0.690.11 a

83.952.74 bcdef

SIMEXC

11.611.43 ab

1.50.15 a

0.520.04 abc 40.226.12 a

9.762.7

ARREXA

12.241.93 ab

1.5 0.18 a

0.550.05 abc 37.373.75 a

11.242.45 a

0.590.15 ab

86.141.02 ab

37.763.63 a

a 0.540.11 b

86.041.89 ab

ARREXD

12.622.29 a

1.43 0.2 a

0.570.05 ab

37.163.54 a

10.663.18 a

0.640.16 ab

86.781.08 a

LACOENC

10.851.82 b

1.410.16 a

0.570.05 abc 39.454.86 a

11.522.53 a

0.540.1 b

86.442.02 a

CCREXC

11.951.67 ab

1.50.15 a

0.540.04 abc 38.22.73

0.580.12 ab

86.061.41 ab

ACAENC

11.681.6 ab

1.450.14 a

0.530.05 abc 37.963.57 a

10.933.2

a 0.570.13 ab

85.112.77 abcd

9.582.65

a 0.510.17 b

85.912.21 abc

a 13.1414.85a

PIJEXB

11.341.48 ab

1.480.16 a

0.520.07 c

PIJENB

11.771.66 ab

1.450.15 a

0.530.06 abc 38.634.91 a

39.834.07 a

11.052.75 a 0.560.14 ab

85.931.95 abc

ACAEXA

12.162.04 ab

1.5 0.21 a

0.570.04 abc 38.074.34 a

11.742.9

83.642.36 cdef

RVEXD

12.082.06 ab

1.530.16 a

0.550.08 abc 37.533.48 a

14.1416.56a

10.442.11 a 0.560.11 b

85.992.44 abc

11.393.05 a 0.600.13 ab

82.712.69 ef

0.630.16 ab

84.683.24 abcde

SIMEXA

12.221.11 ab

1.470.17 a

0.520.06 bc

CACEXC

11.461.54 ab

1.480.16 a

0.570.06 abc 39.434.65 a

11B

12.621.69 a

1.520.18 a

0.540.05 abc 41.213.94 a 9.953.17

a 0.630.12 ab

83.422.95 def

CONTROL

11.621.33 ab

1.440.17 a

0.550.06 abc 52.3775.95a

a 0.590.14 ab

84.011.7 bcdef

CV

14.6

11.49

10.25

39.243.99 a

a 0.620.12 ab

48.27

11.092.5
62.12

22.58

2.65

CV: Coeficiente de variacin


Letras distintas (a-f) por columnas indican diferencias significativas (p 0.05)

Se obtuvieron diferencias estadsticamente significativas (P0.05) entre algunos


tratamientos pero no respecto al tratamiento control, en las variables longitud y dimetro
del tallo, peso seco y porcentaje de humedad de las plntulas, nicamente en el porcentaje
de humedad se encontraron diferencias significativas respecto al tratamiento control. En
cuanto a la longitud del tallo, las plntulas de los tratamientos ARREXD y 11B presentaron
15

los valores mayores en esta variable. Para ambos casos el valor de las medias fue el mismo,
mientras que los tratamientos HUXEXC y LACOENC presentaron los valores ms bajos.
Para la variable dimetro del tallo, los valores ms altos encontrados correspondieron a los
tratamientos IXTEXE y ARREXD con 0.57 cm para ambos casos. Por otra parte, el
tratamiento PIJEXB fue el que present valor mas bajo.
Los resultados obtenidos en cuanto al peso seco de las plntulas colocaron al tratamiento
IXTEXE como el mas alto con 0.69 g. El porcentaje de humedad de las plntulas de los
tratamientos ARREXD y LACOENC resultaron ser los mayores.
Por otra parte, para las variables nmero de hojas, contenido de clorofila y longitud de la
raz principal no existieron diferencias significativas entre tratamientos.
La nula diferencia en el nmero de hojas y contenido de clorofila podra deberse a la edad
de las plntulas de J. curcas del presente trabajo, ya que como mencionan Desai et al.
(2007) el contenido de clorofila es bajo en edades tempranas de una planta, puesto que sta
le da prioridad a la formacin de los tejidos que le proporcionan soporte ante las
condiciones del

ambiente en que se encuentran, ms que al desarrollo del aparato

fotosinttico, lo anterior se refuerza si tomamos en cuenta que entre las medidas del
dimetro del tallo si existieron diferencias significativas y que estas fueron tomadas a la
altura de la superficie del suelo, sugirindonos que, precisamente, las plntulas en el inicio
de su establecimiento, buscan asegurar su estabilidad

para sobrevivir frente a las

condiciones ambientales.
Mientras que el nulo efecto de los inoculantes en la promocin del crecimiento de la raz
principal de las plntulas de J. curcas podra atribuirse al estadio de la planta en que se
realiz la inoculacin ya que sta se aplic sobre la semilla y no en la raz de las plntulas
16

puesto que la colonizacin de estas bacterias se lleva a cabo en las races y es ah donde
estas intercambian metabolitos con las plantas y provocan cambios morfolgicos y
fisiolgicos (Ribaudo et al. 2006). Adems, la inoculacin nicamente se llev a cabo en el
da uno del experimento y no se realiz posteriormente cuando el sistema radicular estaba
formado, lo que pudo haber impedido que las clulas inoculadas sobrevivieran hasta el
momento en que las races empezaron a formarse y ejercer as su efecto, ya que de acuerdo
a Murty y Ladha (1987) las rizobacterias colonizan la superficie de la raz a travs de
mecanismos como la imbibicin en la capa de mucigel de la superficie de estas y de la
sntesis de un canal fibrilar de naturaleza proteica, con los cuales estas bacterias aseguran
su adhesin y supervivencia en la raz. Por otra parte, Bashan y Levanony (1990) resaltan
que el proceso anterior llevado a cabo por las bacterias, resulta clave no solo para la
sobrevivencia de stas, sino porque de lo contrario, las sustancias excretadas por ellas, se
difunden a travs del suelo y son consumidas por microorganismos metablicamente
verstiles antes de que puedan ejercer efecto alguno sobre la semilla o la planta.
Por otra parte, a diferencia de los resultados del presente trabajo, Desai et al. (2005)
inoculando semillas de J. curcas con Bacillus pumilus, reportaron porcentaje de
germinacin del 100% nicamente para las semillas inoculadas as como incremento en la
longitud de las races de las plntulas de hasta 140 % respecto al tratamiento control, sin
embargo, ellos inmovilizaron las clulas bacterianas con Carboxil Metil Celulosa
suplementado con quitina y las adhirieron de este modo a la superficie de las semillas, este
proceso pudo haber asegurado que las bacterias se mantuvieran sobre stas y que los
metabolitos excretados por ellas llegaran hacia la semilla y posteriormente a las races,

17

promoviendo la germinacin y crecimiento de las races, as como tambin evitar la prdida


de las bacterias en el entorno, este proceso puede explicar el por qu del nulo efecto de la
inoculacin en la germinacin en el presente trabajo, ya que como indican Bashan y
Holguin (1997) cuando la inoculacin se lleva a cabo sobre la semilla o directamente en el
suelo, las bacterias quedan sujetas a todos los factores qumicos y fsicos de este, adems de
la competencia de la microbiota ah presente, mientras que Bashan et al. (1995) mencionan
que durante el proceso de irrigacin las bacterias pueden ser arrastradas por el agua y
difundirse a travs del suelo de los alrededores cuando estas no se encuentran adheridas a
las races.
Las diferencias de respuesta de los tratamientos observada en este trabajo en cuanto a la
germinacin, as como las obtenidas en algunas variables, podra

ser atribuida a la

variabilidad gentica de las semillas ms que al efecto de los inoculantes microbianos,


puesto que las semillas fueron tomadas de diferentes plantas, cultivadas en diferentes reas
de terreno.

18

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