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16/8/2007

A DiaMed Latino Amrica


oferece

Testes em fase de
antiglobulina humana

Curso de Imunohematologia Mdulo I,


Bases Imunohematolgicas:

Direto e Indireto

Desvendando a Imunohematologia

Site Novo!!!!!
www.diamed.com.br

O que so potencializadores?

O que so potencializadores?

So substncias ou meios capazes de


promover alteraes no equilbrio eletro-

Como surgiram ?

cintico existente entre hemcias suspensas em

Em 1945, Coombs e cols. descreveram o teste indireto de antiglobulina em


meio salino.

meio isotnico para permitir a deteco de

Passados mais de 50 anos, o clssico PAI salino ainda citado na literatura


como o padro ouro.

anticorpos ligados em suas membranas


Aceleram a reao
Melhoram o acesso dos anticorpos
Tm diferentes fundamentos e tcnicas

O que so potencializadores?

Potencializadores de reao agXac

Soro antiglobulina humana (Coombs)

Albumina bovina

em meio salino.

Polietilenoglicol (PEG)

Passados mais de 50 anos, o clssico PAI salino ainda citado na

Enzimas proteolticas

Como surgiram ?
Em 1945, Coombs e cols. descreveram o teste indireto de antiglobulina

literatura como o padro ouro.


A seguir, Diamond e Abelson descreveram a albumina 22% como
um potencializador para a deteco de anticorpos incompletos ou

Ficina, papana, bromelina

Solues de baixa fora inica (LISS)

IgG.

16/8/2007

Teste da Antiglobulina Humana

Explicaremos mais adiante!

Potencial Zeta e seus modificadores


A aglutinabilidade de um sistema tanto maior quanto mais
baixo for o valor do Potencial Zeta
Reduo da carga eltrica das hemcias (
):

+ + +
+ + + +++
+++ + + +
+ + + +
+
+++
+
+
+
+
+
++ + +
+
+ +
+
++
+ + +
+
+
+ + + + ++ + +

Enzimas proteolticas

Enzimas proteolticas

Hidrolizam as sialoglicoprotenas da superfcie celular e,


+
+++ Enzima
+consequentemente,
+ + reduzem a carga negativas da membrana

+ ++ + + ++
++ + destas tcnicas pode:
Enzima
A utilizao
+ +
+ +
+ +
- Potencializar
a+reatividade
de alguns sistemas +
+
+
ABO,Rh, Kidd, Lewis e P
++ ++ +++++ especialmente
+
+ antgeno/anticorpo,
- +Anular as configuraes antignicas de M, N, S, s, Fya, Fyb e
Hidrlise
Sialoglicoprotenas
Xga.
++++++ ++ +
++
++++falsos
++positivos ou negativos.
++ resultados
- Produzir
(macromollulas)
+
+
+ ++ so: +Bromelina e Papaina, alm de
+ mais usadas
As enzimas
tripsina e ficina.
++ ++++ ++ + +
+

Os mais usados:

fixao de anticorpos especficos


tratamento c/ enzimas proteolticas

Potencial Zeta e seus modificadores


A aglutinabilidade de um sistema tanto maior quanto mais baixo for o valor do
Potencial Zeta

Reduo da carga eltrica das hemcias (


):
fixao de anticorpos especficos
tratamento c/ enzimas proteolticas

Alterao da composio do meio:


adio de substncias macromoleculares (alteram D)
modificao da fora inica ()

Os mais usados:

Solues de baixa fora inica (LISS)

Polietileno glicol (PEG)

Soluo de glicinato de sdio tamponada com baixa fora inica.

Causam
menor interferncia
++ ++ na unio antgeno-anticorpo, facilitando
++ ++ ++ das++hemcias.
+
a sensibilizao
+
+++
+
+

+
+ +
+++
+tempos
+
Permitem
mais
+ ++ LISS
Salina
+ curtos.
++++de+incubao
+
+
+
+ +
Pode produzir falsos resultados
positivos
devido a fixao
+
+
+
+ ++
++ de componentes
inespecfica
++ + do complemento membrana.
++ ++ +
+ ++
+
+
+
+
+
+
++
+
+ +
+
+

Polmero, solvel em gua cuja ao consiste na eliminao de gua


e na +
concentrao +
dos
+
+++anticorpos

+ + ++ +

Aumenta
+ + + a+intensidade
+ + +++++da+ aglutinao.
+
++ +aSalina
especialmente
til
deteco de anticorpos IgG.
++ para
++
PEG

+ + pois+a +baixa
++ +
No se deve usar o+soro
antiglobulina poliespecfico
+ ++
+
++
fora +
inica
meio
+++produz
+ + resultados falso positivos devido a
+ + do +
+
++ componentes
++ inespecfica
do complemento na superfcie
+ + ++de
+fixao
++
++
H 2O
da clula.
H 2O

H 2O

16/8/2007

Aglutinao

Potencial Zeta e seus modificadores


A aglutinabilidade de um sistema tanto maior quanto mais baixo for o valor do
Potencial Zeta

Reduo da carga eltrica das hemcias (


):
fixao de anticorpos especficos
tratamento c/ enzimas proteolticas

Alterao da composio do meio:


adio de substncias macromoleculares (alteram D)
modificao da fora inica ()

Ph e temperatura

+ + +
+ + + +++
+++ + + +
+
+
+ +
+
+ + + +++
+
+ Potencializador
++ + +
+
+ +
Liss, PEG, Alb
+
++
+ + +
+
+
+ + + + ++ + +
+
+ +
+ + +
+
+
+
+
+
+ + +
+ + + + +
+ +
+
+
+
+
+
++ +
Potencializador +
+

GH

Potencializadores de reao agXac


No se esqueam que
existem reaes de
aglutinao inespecficas,
que geralmente ocorrem
por erros na execuo da
tcnica!

Inexistncia de um nico mtodo que associe o necessrio


nvel de sensibilidade/ especificidade .
Embora os novos mtodos apresentem alta especificidade,
recomenda-se a eleio, pelo laboratrio, de pelos
2 tcnicas, sendo conveniente que uma delas utilize
a enzima como potencializador.
(BRANDO, C. SBHH, JUNHO 2002)

Potencializadores

Soluo de
PEG ou
PEG+LISS

LISS

Soluo de
albumina
bovina 22%

Soluo de
enzimas
(1estgio)

Quantidade
(geralmente)

2 gotas

4 gotas

2-3 gotas

2 gotas

Tempo de
incubao a
37C

15-(45) min

5-(30) min

15-(60)min

10-(30)min

Caractersticas

 Sensibilidade
comparada ao
mtodo em gel

 Rapidez

Boa
reprodutibilidad
e
Usar com soro
AGH
monoespecfico

 Boa
sensibilidade
Qualquer
variabilidade em
proporo do
potencializador e
soro pode
promover falsos
resultados
positivos

Vamos falar da rotina de


Pesquisa e Identificao de
Anticorpos Irregulares...

Sensibilidade
 Anticorpos do
sistema ABO/
Viscoso, pode
Rh
dificultar a
leitura e causar
Para PAI e
roleaux
Identificao de
anticorpos
Potencializao de
acs sem
significado clnico

Khn, T.I.B.B., Jornada Senac 2004

16/8/2007

O que acontece quando uma


substncia estranha penetra em nosso
organismo?

Transfuses sanguneas
Reao transfusional:

(Sistema

Transfuso  introduo clulas  substncias


estranhas  resposta imune

reconhece as substncias/clulas que


so
estranhas
ao
nosso
organismo
(antgenos)
e responde combatendo-a.

Por isso, quanto mais similar for este sangue,


menor a possibilidade do organismo do receptor
combater as clulas do doador.

Sistema
Imune):

de

defesa

coordenado e complexo:

Transfuses

Riscos transfusionais

Benefcios X Riscos
A reao transfusional qualquer intercorrncia

Benefcios
Benefcios
Benefcios

Riscos
Riscos
Riscos

resultante da transfuso sangunea, durante ou aps sua


administrao.
(WENDEL, S.N. ET AL,2005)

Incidncia de aloimunizao antgenos de


grupos sanguneos
Pacientes politransfundidos frequentemente
desenvolvem aloanticorpos

3% dos pacientes em geral

at 35% dos pacientes falciformes

at 10% dos pacientes talassmicos

cerca de 10% dos pacientes politransfundidos

Reao Transfusional Imune Hemoltica


(RTIH)
Imediatas:
ocorrem entre 10 minutos e 24 h aps o incio da
transfuso
Tardias:
Podem ocorrer at 7-20 dias depois de realizada a
transfuso.

O risco cerca de 1% a cada nova transfuso

(RDC 153/2004)

ISSIT, P.D.
P.D.,, 1999

16/8/2007

Frequncia dos anticorpos implicados na


RTIH
Tardia

Imediata

Extravascular

Intravascular

O QUE UM PACIENTE SENSIBILIZADO?


Indivduo que produziu um anticorpo irregular, isto ,
anticorpo que no deveria ter sido formado .

Rh ( 34% )

ABO (0,8% )

Kidd ( 30% )

Extravascular

Ateno:

Duffy ( 14% )
Kell ( 13%)

Kidd,Duffy

Devemos sempre avaliar seu significado clnico!

Outros (1%)

Mollison, 1988

Hemlise mediada por anticorpos

Anticorpos contra antgenos eritrocitrios


Aloanticorpos
partir

AutoAnticorpo

Aloanticorpo

do

so

reconhecimento

a
de

substncias no prprias que esto


presentes

Anticorpo droga-induzido

formados

na

membrana

eritrocitria
Antgenos!

Anticorpos contra antgenos eritrocitrios

O que poder acontecer se transfundirmos hemcias


contendo antgenos incompatveis aos anticorpos j
formados, presentes no plasma do receptor?

Protenas (imunoglobulinas)
produzidas pelos plasmcitos aps

Hemlise intravascular

ativao do Sistema Imune.

Hemlise extravascular

Em Imuno-hematologia:
classes IgM e IgG so as mais
importantes.

EM ALGUNS CASOS:
MORTE DO PACIENTE

16/8/2007

O que poder acontecer se transfundirmos hemcias


contendo antgenos incompatveis aos anticorpos j
formados, presentes no plasma do receptor?

O que so anticorpos irregulares?

...E QUE TESTES

Por isso, devemos pesquisar os

UTILIZAMOS
PARA DETECTDETECTLOS IN VITRO ?

anticorpos no receptor antes de


transfuses!!!!

Paciente
AMOSTRA DE SANGUE

Testes Laboratoriais
Rotina Imunohematolgica

FENOTIPAGEM
ABO/Rh

T.A.D.

POSITIVO

NEGATIVO

ELUIO

T.A.D.

reversa
ABO

NEGATIVO

POSITIVO

IDENTIFICAO
DE ANTICORPOS
SRICOS

IDENTIFICAO
DE ANTICORPOS
ADSORVIDOS

Paciente
AMOSTRA DE SANGUE

P.A.I.

*discrepncias

Painel de Hemcias

Fenotipagem
paciente/bolsa

Deteco de Anticorpos
P.A.I.

Soro/plasma
principal: P.A.I.
existem outras tcnicas que detectam

Ligados s hemcias
principal: T.A.D.
existem outras tcnicas que detectam
ELUIO

Painel de Hemcias

16/8/2007

TAD

PAI

Qual a diferena entre


TAD e PAI???

Porque usamos sempre


Soro AGH???

Teste da Antiglobulina Humana


Alguns anticorpos no conseguem sozinhos abaixar o
Potencial Zeta, a ponto de aglutinar os eritrcitos
anticorpos no aglutinantes

Auto
anticorpo?

Aloanticorpo?

TAD POSITIVO

PAI POSITIVO

Teste da Antiglobulina Humana


O Soro de AGH um anti-anticorpo humano,
inicialmente produzido a partir da sensibilizao de
animais (heteroanticorpo)

Precisam de um meio artificial que promova a


visualizao desta reao, pela aglutinao
TESTE DA ANTIGLOBULINA HUMANA

_
+
+
+ + + + ++ + +
+ + + +
+ +

Estes acs geralmente so no aglutinantes!

Reage com todas as globulinas humanas quando


adicionado ao teste

Vamos ver como isto funciona!

_ +
+
+
+
_
+
+
+ _ +
_
_
+ _
_ + _ +
+
+
+ + +
+
+
+
_
+
+ +
_ + _ + _ + _ +
+
+
+ + +
_
+
+
_
+
+
+
+ _
+ ++
+
+ +
+
+
COOH_
_
+ ++
_
+
+
COOH+
+
+
+ + +
_
_
+ _
COOH+
+ + +
+
+ + + +
+
COOH_
_
+ + +
+
+
+ + _
+
COOH_
+
+ + +
_
+
+
+
COOH+
+ +
+ + +
+ _
_ +_
+
+
COOH+
+
+
+
++ +
_
_
+
COOH+ + + +
+
+
+
+ +_ + + _ +
COOH+
+
_
+
+
COOH+ +
+ _
+
+ + +
+
+
COOH_ +
+ _
+
+ +
+
_ +
+
COOH+ +
ImunoBase- DiaMed AG

Sensibilizao
Acs no aglutinantes

16/8/2007

_
+
_ + _ +_
+
+ ++ + + +
+
_
+
+ + + + _+
_
+
+
_ +
+
+
+
+
+ +
+
+
_
+
+
+ _ + _ + _ +
+
+
+
+
_
_
+
+
+ _
+
+
+
COOH+
+
_
+
COOH_ + Adio de soro
+ AGH
+
+
COOH_
_
+ _Aps lavagem
+
+ +
+ em
+
COOHtubo!
+ + - tcnica
_
_ +
+ +
+
+
_
COOH+
+ +
_
+
+
_
+
+
+
COOH+
+
+
+ _
+_
+ +
COOH+
+
+
+
_
_
COOH+ +
+
+
COOH+ + + + _ +
+ +
_
COOH+
+
+ _
+
+ +
COOH+
+ _ +
+ + +
COOH_ +
ImunoBase- DiaMed AG
+ +

+
+ ++ + + +
+
+
+

_
+

_+
+

COOH-

+
+

COOHCOOHCOOHCOOH-

_
_ + _ +_
+
+
_
+
_
+
_ +
+
+
+
+
+
_
+ _ + _ + _ +
+
+
_
+
_
+
+
+
+
+
_
+ _ +
_
+
+
+
Adio de soro AGH=
_ de+
_
+ _
Neutralizao
+
+
+ + cargas eltricas
_
_ +
+
+
+
_
+
+
_
+
+ _
+
+

COOH-

COOH-

COOHCOOHCOOHCOOHImunoBase- DiaMed AG

COOH-

+
+
+ _
+
_
+
+
+
+
+
_
_
+
+ +
+
+ + + + _ +
+ +
_
+ +
+
+ _
+ +
+
+ _ +
+ + +
_ +
+ +

Princpio do Teste de AGH


TESTE DA
ANTIGLOBULINA DIRETA
(T.A.D.)
EM TUBO
Auto
anticorpo

TAD POSITIVO

...Ser
Ser que eu no posso
pular esta etapa???
to chato e
trabalhoso!!!

1 passo:
Lavagem de hemcias e preparo de suspenso
5%

NO!
A lavagem das hemcias para
TAD obrigatria:
3X para amostras em geral
6-9X para Cls de cordo

16/8/2007

Cuidados com o Teste da Antiglobulina


Humana
Os anticorpos do soro de AGH podem reagir com
qualquer globulina humana:
Por isso, em tubo necessrio lavar (bem!!) as hemcias
antes de acrescentar-se o soro AGH

ATENO!

E pronto!
Sua suspenso de
trabalho a 5% est
preparada !

Em GEL: tcnica sem lavagem: POR QUE?

Adicionar 1 gota de
suspenso de hemcias
LAVADAS, a 5%

16/8/2007

+ 1 gota de suspenso
de hemcias a 5% .
AGH monoespecfico IgG:

Centrifugar
imediatamente
15 a 3.400 rpm.

Adicionar 2 gotas do soro de


Antiglobulina humana IgG

Observar o resultado e
anot-lo.

DiaMed IDID-Micro Typing System


Soro poliespecifico

TESTE DA
ANTIGLOBULINA DIRETA

Sem
Lavagem!

(T.A.D.)
EM GEL TESTE
Auto
anticorpo?

Centrifugao 85g
TAD POSITIVO

DiaMed IDID-Micro Typing System


Perfil soros monoespecficos

SOROS DE ANTIGLOBULINA HUMANA

Poliespecfico

Monoespecficos
IgG, IgA, IgM, C3 ( e fraes), C4

10

16/8/2007

Soro de AGH Mono e Poliespecficos

Soro de AGH Mono e Poliespecficos

 POLIESPECFICO
 Anticorpos contra Imunoglobulina humana (anti-IgG +anti-cadeias

Anti-IgG !

pesadas) e contra fraes C3(C3b+C3d) do complemento.

MONOESPECFICOS


Soro de AGH Mono e Poliespecficos

Afinal,
quando se usa
um ou outro?

Anticorpos contra apenas um tipo de imunoglobulina (IgG, IgM,


IgA) ou complemento (C3b, C3d ou C4).

Soro de AGH Mono e Poliespecficos


TAD
de RN?
estudo de AHAI?
estudo de reao hemoltica imunolgica ps
transfusional?
PAI
pesquisa de Ac complemento-dependente com
Albumina?
vc est usando PEG?
est usando soro ou plasma?

Resumindo: Como usar Controle de AGH ?


Ex: PAI

Em ambos os casos,
quando o resultado
observado for negativo,
obrigatrio adicionar 1

II

gota da hemcia Controle


de Coombs.
Centrifugar 15 a 3.400

II

rpm.

II

11

16/8/2007

Controle de AGH

Resumindo tcnica TAD

Se der negativo...comear de novo!


Aplicaes laboratoriais: pesquisa a presena de hemcias
sensibilizadas por anticorpos e/ou fraes de complemento.

- No adio do soro de AGH


- Soro AGH invlido
- Neutralizao do soro AGH
- Lavagem inadequada !!!
Resultado
negativo aps
adio do Controle
de AGH???

Estudo da Doena Hemoltica Peri-Natal


Anemia Hemoltica Auto-Imune
Hemlise induzida por drogas
Reaes hemolticas imunes ps-transfusionais

Algoritmo em TAD
TAD

NEGATIVO

Eluio- Opcional
Acs baixo ttulo
Importncia Clnica??

POSITIVO

PESQUISA DE ANTICORPOS
IRREGULARES
(P.A.I.)

Tratar clulas com


Cloroquina
para fenotipagem

Pesquisa c/ soros
Monoespecficos
subclasses

IgG-Eluio
Titulao

Aloanticorpo?

Algoritmo e Mtodos acessrios


sero discutidos no mdulo II

Identificao
do Ac
Fase AGH

Titulao

PAI POSITIVO

12

16/8/2007

Mesmo
calibre!

Lavar 3x com soluo


fisiolgica

13

16/8/2007

Adicionar 2 gotas de
soro de antiglobulina
humana. Centrifugar
e ler, anotando os
resultados.

Desprezar o
sobrenadante, e na ltima
vez, secar bem a boca do
tubo, retirando qualquer
excesso de salina

P.A.I./ T.A.I. (Coombs indireto)


Aplicaes:

No esquea!

Detectar anticorpos anti-eritrocitrios no plasma do paciente ou

Em caso de resultado
negativo,adicionar 1 gota da
hemcia Controle de AGH ,
centrifugar e ler o resultado,
que dever ser positivo.

doador
- Pacientes obsttricos: detectar e permitir monitoramento da gravidez
de mulheres com anticorpos capazes de causar DHPN / identificar
mulheres Rh- que devem receber IgRh
- Politransfundidos
- Investigao de AHAI

Especificidade e significado clnico dos acs

PAI em Gel teste

Sem
Lavagem!

Porque?

ANTICORPOS
CLINICAMENTE
IMPORTANTES

ANTICORPOS
BENGNOS

ANTICORPOS POSSIVELMENTE
IMPORTANTES
(SE REATIVOS A 37 0C)

ANTICORPOS
RARAMENTE
IMPORTANTES

ABO

Chido / Rodgers

Lewis

Yt (Yta)

Rh

Xg (Xga)

MNS (M, N)

Vel

Kell

Bg

P (P1)

Ge

Duffy

Knops

Lutheran

Do (Gya, Hy)

Kidd

Csa

A1

Sda

Diego

JMH

MNS (S, s)

Anti-H
(Bombay)

14

16/8/2007

Bem, e se der positivo com alguma das


hemcias?

Quando detectamos a presena de anticorpos


irregulares:

Significa que a amostra possui

Prximo passo:

anticorpo(s) irregular(s), e
devemos portanto identific-lo.

Identificar a especificidade
do anticorpo

Como?

Painel de hemcias

Utilizando um painel de hemcias!

Identificao de Anticorpos Irregulares


(I.A.I.)
Painel de Hemcias

Identificao de Anticorpos Irregulares


1

10

Dpnp!joufsqsfubs!
pt!sftvmubept!
ep!qbjofm@
Amostra
Soro

-No esquea do Autocontrole!

15

16/8/2007

P.A.I.
POSITIVO

-Algoritmo em PAI positivo

Painel de hemcias

Resultado Ntido

Fazer contra-prova
Fenotipagem
Ag
correspondente

Dificuldades?

Problemas com a deteco dos


anticorpos

Todas as Reaes
POSITIVAS

Auto-controle
NEGATIVO

Auto-controle
POSITIVO

Mistura de
Anticorpos

Auto-AC
???

Ac contra
AG pblico

Falha Tcnica

Dificuldades tcnicas
Utilizao de tcnicas complementares

Ttulo do anticorpo
Amplitude trmica deste anticorpo

Importante: anlise crtica dos resultados


obtidos

Metodologia aplicada

Escolha da(s) tcnica(s) auxiliar(es


auxiliar(es))

Soro x hemcias

Alguns casos so resolvidos apenas com


 tecnologia de ponta. Ex: biologia molecular

Reagentes de boa qualidade

Mas porque o
receptor forma
anticorpos, j que
so feitos testes prtransfusionais?

16

16/8/2007

Testes pr-transfusionais
obrigatrios (RDC 153/ 2004 M.S.)
Paciente

Bolsa
Retipagem ABO

Fenotipagem ABO/Rh(D)

Retipagem Rh(D) para

P.A.I.

bolsas

Prova cruzada maior

Rh-, sem

Seleo de unidade
para transfuso

pesquisa de D fraco

Auto-controle/ TAD (opcional) Fenotipagem das bolsas

para pacientes J
sensibilizados (obrigatrio!)

Jka

Fy
K

D
S

K
Fy
a

+
Anti-Jka

Hemcias

soro do receptor

do doador

Lembrar a PCTestes

pr-transfusionais
(RDC 153/ 2004 M.S.)

insuficienteobrigatrios
para prevenir
aloimunizao eritrocitria!

Paciente
Prova cruzada maior

Bolsa
Fenotipagem das bolsas
para pacientes J
sensibilizados
(obrigatrio!)

Traumas?
Comentrios?

No garante a sobrevivncia de

eritrcitos transfundidos

No detecta todos


os anticorpos (efeito de dose)

17

16/8/2007

Referncias Bibliogrficas

Fundamentos da Imunohematologia eritrocitria

Ana Lcia Girello & Telma Ingrid


B. B. Khn, Editora SENAC,
2007. 2 edio.

Revisado e ampliado

18