You are on page 1of 11

Praktikum Bioanalisis II

PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS AMITRIPTILIN
DALAM PLASMA SECARA KROMATOGRAFI GAS

KELAS

: B

KELOMPOK

: III

ANGGOTA KELOMPOK

: 1. Astri Y.Permana

(2010210033)

2. Astrialita Linuih

(2010210034)

3. Caecilia Arsi

(2010210045)

4. Denny Nicola C.

(2010210061)

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PANCASILA
JAKARTA
2013

Pancaindra Farma Jakarta. 001/ 2013 PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS AMITRIPTILIN DALAM PLASMA SECARA KROMATOGRAFI GAS Diajukan oleh: Laboratorium Q-Lab Fakultas Farmasi Universitas Pancasila Disponsori oleh : PT. Oktober 2013 .PROTOKOL No.

S.P. Jakarta Selatan..Jakarta Selatan Tempat Penelitian Nama : Laboratorium Pengujian Q. Jagakarsa. M. Srengseng Sawah.Lab Fakultas Farmasi Universitas Pancasila Alamat : Jl.Farm. S.Si. Astrialita Linuih Tanggal Pelaksanaan Oktober 2013 .Judul PROTOKOL VALIDASI METODE ANALISIS AMITRIPTILIN DALAM PLASMA SECARA KROMATOGRAFI GAS Nomor Protokol No. Apt Dokter Penanggungjawab : dr. 12640 Personil Peneliti Utama : Caecilia Arsi.Si. 001 / 2013 Sponsor Nama : PT. Raya Layang no 13 . Apt Peneliti Pendamping : Astri Y. Farm. Apt Analis : Denny Chilwin W. Pancaindra Farma Alamat : Jl. S...

Obat ini banyak digunakan untuk terapi depresi dan boleh dianggap sebagai pengganti penghambat MAO yang tidak banyak digunakan lagi. Golongan obat ini bekerja menghambat ambilan kembali neurotransmitor di otak. Berdasarkan Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia. kerusakan hati. dan dalam bentuk larutan suntik 100 mg/10 ml.diskrasia darah. terutama depresi endogen.I. Dosis ini kemudiaan ditinggikan sampai menimbulkan efek terapeutik. Derivat dibenzodikloheptadine telah dibuktikan dapat mengurangi keadaan depresi. Pasien koma. perbaikan nafsu makan.Amitriptilin berupa serbuk hablur atau hablur kecil. tidak berbau atau hampir tidak berbau .bertambahnya aktifitas fisik.. Untuk itu diperlukan suatu metode analisis obat yang terpercaya dalam matriks biologis yang sesuai. Dosis permulaan 75 mg sehari. kerusakan otak subkortikal dikontraindikasikan menggunakan Amitriptilin. Obat ini dikontraindikasikan pada pasien yang hipersensitif terhadap derivat dibenzodikloheptadin. depresi sumsum tulang. putih atau hampir putih. Amitriptilin tersedia dalam bentuk tablet 10 dan 25 mg. dan pola tidur yang lebih teratur. PENDAHULUAN Amitriptilin suatu derivate dibenzodikloheptadin merupakan antidepresan klasik yang karena struktur kimianya disebut sebagai antidepresan trisiklik. Amitriptilin tersedia dalam bentuk garam amitriptilin hidroklorida yang memiliki kelarutan mudah larut dalam air dan etanol. Amitriptilin merupakan obat copy yang wajib untuk uji bioekuivalensi. biasanya antara 150 mg – 300 mg sehari. Pengukuran analit dalam matriks biologis harus divalidasi. Perbaikan berwujud sebagai perbaikan suasana perasaan (mood) . kewaspadaan mental. Validasi metode bioanalisis mencakup semua prosedur yang menunjukkan bahwa metode khusus yang digunakan untuk pengukuran kuantitatif analit yang berasal dalam .

Metode analisisnya menggunakan peralatan yang canggih. HPTLC and HPLC in different pharmaceutical dosage forms. atau urin. Namun penerapan metode yang telah ada tersebut tidak selalu dapat dilakukan karena diperlukan biaya yang sangat besar untuk menyediakan peralatan yang dibutuhkan. Penyiapan Sampel Biologi . Untuk menilai secara kuantitatif Amitrptilin agar hasilnya dapat menjadi acuan uji preklinik dan/atau biofarmasetik serta uji farmakologi klinik dengan menggunakan metode analisis yang terpercaya (yang selektif dan sensitif) dalam matriks biologis yang sesuai d. dapat dipercaya dan dapat dilakukan ulang (reproducible) untuk penggunaan yang diinginkan.Larutan stok clomipramine (standar internal) yangdisiapkan dalam metanol pada konsentrasi 100 µg mL-1. II. Untuk menghasilkan hasil analisis yang paling baik sehingga semua variabel yang terkait dengan metode analisis harus dipertimbangkan seperti prosedur pengambilan sampel. TLC. B. UV. Untuk memperoleh kondisi optimum untuk analisis Amitriptilin dalam plasma in vitro secara kromatografi Gas dan melakukan validasi metode analisis Amitriptilin dalam plasma in vitro secara kromatografi gas. fase yang digunakan pada kromatografi. ketika disimpan pada suhu -20 ° C.Mass Spectrometer (LC-MS). Salah satu cara analisis Amitriptilin yang paling banyak digunakan adalah dengan kromatografi gas . serum. dan pereaksi dalam melakukan pemeriksaan. Larutan preparasi dibuat setiap hari dari larutan stok dengan pengenceran dengan metanol. dan sistem deteksinya. Untuk membuktikan karakteristik kinerja metode (parameter tersebut) memenuhi persyaratan dalam penggunaannya dan untuk melihat pengaruh dari kondisi peralatanperalatan yang digunakan.Larutan stok yang stabil selama setidaknya dua bulan. III. c. dihitung sebagai basis. seperti darah.matriks biologis. METODOLOGI A. Penyiapan Larutan Baku Stok Larutan stok dari analit disiapkan dalam metanol pada konsentrasi 100 µg mL1. seperti Liquid Chromatography. b. plasma. fase gerak. TUJUAN PENELITIAN a. tahap penyiapan sampel.

Preparasi Sampel Untuk 500 uL plasma di kaca-tutup 10 mL tabung sentrifus. Campuran ini divortex selama 1 menit dan kemudian disentrifugasi pada 3500 g selama 10 menit.0 m. Semua sampel disimpan pada -20 ° C. D. mulai dari 240 C dan 260 C. 500 uL buffer Tris pH 9. C. Carier Gas Helium.5 dan 5 mL heksana: isopropylic alkohol (95:5. Lapisan organik dibuang dan 100 uL fase berair dipindahkan pada microvial untuk autosampler dan 50 uL disuntik. gangguan hadir bervariasi dengan masing-masing set sampel yang dianalisis. Namun. yang dicairkan sebelum digunakan. 50 uL larutan kerja baku internal (2 mg mL-1).Dikumpulkan plasma blanko yang digunakan untuk mendapatkan kalibrasi Sampel diperoleh dari sukarelawan yang sehat. Setelah pusaran pencampuran (1 menit). HP-5 (5% Phenyl metil siloksan) kolom kapiler dengan diameter . oven suhu divariasikan Untuk menjaga pemisahan dasar dari analit. Temperatur awal 300 C   dengan tekanan 12 psi. Oleh karena itu. Analisis untuk analit dalam etil asetat dilakukan pada suhu oven isokratik 260 C.digunakan suhu spesifik untuk setiap set sampel bervariasi antara 240 C dan 260 C Pada dasarnya. campuran disentrifugasi pada 3500 g selama 10 menit dan fase organik dipindahkan ke segelas tabung tutup yang 150 uL fosfat asam 0. EDTA sampel darah (5 mL) dikumpulkan untuk genotip danAnalisis farmakokinetik.2 mL / menit.1 mL / menit dan total ow dari 27. v / v) ditambahkan.  baik dari satu sama lain. Oven temperature Suhu oven isokratik yang digunakan.1% (v / v) sebelumnya ditambahkan. dan lainnya Column Sebuah 30. Optimasi Metode  Front inlet Split mode (dibagi rasio 20:1) dengan perpecahanow dari 23.

80 menit. Validasi Metode Validasi metode 1. Helium ow rate dari 15 mL / menit. Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa semua puncak analit yang tepat diselesaikan.82 menit. nortriptyline dan maprotyline dalam matriks etil asetat ditentukan dengan menyuntikkan dan menganalisis serangkaian solusi analit standar pada 6890 HP kromatografi gas. E.320 m lm ketebalan 0.   Run time 5 menit Relative Analyte Retention Time Waktu retensi relatif untuk amitriptyline dan nortriptyline dihitung dalam referensi dengan waktu retensi standar internal.2 mL / menit. standar campuran yang mengandung konsentrasi yang sama amitriptyline . maprotyline1 Waktu retensi relatif untuk amitriptyline yang 0. dan retensi relatif waktu untuk nortriptyline yang 0. metode ini hanya cocok untuk menentukan selektivitas dalam kasus-kasus tertentu karena metode ini sangat tidak bisa diandalkan. Detector Nitrogen-fosfor detektor. Larutan standart adalah etil asetat kosong. nortriptyline dan maprotyline dianalisis untuk menentukan waktu retensi masing-masing . dengan waktu retensi. Namun. Biasanya masalah ini diselesaikan dengan data identitas puncak menggunakan metode lain.0 mL / menit dan udara medis ow dari 60. nortriptyline dan . Setelah waktu retensi untuk masing-masing dari tiga senyawa ditentukan . yang dihasilkan dengan metode yang sama. Selanjutnya. dengan suhu 240 C Gas hidrogen ow dari 4.0 mL / menit.25? M? Dan suhu maksimum 325 C. Konstan  tekanan 12 psi dan awal ow rate dari 1. Selektivitas Salah satu metode untuk mengevaluasi selektivitas metode kromatografi adalah membandingkan waktu retensi puncak hadir dalam kromatogram sampel. Selektivitas metode untuk amitriptyline . standar terpisah amitriptyline .

1 ( Lampiran A ) . 2. Selain tiga standar konsentrasi yang lebih rendah ini. tampak bahwa batas deteksi dan batas kuantitasi untuk amitriptyline adalah setara dengan beberapa konsentrasi antara 0 dan 5 mg/L. 18 konsentrasi terukur per konsentrasi tingkat menjadi sasaran analisis varians (ANOVA). amitriptyline . Presisi intraday RSD (%) diperkirakan akan tinggi pada sampel yang kosong karena acak fluktuasi. Linearitas Persyaratan linearitas untuk pekerjaan analitis cukup ketat.995 atau lebih diperlukan untuk kegiatan . Sampel kontrol kualitas dianalisis dalam rangkap tiga pada setiap 6 hari.maprotyline disuntikkan untuk menentukan apakah tiga obat dapat dipisahkan yang sesuai resolusi . RSDs untuk semua lainnya amitriptyline standar kalibrasi memenuhi kriteria penerimaan presisi. 200 dan 400 ng mL-1 masing-masing analit. nortriptyline dan maprotyline adalah disajikan pada Gambar A. b. dengan akhir konsentrasi 15. Sebuah kromatogram menggambarkan baseline pemisahan tiga komponen . dan melebihi kriteria penerimaan presisi 15% pada batas konsentrasi. Akurasi Presisi dan akurasi diperiksa dengan menambahkan sejumlah analit pada plasma kosong. 4. RSD untuk 0 mg / L. Menurut Sadek (2000). 3. Presisi interday Rasio tinggi puncak untuk sembilan suntikan setiap standar kalibrasi. karena masing-masing RSDs semua kurang dari 10%. mengingat hari sebagai variabel pengelompokan. dan 10% untuk semua konsentrasi lainnya. seluruh periode validasi yang disusun. koefisien korelasi dari 0. Presisi a. Akurasi dihitung dengan membandingkan ratarata dari 18 konsentrasi diukur per tingkat konsentrasi dengan konsentrasi nominal. 5 mg / L dan 10 mg / L amitriptyline kalibrasi standar sangat tinggi. konsentrasi standar memiliki RSD yang kurang dari ambang batas 10% ditetapkan untuk semua konsentrasi lain dalam rentang konsentrasi yang bekerja untuk analit. dan standar masing-masing relative penyimpangan dihitung. Berdasarkan penurunan cepat dalam RSD antara sampel kosong dan 5 mg/L standar. Namun.

disuntik tujuh kali berturut-turut. Jika kurva kalibrasi tidak berjalan melalui titik asal. diikuti oleh volume yang sesuai dari campuran amitriptyline dan larutan stok nortriptyline. 2000). Masing-masing dari sembilan standar kalibrasi disiapkan dalam 10 mL volumetri bertanya.5 mg / L maprotyline standar dengan tidak adanya amitriptyline dan nortriptyline juga disiapkan. . Dalam rangka untuk menentukan tingkat kebisingan dasar. dan seluruh rangkaian standar kalibrasi. Masing-masing standar sembilan kalibrasi disiapkan dengan menambahkan 50 L dari 0.5 mg / L. sampel diuji termasuk tidak hanya kosong. sesuai dengan metode yang dikembangkan sebelumnya. Target jumlah analisis untuk setiap standar adalah sepuluh. Untuk pekerjaan kurang kritis. Koefisien korelasi dari 0.analisis yang cukup kritis. Pengukuran LOD dan LLOQ Kurva kalibrasi masih diperlukan untuk penentuan LOD dan LOQ. lereng dari kurva kalibrasi harus constant. konsentrasi standar internal di masing-masing sembilan standar kalibrasi adalah 0. koefisien korelasi dari 0. sebuah alikuot dari setiap standar kalibrasi dipipet ke autoinjector botol bersih dan ditutup.98 atau lebih besar yang dapat diterima untuk menyatakan bahwa metode adalah linier selama rentang konsentrasi yang diharapkan. dari terendah ke konsentrasi tertinggi. akan tergantung pada tujuan dari metode yang diuji. dan kemudian menipiskan ke tanda pada volumetric dengan etil asetat.1 mg / mL amitriptyline dan 0.1 mg / ml maprotyline (standar internal). dan sebagai hasilnya akan dibatasi oleh pertimbangan keuangan dan waktu. dalam hal koefisien korelasi. Standar kalibrasi dijalankan pada HP 6890 kromatografi gas dengan detektor nitrogen-fosfor. dan kesalahan sistematis proporsional ada ketika lereng tidak konstan (Meyer. Sembilan standar kalibrasi dibuat dari campuran 0. konstan kesalahan sistematis yang hadir. tetapi juga kalibrasi standar. dan karena itu. Setelah pencampuran menyeluruh. dan nilai y-intercept harus sama dengan nol.1 mg / L) ke konsentrasi tertinggi (1. Standar kalibrasi disuntik dari konsentrasi terendah (0. Untuk percobaan ini. Dalam situasi yang ideal. 0.1 mg / mL nortriptyline larutan stok (dalam metanol).990 atau kurang mungkin diperbolehkan (Sadek.5 mg / L). 1998). Linearitas kebutuhan.

Seperti disebutkan sebelumnya. AUCinf. dilakukan untuk memperkirakan kebisingan awal di bawah maprotyline yang puncak rata-rata ( SD) dalam satuan puncak tinggi ( pA ) .5 mg / dilakukan untuk memperkirakan kebisingan dasar pada waktu retensi amitriptyline dan nortriptyline. dan sebagai hasilnya. urutan. harus dikonversi dengan rasio tinggi puncak dengan membaginya dengan maprotyline rata ( standar internal) puncak tinggi untuk 20 suntikan ulangan dari sampel kosong . Residual error (error mean square/ kesalahan rata-rata kuadrat) digunakan untuk membangun selang kepercayaan 90%. Analisis Statistik Model ANOVA (A linear mixed-effects analysis of variance) digunakan untuk analisa dosis normal dengan parameter AUClast. Konsentrasi masingmasing setara dengan analit LOD kemudian dapat dihitung dengan memasukkan rasio tinggi puncak dihitung ( y ) ke dalam persamaan untuk kurva kalibrasi yang tepat . ditambah tiga standar deviasi ( SD ) . Dua puluh suntikan ulangan dari L maprotyline standar 0.5 mg / L . pada waktu retensi. Selain itu. ketinggian puncak rata-rata yang sesuai . F. hanya tujuh set lengkap. periode. ditambah tiga SD . Ini 0. adalah berarti puncak tinggi ( pA ) pada setiap waktu retensi dari standar kosong . Data kalibrasi diperoleh. etil asetat .5 mg / L maprotyline standar. standar maprotyline disebut sebagai sampel kosong sebagai mengandung tidak amitriptyline atau nortriptyline . dan Cmax. Model ini menggabungkan faktor-faktor untuk pengobatan. 10 suntikan ulangan dari kalibrasi standar pelarut . dihitung dari 20 suntikan ulangan dari 0. dihitung dengan menggunakan metode statistik.Namun. Dalam rangka untuk menentukan konsentrasi setara dengan LOD untuk setiap analit . Uji non-parametrik Wilcoxon bertanda peringkat digunakan untuk menaksirkan perbedaan pengobatan untuk data Tmax berpasangan yang diperoleh pada studi sukarelawan sehat. Uji A Mann-Whitney U digunakan untuk menaksirkan . dan subjek yang dikumpulkan sebagai sukarelawan sehat dalam studi cross-over dan pengobatan dan subjek pasien yang tidak rumit untuk studi paralel. dan pemecahan untuk konsentrasi (x). LOD . autoinjector jarum menjadi terpasang selama menjalankan.

Anxiety 1998. Jakarta: Gaya Baru Tjay. Ganiswara. M. Jerkovich. 1995. IL. USA) digunakan untuk farmakokinetik dan analisis statistik parametrik. Clin. CA.. Preskorn.1990. H. AUC berada dalam rentang 80-125%. Tan Hoan & Drs.0 (SPSS Inc.3 (Pharsight Corporation. Bioekivalensi disimpulkan jika selang kepercayaan 90%. Psychopharmacol. Sulistia G. Depress.perbedaan pengobatan untuk data Tmax tidak berpasangan yang diperoleh pada studi pasien yang tidak rumit. Farmakologi dan Terapi edisi IV. WinNonlin Professional. Taraf signifikan 0. G.05. Versi 5. SPSS untuk Windows.. J. G. 11. 88. D. USA) digunakan untuk analisis statistik non-parametrik. 2002. 7. S.Obat Penting. Versi 16. Kirana Rahardja. Obat. Chicago. Jakarta : IKAPI . Drs. Daftar Pustaka Anderson. Mountain View. I.. 10.