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GUIN DE PRCTICAS

MICROBIOLOGA
(2 INGENIERA AMBIENTAL)

rea de Biodiversidad y Conservacin


Escuela Superior de Ciencias Experimentales y Tecnologa
Universidad Rey Juan Carlos
Prof. Nuria Navarro

NORMAS PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA


1. Es obligatoria la utilizacin de la bata.
2. Sobre la mesa deben estar nicamente los objetos que se vayan a utilizar.
Los abrigos, bolsos, libros, etc. Deben situarse fuera del laboratorio en el lugar
destinado a tal fin.
3. Hay que trabajar con calma y concentracin, procurando no distraer al resto
de personas que trabajan en el laboratorio.
4. Hay que trabajar sobre el papel de filtro y en las cercanas del mechero.
Mantener los tubos y los cultivos en posicin vertical en gradillas, nunca sobre
la mesa ni en la bata. Es conveniente evitar movimientos bruscos,
desplazamientos innecesarios por el laboratorio o trabajar con ventanas abiertas
que generen corrientes de aire que originen contaminaciones o produzcan
accidentes.
5. Uno de los riesgos principales en un laboratorio de Microbiologa es la
generacin de aerosoles que contengan microorganismos, ya que son
fcilmente inhalados. Todas las operaciones bruscas en las que se manejan
lquidos pueden generar aerosoles (centrifugaciones, vertidos rpidos como
pipeteos, trasvases, etc., y el manejo rpido del asa de siembra). Por lo tanto, se
debe trabajar con calma.
6. Manejo de los mecheros. Las llamas fras son anaranjadas y se ven bien, pero
no esterilizan suficientemente; las llamas calientes son de un azul
prcticamente invisible, lo cual supone un riesgo si no se trabaja con cuidado.
7. Incendio de disolventes. Es frecuente el empleo de disolventes inflamables
(alcohol, acetona, etc.). En el caso de que se provoque algn pequeo fuego no
se deber soplar nunca sobre el disolvente ni emplear un extintor si no es
estrictamente necesario, ya que un chorro fuerte de aire extendera el disolvente
ardiendo por toda la zona. Se debe utilizar una manta ignfuga o una toalla
empapada en agua para cubrir el recipiente, bandeja o zona incendiada. Si el
fuego se extiende, usar el extintor dirigindolo a la base de las llamas.
8. Al finalizar cada prctica, las mesas de trabajo deben quedar limpias,
recogidas y en perfectas condiciones de uso.
9. No se permite fumar en el interior del laboratorio, ni introducir comida o
bebida. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las
manos a la boca, nariz, ojos u odos.
10. En casos de accidente, como roturas, vertido de cultivos, cortes, quemaduras,
etc. deber advertirse inmediatamente al profesor encargado del laboratorio.
11. El material de desecho debe disponerse en recipientes adecuados para su
posterior descontaminacin y limpieza.
12. Antes de salir del laboratorio es preciso lavarse las manos con agua y jabn.
13. Bajo ningn concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del
laboratorio.

NDICE

PRCTICA 1...4
1.1 ESTERILIZACIN (TCNICAS DE ESTERILIZACIN Y PREPARACIN
DEL MATERIAL).
1.2 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES.
1.3 CULTIVO DE MICROORGANISMOS. TCNICAS DE SIEMBRA.
1.4 PRODUCCIN DE INDOL
1.5 TEST DE MOVILIDAD
1.6 FERMENTACIONES. PREPARACIN DE YOGUR.
1.7 CEPAS MICROBIANAS, MORFOLOGAS
1.8 DILUCIONES
SERIADAS.
RECUENTO
DE
POBLACIONES
MICROBIANAS.

PRCTICA 2.24
2.1 RECUENTO DE POBLACIONES MICROBIANAS.
2.2 PRUEBAS BIOQUMICAS.
2.3 REALIZACIN DE FROTIS Y TINCIN DE GRAM.
2.4 PRUEBA DE LA CITOCROMO C OXIDASA
2.5 ANLISIS MORFOLGICO.
2.6 MICROSCOPIO.
PRACTICA 3.37
3.1 COLUMNA DE WINOGRADSKY.
3.2 IDENTIFICACIN DE CEPAS BACTERIANAS.
3.3 OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS (LEVADURAS, MOHOS,
ALGAS Y PROTOZOOS).

PRCTICA 1

1.1 ESTERILIZACIN (tcnicas de esterilizacin y preparacin del material).


1.2 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES.
1.3 CULTIVO DE MICROORGANISMOS. TCNICAS DE SIEMBRA.
1.4 PRODUCCIN DE INDOL
1.5 TEST DE MOVILIDAD.
1.6 FERMENTACIONES. PREPARACIN DE YOGUR
1.7 CEPAS MICROBIANAS, MORFOLOGAS.
1.8 DILUCIONES
SERIADAS.
RECUENTO
DE
POBLACIONES
MICROBIANAS.

1.1

ESTERILIZACIN

Los mtodos de esterilizacin ms frecuentes son: incineracin, calor seco y calor


hmedo.

INCINERACIN: Se utiliza para esterilizar agujas, asas, esptulas, varillas,


puntas de pipeta, cuellos de tubos, etc. Consiste en someter directamente a la
llama del mechero los utensilios que se vayan a esterilizar.

CALOR SECO: Se realiza en el horno Pasteur a 180C durante 30 minutos; 170C


durante 1 hora o 160C durante 2 horas. Se emplea para esterilizar material de vidrio u
otros materiales que sean termorresistentes e interese mantener secos.

CALOR HMEDO: El vapor de agua es uno de los


mtodos ms eficaces para destruir microorganismos y, a
igualdad de temperatura, es mucho ms eficaz que el calor
seco (aire). Los microorganismos mueren por coagulacin
de su protoplasma, la eficacia depende pues del agua
contenida en el interior de los microorganismos.
Hay varias formas de emplear el calor hmedo:
1. Mediante vapor saturado a presin que se realiza en
un AUTOCLAVE. El autoclave est constituido
por una caldera de un material resistente a la
presin, sostenida por una camisa metlica que
lleva la fuente calorfica en la parte inferior. El interior de la caldera tiene una

rejilla sobre la que se coloca el material a esterilizar. La parte superior de la


caldera lleva una tapadera de cierre hermtico que va conectada a un manmetro
y tambin existe una espita para la salida de vapor. En el interior del autoclave
se pone agua hasta el nivel indicado (la altura de la rejilla), a continuacin se
coloca el material a esterilizar debidamente impermeabilizado y se cierra la
tapadera; se conecta la fuente calorfica y cuando el agua hierve, el vapor de
agua que se va formando desplaza al aire que existe en el interior del autoclave.
Una temperatura de 120 C de vapor de agua (1,1 atm) durante 15-20 min son
suficientes para esterilizar la mayora de los materiales y medios no
termolbiles. Si lo que interesa esterilizar son medios lquidos, la boca del
envase debe estar taponada con algodn o algn tipo de tapn no cerrado
hermticamente.

2. Mediante esterilizacin fraccionada o vapor fluente. Esta tcnica se utiliza para


esterilizar medios de cultivo que no puedan someterse a una temperatura
superior a los 100C sin perder alguna de sus propiedades; por ejemplo medios
azucarados o con protenas. Esta esterilizacin se realiza a la presin atmosfrica
por lo que no se cierra la espita del autoclave, una vez alcanzados los 100C en
el interior del autoclave y por la espita salga el vapor de una forma regular, se
empieza a contar el tiempo de esterilizacin, que es de 20 minutos. Este proceso
se realiza 3 das consecutivos (esterilizacin fraccionada), ya que las formas
esporuladas no son destruidas a esta temperatura (solamente se eliminan las
formas vegetativas). Las formas esporuladas germinan durante los intervalos de
espera y son destruidas en el siguiente ciclo.

1.2

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros


componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. La diversidad metablica de los microorganismos es enorme; por
ello, la variedad de medios de cultivo es tambin grande, no existiendo un medio de
cultivo universal adecuado para todos ellos.
Segn la finalidad del medio de cultivo podemos encontrar distintos tipos:
1) Medios nutrientes: Son medios de propagacin que permiten el desarrollo de varios
tipos de microorganismos. No contienen inhibidores. Como ejemplos de medios
nutrientes comunes tenemos agar nutritivo y caldo nutriente.
A veces estos medios se enriquecen con ciertos productos tales como sangre, yema de
huevo, etc. para permitir el crecimiento de microorganismos exigentes; tendramos
entonces un medio de cultivo rico o enriquecido; ej. agar-chocolate.
Tambin pueden contener indicadores para diferenciar distintos tipos de
microorganismos por sus propiedades bioqumicas; tales medios se llamaran medios
diferenciales, como el agar de Kliger (KIA).

2) Medios selectivos o inhibitorios: Son medios slidos que contienen adems de los
nutrientes, ciertas sustancias que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos
permitiendo el crecimiento de otros, por ej. agar cetrimide.
Estos medios tambin pueden contener indicadores para diferenciar los distintos tipos
de microorganismos que puedan crecer en l; tal medio sera selectivo y diferencial, por
ej. Mac Conkey, Baird Parker, EMB, etc.
3) Medios de enriquecimiento selectivo: Son medios lquidos que contienen inhibidores,
como tetrationato, sales biliares, concentraciones de cloruro de sodio mayores a la
fisiolgica, etc.
4) Otros: Dentro de los otros tipos de medios de cultivo podemos sealar:
a) medios de mantenimiento
b) medios para identificacin
c) medios para ensayo microbiolgico de vitaminas y aminocidos
d) medios para recuentos, etc.
En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados,
normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar.
En general, la preparacin de un medio de cultivo se reduce a pesar la cantidad deseada
del mismo y redisolverla en agua destilada. Antes de su esterilizacin, los medios
lquidos se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o matraces); en ningn caso
la altura del lquido en el recipiente debe exceder un tercio del volumen total de este.
Una vez fundido, se distribuye en caliente en tubos o matraces (no en placas de Petri),
se tapa y se esteriliza.
Finalizada la esterilizacin en autoclave:
1. Los medios lquidos se dejaran enfriar a temperatura ambiente
2. Los medios slidos contenidos en tubos deben inclinarse para que al
solidificarse, adopten la forma de agar inclinado (slant) si tal es su finalidad.
3. Las placas Petri pueden tambin ser preparadas ahora, vertiendo el medio aun
fundido y estril dentro de ellas en un ambiente asptico (p. Ej. En la
proximidad de la llama de un mechero Bunsen).
Material necesario
Esptulas para pesar
Papel de aluminio
Probetas de 500 ml
Medios de cultivo (Agar Nutritivo, Triptone Soya Agar TSA, Agar de Kliger KIA,
King B)
Agua destilada
2 balanzas
2 agitadores magnticos
Imanes
Botellas de 1 l
Tubos de 10 ml con sus tapones correspondientes
Gradillas para tubos de 10 ml
Placas de Petri
Cinta de autoclavar

Cada grupo tendr que preparar el medio de cultivo que se indica en la tabla 1.
As mismo cada grupo tendr que sembrar cada cepa problema que le corresponda
(segn se indica en las Tabla 1) en su placa de agar correspondiente y en los tubos KIA
(ver Tabla 2), por tanto cada grupo necesita 3 placas y 3 tubos KIA.

Tabla 1.
GRUPO
A
B
C
D
E
F
G
H
I

CEPA
1, 4, 6
2, 5, 7
1, 3, 6
2, 7, 4
3, 5, 8
3, 6, 8
2, 5, 7
1, 4, 8
1, 5, 6

MEDIO
AN
KIA
AN
TSA
AN
KING B
AN
KIA
AN

Tabla 2.
CEPA
1
2
3
4
5
6
7
8

MEDIO DE CULTIVO
Agar Nutritivo
Agar Nutritivo
Agar Nutritivo
Agar triptona soja (TSA)
Agar Nutritivo
Agar Nutritivo
King B
Agar Nutritivo

T DE CULTIVO (C)
30
37
30
37
37
37
30
37

AGAR NUTRITIVO
El agar se utiliza como agente gelidificante para dar solidez a los medios de cultivo. El
componente dominante en el agar bacteriolgico es un polisacrido, al que acompaan
algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un gel de agar al 1-2% en
agua licua hacia los 100 C y se gelifica alrededor de los 40 C, dependiendo de su
grado de pureza. Con la excepcin de algunos microorganismos marinos, el agar no es
empleado como nutriente.
El agar nutritivo es una mezcla de agar bacteriolgico (15,0 gr/l agua destilada), mas
peptona de gelatina (5,0 gr/l) y extracto de carne (3,0 gr/l).
Mtodo de preparacin (hacer 250 ml de medio de cultivo)
1.
2.
3.
4.

Pesar 5,75 gr de Agar nutritivo en la balanza y echarlo en la botella.


Tomar 250 ml de agua destilada en una probeta.
Echar el agua destilada en una botella.
Meter en el autoclave a 121C durante 20 minutos (IMPORTANTE: se cierra el
tapn y se abre una vuelta).
5. Repartir el medio de cultivo en placas de Petri. En las cercanas de la llama del
mechero coger una placa Petri, quitar la tapa con la misma mano (no dejar la tapa
sobre la mesa de trabajo), y flamear un poco el interior de la placa. Con la otra
mano, coger la botella con el medio de cultivo, quitar el tapn y flamear la boca en
las cercanas de la llama. Echar el medio de cultivo en la placa Petri. Tapar la placa
Petri y dejar en la mesa. Tapar la botella. Rotular las placas Petri indicando el medio
de cultivo.

AGAR TRIPTONA SOJA (TSA )


Est compuesto de de agar bacteriolgico (15,0 gr/l agua destilada), peptona de soja (5,0
gr/l), peptona de casena (15,0 gr/l) y sodio cloruro (5,0 gr/l).
Mtodo de preparacin (hacer 250 ml de medio de cultivo por mesa)
1.
2.
3.
4.

Pesar 10 gr de TSA en la balanza y echarlo en la botella


Tomar 250 m l de agua destilada en una probeta.
Echar el agua destilada en una botella.
Meter en el autoclave a 121C durante 20 minutos (IMPORTANTE: se cierra el
tapn y se abre una vuelta).
5. Repartir el medio de cultivo en placas de Petri. En las cercanas de la llama del
mechero coger una placa Petri, quitar la tapa con la misma mano (no dejar la tapa
sobre la mesa de trabajo), y flamear un poco el interior de la placa. Con la otra
mano, coger la botella con el medio de cultivo, quitar el tapn y flamear la boca en
las cercanas de la llama. Echar el medio de cultivo en la placa Petri. Tapar la placa
Petri y dejar en la mesa. Tapar la botella. Rotular las placas Petri indicando el medio
de cultivo

MEDIO AGAR DE KLIGER (KIA)


Este medio diferencial complejo (de color rojo) es muy til, ya que
demuestra varias caractersticas enzimticas de la bacteria. Esta
compuesto principalmente de dos azucares en distinta proporcin
(glucosa al 0,1% y lactosa la 1%), tiosulfato sdico, citrato frrico y
rojo fenol como indicador de pH. Para estudiar el comportamiento de
las bacterias en aerobiosis y anaerobiosis; la siembra en este medio de
cultivo se realizara tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en
la profundidad de este (anaerobiosis).

Mtodo de preparacin (hacer 250 ml de medio de cultivo)


1.
2.
3.
4.

Pesar 13 gr de KIA en la balanza y echarlo en la botella.


Tomar 250 ml de agua destilada en una probeta.
Echar el agua destilada en una botella.
Meter en el autoclave a 121C durante 20 minutos (IMPORTANTE: se cierra el
tapn y se abre una vuelta).
5. Repartir el medio de cultivo en tubos de 10 ml. Llenarlos hasta la mitad de su
capacidad. Tapar los tubos. Rotular las tubos indicando el medio de cultivo
6. Colocar todos los tubos en gradillas inclinadas.
7. Inclinar los tubos y dejarlos enfriar

MEDIO B DE KING
Es un medio para la identificacin de Pseudomonas, ya que favorece la produccin de
fluorescena. Esta compuesto por una mezcla de peptonas (20,0 gr/l), fosfato dipotsico
(1,5 gr/l), sulfato de magnesio (1,5 gr/l) y agar bacteriolgico (14,0 gr/l).
Mtodo de preparacin (hacer 250 ml de medio de cultivo)
1.
2.
3.
4.
5.

Pesar 9,25 gr de B de King en la balanza y echarlo en la botella


Tomar 250 ml de agua destilada en una probeta.
Echar el agua destilada en una botella.
Aadir 2.5 ml de glicerina. Introducir un agitador, tapar la botella y etiquetarla.
Meter en el autoclave a 121C durante 20 minutos (IMPORTANTE: se cierra el
tapn y se abre una vuelta).
6. Repartir el medio de cultivo en placas de Petri. En las cercanas de la llama del
mechero coger una placa Petri, quitar la tapa con la misma mano (no dejar la tapa
sobre la mesa de trabajo), y flamear un poco el interior de la placa. Con la otra
mano, coger la botella con el medio de cultivo, quitar el tapn y flamear la boca en
las cercanas de la llama. Echar el medio de cultivo en la placa Petri. Tapar la placa
Petri y dejar en la mesa. Tapar la botella. Rotular las placas Petri indicando el medio
de cultivo

10

1.3

CULTIVO DE MICROORGANISMOS. TCNICAS DE SIEMBRA.

La toma del inculo de las muestras que hay que examinar es simple pero se requiere
prestar atencin en el proceso. Se recomienda colocar el mechero frente a la persona
que est trabajando y la preparacin o muestra que contiene los microorganismos, as
como el resto del material necesario. Todo ello ha de ser alcanzado con facilidad y sin
tropiezos.
Material necesario
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Placas Petri de agar nutritivo, TSA y B de King


Placas de petri con las capas problema
Tubos con medio KIA
Rotuladores.
Asas de siembra
Aguja de siembra
Mecheros
Cerillas

Mtodo de preparacin
1. Tomar el asa de siembra y flamear el filamento hasta que ste alcance un rojo
incandescente. Enfriar en la proximidad de la llama unos 10 segundos.
Si la muestras est en una placa de Petri, coloque la placa invertida sobre la mesa de
trabajo y levante la parte que contiene el medio de cultivo con los microorganismos.
Llvela a la proximidad de la llama del mechero.
2. Trabajando en todo momento en la proximidad de la llama, tome una pequea
porcin de una de las colonias mediante un ligero roce con el asa de siembra.
3. Transferir el inculo a otro medio de cultivo estril, tomando las mismas
precauciones en su manejo (flameando bocas de tubos, trabajando en la proximidad
de la llama, etc.) o bien proceder a preparar un frotis para tincin.

4. Si la transferencia se va a realizar sobre un medio estril en una placa Petri,


depositar el inculo en un rea pequea de la superficie de la placa, prxima al
borde. Empezar en el borde exterior del agar moviendo el asa en zigzag hacia el
centro de la plaza teniendo cuidado de no solapar las lneas. Flamear el asa. Realizar
una segunda estra con el asa flameada, y una vez fra, cruzando el espesor de la
primera estra por 2 o 3 veces para recoger microorganismos. Despus difunda el

11

inoculo haciendo estras en zigzag. Solo 2-3 veces seguidas, no vuelva atrs a la
primera zona de estra. Esta porcin de estra debe ocupar la mitad del resto de la
plaza que queda sin utilizar. Repetir la operacin por tercera vez. Esta debe ocupar
la porcin restante de la placa.

5. Una vez realizada la transferencia: tapar la placa. sta se incubar en posicin


invertida para evitar que el agua de condensacin se deposite sobre la superficie del
agar, lo cual impedira la obtencin de colonias aisladas. La placa debe estar
marcada con la identificacin del cultivo, la fecha y el nombre.
6. Antes de dejar el asa de siembra sobre la mesa, flamearla de nuevo con el objeto de
esterilizarla.

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7. Si la transferencia se va a realizar sobre tubos inclinados


(slant): Sembrar en superficie y en
profundidad. Para sembrar en profundidad,
coger un inoculo con la aguja de siembra en
introducirla dentro del medio (figura). Para
sembrar en superficie, hacer un zigzag sobre la
superficie del slant con la aguja. Flamear la boca
de los tubos antes de colocar el tapn. Flamear la
aguja de siembra para esterilizarla.

8. Incubar las placas y tubos durante un mnimo de 24 horas a la T que precise cada
cepa. Colocar las placas boca abajo dentro de la estufa para evitar la
condensacin que impedira la formacin de colonias aisladas.
9. Observar si hay crecimiento de colonias caractersticas en cada medio
de cultivo.

1.4. PRODUCCIN DE INDOL


El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano.
Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el
triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol
es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de
microorganismos (se utiliza para distinguir bacterias coliformes entre s).
La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol
reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio
activo del reactivo de Kovacs. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptfano.
Material necesario
3 tubos con caldo triptona
Placas de Petri con las capas problema
Reactivo de Kovacs: : alcohol amlico + paradimetilbenzal- dehdo en medio cido
Asa de siembra

Mtodo
1. Inocular los tubos con caldo triptona con las cepas problema e incubar a la T
que precise cada cepa durante 24 horas.
2. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared
interior del tubo.
El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la

13

interfase del reactivo y el medio, segundos


despus de aadir el reactivo, indica la presencia
de indol y, por tanto, que la prueba es positiva.

1.5.-TEST DE MOVILIDAD.
Hay bacterias que tienen la capacidad de moverse por la presencia de flagelos. Para
ello se realiza el test de la movilidad en medio semislido. La concentracin de agar en
el medio ha de ser suficientemente baja como para formar un gel suave que no impida la
movilidad de aquellas bacterias que la presenten. Para identificar la movilidad
bacteriana se le aade al medio una sal de tetrazolio (TTC) que ser reducida por el
metabolismo bacteriano transformndolo en formazn cuya coloracin es rojiza. De este
modo, las bacterias no mviles mostrarn coloracin rojiza tan slo a lo largo de la lnea
de inoculacin mientras que las bacterias mviles pueden desplazarse de la lnea de
inoculacin y por lo tanto el color rojo se ver en una mayor rea (ver dibujo 1 apartado
2.2).
Mtodo de preparacin
Aadir a cada uno de los tubos, aproximadamente 1 ml del medio correspondiente para
cada bacteria y 3 ml de una solucin con sal de tetrazolio (TTC) al 0,04 % (se os dar ya
preparado).
Una vez que el medio gelidifica, se har una siembra en profundidad (por picadura) de
cada una de las cepas bacterianas que cada grupo tiene asignadas. Los tubos se
colocarn en las estufas a sus temperaturas correspondientes durante 24 h. (determinar
la movilidad al da siguiente).

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1.6 FERMENTACIONES. PREPARACIN DE YOGUR


La fermentacin lctica es producida por bacterias capaces de transformar azcares en
cido lctico, disminuyendo de tal manera el pH del medio que impide el crecimiento de
otros microorganismos. La leche fresca tiene un pH de aproximadamente 6,6. A este pH
la casena (protena de la leche) est formando una suspensin coloidal de caseinato
clcico. Conforme las bacterias lcticas van fermentando los azcares, se va
acumulando cido lctico, disminuyendo gradualmente el pH. En condiciones cidas la
casena se desnaturaliza y la leche se coagula formando un producto semislido, que es
el yogur.
La FAO/OMS define el yogur como la leche coagulada obtenida por la fermentacin
cido-lctica de la misma por Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus (l:
1, 42 C). Los microorganismos del producto final deben ser viables y abundantes. La
legislacin espaola fija los siguientes valores: pH < 4,6; bacterias > 107 UFC/ml.
Material necesario
Leche pasteurizada
Cultivo iniciador de la fermentacin: yogur
comercial (natural)
Pipeta automtica o pipetas estriles de 5 ml
Tubos estriles de 10 ml de capacidad
Asas de siembra
Mecheros
Mtodo
1. Aadir con pipeta estril 5 ml de leche
pasteurizada a 2 tubos estriles.
2. Uno de los tubos es inoculado mediante el
asa de siembra con el cultivo iniciador de la
fermentacin procedente de un yogur
comercial. En estos yogures los gneros
ms utilizados son Lactobacillus y
Streptococcus. El otro tubo no se inocula y
se mantiene como control.
3. Incubar los 2 tubos durante 24 horas a 37C
para favorecer el crecimiento de estas
bacterias, ya que son termfilas.
Al da siguiente comprobar que se ha producido
una fermentacin lctica: la leche se coagula en el
tubo inoculado. Mediante tincin de Gram se
confirma la presencia de bacilos y cocos
responsables de la fermentacin. En el tubo control
no inoculado se mantienen las caractersticas
iniciales: la leche es lquida.

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1.7. CEPAS MICROBIANAS, MORFOLOGAS


Las bacterias son capaces de modificar el ambiente que las rodea, captando sustancias
necesarias para su multiplicacin y liberando al medio productos de desecho, enzimas,
exotoxinas, etc. Las interacciones que cada cepa bacteriana establece con el entorno son
propias y caractersticas. Esta especificidad depende del genotipo de la bacteria y se
expresa en un determinado equipo enzimtico. Por ello, la caracterizacin de dichas
enzimas es una til herramienta para la identificacin y clasificacin bacteriana.
Vamos a trabajar con 8 cepas bacterianas, con distintas morfologas y metabolismo. A
travs del anlisis morfolgico y distintas pruebas bioqumicas se identificar la cepa
correspondiente.

CEPAS MICROBIANAS
Bacillus sp. Esporulado. Gram positivo y observar las endosporas, as como la
morfologa de bacterias bacilares. Fermentacin de la glucosa .Medio de cultivo
recomendado: Agar Nutritivo. T cultivo: 30 C

Staphylococcus epidermis. Gram positivos, morfologa de bacterias esfricas


(cocos) agrupadas en racimos irregulares. Fermentacin de la lactosa. Medio de
cultivo recomendado: Agar nutritivo. T cultivo: 37 C

Micrococcus luteus. Gram positivos, morfologa de bacterias esfericas (cocos)


agrupadas en tetradas. Metabolismo respiratorio. Medio de cultivo
recomendado: Agar nutritivo. T cultivo: 30 C

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Enterococcus faecalis. Gram positivos, morfologa de bacterias esfricas en


rosarios y prueba de la catalasa negativa. Fermentacin de la lactosa. Medio de
cultivo recomendado: Agar triptona soja (TSA). T cultivo: 37 C

Citrobacter freundii. Gram negativos, morfologa de bacilos cortos.


Fermentacin de la lactosa. Produccin de sulfhdrico Medio de cultivo
recomendado: Agar nutritivo. T cultivo: 37 C

Klebsiella pneumoniae. Gram negativos, morfologia de bacilos cortos.


Fermentacin de la lactosa y produccin de gas. Agar nutritivo. T cultivo: 37 C

Pseudomonas fluorescens. Gram negativos, morfologa de bacilos cortos y


delgados (muy mviles, observar la movilidad), bacteria aerobia productora de
pigmento fluorescente. Metabolismo respiratorio. Positivo para la prueba de la
citocromo C oxidasa. Medio de cultivo recomendado: King B. T cultivo: 30 C

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Escherichia coli. Gram negativos, morfologa de bacilos cortos, prueba de


asimilacin y fermentacin de la lactosa en el medio de Kliger positiva
(producen gas). Indol positivo. Medio de cultivo recomendado: Agar nutritivo.
T cultivo: 37 C

MORFOLOGAS

Aunque existen miles de especies de bacterias diferentes, los organismos individuales


presentan una de las tres formas generales siguientes:
- elipsoidal o esfrica
- cilndrica o en forma de bastn
- espiral o helicoidal.
Las bacterias esfricas o elipsoidales se denominan COCOS. Muchas bacterias con esta
forma presentan modelos de agrupacin que derivan de los diversos planos de divisin
celular. As tenemos:

cocos en pares (diplococos)----------- Ej. Neisseria


cocos en rosarios ----------------------- Ej. Streptococcus
cocos en racimo ------------------------ Ej. Staphylococcus
cocos en ttradas ----------------------- Ej. Pediococcus
cocos en cubos ------------------------- Ej. Sarcina
cocos sin distribucin especial

Las clulas bacterianas cilndricas se denominan BACILOS o BASTONES y presentan


otros modelos de agrupacin. As tenemos:

bacilos en cadena ------------------------------------ Ej. Bacillus


bacilos en letras chinas o empalizadas ------------ Ej. Corynebacterium
bacilos sin distribucin especial

Las bacterias helicoidales se presentan en general como clulas individuales,


independientes; pero las clulas de las distintas especies presentan notables diferencias
de longitud, nmero y amplitud de las espiras y rigidez de la pared.

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19

1.8.
DILUCIONES
MICROBIANAS.

SERIADAS.

RECUENTO

DE

POBLACIONES

Diluciones seriadas
La carga microbiana de las muestras a analizar es muy variable. Antes de analizarla
microbiolgicamente debe diluirse para que el recuento pueda ejecutarse con una
razonable precisin. Las diluciones se preparan mezclando una parte de la muestra con
nueve partes del diluyente que habitualmente es una solucin salina estril. El factor de
dilucin para esa muestra es l/l0 o 10-1 y se calcula de la forma siguiente:
Factor de dilucin: volumen de la muestra / volumen de la muestra + volumen
del diluyente
Se pueden preparar diluciones adicionales segn se necesite. En la figura de abajo se
muestra la forma de hacerlo. La siembra en placa se refiere a la operacin de transferir e
incorporar la muestra que va a analizarse, o sus diluciones, a una placa de Petri con un
apropiado medio de agar. La siembra en superficie se hace dejando solidificar el
medio de agar e incorporando la muestra despus por extensin en la superficie.

Recuento de poblaciones microbianas


El recuento se refiere a la enumeracin del nmero de unidades formadoras de
colonias (UFC) o clulas microbianas viables, presentes en una unidad de volumen o
peso de la muestra. La enumeracin del nmero de colonias en las placas de agar puede
tambin denominarse recuento.

20

Algunas tcnicas de enumeracin, como el mtodo de recuento al microscopio,


permiten determinar el nmero de clulas por unidad de volumen o peso de las
muestras. La tcnica de recuento en placa, utilizada en esta prctica, determina, sin
embargo, el nmero de clulas o agregados celulares que pueden formar colonias en las
placas de agar. Como es imposible distinguir entre las colonias que proceden de clulas
individuales de las que surgen de agregados, la poblacin final enumerada por este
mtodo se expresa en trminos de unidades formadoras de colonias por unidad de
volumen o peso (es decir, UFC/ml o UFC/g).
El recuento en placa de colonias puede hacerse visualmente, preferentemente con la
ayuda de un contador de colonias. Para ejecutar esta operacin con precisin y rapidez,
se deben marcar las colonias contadas en el fondo de la placa con un lpiz marcador con
el fin de asegurarse que las mismas colonias no se enumeran de nuevo.
Conociendo el factor de dilucin, el volumen del inculo y el nmero de colonias de la
placa (o la media de placas duplicadas), el nmero de microorganismos se calcula
mediante la siguiente expresin:
Recuento (UFC/ml) = nmero de colonias / factor de dilucin x volumen
inoculado en la placa

Reglas para el recuento


1. Placas con un nmero de colonias en el intervalo de 20-200 (la mejor
situacin posible). Si en una estimacin preliminar las placas contienen entre
20 y 200 colonias, descarte el resto de placas y cuente slo las que estn en
este intervalo. Advierta que otras referencias aconsejan intervalos entre 30 y
300 (u otros) como apropiados para un recuento en placa. Calcule el UFC/ml
mediante la ecuacin anterior (usando la media del nmero de colonias).
Una placa en el intervalo 20-200. Si el experimento proporciona slo
una placa con un nmero de colonias entre 20 y 200, calcule el
UFC/ml de la muestra original utilizando el nmero de colonias de la
placa en vez de la media.
Diluciones seriadas. Si las placas de dos diluciones seriadas
proporcionan 20-200 colonias, calcule el UFC/ml de acuerdo con el
resultado de las dos diluciones. Si el nmero hallado de ambas no es
muy diferente por ej., 1,5 x 104 y 1,2 x 104 UFC/ml) haga la media y
considere este valor como resultado final. Si el nmero de ambas es
bastante diferente (por ej., el UFC ms elevado es dos veces mayor
que el ms bajo), considere al ms bajo como UFC/ml final.
2. Placas con un nmero de colonias entre 1-20. Si el recuento proporciona
solamente placas con menos de 20 colonias, registre el nmero real de
colonias de las que procedan de la dilucin ms baja (es decir, el inculo
ms concentrado depositado en las placas) y aplique la ecuacin. Adems,
indique en el resultado que el recuento es estimado.

21

3. Placas con ms de 200 colonias Si la operacin rinde slo placas que


contengan un nmero de colonias superior a las 200, halle un recuento
estimado como sigue. Cuente porciones representativas de la placa en la que
se deposit la dilucin ms elevada. Elija un rea representativa de un
contador de colonias que est dotado de rejillas de 1 cm. Si hay menos de 10
colonias/cm2, cuente 13 cuadrados (7 consecutivos en sentido horizontal y 6
en el vertical). La suma de las colonias de los 13 cuadrados multiplicada por
5 es el recuento estimado de los 65 cm2 de la placa (el rea de una placa de
Petri tpica). Si hay ms de 10 colonias/cm2, cuente 4 cuadrados
representativos y multiplique la media por 65 para calcular el recuento de la
placa. En todos los casos, la ecuacin anterior se utiliza para obtener el
UFC/ml (estimado).

4. Placas con colonias esparcidas. Cuente una cadena de colonias que no estn
muy separadas como si fuese una sola colonia. Si las colonias pueden
distinguirse, no considere entonces que estn esparcidas para fines de
recuento. Si las cadenas de colonias se forman a partir de puntos distintos,
cuente cada colonia como si fuese una sola. Si la zona esparcida es superior
al 25% de la placa, anote que el resultado como colonias esparcidas y no
como un recuento cardinal.

22

Material necesario
6 Tubos con 9 ml de solucin salina estril (SS)
Micropipetas estriles de 1 ml
Varillas de vidrio acodadas (esptula de Drigalski)
Mechero
Etanol de 96C
3 placas de agar de Levine (EMB)
Muestra problema (agua de la depuradora)
El agar de Levine (EMB) est compuesto por peptona (10,0 gr/l agua destilada), lactosa
(10,0 gr/l), fosfato dipotsico (2 gr/l), eosina (0,40 gr/l), azul de metileno (0,065 gr/l) y
agar (15 gr/l). Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de
enterobacterias, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas y permite la
diferenciacin de bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa, dando lugar a
colonias incoloras, las no fermentadoras, y colonias de color azulado-negro con cierto
brillo metlico, las fermentadoras.
Mtodo de preparacin
1. Tomar 1 ml de la muestra problema con una micropipeta estril y aadirlo a uno de
los tubos con 9 ml de solucin salina estril. Es muy importante que los volmenes
sean exactos.
2. Agitar el tubo para homogeneizar totalmente la suspensin. De esta forma hemos
conseguido diluir la muestra inicial 10 veces (dilucin 10-1).
3. Repetir la misma operacin a partir de esta primera dilucin para conseguir la
dilucin (10-2) y as sucesivamente hasta 6 diluciones.
4. Sembrar las 3 ltimas diluciones en placas de agar de levine (EMB) con 0.1 ml (100
l) de cada una de las tres ltimas diluciones realizadas. Este inculo debe
extenderse de forma homognea por toda la superficie de la placa para lo cual
utilizaremos la varilla de vidrio acodada, previamente esterilizada (impregnndola
de alcohol y pasndola por la llama del mechero).
5. Incubar las placas a 37 C durante 24 h.
6. Contar las colonias de las placas diferenciando los microorganismos fermentadores
y no fermentadores de lactosa. Calcular con estos datos el nmero de UFC/ml
iniciales.

23

PRCTICA 2
2.1 RECUENTO DE POBLACIONES MICROBIANAS.
2.2 PRUEBAS BIOQUMICAS.
2.3 REALIZACIN DE FROTIS Y TINCIN DE GRAM.
2.4 PRUEBA DE LA CITOCROMO C OXIDASA
2.5 ANLISIS MORFOLGICO.
2.6 MICROSCOPIO.

Material necesario
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o

Placas con las bacterias incubadas el da anterior.


Asa de siembra
Rotuladores.
Tubos slant con medio KIA.
Agua oxigenada (H2O2).
Tubos de 10 ml con tapn
Gradillas para tubos de 10 ml.
Mechero.
Pinzas.
Microscopio.
Aceite de inmersin.
Papel de filtro.
Frascos lavadores.
Cristalizadores y puentes de tincin.
Varilla de vidrio acodada
Portaobjetos y cubreobjetos.
Colorantes:
Solucin de cristal violeta al 1%.
Solucin de safranina al 0,5%.
Solucin diluida de yodo (Lugol).
Etanol 96.

2.1.RECUENTO DE POBLACIONES MICROBIANAS


Contar las colonias de las placas diferenciando los microorganismos fermentadores
y no fermentadores de lactosa. Calcular con estos datos el nmero de UFC/ml
iniciales.

24

2.2 PRUEBAS BIOQUMICAS


1. Prueba de la catalasa. En los ambientes acuosos, que contienen oxigeno
disuelto, como el citoplasma de las clulas, aparecen formas toxicas derivadas
del oxgeno. El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos
finales del metabolismo oxidativo aerbico de los hidratos de carbono. Si se deja
acumular, el perxido de hidrgeno es letal para las clulas bacterianas. Las
bacterias que aparecen en medios aerobios necesitan un equipo enzimtico capaz
de neutralizar estas formas txicas. Entre estas enzimas se encuentra la catalasa,
que convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno molecular, de acuerdo
a la siguiente reaccin:

2 H2O + BURBUJAS DE O2
2 H2O2 CATALASA

La prueba de la catalasa es positiva cuando se ponen en contacto una bacteria


con actividad catalasa con peroxido de hidrogeno al 3% y se producen burbujas
de oxgeno. La mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas
poseen actividad catalasa.
Tcnica
1. Poner una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos.
2. Transferir a la gota con un asa de siembra, una muestra bacteriana de una
colonia aislada.
3. Examinar y anotar la presencia o no de burbujas. La rpida aparicin y
produccin sostenida de burbujas de gas o efervescencia, indica una prueba
positiva.

2. Agar de Kliger (KIA): la informacin que podemos obtener es la siguiente:


El medio KIA contiene una pequea cantidad de glucosa (0.1 %) y una gran
cantidad de lactosa (1 %). Los microorganismo capaces de metabolizar glucosa
y lactosa lo pueden hacer por la va fermentativa (en anaerobiosis) o por la va
25

respiratoria (anaerobiosis o aerobiosis), en cualquier caso habr liberacin de


cidos que bajarn el pH del medio (en menor cantidad por las vas
respiratorias). Como consecuencia el rojo fenol (indicador de pH) vira a
amarillo. La sucesin de eventos metablicos es la siguiente (ver dibujo):
Hay microorganismos que slo son capaces de utilizar la glucosa como
fuente de carbono (en aerobiosis y en anaerobiosis). Los productos de su
degradacin acidifican el medio que cambia de rojo a amarillo. Sin embargo,
una vez agotada la glucosa, las bacterias tienen la capacidad de metabolizar las
peptonas del medio KIA a travs de la descarboxilacin oxidativa de las
protenas (condiciones aerobias). Este proceso, libera al medio aminas que
neutralizan los cidos que se han generado en la superficie. Como consecuencia,
en la superficie del tubo no se observar cambio de color asociado a la
acidificacin. Observaremos, el fondo del tubo amarillo y la superficie de
color rojo.
Otras bacterias son capaces de fermentar tambin la lactosa (dmero de
glucosa y galactosa) por la presencia de la enzima galactosidasa (se trata de una
enzima inducible, lo que significa que existe un periodo de latencia entre el
agotamiento de la glucosa y la produccin de las primeras molculas de
galactosidasa, de tal forma que despus de un tiempo de consumo de peptonas
se comienza a utilizar lactosa). En este caso, la produccin de cidos es tan
elevada que la produccin de aminas en superficie no es suficiente como para
neutralizar los cidos generados. Esto dar lugar a un descenso de pH y un
cambio de color (de rojo a amarillo) tanto en el fondo como en la superficie.
Observaremos todo el tubo amarillo.

a. Fermentacin de la glucosa en medio Kliger. Viraje a color amarillo


en el fondo del slant.

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Si la bacteria metaboliza slo la glucosa: en la superficie del slant la


utilizar por va respiratoria y, donde la tensin de oxigeno disminuya lo
suficiente, emplear una pequea proporcin por va fermentativa. Esto
generar una pequea cantidad de cidos que sern neutralizados por el
amonio derivado del consumo de las peptonas (proceso que desprende
oxigeno). Como resultado, el medio mantendr su color rojo en la
superficie, a no haber cambiado el pH.
Por el contrario, las bacterias crecidas en la profundidad del slant
emplearn desde el primer momento la glucosa por va fermentativa,
generando cidos que no sern neutralizados, provocndose un descenso
del pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiar a amarillo.
b. Fermentacin de la lactosa. Viraje a color amarillo en la superficie del
slant. Si la bacteria, adems, fermenta la lactosa: los cidos
producidos modificaran tambin el pH de la superficie del medio. En
este caso, el amonio no es capaz de neutralizar la cantidad de cidos
producidos en esta fermentacin, ya que la lactosa se encuentra en el
medio a mayor concentracin que la glucosa. Como consecuencia, el
color del medio en la superficie cambiar a amarillo.
c. No fermentacin de los azucares. El slant no cambia de color. Si la
bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), el medio permanecer de
color rojo. En este caso, los azucares son respirados, degradndose
completamente hasta CO2, que se elimina y no modifica el pH.
d. Produccin de gas en la fermentacin. Aparicin de burbujas, rotura o
elevacin del agar del fondo del tubo.
e. Produccin de cido sulfhdrico (SH2). Aparicin de un precipitado de
color negro en el fondo del tubo. Algunas bacterias son capaces de
liberar azufre de algunos aminocidos (cisteina y metionina) o son
capaces de reducir compuestos azufrados (sulfato, sulfito, tiosulfato),
dando lugar en ambos casos a la produccin de cido sulfdrico (H2S).
En el caso del medio KIA, las bacterias van a utilizar el tiosulfato sdico
del medio como aceptor final de electrones en la cadena transportadora
(respiracin anaerobia). Este H2S puede ser nuevamente incorporado por
las bacterias en aminocidos o bien coenzimas. Esta capacidad de
producir H2S nos puede servir para identificar algunas bacterias como
Proteus, Citrobacter, Salmonella etc. Para ello, el H2S reacciona con el
hierro (Fe2+) presente en el medio, formando un precipitado negro de
sulfuro de hierro. Los iones Fe2+ proceden de los iones Fe3+ del citrato
frrico del medio KIA y aparecen debido a los cambios en los
potenciales redox producidos al someter al autoclave el medio de cultivo.

27

Tcnica
1. Coger tubos con KIA y realizar en cada uno de ellos una siembra en
superficie y en profundidad con cada una de las bacterias que cada grupo
tenga asignadas.
2. Colocar cada uno de los tubos en las estufas a sus temperaturas
correspondientes.

3. Produccin de pigmentos de Pseudomonas sp.


La capacidad para producir pigmentos como pioverdina (fluorescena) y
piocianina es una caracterstica importante para la identificacin de especies de
Pseudomonas. Algunas de ellas elaboran slo fluorescena (ej. Ps. fluorescens) y
otras ambos pigmentos (ej. Ps. aeruginosa).
El medio King B (o Pseudomonas Agar F) potencia la elaboracin de
fluorescena e inhibe la de piocianina. Estos pigmentos son solubles en agua y
difunden al medio. La fluorescena es un pigmento amarillo-verdoso y es
fluorescente cuando es expuesto a la luz UV (*=254 nm). Existen pigmentos
amarillo-verdosos producidos por algunas especies de Pseudomonas que no son
fluorescentes.
Observar al UV y a simple vista, la produccin de pigmento amarillo-verdoso en
el medio King B.

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Resultados de pruebas bioqumicas. Identificacin bacteriana


PRUEBA
Catalasa

POSITIVA
Aparicin de burbujas de O2

KIA
Fermentacin de glucosa
Fermentacin de lactosa
Produccin de gas
Produccin de SH2

Fondo amarillo
Superficie amarilla
Burbujas o ruptura del agar
Precipitado de color negro

King B
Pseudomonas fluorescens

Pigmento fluorescente

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2.3 REALIZACIN DE UN FROTIS


La preparacin de un frotis o extensin sobre un portaobjetos es imprescindible para
poder aplicar los mtodos habituales de tincin que permiten la observacin al
microscopio de las bacterias y determinar su tamao, morfologa y disposicin relativa.
Material necesario

Mechero.
Placas Petri con los cultivos de las muestras problema
Tubo con yogur
Asa de siembra.
Pinzas.
Portaobjetos.

Tcnica utilizada
1. Colocar una pequea gota de agua en un portaobjetos limpio.
2. Con el asa de siembra previamente flameada transferir una pequea cantidad del
cultivo bacteriano en medio slido a la gota (destapar la placa Petri en las cercanas
de la llama, sin dejar la tapa en la mesa y tomar una pequea muestra con el asa de
siembra). Remover la mezcla hasta formar una suspensin homognea y extenderla
para facilitar su secado.
3. Esperar hasta que la fina pelcula de lquido se evapore.
4. Fijacin de las bacterias al vidrio portaobjetos:
a. Por calor (bacterias procedentes de medio slido). Pasar tres veces el
portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el
portaobjetos entre los pases.

30

TINCIN DE GRAM

Esta tincin fue desarrollada por Christian Gram en 1884 y es uno de los primeros pasos
que se realiza para cualquier identificacin bacteriana. La tcnica es capaz de
diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: Gram positivas y Gram negativas. El
fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las
bacterias Gram positivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras
que las bacterias Gram negativas tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa
lipopolisacardica externa
La tincin de Gram requiere 4 soluciones:
1. Primer colorante. Es un colorante bsico que en contacto con las clulas cargadas
negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El ms utilizado es el cristal
violeta.
2. Solucin mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las
clulas. Ej.: lugol. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua
con el cristal violeta.
3. Agente decolorante. Es un disolvente orgnico. Ej.: etanol. Algunos organismos
(Gram positivos) no se decoloran, mientras que otros (Gram negativos) lo hacen. La
diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la
decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de
bacterias Gram negativas, el alcohol es un solvente lipdico y disuelve la membrana
exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a
la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de
retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las clulas Gram
positivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y
menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared
celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y
provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la
pared celular. Despus de la decoloracin las clulas Gram positivas son todava
azules/violetas, pero las Gram negativas son incoloras.
4. Colorante de contraste. Es un colorante bsico de distinto color que el primer
colorante, por ejemplo safranina. Las bacterias Gram positivas se teirn de azul o
violeta por el cristal violeta y no perdern esta coloracin durante los pasos
sucesivos. Las bacterias Gram negativas perdern la coloracin inicial del cristal
violeta en los siguientes pasos y se teirn de rosa debido a la safranina.

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Material necesario

Portaobjetos con frotis bacterianos previamente preparados (bacterias a identificar y


bacterias del yogur)
Colorantes (1 bote por equipo):
o Solucin de cristal violeta al 1%.
o Solucin de safranina al 0.5%.
o Solucin diluida de yodo (Lugol).
o Etanol 96.
Microscopio.
Aceite de inmersin
Papel de filtro.
Frascos lavadores.
Cubres.
Cristalizadores y puentes de tincin.

Tcnica:

1.

Preparar frotis bacterianos de todas las cepas a


identificar y de las bacterias del yogur.
2. Teir con cristal violeta (1 minuto).
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4. Cubrir con lugol (1 minuto).
5. Lavar con agua el exceso de lugol.
6. Decolorar con etanol hasta que la preparacin deje de
perder color (unos 30 segundos). Repetir este paso.
7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de
disolvente.
8. Teir con safranina (1 minuto).
9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
10. Poner un cubre.
11. Examinar al microscopio. Dibujar la morfologa y el
color que toman los distintos tipos bacterianos en
estudio.

32

33

2.4. PRUEBA DE LA CITOCROMO C OXIDASA


Los citocromos son protenas que forman parte de cadenas transportadoras de electrones
propias del metabolismo respiratorio y fotosinttica. Esta prueba se basa en la capacidad
del colorante tetrametil-p-fenilendiamonio de oxidarse al ceder electrones al citocromo
C. Este colorante es incoloro en estado reducido y puede oxidarse rpidamente en
presencia del citromo C, produciendo formas coloreadas (azul).
Mtodo
Se coloca un trozo de papel de filtro sobre un portaobjetos limpio y se aade una gota
del reactivo tetrametil-p-fenilendiamonio. Con un palillo (el asa de siembra si es de
acero puede enmascarar el resultado) se extender la muestra de una colonia sobre el
reactivo. Si se observa coloracin azul se confirmar que la bacteria contiene la enzima
citocromo C (Pseudomonas la tiene y la familia de las Enterobacteriaceae no)

2.5. ANLISIS MORFOLGICO


Material necesario

Portaobjetos de las tinciones Gram (bacterias a identificar y bacterias del yogur)


Microscopio.
Aceite de inmersin.
Papel de filtro.
Frascos lavadores.
Cubres.

Tcnica:
1. Examinar al microscopio las preparaciones con tincin Gram. Dibujar la
morfologa de los distintos tipos bacterianos en estudio.
2. El yogur procede de la fermentacin de dos bacterias: Lactobacillus bulgaricus
(bacilo) y Streptococcus thermophilus (coco). Identificarlas.

34

2.6. MICROSCOPIO
El microscopio compuesto dispone de dos o ms lentes de aumento. Un microscopio se
divide en dos partes: el soporte y el sistema ptico.
Soporte: consta de:
Base, que normalmente alberga la fuente de alimentacin (lmpara
incandescente o halgena).
Brazo, soporta todo el sistema ptico, el cabezal portaoculares (mono o
binocular) y el revolver portaobjetivos. En el brazo se dispone tambin del mecanismo
de anclaje de la platina.
Platina, es la pieza donde se coloca la preparacin para su observacin. Presenta
un orificio central por donde pasa la luz.
Macromtrico y micromtrico, permiten enfocar la preparacin. El primero se
emplea para un enfoque rpido, mientras que el micromtrico permite afinar el enfoque.

Sistema ptico: Est formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes; los
oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto. Un microscopio
convencional posee tres sistemas separados de lentes:
Condensador, colocado entre la fuente de luz y la preparacin. Concentra los
rayos de luz en un punto o foco, que, para una observacin ptima, debe hacerse
coincidir con el plano de la muestra. Incorpora tambin un diafragma tipo iris que
permite ajustar la cantidad de luz que llega a la preparacin y acta de un modo muy
eficaz sobre el contrastado de la preparacin.

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Objetivos, que proporcionan una imagen ampliada de la proyeccin real e


invertida que se forma en el plano focal anterior del ocular. Los objetivos estn
montados sobre un dispositivo portaobjetos giratorio de revolver. En bacteriologa se
hace uso frecuente del objetivo de inmersin (100 aumentos) que debe ser utilizado
incluyendo entre l y la preparacin una gota de anisol. En los otros objetivos no se usa
anisol, porque la distancia a la muestra es mayor.
Ocular, aumenta a modo de lupa la imagen real proyectada por el objetivo y
permite que sea percibida por el ojo. Lleva grabado el nmero de aumentos.

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO


1. No tocar las lentes del ocular y de los objetivos con las manos.
2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con el dispositivo mvil.
Compruebe previamente que el objetivo de menor aumento est en posicin de
empleo.
3. Para bacteriologa, ilumine la preparacin bajando el condensador (ms
contraste) y con el diafragma abierto.
4. Coloque el objetivo de 10 aumentos y enfoque:
a. Acerque al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando
para ello el macromtrico. No haga esta operacin mirando por el ocular,
ya que podr romperse tanto la preparacin como el ocular.
b. Suba el tubo lentamente con el macromtrico observando por el ocular
hasta que obtenga un enfoque ntido.
5. Pase al objetivo de 40 aumentos. Suba ligeramente el condensador. La imagen
debe estar casi enfocada; afine con el micromtrico. Si la imagen no est ni
medianamente enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo de 10
aumentos.
6. Empleo del objetivo de inmersin:
a. Gire el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio
camino entre ste y el objetivo de 40 aumentos.
b. Coloque una gota de aceite de inmersin sobre el punto de luz.
c. Termine de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objeto de
inmersin, asegurndose de que ste no toca la preparacin, pero s la
gota de aceite.
d. Enfoque cuidadosamente con el micromtrico. La preparacin debera
estar prcticamente enfocada si se ha realizado un enfoque cuidadoso con
el objetivo de 40 aumentos. Recuerde que la distancia de trabajo desde la
lente frontal del objetivo de inmersin a la preparacin es mnima, por lo
que el riesgo de accidente es mximo.
e. Una vez que haya puesto el aceite sobre la preparacin, ya no puede
volver a colocar el objetivo de 40 aumentos sobre ese campo, ya que se
manchara.
f. Finalizada la observacin de una preparacin, y antes de retirarla de la
platina, se colocar el objetivo de menor aumento girando el revlver en
el sentido hacia la lupa. Nunca retire la preparacin con el objetivo de
inmersin en posicin de observacin.
g. Retire la preparacin y limpie el objetivo de inmersin cuidadosamente
con papel de arroz.

36

PRCTICA 3
3.1 COLUMNA DE WINOGRADSKY.
3.2 IDENTIFICACIN DE CEPAS BACTERIANAS.
3.3 OBSERVACIN
DE
MICROORGANISMOS
MOHOS, ALGAS Y PROTOZOOS).

(LEVADURAS,

3.1. COLUMNA DE WINOGRADSKY


El estudio de las comunidades microbianas en condiciones de laboratorio puede
realizarse fcilmente en una columna de Winogradsky, la cual simula un
microecosistema o microambiente que ilustra cmo los microorganismos ocupan
microespacios altamente especficos de acuerdo con sus necesidades vitales, tales como:
requerimientos de carbono, energa y oxgeno, as como la interdependencia, de forma
tal que la actividad metablica de un microorganismo posibilita el crecimiento de otros
y viceversa.
Las columnas de Winogradsky se preparan con muestras de suelo colectadas en
ambientes hmedos, las cuales son enriquecidas con compuestos orgnicos e
inorgnicos y finalmente son expuestas a una fuente de luz natural. En ellas se observa
que despus de 3 4 semanas de incubacin aumenta la cantidad de los distintos tipos
de microorganismos, que de acuerdo con sus caractersticas fisiolgicas se establecen en
las diferentes zonas a lo largo de la columna, lo que se conoce como sucesin. De esta
forma, el resultado es una columna estratificada (zonas de diferente color) tanto en el
suelo como en el agua, donde cada estrato se relaciona con un proceso qumicobiolgico.

37

Material necesario
Recipiente alto de boca ancha, de paredes trasparentes, rectas y sin bordes (botellas
plsticas de 2 L o probeta de vidrio).
300 a 500 g de barro de un arroyo, lago, pantano o ro (sedimento superficial o
subsuperficial), junto con agua de la misma zona (1-2 L).
Fuente de S (yema de huevo), fuente de celulosa (papel de filtro, hierba).
Fuente de CaCO3 (cscara pulverizada de un huevo).
1 esptula.
Parafilm

Metodologa
1. Quitar las piedras, ramas o partculas grandes del barro.
2. Adicionar al barro la cscara de huevo machacada muy fina, el papel muy
cortado y la yema de huevo. Mezclar hasta homogenizar completamente. Poner
una parte de la celulosa en el fondo de la botella.
3. Colocar la mezcla en la botella hasta ocupar 1/3 del volumen total (ms o menos
unos 10 cm de capa). Compactar el barro a fin de eliminar las burbujas de aire.
4. Aadir el agua a la botella hasta llegar a una altura de aproximadamente de 3 a 5
cm debajo del borde. Tener cuidado de no resuspender la muestra compactada,
para ello inclinar la botella y resbalar el agua lentamente por las paredes.
5. Agitar la solucin con una varilla para eliminar burbujas de aire.
6. Registrar el aspecto final de la columna (color del sedimento y del lquido).
7. Marcar el nivel de agua y cubrir la boca de la botella con parafilm.
8. Incubar a temperatura ambiente (25 a 30C) cerca de una ventana para que
reciba iluminacin.
9. Examinar la columna peridicamente durante varias semanas anotando los
cambios de color y grosor de las diferentes capas.

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3.2 IDENTIFICACIN DE CEPAS BACTERIANAS


Cada uno de los resultados que hayamos ido obteniendo durante las prcticas, los
iremos apuntando en la tabla. Identificar cada una de las cepas basndose en todas las
pruebas realizadas previamente: anlisis morfolgicos, pruebas bioqumicas, tincin
Gram, crecimiento en los distintos medios de cultivo y presencia o no de fluorescencia.
Realizar una tabla con los resultados.

Cepa

Morfolo
ga

Gram

Catalasa

Ferment
glucosa

Ferment
lactosa

No
ferment.
azucares

Gas

SH2

Citocromo
C oxidasa

Movili
dad

Indol

3.3 OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS (LEVADURAS, MOHOS,


ALGAS Y PROTOZOOS)
Se trata de observar microorganismos vivos y conocer sus caractersticas (morfologa,
tamao, color, movimiento, etc.) evitando los artefactos que pueden ocasionar la
fijacin y la tincin. Observaremos levaduras, hongos, algas y protozoos.
Hay que dibujar con detalle los diferentes tipos morfolgicos y describir sus
movimientos.

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Fluores
cencia

Material necesario
1. Muestras de agua de arroyo, lago, pantano, ro (zona calmada), mar(1-2 L)
2. Placas de Petri con Rhizopus sp., Penicillium sp., Aspergillus sp. y
Saccharomices cerevisae.
3. Muestras de la cerveza elaborada
4. Preparaciones microscpicas de Toxoplasma gondii, Amoeba proteus,
Radiolarios,Foraminiferos, Trypanosoma gambiense, Dinobryon, Phytophthora
infestans y Nostoc.
5. Mallas de filtracin
6. Pinzas
7. Aguja enmangada
8. Cristal violeta
9. Lactofenol
10. Papel de filtro.
11. Frascos lavadores.
12. Cristalizadores y puentes de tincin.
13. Mechero alcohol.
14. Pipetas.
15. Portaobjetos y cubreobjetos.
16. Microscopio.
17. Aceite de inmersin.
18. Guas de identificacin de microorganismos acuticos.

Observacin de mohos y levaduras

Levaduras
1. Transfiera una porcin de la colonia de Saccharomices cerevisae a una gota de agua
sobre un porta.
2. Emulsione y extienda la mezcla. Fije al calor la extensin resultante.
3. Haga una tincin con cristal violeta durante 1 minuto. Lava la muestras con agua
destilada. Pon un cubre sobre la preparacin.
4. Examina las clulas a 1000x (aceite de inmersin). Dibuja la morfologa celular de
las levaduras.

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Mohos
1. Coloque una gota del colorante azul de lactofenol en un porta.
2. Extiende sobre el colorante un trozo de micelio (con ayuda de las pinzas y de la
aguja enmangada). Coloca el cubreobjetos despus procurando que no quede
ninguna burbuja de aire.
3. Observa la muestra al microscopio con diferentes aumentos y recorrindola en toda
su extensin. Dibuja lo que observas.
4. Repite estos pasos con Rhizopus sp., Penicillium sp. y Aspergillus sp.

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Observacin de Toxoplasma gondii


Toxoplasma gondii es un protista parsito (Alveolados) causante de la toxoplasmosis
animal y humana, esta ltima contrada por el consumo de carne cruda o poco hecha,
producto donde se encuentran los toxoplasmas endgenamente como consecuencia de
su ciclo biolgico. Las clulas de T. gondii son mviles y tienen forma de media luna,
miden 3-12 m de largo por 1-3 m de ancho, con un extremo romo y otro ms
aguzado. El ncleo se halla situado prximo al extremo romo.

Metodologa
Observar las preparaciones al microscopio, dibujando la morfologa e indicando las
estructuras que se observen (p.e. ncleo).

Observacin de algas y protistas


Se observarn varios gneros de algas y protozoos muy frecuentes en aguas dulces. Ej.:
Euglena, Volvox, Paramecium, Diatomeas, Ameba, etc.
Tcnica:
1. Tomar una gota de la muestra y depositarla en el portaobjetos.
2. Colocar el cubreobjetos. Para evitar burbujas, depositar el cubreobjetos sobre la
gota; primero una arista y luego todo l.
3. Observar al microscopio e identificar el gnero con ayuda de la gua de
identificacin. El calor desprendido por el foco luminoso ir secando
progresivamente la preparacin. Por tanto, los microorganismos se irn
paralizando. Cuando se observen estos efectos, levantar el cubreobjetos y aadir
ms lquido.
4. Observar al microscopio las preparaciones de: Amoeba proteus (Protistas:
Amoebozoos, se muestra el ncleo, pseudopodos, ecto- y endoplasma),

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Radiolarios (Protistas, especies diversas), Foraminiferos (Protistas: Cercozoos,


especies diversas), Trypanosoma gambiense (Protistas: Euglenozoos, agente
causal de enfermedad del sueo), Dinobryon (Protistas: Estramenpilos, algas
pardo-doradas en colonias), Phytophthora infestans (Protistas: Estramenpilos,
Oomicetos, causa el mildi de la patata) y Nostoc (Bacterias fotosintticas:
Cianobacterias, con heterocistos.
5. Dibujar la morfologa e indicar las estructuras que se observen (p.e. ncleo).

(Metazoos. Filo: Rotifera)

(Metazoos. Filo: Nematoda)

(Metazoos. Filo: Annelida)

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