Mutazioni I parte

Ruolo delle mutazioni

Come insorgono le mutazioni ? Le mutazioni spontanee sono indotte ?
Il test di fluttuazione
Il calcolo del tasso di mutazione
La frequenza di mutazione
I tipi di mutazione: transizioni e transversioni
Delezioni, sostituzioni e inserzioni
Mutazioni puntiformi e frameshift
Mutazioni spontanee: meccanismi
Le modificazioni tautomeriche delle basi
Forme enoliche e iminiche
Conseguenze e modalit di insorgenza della mutazione
Gli analoghi delle basi
Il 5-bromouracile
2-aminopurina
Agenti alchilanti
La depurinazione
Gli agenti intercalanti
La deaminazione
Azione dei raggi UV
Effetto dei radicali liberi dellossigeno
Mutageni ambientali: radiazioni e agenti chimici
Come si valuta la mutagenicit di una sostanza ?
Il test di Ames
FREQUENZA E CAUSE DI MUTAZIONE SPONTANEA.
Le prime informazioni sulla frequenza di mutazione spontanea in specie
diploidi sono state ottenute da studi condotti su animali da esperimento come
la Drosofila e il topo e su vegetali come il granturco (Zea mais). Questi studi si
sono basati su un approccio indiretto, ovvero su una quantificazione di eventi
mutazionali rivelati attraverso la manifestazione fenotipica del cambiamento
genetico (che di per se pu essere indipendente da conseguenze
fenotipiche). Essi identificano quindi solo mutazioni di regioni del DNA che
sono trascritte o che in qualche modo influenzano il processo di trascrizione.

Un tipo di studio del genere il seguente: si incrociano esemplari di topolini

altamente inincrociati (quindi puri) con topolini appartenenti allo stesso
ceppo ma recanti una mutazione recessiva in omozigosi che modifica il colore
del mantello. La progenie prodotta da questi incroci presenter un mantello
dal colore identico a quello comunemente condiviso dagli esemplari del ceppo
puri, a meno che uno di questi sviluppi una mutazione identica a quella
recata in omozigosi dal membro mutato. In questo caso la progenie
dellincrocio recher al 50% la mutazione in omozigosi e presenter il
mantello dellaltro colore. Stabilire quantitativamente il rapporto tra questi
eventi sul numero totali di incroci effettuati permette di ottenere una stima del
tasso di mutazione spontanea per quel gene.
Entro questi limiti, si potuto constatare che la frequenza di mutazione
spontanea varia per i diversi loci, sia pure in un ambito relativamente ristretto.
Nel topo, una ricerca per mutazioni in alleli recessivi responsabili di
modificazioni del colore del mantello, condotta su molte centinaia di migliaia di
individui, ha fornito un tasso medio per locus di 11.2 per milione di individui.
Numerose indagini sulla frequenza di mutazione per loci non individuati,
basate su osservazioni sistematiche di cambiamenti fenotipici (su base
monogenica) in ceppi di topi inincrociati, sono state condotte presso i
Laboratori Jackson a Bar Harbor (sede di uno dei pi grandi allevamenti di
roditori a scopi scientifici) su popolazioni molto vaste di questi animali.
Dall'insieme dei dati ottenuti da molti di questi studi emerso che la
frequenza di mutazione spontanea di alleli recessivi dell'ordine di 10-6 per
locus per generazione e potrebbe essere anche pi elevata.
Studi sulla velocit di cambiamento di sequenze di DNA sembrano indicare
che la frequenza di mutazione deve essere significativamente diminuita
durante l'evoluzione dei primati, forse a causa del pi limitato numero di
generazioni per unit di tempo in rapporto a quanto avviene per altri
mammiferi che hanno una attesa di vita pi breve e cicli riproduttivi pi
frequenti.
Occorre tenere presente che sono numerose le modificazioni del DNA che
non si esprimono a livello fenotipico. In questo caso la mutazione non
sottoposta a pressione selettiva e non assume valore evolutivo immediato.
Inoltre, ancora pi numerose sono le variazioni del DNA che sono eliminate
prima di essere trasmesse per azione dei sistemi di riparazione del danno
genetico. Questi sistemi hanno indubbiamente un ruolo nel ridurre la
frequenza di mutazione spontanea, forse adeguandola al valore ottimale per
una data specie in evoluzione.

Il termine 'spontaneo' sottolinea la natura inevitabile degli eventi mutazionali

che si manifestano con una data frequenza nel materiale genetico di individui
di una specie che evolve in un ambiente naturale.
E noto che gli organismi viventi, uomo compreso, sono continuamente
esposti ad un fondo naturale (quindi inevitabile) di radiazione che deriva in
parte dalla radiazione cosmica primaria e secondaria, in parte dai radionuclidi
ambientali (radiazione terrestre) e costitutivi (radiazione interna). Le radiazioni
sono potenti fattori mutageni. Da un punto di vista genetico, solo le radiazioni
che raggiungono le gonadi hanno importanza ed stato calcolato che, nella
specie umana, la dose di radiazione naturale assorbita per anno dalle gonadi
sia dell'ordine di 0.1 rad. Questo valore tende ad aumentare in popolazioni
che abitano regioni situate in prossimit di giacimenti di uranio o di altri
elementi radioattivi naturali. La radiazione di fondo sembra tuttavia contribuire
in piccola parte alla frequenza di mutazione spontanea nell'uomo. Stime
approssimate indicherebbero che solo il 10% di tale frequenza sia attribuibile
all'azione delle radiazioni naturali.
E stato dimostrato che alterazioni termo-dipendenti della struttura covalente
del DNA, come perdita di basi puriniche per idrolisi del legame N-glucosidico
che le unisce al desossiribosio, avvengono a velocit apprezzabile a
temperature moderate e compatibili con la fisiologia dell'organismo. Eventi di
questo tipo causano degradazione dell'informazione genetica: se tale
informazione non venisse prontamente e correttamente reintegrata, l'evento
degradativo termo-dipendente diventerebbe fonte di mutazione. In effetti,
poich la temperatura aumenta la velocit di qualunque reazione chimica, non
appare sorprendente che essa influisca sulla frequenza di mutazione. Nei
mammiferi di sesso maschile, le gonadi sono di solito mantenute ad una
temperatura inferiore a quella del resto del corpo. Ci potrebbe costituire un
fattore che tende a limitare un eccesso di mutazioni nel maschio. Alterazioni
dirette o indirette del DNA sono state osservate per azione di agenti chimici
naturali esogeni (psoraleni, micotossine, antibiotici, ecc.) e per azione di
prodotti endogeni del metabolismo (in particolare radicali liberi) capaci di
raggiungere il DNA ereditabile a dosaggi significativi. Anche il contributo di
queste azioni non esaurisce peraltro il problema delle fonti di perturbazione
responsabili della frequenza totale di mutazione spontanea.
E stato infine proposto che una quota non trascurabile di mutazioni
spontanee rappresenti il risultato degli inevitabili errori che avvengono durante

i processi di replicazione, di ricombinazione, di trasposizione e di riparazione

del DNA.
Le radiazioni sono da gran tempo note come agenti mutageni. Possono
indurre mutazioni e aumentare il tasso di mutazione al di sopra dei valori di
frequenza spontanea di specie. Una serie di studi sono intesi a definire i
possibili effetti mutageni indotti dall'impiego di radiazioni nella pratica medica,
dalla produzione di radionuclidi artificiali a scopo scientifico, medico e
industriale, dall'inquinamento ambientale per utilizzazione di impianti nucleari
e per ricaduta radioattiva (fall-out) conseguente ad esplosioni atomiche di
superficie.
Studi in Drosofila sull'induzione di mutazioni mediante raggi X hanno
evidenziato l'esistenza di una relazione lineare tra frequenza di mutazione e
dose di radiazione. La costanza di tale relazione entro una gamma assai
estesa di valori (tra 8 e 6000 r o pi) e l'uniformit e riproducibilita dei dati da
diverse fonti sono rimarchevoli. Sembra non esistere un valore soglia al di
sotto del quale la radiazione non ha effetto sulla frequenza di mutazione. Per
quanto riguarda gli effetti sulla specie umana (sia che si tratti di mutazioni
gametiche sia somatiche) qualche indicazione stata ottenuta dall'analisi
della progenie dei sopravvissuti ai bombardamenti atomici di Hiroshima e
Nagasaki, e dallo studio sulle conseguenze alla esposizione in disastri come
quello di Chernobyl. Effetti come la comparsa di tumori (leucemie), dovuti
presumibilmente a mutazioni somatiche, sono vistosi. Ad esempio, l'incidenza
di leucemia nei superstiti di Hiroshima che si trovavano nel raggio di un
chilometro dal centro di esplosione, stata, dopo 12 anni, 50 volte superiore
ai livelli della popolazione di controllo. E ancora, anomalie cromosomiche
sono state frequentemente osservate anche dopo molti anni in linfociti (cellule
somatiche) prelevati da individui irradiati nel corso di terapia o di incidenti
nucleari. Possiamo ora chiederci se l'inquinamento da radiazioni provocato
dall'uomo o il largo impiego di radiazioni nella pratica medica rappresentino
un rischio genetico potenziale o attuale. La quantit totale di radiazioni
geneticamente significativa che stata immessa sino alla fine degli anni 6070 nell'ambiente in seguito ad azioni belliche o ad esperimenti di superficie
con materiali fissili supera di poco il valore di 0.1 rem. Ci corrisponde, per
ciascun individuo, a poco meno di un anno di esposizione in pi al fondo
naturale ed quindi relativamente trascurabile. L'inquinamento ambientale
tuttavia aumentato in relazione alla proliferazione degli impianti nucleari che la
crescente richiesta energetica favorisce. Lo scarico dell'acqua usata per
raffreddare i reattori causa contaminazione radioattiva delle acque di
superficie e degli organismi che di tali acque sono tributari; i rifiuti gassosi

dell'impianto aumentano la contaminazione dell'atmosfera. E probabile

(auspicabile) che l'incremento della radiazione dovuto a queste fonti possa
essere contenuto in limiti ragionevoli.
Particolare attenzione merita il problema del rischio connesso all'impiego dei
raggi X e delle altre forme di energia radiante nella pratica medica. Il
contributo di questa fonte tutt'altro che trascurabile. L'impiego diagnostico e
terapeutico dell'energia radiante deve essere accuratamente soppesato in
rapporto ai possibili svantaggi dovuti ad induzione di mutazioni gametiche e
somatiche.
Pochi invece sono gli studi epidemiologici sulla azione mutagena della
temperatura, che stata studiata principalmente nei batteri.
La maggior parte delle informazioni sull'azione mutagena delle sostanze
chimiche stata fornita in genere da studi sui microrganismi. Oggi sono
peraltro a disposizione anche sistemi di saggio che utilizzano cellule in coltura
ottenute da eucarioti superiori, compresa la specie umana. Altri sistemi di
saggio si basano sull'impiego di piante, insetti e mammiferi. Un enorme
numero di composti stato sottoposto ad analisi. Ci ha consentito di
identificare come mutageni, in uno o pi sistemi di saggio, molecole che
trovano collocazione in svariate classi di sostanze tra cui pesticidi, coloranti,
dolcificanti, additivi alimentari, antibiotici, farmaci antineoplastici, inquinanti
dell'atmosfera da sorgenti industriali e da mezzi di locomozione, sostanze
chimiche usate nell'industria della plastica, una variet di agenti alchilanti
industriali, ecc. L'identificazione di una sostanza come mutageno tuttavia
solo il primo passo nella valutazione dei rischi che la presenza nell'ambiente o
l'impiego di tale sostanza comporta. E infatti necessario conoscere se i
risultati del sistema di saggio impiegato possono essere estrapolati alla specie
umana sia da un punto di vista qualitativo (la sostanza in grado di indurre
mutazioni gametiche nell'uomo ?), sia da un punto di vista quantitativo (quale
l'impatto mutageno nella popolazione umana per date condizioni di
esposizione ?); necessario avere informazioni sulla quantit di sostanza
chimica che viene prodotta nel presente e sar prodotta nel futuro, sulla
quantit che immessa nell'ambiente o che distribuita nei materiali con i
quali l'uomo viene in contatto, sulla stabilita del composto e sulla persistenza
nell'ambiente o nei materiali in cui presente; e infine necessario determinare
la distribuzione della sostanza nell'organismo e le eventuali trasformazioni che
essa subisce per attivazione o inattivazione metabolica. Tutti questi fattori
debbono essere integrati in una difficile analisi per la quale al presente non
esistono soddisfacenti regole e indicazioni. Per questa ragione, il rischio di
mutagenicita delle varie sostanze chimiche nella specie umana difficile da

valutare correttamente. Quale limpatto sull'incremento di anomalie

genetiche in neonati in seguito all'esposizione dei genitori a sostanze
chimiche presenti nell'ambiente ? Negli Stati Uniti ed in Norvegia sono stati
riscontrati aumenti di 2-3 volte nel numero di malformazioni congenite in
bambini nati in insediamenti siti in prossimit di grossi impianti destinati alla
produzione di cloruro di vinile, un potente mutageno (e cancerogeno) attivo
anche nella specie umana. La preoccupazione circa la presenza di agenti
mutageni nell'ambiente, nei cibi, nei materiali con i quali l'uomo viene, per una
ragione o per l'altra, in contatto accresciuta dalla chiara correlazione
esistente tra mutagenesi e cancerogenesi. E noto infatti che la maggior parte
degli agenti mutageni possiede anche attivit cancerogena ed esiste un forte
sospetto che tutti i cancerogeni (terminali) siano necessariamente mutageni.
Quando si consideri che la dieta della maggior parte della popolazione dei
paesi occidentali contiene migliaia di composti di sintesi come coloranti,
sapori, preservanti, emulsificanti, antibiotici, pesticidi e contaminanti derivati
dagli involucri, molti dei quali possono possedere attivit mutagena (e
cancerogena), la vastit del problema nei suoi aspetti medici, economici e
sociali diviene facilmente apprezzabile.
Per ultimo va ricordato che anche agenti biologici possano indurre alterazioni
ereditabili del materiale genetico.

QUALCHE NOTA SULLE MODALIT E I MECCANISMI MOLECOLARI Dl

MUTAZIONE

Il processo mutativo pu interessare una o pi basi della sequenza

polinucleotidica del DNA. Talora pu coinvolgere centinaia o migliaia di
nucleotidi.
Mutazioni che interessano un solo nucleotide (mutazioni puntiformi) originano
generalmente per sostituzione di una base della sequenza originale con
un'altra base. Scambi purina-purina (A->G) o pirimidina-pirimidina (C->T)
sono definiti transizioni; scambi purina-pirimidina o viceversa (A->C, A->T, G>C, G->T) prendono il nome di transversioni. Entrambi i tipi di mutazione
possono, con frequenza finita, essere corretti per reversione da una seconda
mutazione che ripristina il genotipo originale. Mutazioni puntiformi possono
derivare anche da inserzione o da perdita di un nucleotide nella sequenza.
La maggioranza delle mutazioni spontanee insorgono durante i processi di
replicazione, di ricombinazione, di trasposizione e di riparazione del DNA.

La replicazione del DNA avviene con accoppiamento di basi secondo uno

schema che prevede la formazione di specifici legami idrogeno tra adenina e
timina (A-T) e tra guanina e citosina (G-C). Questo accoppiamento
complementare legittimo messo in crisi quando le basi si presentano in
forma alternativa tautomerica, molto pi rare, in equilibrio con le prime.
Queste forme presentano uno spostamento cruciale di un atomo di idrogeno
ed il nuovo assetto consente la formazione di legami idrogeno con una base
diversa da quella prevista dal normale schema di accoppiamento
complementare. Ad esempio, la forma iminica dell'adenina e la forma enolica
della timina possono dar luogo ad accoppiamenti illegittimi rispettivamente
con la citosina (A-C) e con la guanina (G-T). Quando alla migrazione
protonica si aggiunge la rotazione di 180 dell'altra base intorno al suo legame
con lo scheletro zucchero-fosfato, allora si ha la formazione di transversioni.
Eventi di questo tipo consentono un accoppiamento A-A', intermediario della
transversione A-T -> (AA') -> T-A. Con queste modalit, l'accoppiamento
illegittimo avr come conseguenza l'introduzione di un nucleotide sbagliato
nella sequenza polinucleotidica della replica. Questi meccanismi, proposti per
spiegare l'insorgenza delle mutazioni spontanee, forniscono anche le basi
molecolari dell'azione di alcuni mutageni (analoghi delle basi naturali,
sostanze capaci di convertire le basi naturali in basi a differente assetto).
Vediamo alcuni esempi. Il 5-bromouracile, un analogo della timina in cui un
atomo di bromo sostituisce il metile in posizione 5 dell'anello pirimidinico,
esercita la sua azione mutagena favorendo errori per sostituzione durante la
replicazione del DNA. La presenza dell'atomo di bromo conferisce una
maggior stabilit alla rara forma enolica della molecola aumentando la
probabilit di accoppiamenti illegittimi. Ci pu avvenire: (a) per illegittimo
accoppiamento del 5-bromouracile con guanina, cui segue la sostituzione
della guanina con adenina ed accoppiamento finale dell'adenina con timina. In
questo caso una coppia A-T ha sostituito l'originale coppia G-C nella
sequenza; (b) per incorporazione del 5-bromouracile al posto della timina, cui
segue lappaiamento illegittimo con guanina e sostituzione finale del 5bromouracile con citosina. In questo caso una coppia G-C ha sostituito
l'originale coppia A-T. In entrambi i casi siamo di fronte a sostituzioni per
transizione. Un analogo dell'adenina, la 2-aminopurina, ha azione mutagena
simile. L'analogo pu appaiarsi con la timina e, pi raramente, con la citosina.
In quest'ultimo caso l'accoppiamento illegittimo 2-aminopurina-citosina
sostituito dapprima dall'accoppiamento 2-aminopurina-timina e quindi da A-T.
La coppia originale G-C quindi sostituita per transizione dalla coppia A-T.
Anche gli agenti alchilanti (mostarde solforate ed azotate, epossidi, metilanti
industriali, ecc. ) causano sostituzioni per transizione e pi raramente per

transversione. Il loro pi frequente bersaglio l'anello purinico. La forma

alchilata della guanina (generalmente 06-alchil-G) tende ad appaiarsi
incorrettamente con la timina e la guanina alchilata viene sostituita dalla
adenina in una ulteriore replicazione del DNA. Altre volte l'alchilazione
dell'anello purinico seguita dall'idrolisi del legame purina-desossiribosio, e la
purina viene allontanata. Talora, agenti alchilanti bifunzionali (portatori di due
gruppi alchilici reattivi nella molecola) formano legami intermolecolari tra
filamenti vicini di DNA (o tra filamenti di DNA e gruppi reattivi di altre
molecole) disturbando la replicazione (oltre che la trascrizione ed i processi di
ricombinazione). Altri mutageni (acido nitroso, idrossilamina) reagiscono con
le basi, modificandole, cos da consentire errori di appaiamento.
L'idrossilamina, ad esempio, modifica la citosina che alla fine sostituita dalla
timina secondo meccanismi analoghi a quelli descritti sopra.
Mutazioni durante il processo di replicazione del DNA insorgono anche con
meccanismi diversi in cui l'accoppiamento delle basi legittimo (A-T, G-C), ma
non corretto il loro allineamento nella sequenza, con appaiamento fuori
registro. Allineamenti incorretti possono avvenire in regioni del DNA
caratterizzate da sequenze ripetitive uniche o duplici ed essere generati da
palindromi o quasi-palindromi. Nella replicazione, l'incorretto allineamento
causa di delezioni o inserzioni di singole basi, piccoli gruppi di basi e
sequenze pi estese. Alcuni mutageni operano con meccanismi simili.
Intercalandosi tra le basi appaiate della doppia elica del DNA, alterano la
regolarit della spaziatura tra le stesse. Ci causa di errori nella replica
polinucleotidica che pu presentare delezioni o inserzioni localizzate. Si
comportano in questo modo mutageni del tipo delle acridine (proflavina,
arancio di acridina).
Durante la prima divisione meiotica nel corso della gametogenesi, i
cromosomi si appaiano, scambiando materiale genetico tramite il processo di
crossing over (ricombinazione). Il meccanismo di ricombinazione prevede la
rottura e la riunione di segmenti di DNA tra i quali esista corrispondenza delle
sequenze che individuano alleli omologhi sui cromatidi che partecipano allo
scambio. In conseguenza del preciso allineamento, il processo non altera la
disposizione delle sequenze polinucleotidiche del DNA. Tuttavia, in qualche
caso, allineamento delle sequenze e appaiamento genico non sono precisi.
Ci accade in regioni cromosomiche in cui siano presenti duplicazioni geniche
contigue (duplicazioni in tandem). In queste regioni, due segmenti di DNA
molto simili si succedono nel cromatide ed un errato appaiamento di
sequenze durante la meiosi diviene probabile. Se un evento di ricombinazione
si manifesta nella regione di incorretto appaiamento, esso esita in delezioni o
duplicazioni di materiale genetico.

Accanto ai processi di ricombinazione omologa appena descritti sono oggi

note forme di ricombinazione tra regioni di DNA largamente non omologhe.
Queste ricombinazioni sono in gran parte legate all'attivit di elementi
trasponibili: segmenti discreti di DNA, normali costituenti del genoma di un
organismo, sono capaci di muoversi da un sito cromosomico ad un altro
generando nuove combinazioni genetiche (che saranno poi saggiate dalla
selezione). Gli elementi trasponibili (sequenze di inserzione, trasposoni)
mostrano una grande versatilit di ricombinazione. Il processo dipende dalla
presenza in essi di corte sequenze di DNA che sono substrato per vari enzimi
di ricombinazione (transposasi) e rappresenta una forma di variazione
genetica piuttosto drastica. Altri elementi trasponibili si comportano come
retrotrasposoni, attraverso un meccanismo che coinvolge la formazione di un
RNA intermediario. Da queste ricombinazioni non omologhe si generano
duplicazioni, riarrangiamenti e anche fusioni. L'inserzione di questi elementi in
una nuova e distante regione del genoma causa di mutazioni per inserzione
che alterano profondamente sequenza e funzione di importanti geni.