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Practica IV Cromatografa

Escuela Nacional De
Ciencias Biolgicas

EQUIPO 3
HERNNDEZ BALDERAS JOSE LUIS, RAMREZ PREZ ANA BERTHA

CROMATOGRAFIA
La cromatografa puede definirse como una tcnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de
desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase mvil (lquida o gaseosa) a travs
de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser lquida o slida. Las propiedades de los
componentes de una mezcla determinan su movilidad entre s y con respecto a la fase mvil. La base de la separacin
cromatogrfica ser, por tanto, la diferencia en la migracin de los mismos.
El botnico ruso Mijail Tswett (Figura
1) estableci las ventajas de la tcnica, adopto
la terminologa y defini los procedimientos
experimentales bsicos para esta tcnica, se
considera que es el Padre de la Cromatografa.
En los aos 30 y 40 empez su desarrollo y
aplicacin en diferentes procedimientos de
experimentacin.

en la fase estacionaria y que tienden a quedar


retenidas. En resumen se fundamenta en la
separacin entre la fase estacionaria slida o
liquida y la fase mvil liquida o gaseosa.

Los fenmenos rectores del proceso de


retencin y separacin son la adsorcin y
la absorcin. El primero queda delimitado a la
superficie interfacial es decir se refiere a la
La palabra Cromatografa significa Escribir en
fijacin o retencin de la sustancia entre la
Colores, porque cuando fue desarrollada los
superficie de las dos fases; se relaciona con
componentes separados eran colorantes. Se
fuerzas qumicas y fsicas que dependen de la
define como una tcnica o mtodo fsico de
naturaleza de la sustancia absorbida,
separacin basado en las diferentes velocidades con
temperatura, naturaleza del absorbente y
Fig. 1 Mijail
que se mueven los solutos disueltos en un
concentracin. El segundo fenmeno determina la
Tswett
disolvente llamado eluente (fase mvil) a travs de
retencin de una especie qumica por parte de una
un medio estacionario o fijo. Los componentes a separar se
masa y depende de la tendencia que tiene sta a formar
distribuyen entre la fase estacionaria y la fase mvil o fluido
mezcla o reaccionar qumicamente con la misma.
que pasa a travs o a lo largo de la fase estacionaria. Como los
componentes de la mezcla presentan diferente tendencia a
permanecer en cualquiera de las fases, la separacin se da por
el movimiento de la fase mvil en relacin con la estacionaria
y de la distribucin de las sustancias entre las dos fases. Las
molculas que "prefieren disolverse" en la fase mvil sern
eludas ms rpido que las que son preferencialmente solubles
OBJETIVO GENERAL
Fig. 2 Cromatografa
Conocer la tcnica de cromatografa y los factores experiementales que la afectan.
en capa fina
OBJETIVO PARTICULAR

Aplicar y comparar los mtodos cromatograficos de capa fina y colimna, para separar, identificar y purificar
compuestos organicos.
Observar el afecto de diferentes fases mviles y estacionarias en la separacin.
Determinar los valores de Rf como un parmetro en la identificacin de los compuestos separados.

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Practica IV Cromatografa

HIPOTESIS
Experiencia. Separacin de licopenos.
Si desarrollamos los pasos de cromatografa en papel en los
licopenos obtenidos en la prctica Extraccin liquido-liquido y
la mezcla de Hexano-Acetato, obtendremos el desarrollo de
cromatograma y con esto poder observar los componentes del
licopeno.
Experiencia. Cromatografa en capa fina de una mezcla
de colorantes.
Si efectuamos la cromatografa en varias cromatoplacas desde
puntos sealados, en contacto a la mezcla de Acetato de EtiloEtanol a diferentes concentraciones y medimos las distancias
entre los puntos, obtendremos los valores de Rf y
observaremos cual es la concentracin adecuada para esta
cromatografa.
MATERIALES
REACTIVO
Silica-gel para columna
Hexano-Acetato de Etilo
1:1
Acetato de Etilo-Metanol
1:1
Acetato de Etilo-Metanol
7:3
Acetato de Etilo-Metanol
1:1
Mezcla de colorantes
anaranjado de metiloazul de metileno 1:1

CANTIDAD
4g
30 ml
30 ml
10 ml
10 ml
10 ml

OBSERVACIONES
En la separacin de licopenos se preparo la columna para
cromatografa cuidando que el pedazo de algodn que se
debe colocar, fuera de un tamao, por el cual no se

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filtrara, ni se obstruyera la salida de los componentes de


la columna.
Se adiciono slica-gel, la cual es acida, se opto por una
slica gel con poro pequeo, debido al fenmeno que
se lleva acabo en la columna, es decir la adsorcin.
Dependiendo del tamao del poro se eluye.
Para acelerar el tiempo en el que se empacaba la
columna, se omiti el circulo de papel filtro, ya que
con este tardara mas en bajar nuestra slica-gel y el
hexano, se empaco con hexano debido a que era el
disolvente menos polar, siempre se debe de empezar
con el menos polar e ir aumentado gradualmente la
polaridad del disolvente.Tambin se acelero el
proceso con la aplicacin de oxigeno, se opto por
este, debido a que el nitrgeno a pesar de dar
mejores resultados sin impurezas, es muy caro.
Al agregar el extracto de licopenos, se observo
primero que dicho extracto no estuviera turbio, si
este era el caso, se le agregaba un poco de hexano y
se eliminaba la turbidez, posteriormente se agrego
cuidadosamente a la columna.
Una vez que los pigmentos penetraron en la slica-gel
se lleno la columna con Hexano-Acetato de etilo (1:9),
debido a que los licopenos son poco polares. En este
procedimiento fue importante mantener el goteo
constante y no dejar que el nivel del disolvente bajara
ms all de la superficie de la slica-gel
Se obtuvieron 3 tubos de ensayo con diferente
coloracin en tonos amarillos disminuyendo
gradualmente el tono, esto con el eluyente HexanoAcetato de etilo, no fue necesario cambiar de
eluyente.
Se desarrollo el cromatograma con etanol, sin
embargo no fue en la concentracin correcta, porque
la mancha se corri hasta la parte superior, por lo que
hay que hacer ensayos para encontrar el disolvente
correcto.

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RESULTADOS
En la columna cromatografa se apreci muy claramente la
separacin de las fases, los primeros tubos que colectamos
eran muy coloridos, y gradualmente fueron perdiendo esta
caracterstica, lo que nos indica la separacin por volmenes.
En la tercera experiencia, en la mescal hexano: Acetato de
etilo 1:1 es poco polar por lo que al hacerla pasar por la
columna, eluyeron las sustancias no polares, mientras que las
polares quedan adheridas a la matriz de la columna, es decir al
slica-gel; al cambiar la mezcla a acetato de etilo: metanol 1:1
de mayor polaridad, las molculas polares van movindose al
reemplazarse su interaccin con la slica-gel por interaccin
con la mezcla acetato de etilo: metanol 1:1. Con lo que
observamos una mayor separacin.
En la cromatografa de capa fina se ocuparon 3 tintas, amarilla,
naranja y rosa, el Rf (distancia recorrida por el solvente
/distancia recorrida por el soluto) de cada una es de:
Tinta amarilla = 2.3 cm /3.9 cm = 0.59
Tinta naranja = 1 cm /3.9 cm = 0.256
Tinta amarilla = 0.5 cm /3.9 cm = 0.128

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Al desarrollar el cromatograma en el caso de que las


sustancias sean coloreadas, se identifican a simple vista las
posiciones de los distintos pigmentos separados.
En ocasiones el cromatograma no presenta coloracin,
siendo necesario utilizar reveladores, en trminos
generales los reveladores son soluciones reactivas que se
emplean para poner en evidencia la presencia de los
componentes de la muestra, mediante reacciones que
generan especies cromognicas o fluorescentes.

Comercialmente estn disponibles placas cromatograficas


con revelador fluorescente incluido, y su presencia
generalmente se seala con F254, F366 o F254, 366. Estos
sealamientos se refieren a las longitudes de onda ms
usadas, 254 y 366 nm.
Existen reveladores de carcter bastante general, en tanto
que otros son especficos para ciertos grupos funcionales.
Los componentes orgnicos reaccionan y se visualizan con
el revelador de sulfato srico, al someterse a una
temperatura de 100C. Las cetonas y los aldehdos pueden
evidenciarse con la 2,4-dinitro-fenilhidracina. La ninhidrina
reacciona con los grupos aminados. Los alcaloides dan
reaccin positiva con el reactivo de Dragendorff. Las grasas
con la rodamina B producen manchas que fluorescen con
la luz UV.

DISCUSIONES
En la cromatografa de columna dependiendo de las
caractersticas de cada compuesto algunos tendern a
quedarse ms retenidos en el slido, mientras que otros
avanzarn con el paso del disolvente. En este caso la
polaridad es muy importante para elegir el tipo de disolvente y
para saber en que parte del sistema quedara nuestro analito,
permitindonos as obtener una buena separacin de los
constituyentes del mismo.
En la cromatografa de columna es importante que la columna
no se seque en ningn momento ya que el aire se introduce en
la misma, agrietndola. Las grietas impiden el normal
desarrollo de los equilibrios de adsorcin y desorcin entre el
adsorbente y el disolvente, reducindose la capacidad de
separacin.

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Los reveladores lquidos pueden distribuirse sobre las


placas cromatograficas por aspersin con un nebulizador o
por inmersin. Generalmente se obtienen mejores
revelados por nebulizacin.
Para trabajar en una separacin de cromatografa en capa
fina es necesario realizar primero un anlisis del
comportamiento cromatogrfico en placa de la mezcla a
separar. Se prueba dicho comportamiento en distintos
disolventes y mezclas de disolventes, resultando adecuado
para la separacin aquel en el cual el componente que
tenga mayor movilidad no supere una Rf = 0,6.

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CONCLUSIONES
Se conoci la tcnica de cromatografa y los factores que la
afectan, as como la efectividad de diferentes mezclas de
solventes para realizar la tcnica.
Con la cromatografa de columna se determin que
solventes son ms efectivos para realizar una separacin,
mientras que con la cromatografa en columna se pudo
apreciar la velocidad a la que eluyen los licopenos.
BIBLIOGRAFA
Brewter Ray Q. Curso de Qumica orgnica
experimental.
Editorial Altambra.Espaa 1974
Pgs. 43-48

Wilbert Adolfo Villegas Casares, Pablo Oscar Acereto


Escoffi, Mim Elizabet Vargas Quionez. Anlisis
Ultravioleta-visible. La Teora Y la Prctica en El
Ejercicio Profesional.
Pg. 3

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