6.

APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LOS HONGOS
Los objetivos de la ingeniería genética de levaduras y hongos filamentosos es investigar
aspectos de sus funciones biológicas y también para construir cepas para aplicaciones
biotecnológicas particulares.
Aunque la ingeniería genética esta también desarrollada solamente en unas pocas especies, se
puede desarrollar esta tecnología para la mayor parte de las especies.
Tabla 6.1 Productos y especies comercialmente importantes

Cada producto es una diana para mejorar su producción utilizando cepas modificadas
genéticamente, lo que está más avanzado en el caso de las enzimas y de los antibióticos.
Las levaduras tanto como los hongos filamentosos se utilizan como hospedadores para la
producción de proteínas heterólogas.
Para ser efectivo un sistemas de producción debe dar lugar a un rendimiento suficiente de la
proteínas (sea para la vialidad comercial como para proporcionar material de investigación) y la
proteínas debe ser autentica en sus propiedades, es decir que, lo más cercana posible a la
proteína obtenida de su fuente natural.
6.1 Producción de proteínas: la importancia de la secreción
La mayor parte de las enzimas que se pueden obtener comercialmente se excretan en los
organismos productores, aunque algunas enzimas importantes se extraen de la biomasa celular.
La principal ventaja de las enzimas que se excretan, en contraste con las intracelulares, es la
facilidad de purificar la enzima. Las enzimas que se excretan están normalmente bien plegadas
y son activas ya que esta es una función del sistema de control de calidad de la vía de secreción.

La mayor producción de enzimas intracelulares puede conducir a la acumulación de proteínas
incorrectamente plegadas y por tanto inactivas; o el propio proceso de extracción, que es caro,
puede inactivar una proporción de la proteína reduciendo así el rendimiento de la recuperación.
La vía secretoria también es el sitio de la glicosilación, que puede contribuir a la función o a la
estabilidad de algunas proteínas. Se produce la N-glicosilación (en asparraginas) y la Oglicosilación (en serinas o treoninas), existiendo a veces ambos tipos de glicosilación en la
misma proteína. La composición de los componentes del glicano de las glicoproteínas que se
excretan varía de acuerdo con la especie y la glicosilación de proteínas heterólogas será
diferente de acuerdo con el hospedador que las produce.
Si esto supone una dificultad en la práctica dependerá de la aplicación que se pretenda para la
enzima. Posiblemente la dificultad será más aguda si la proteína heteróloga se intenta que tenga
un uso terapéutico en humanos, ya que los glicanos de las proteínas humanas y de hongos tienen
diferente composición y su antigenicidad puede conducir a su rápida eliminación de la corriente
sanguínea. La actividad de la enzima por si no tiene porqué ser afectada por la alteración en la
glicosilación.
Es deseable pero no esencial, una alta capacidad secretora en el organismo productor. Aquellas
especies que naturalmente secretan un conjuntos de enzimas como parte de su estilo de vida
puede esperarse que sean sistemas de elección para uso como hospedadores para la producción
de proteínas heterólogas. Muchas especies de hongos filamentosos segregan enzimas para
degradar la materia orgánica polimérica, y en el laboratorio y a escala de cultivo comercial,
secretan sustancias prodigiosas de enzimas. No es sorprendente que los hongos filamentosos
sean la fuente de aproximadamente diez veces más enzimas comerciales homólogas que las
levaduras. Para la producción de proteínas heterólogas, sin embargo, tanto levaduras como
hongos filamentosos han sido desarrollados como hospedadores y cada sistema tiene sus
partidarios y sus detractores.
6.2 Proteínas heterólogas de levaduras
S. cerevisiae se utiliza ampliamente en la producción de pan y de alcohol, y es considerado un
microorganismo seguro. La facilidad de transferencia y de regulación/expresión de genes y su
amplia familiaridad lo hace a primera vista un organismo hospedador atractivo para la
producción de proteínas heterólogas diferentes. Se han producido un gran número de proteínas
heterólogas transfiriendo genes a S. cerevisiae y las proteínas se producen con rendimientos
suficientes como para su comercialización (como la albúmina sérica humana y la insulina
humana).
Dificultades principales. El primer problema es que muchas proteínas deseadas están
<<hiperglicosiladas>> es decir, que las cadenas de carbohidratos unidas a los N son
frecuentemente largas y de alto contenido en manosa, lo que no es una característica de los
glicanos humanos. Por otra parte la albumina sérica humana cuando se produce en levaduras no
es naturalmente glicosilada. El segundo problema es que el rendimiento de proteína secretada
frecuentemente es muy bajo.
Un conjunto de sistemas alternativos de expresión en levaduras han sido desarrollados para la
utilización de substratos baratos, fácilmente disponibles o para la secreción más eficiente de
proteínas.

Kluyveromyces lactis crecida sobre suelo rico en lactosa se utiliza comercialmente para la
producción de lactasa (β-galactosidasa) y el fuerte promotor inducible del gen que la codifica se
utiliza para dirigir la expresión de genes heterólogos.
La quimosina ha sido producida comercialmente a partir de K. lactis y también se han
producido varias otras proteínas con rendimientos en proteínas secretadas, descritas en la
literatura, generalmente mas altos que los de S. cerevisiae.
Dos levaduras que utilizan metanol, Pichia angusta y P. pastoris, poseen el fuerte promotor
inducible por metanol del gen de la metanol oxidasa que se utiliza para dirigir la expresión de
los genes que se introducen. Se han descrito unos rendimientos impresionantes de varias
heterólogas secretadas por ambas especies, particularmente cuando se obtienen en los
biorreactores altas densidades de células.
También, la hiperglicosilación parece no ser un problema principal en las proteínas que se
excretan en P. pastoris. Yarrowia lipolytica es poco corriente ya que es capaz de crecer sobre
hidrocarburos, aunque esta capacidad no ha sido explotada todavía mediante la provisión de
promotores que dirijan la expresión heteróloga de genes, si no que más bien se ha utilizado el
promotor regulado del gen que codifica la principal proteasa alcalina para dirigir la expresión,
aunque también hay disponibles otros promotores. Un amplio rango de proteínas se excretan
naturalmente por Y, lipolytica, a diferencia de otras levaduras, lo que indica una capacidad de
secreción bien desarrollada.
Las casetes de expresión utilizadas para la producción de proteínas heterólogas tienen varias
características interesantes. El gen extraño (generalmente un gen de cDNA para evitar la
posibilidad de que se produzca el procesamiento incorrecto de los intrones en el organismo
heterólogo) está flaqueado por un promotor y un terminador de levaduras. En general, se
prefiere un promotor derivado de la levadura huésped, aunque algunos promotores operan
efectivamente en diferentes especies (así, el promotor del gen PGK de S. cerevisiae, que
codifica la fosfoglicerolquinasa, se utiliza en K. lactis). Una secuencia peptídica corta,
denominada secuencia señal, en el extremo N-terminal de la proteína que se va a producir
constituye un requerimiento para la secreción de proteínas. El corte de la secuencia señal se
lleva a cabo en la célula por una endopeptidasa intracelular especifica al entrar la proteína en el
retículo endoplásmico (ER) que es el inicio del sistema de secreción en eucariotas. El sitio de
corte no es especifico de secuencia pero está gobernado primariamente por el tamaño y la
distribución de carga (generalmente una región N-terminal positiva y un cuerpo hidrofóbico) de
la secuencia señal. Se han expresado varias secuencias señal sintéticas, homologas y heterólogas
que funcionan con mucha eficacia. Resulta normal incluir una <<pro-secuencia>> corta después
de la secuencia señal y antes del extremo N-terminal de la proteína diana. Las pro-secuencias
están naturalmente presentes en muchas proteínas homologas secretadas y pueden ayudar en el
plegamiento. En S. cerevisiae se emplean frecuentemente la señal y la pro-secuencia de la
proteína que constituye el factor a de conjugación. Esta pro-secuencia termina en una pareja de
aminoácidos básicos, lisina-arginina y una endopeptidasa que está localizada en el aparato de
Golgi (Un orgánulo de la vía de secreción) corta después de la lisina-arginina liberando la
proteína diana madura con su secuencia N-terminal correcta. Esta endopeptidasa se denomina
Kex2p en S. cerevisiae y enzimas equivalentes se encuentran en otras levaduras y hongos
filamentosos.
Muchas proteínas heterólogas se producen con rendimientos que son demasiado bajos (para su
viabilidad comercial o experimental) o que son estructural y funcionalmente diferentes de la
proteína autentica. Las levaduras no son diferentes en este aspecto a otros sistemas de
expresión, y se han llevado a cabo modificaciones en los procedimientos normales a fin de

superar estas dificultades. La utilización de vectores que se replican con alto número de copias
puede resultar en la titulación de los factores de transcripción necesarios, de forma que resulten
limitantes. Esto sucede en S. cerevisiae con el promotor GAL1 inducible por galactosa.
Aumentando la expresión de la proteína reguladora asociada (Gal4p) se supera este efecto de
titulación.
Muchas de las limitaciones que conducen a bajos rendimientos de proteína secretada son posttraduccionales y relacionados con la vía de secreción o con degradación proteolítica. Por tanto
se han buscado mutantes deficientes en proteasas y lo contrario, se ha buscado el aumento de las
actividades proteolíticas específicas de la peptidasa de la señal y de la proteasa Kex2. Cada
enfoque ha mostrado ser prometedor sin que supere completamente las etapas limitantes que
bloquean la obtención de altos rendimientos. El plegamiento de las proteínas durante la
secreción ocurre dentro del RE y es asistido por proteínas chaperonas residentes. Otras
proteínas, denominadas foldasas catalizan también el plegamiento formando puentes disulfuro
dentro del RE. Una expresión mayor de las foldasas y de las chaperonas ha aumentado el
rendimiento de secreción de algunas, pero no de todas, las proteínas heterólogas de S. cerevisae.
Se ha llevado a cabo la mutagénesis de cepas para aumentar el rendimiento de proteínas
secretadas y en unos pocos casos se han localizado las mutaciones en genes determinados. Las
mutaciones descritas afectan a todos los aspectos, incluyendo la transcripción, la proteólisis y la
glicosilación. Aunque la mutagénesis continuara siendo utilizada para mejorar los rendimientos,
muchas mutaciones son recesivas y no se incorporan fácilmente en las cepas comerciales
poliploides que tiene múltiples de cada cromosoma. Por tanto, la manipulación dirigida supone
un enfoque complementario y valioso.
6.3 Proteínas heterólogas de hongos filamentosos.
Los vectores típicos de expresión en hongos no son muy diferentes de los que ya se han descrito
para levaduras. La principal diferencia es que los plásmidos nucleares de replicación autónoma
no son normalmente una opción con los hongos filamentosos comerciales, y todos los vectores,
con la excepción de los que se utilizan con propósito de investigación se diseñan para que se
integren en el genoma fúngico.
Como con los vectores de integración de levaduras la integración genómica del ADN
transformante proporciona una estabilidad añadida, aunque no necesariamente completa, pero es
esperable alguna incertidumbre acerca del nivel de expresión de los genes y un límite en el
número de copias de gen que pueden ser integrados. Desde el punto de vista práctico la
transformación de hongos produce cepas transformadas que difieren en el nivel de proteína
heteróloga producida. Una de las razones de las variaciones en la expresión génica al integrarse
el vector en el genoma es que algunas partes del genoma son más activas transcripcionalmente
que otras. Se pueden conseguir copias múltiples del ADN transformante mediante presión
selectiva y en A. niger, un ejemplo elegante es el uso del gen amdS de A. nidulans, descrito
anteriormente. Sin embargo no siempre es ventajoso aumentar el número de copias más allá de
cierto límite, ya que no supone ventajas en término de rendimiento de proteína. Por ejemplo,
más allá de unas 20 copias del promotor glaA de A. niger, se hacen limitantes los factores de
transcripción. Observaciones análogas han sido hechas en levaduras en las que la limitación se
supera aumentando la expresión de los factores de transcripción. Esta estrategia también
funciona en los hongos filamentosos.

A parte de la estrategia de la dosis génica que ya hemos descrito, la muta génesis de cepas que
producen proteínas y la búsqueda de los mutantes resultantes que originen una producción de
proteínas mejorada es otro método efectivo para la optimización de las cepas. Por supuesto que
la combinación de modificación genética dirigida (GM) con la muta génesis convencional para
la mejora de cepas proporciona un enfoque muy poderoso para la optimización de las cepas.
Dos estrategias adicionales basadas en (GM) se utilizan ahora rutinariamente. Los hongos que
más se utilizan comercialmente excretan proteasas que pueden degradar las proteínas
heterólogas que se producen. Por lo tanto una estrategia es utilizar cepas mutantes deficientes en
proteasas o bien cepas en las que hayan sido eliminados por interrupción génica o delección
génica genes específicos para proteasas. La segunda estrategia es emplear funciones génicas en
las que el gen diana se fusione corriente debajo de un gen que codifique una proteína
“portadora” que se excrete bien, como la glucoamilasa en A. niger o la celobiohidrolasa en
trichoderma reesei. Cuando esta táctica se utilizó para la producción de quimosina de ternero, la
quimosina que es una proteasa se cortaba así misma de la fusión quimosina-glucoamilasa en los
límites de la prosecuencia liberando una quimosina madura. Para la mayor parte de las proteínas
heterólogas este enfoque no es posible y se incluye un sitio en la unión de la fusión que será
cortada por una proteasa. El sitio empleado generalmente es la secuencia dibásica lisinaarginina, que es el sitio de corte para la proteasa kex2 en levaduras. Esta enzima funciona bien
en hongos filamentosos. La estrategia de la proteína de fusión parece aumentar el rendimiento
de la proteína que se excreta aumentando la estabilidad del mARN y facilitando el paso de la
proteína a través de la vía secretoria, aunque no se conoce cuál es el mecanismo.
La identificación de las etapas que limitan la obtención de un alto rendimiento de proteínas
secretadas, que tengan las actividades esperadas de la auténtica proteína, es la primera etapa
hacia la definición de estrategias para superar los problemas. Resulta claro que, como con la
expresión en levaduras, pueden unirse varios factores para producir un cuello de botella y que
su importancia relativa depende de la proteína heteróloga. Los genes extraños que utilizan
codones no frecuentes en hongos, la presencia de secuencias que desestabilizan el mRNA,
diferencias en el plegamiento o en las vías de secreción de las proteínas y la abundancia de
proteasas pueden todos ellos contribuir a los cuellos de botella observados.
Además aunque a diferencia de lo que ocurre en levaduras, la hiperglicosilación de proteínas
heterólogas no es un problema en los hongos filamentosos, puede todavía suponer una
dificultad. Además, los patrones de glicosilación difieren de los que se ven en las células de
mamífero, lo que puede ser importante para la producción terapéutica de proteínas. La
estructura del glicano en las glicoproteínas de hongos está siendo analizada y los genes que
codifican enzimas responsables del ensamblaje del glicano están siendo clonados, lo que
proporciona la posibilidad en el futuro de manipular la síntesis del glicano.
Los detalles esenciales de la vía secretoria en hongos filamentosos parecen ser cualitativamente
muy similares a los de los sistemas de levaduras, que han sido estudiados más extensamente.
Algunos de los genes que codifican chaperonas y foldasas han sido clonados así como los genes
que codifican proteínas implicas en el transporte de vesículas. Aunque no se ha descrito la
manipulación con éxito de la vía secretoria de proteínas utilizando estos genes, las herramientas
necesarias para hacerlo ya están disponibles.