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Pr ctica

II:
ESTUDIO

ES PECTROFOTOM TRICO
Y
ESP ECTROF LUORIMTRICO
E
LA
TRANSICIN
AL CALINA
DEL
CIT OCROMO C

Intro duccin

El c tocromo c humano,
es una pr otena que juega un doble pap el en diferentes
com partimentos
celulares . Por un a
parte,
transfiere electrones
en la ca dena
respiratoria mitocondrial y por otra
acta
como induct or de
la
apoptosis
en el
citoplasma. En el intervalo de pH de 1 a 12, el citocromo c oxidado
exhibe al m enos
cinc conformaciones diferentes debidas a cambios en los ligandos a xiales del grupo
hemo y/o al propio plegamiento de la protena.

La transicin alcalina del citocromo c


supone la
sustituci n de la metionina 80 como
ligando axial del grupo hemo por
una lisi na, fenmeno que puede se uirse
espe ctrofotomtricamente (observand o la banda
de absorc in a 699 nm) al registrar
espe ctros entr e 600 y 750 nm. El estudio de
este cambio estructural, que p odra

tener un efecto directo so bre la funci n de la protena se m uestra como ejemplo e las
mltiples aplicaciones de l as tcnicas espectrofotomtricas.

Figura 1. Esqu emas de


los ligando s del gru o hemo (parte
supe rior) y modelos
estru cturales (p arte inferi
r) del ferricitocromo c en el e tado
III (A ), en el estado
alcalino (estado IV) (B) y
n el estad o V o desplegado (C) (Tomado d e Perroud et al.

PNAS 2005, 102: 17570-1 7575),

La prctica

En sta prctic a, el obje ivo es determinar el pH al qu se


produ ce la tran sicin
alcalina de cito cromo c, realizando medidas de Absorbancia a 699 nm variando el pH
de la muestra problema.

Mate rial

Muestra de citocromo c de corazn de caballo a 300 M en tampn fosfato 5 mM a pH


6.5.

Disolucin ferricianuro 50 mM
Disolucin de NaOH 0.1M
Disolucin de HCl 0.2 M
Tir s indicadoras de pH

- Vidrios de reloj (para depositar trozos de 5 mm de tiras de pH) -Par afilm (mezclar
reactivos en la cubeta por inv ersin, no a gitar)

Proc edimiento

- Pro gramar el espectrofot metro en modalidad de espectro (scan), con un rango


entre 750 nm y 600 nm, una e scala en el eje Y (Absorbancia) entre 0 y 0.5 y mod lidad
OV ERLAY o SUPERPO SICIN DE ESPECTR OS (Tecla 6), para ir acumuland o
los disti tos espectros y visualizar as mejor la trans cin.

- Hacer un blan co muestr omitida (s in cit c) con 996 L d e tampn fosfato y 4 l de ferric
ianuro. Realizar un e s pectro entre 600 y 75 0 nm: TEC LA F1 (CO RRECCIN DE LNE A
DE BASE). De esta forma se s alva y alm acena este espectro c omo blanco para

que el espect rofotmetro lo sustra iga de la s medidas


posteriore s con mu estra
(cito cromo c).

- Par a mantener el citocro mo c totalm ente oxida do, aadir


la muestr a de citocro mo c
(pipe tear 996 en la cube ta reducid de plstico) 4 l de l a disoluci n de ferricia nuro, de
m anera que la concent acin final ser 200 M de ferric anuro y el volumen fin al de mue
stra 1mL. M ezclar la m uestra por inversin t apando con un Parafil m la cubeta.

- Registrar el e spectro de absorcin entre 600 750 nm ( OJO: UTILIZAR LA MISMA


CUBETA QUE PARA EL BLANCO!!!). A conti nuacin, teclear el bo tn de cursor y
desp lazarse co n l hasta = 699 nm. Medir A699 nm de la muestra probl ema a pH 6.5.

- Adicionar la c
ntidad de NaOH propuesta en la tabla a con tinuacin, comprobar el pH
y re

istrar de
uevo el e specto y lu ego la A69 9 nm de la muestra.

-Co mprobar q ue el pH es el corre cto pipete


ndo 4 l de la mue stra depositada
en l a cubeta sobre una tira indicad ora de pH . Evaluar visualmente con la
ama
de
colores
del indicador que el pH
es coherente. R ealizar
estas
comprobaciones slo a los valores de pH ind icados en la Tabla siguiente.

- Repetir el paso anterio a los pH: 7; 8; 9; 9.2; 9.4; 9.6 9.8; 10; 10.5; 11.

- Representar las absorbancias medidas frente al pH y determinar el pH al que


se produce la transicin alcalina.

-Realizar espectros de emisin de fluorescencia intrnseca del citocromo c a pH


6.5 y pH 11 para evaluar cambios conformacionales en la protena inducidos
por el pH (exc = 295 nm; em = 310-400 nm). El citocromo c de corazn de
caballo tiene 1 Trp y 4 Tyr.

Referencias

Perroud et al. PNAS USA 102, 49 (2005) 1757017575.

Garca-Heredia et al. Biochimica et Biophysica Acta 1797 (2010) 981993.

Folding of Horse Cytochrome c in the reduced state. Bhuyan A.K. y

Udgaonkar, J.B. Journal of Molecular Biology 312 (2001) 1135-1160.