BIOTRANSFORMACIN

CARLOS MRQUEZ 2122519

JUAN CAMILO CHAPARRO 2124667
CRISTIAN VARGAS VSQUEZ 2114653
ALEXANDRA ACEVEDO CASELLES 2122550
OSCAR ANDRS RONDN ESTUPIAN 2122514

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE INGENIERAS FISICOQUMICAS
REA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2015

BIOTRANSFORMACIN

CARLOS MRQUEZ 2122519

JUAN CAMILO CHAPARRO 2124667
CRISTIAN VARGAS VSQUEZ 2114653
ALEXANDRA ACEVEDO CASELLES 2122550
OSCAR ANDRS RONDN ESTUPIAN 2122514

MONOGRAFA
PERTENECIENTE AL SEGUNDO PERIODO ACADMICO DE 2014
SEMINARIO DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

Docente
MABEL JULIANA QUINTERO SILVA

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE INGENIERAS FISICOQUMICAS
REA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2015

NDICE GENERAL
1. INTRODUCCION
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GENERAL
2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS
3. MARCO TERICO
3.1. HISTORIA DE LA BIOTRANSFORMACIN
3.2. QU ES LA BIOTRANSFORMACIN?
3.3. VENTAJAS DE LA BIOTRANSFORMACIN
3.4. METODOS DE BIOTRANSFORMACIN
3.5. USOS DE LA BIOTRANSFORMACIN
4. ARTCULO
4.1. INTRODUCCIN
4.2. MATERIALES Y METODOS
4.3. RESULTADO Y DISCUSIN
4.4. CONCLUSIONES
5. CONCLUSIONES
6. BIBLIOGRAFA

1. INTRODUCCIN
El presente escrito hace referencia de manera general a la biotransformacin, que se puede
definir como el proceso por en que una sustancia se transforma en otra mediante una reaccin o
un conjunto de reacciones. La principal caracterstica de este proceso es su sostenibilidad, debido
a que en principio satisface las necesidades actuales de las industrias y la sociedad, sin generar
con su aplicacin graves consecuencias al medio ambiente.
Actualmente, la industria qumica est aprovechando la capacidad presente en los agentes
biolgicos, de modificar qumicamente compuestos orgnicos de manera especfica, como
sucede con los microorganismos, a diferencia de los comnmente utilizados catalizadores
sintticos que hacen de la biotransformacin una forma atractiva a la hora de trabajar en la
produccin industrial. Sumado a esto se encuentra la capacidad de reutilizacin, puesto que una
vez empleados en una reaccin qumica, pueden seguir trabajando en ms de un ciclo sin
necesidad de ser reemplazados, junto con esto viene la ayuda ambiental que aporta la
implementacin de estos elementos en la fabricacin de alimentos, medicamentos y productos
qumicos tiles a la humanidad.
Es evidente que este tipo de transformaciones no son cuestiones del hoy, la historia nos ha
mostrado que la manipulacin de procesos qumicos por medio de agentes biolgicos es una
actividad bastante antigua, aun as, fue hasta el siglo pasado que la biotransformacin tuvo una
repercusin notable a nivel industrial y empieza a ser tomada como una alternativa.
El trabajo se realiz con el objetivo de indagar y conocer una de las diferentes aplicaciones de la
microbiologa en la industria, esto permiti identificar la gran importancia en donde los
microorganismos son los principales agentes para el desarrollo de procesos qumicos, mdicos,
farmacutica, industria de alimentos, etc.

2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL
Aprovechar el potencial presente en los microorganismos como entidades biolgicas capaces de
acelerar reacciones qumicas con gran utilidad y aporte en la industria de los alimentos, salud y
dems.
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Gestionar informacin sobre procesos qumicos que implementen la biotransformacin como
herramienta de produccin con miras a una industrial con intereses en el bienestar social.
Investigar y conocer lo favorable y as mismo desfavorable de la biotransformacin de alimentos
con soporte en el artculo a estudiar y las clases recibidas sobre microorganismos.
Profundizar conocimientos adquiridos en microbiologa, acerca de la capacidad que puede
presentar un microorganismo en la industria a la hora de llevar en marcha la realizacin de una
reaccin qumica de inters comercial.

3. MARCO TEORICO.
3.1 HISTORIA DE LA BIOTRANSFORMACIN.
A lo largo de la historia se han venido desarrollando procesos biotecnolgicos que han llevado a
la innovacin del mundo a travs de muchas industrias y esto se ha logrado debido al sin nmero
de descubrimientos de siglos pasados, la biotransformacin no es la excepcin en la historia de
estos procesos.
En la dcada de los 30 Ernest Alexander Sym, bioqumico polaco, trabaj en procesos de
sntesis orgnica catalizada por lipasas en medios orgnicos, siendo la lipasa una enzima
utilizada en el organismo que cumple funcin de desintegrar las grasas de los alimentos para as
poderlos digerir.
Siguiendo en la historia, en la dcada de los 50 se llegaron a descubrir enzimas y mtodos
utilizados para la biotransformacin de frmacos, y se trabaj en los fenmenos de induccin e
inhibicin metablica, los cuales llevaron a que en la dcada de los 60 se investigara sobre el
efecto que los frmacos causaban en el metabolismo, tomando as gran importancia la
farmacocintica, siendo la rama de la farmacologa que estudia estos sucesos en el organismo.
La dcada de los 70 no fue la excepcin para ms descubrimientos a nivel farmacolgico, donde
se estudiaron los modelos de eliminacin heptica, es decir la expulsin de los frmacos del
organismo a travs del rin. Al igual se estudi el polimorfismo gentico, se conocieron las
isoformas especficas de las enzimas o tambin llamadas isoenzimas y se estudiaron los
medicamentos marcadores del funcionamiento heptico que son los utilizados para evaluar
lesiones, infecciones e inflamacin del hgado.
Es evidente que este tipo de transformaciones no son cuestiones del hoy, la historia nos ha
mostrado que la manipulacin de procesos qumicos por medio de agentes biolgicos es una
actividad bastante antigua, aun as, fue hasta el siglo pasado que la biotransformacin tuvo una
repercusin notable a nivel industrial y empieza a ser tomada como una alternativa.

3.2 QU ES LA BIOTRANSFORMACIN?
La Biotransformacin es una serie de reacciones qumicas catalizadas por clulas microbianas
(de cultivo o en reposo) o enzimas aisladas de microorganismos, que se lleva a cabo con el
propsito de obtener un compuesto de mayor actividad biolgica y valor agregado como
biopolmeros, nutracuticos u otro producto qumico.
En general, un proceso industrial puede realizarse por sntesis qumica o por bioconversin. Los
microorganismos tienen la capacidad de modificar qumicamente una amplia variedad de
compuestos orgnicos de una forma muy especfica. Un compuesto orgnico es modificado en
una o varias reacciones sencillas que forman parte de procesos biolgicos. Estos procesos
catalizados por enzimas en la industria son cada da ms numerosos, ya que presentan ventajas
frente a los catalizadores no biolgicos y por esta razn, son ms lucrativos.

3.3 CARACTERSTICAS.
VENTAJAS
-

Especificidad del substrato: Es natural de una enzima catalizar especficamente solo

una etapa de la reaccin.
Especificidad del sitio: Se afectar especficamente solo un sitio en la molcula,
teniendo en cuenta que sta puede presentar varios grupos funcionales.
Condiciones de reaccin: las reacciones enzimticas no causan la destruccin de los
substratos sensibles debido a las suaves condiciones de conversin. Varias reacciones
pueden ser combinadas bien en una etapa de transformacin utilizando un
microorganismo con un adecuado sistema de enzimas o mediante conversiones escaladas
utilizando diferentes microorganismos.

DESVENTAJAS
-

Requieren parmetros operacionales muy estrechos.

Presentan su mayor actividad en medios acuosos.
Pueden sufrir procesos de inhibicin.
Necesidad de purificacin de la enzima para eliminar sitios activos no deseados.
Velocidades de reaccin menores a las deseadas.
Estabilidad pobre a largo plazo.
Se requiere grandes cantidades de enzimas.

3.4 MTODOS DE BIOTRANSFORMACIN.

-

Biotransformaciones realizadas por clulas en suspensin.

Se puede suministrar el sustrato directamente al medio de cultivo.
Los microorganismos se hacen crecer de manera exponencial para obtener la
mxima cantidad de biomasa antes de aadir el sustrato.
Resulta ms econmica que otros mtodos debido a que no exige la compra de
material de soporte para clulas inmovilizadas.
Biotransformaciones realizadas por clulas inmovilizadas.
Evita producir daos a las clulas de cultivo por accin de agitacin en un reactor.
Las clulas de cultivo son utilizadas como verdaderos biocatalizadores.
Facilita la extraccin del producto de inters del biocatalizador y reciclar el medio
empleado para la reaccin (biomasa).
La implementacin del mtodo permite alta concentracin de biomasa por un
largo periodo de tiempo lo que aumenta la productividad del proceso.
Biotransformacin por combinaciones enzimticas.
Debido a que las enzimas realizan modificaciones altamente especificas en el
lugar de accin. Se puede obtener mejores resultados con la implementacin de
este mtodo en comparacin a otros.
El mtodo se utiliza para evitar reacciones indeseadas ya que otros procesos
pueden metabolizar el sustrato de diferentes maneras produciendo mezclas

complejas de productos con rendimientos variados. Permiten incrementar la

velocidad de reaccin.
3.5 USOS DE LA BIOTRANSFORMACIN
A continuacin se presentarn algunos resmenes tomados de los artculos consultados en las
bases de datos de la universidad para el trabajo, con los que se busca mostrar las aplicaciones que
presenta la biotransformacin en la industria.
-

INDUSTRIA AGROQUIMICA

BIOTRANSFORMACIN DE BENCENO Y TOLUENO A CATECOLES POR FENOL

HIDROXILASA ARTHROBACTER.
En la industria se vive en constante bsqueda de nuevas alternativas para llevar a cabo un
proceso como es el caso de la biotransformacin por hidroxilacin de compuestos aromticos
para la produccin de ingredientes agroqumicos y farmacuticos ya que es difcil lograr esto por
reacciones de qumica orgnica, debido al uso de agresivo reactivos, materiales de partida caros
y complicados, uso intensivo de energa, y los bajos rendimientos.
El fenol hidroxilasa gen microorganismo de ingeniera (PHIND) fue utilizado para sintetizar
catecoles de benceno y tolueno mediante reaccin de hidroxilacin sucesiva. Por cromatografa
de liquida de alta eficacia (HPLC) y anlisis por espectrometra de resonancia magntica nuclear
(1H RMN) demostraron que los productos de biotransformacin fueron los catecoles
correspondientes a travs de la produccin intermedia de fenoles. El resultado de la
biotransformacin indic que los principales productos de la oxidacin de tolueno eran o-cresol
y pcresol. 3-metilcatecol fue el producto predominante para la biotransformacin m-cresol que es
derivado de fenol, el cual proviene la monooxidacion del benceno. Con los resultado obtenidos
que sugiri que hidroxilasa fenol podra ser utilizado con xito para transformar tanto el benceno
y el tolueno para catecoles por sucesivos hidroxilacin.
La produccin de catecoles para la industria es de mucha importancia debido a que son
intermedios importantes para la sntesis de sabores, productos farmacuticos, productos
agroqumicos, antioxidacin, antihipertensivos, y polmeros. Por lo tanto, es crtico para buscar
las alternativas de mtodos qumicos para sintetizar estos importantes productos intermedios
industriales.
-

INDUSTRIA DE LA SALUD

PRODUCCIN DE UN AGENTE ANTI-CNCER USANDO BIOTRANSFORMACIN

MICROBIANA.
La biotransformacin microbiana es un gran sistema modelo para producir drogas y compuestos
biolgicamente activos. En este estudio, hemos dilucidado la fermentacin y la produccin de un
agente anti-cncer a partir de un proceso para la hidroxilacin microbiana regioespecfica de
resveratrol. Entre las cepas examinadas, una potente cepa mostr alta actividad de hidroxilacin
regioespecfica para producir piceatannol. En un 5 L (w/v 3L) de fermentacin tarro, este tipo
salvaje Streptomyces sp. en el sistema de lotes producidos 205 mg de piceatannol (es decir, 60%

rendimiento) de 342 mg de resveratrol en 20 h. Uso del producto, un estudio de anti-cncer in

vitro se realiz contra una lnea celular de cncer humano (HeLa). Se demostr que la
biotransformacin de piceatannol posea una actividad anticancergena significativa. Este
resultado demuestra que un mtodo de cribado biotransformacin podra ser de inters
teraputico con respecto a la identificacin de frmacos contra el cncer.
-

INDUSTRIA FARMACUTICA

BIOTRANSFORMACIN MICROBIANA: UNA HERRAMIENTA PARA EL DISEO DE

FRMACOS.
En el campo de la investigacin y desarrollo farmacutico, los estudios de la biotransformacin
se han aplicado ampliamente para investigar el metabolismo de los compuestos utilizando
modelos animales. Es decir, se estn haciendo comparaciones de las rutas metablicas de los
medicamentos en estos modelos animales (metabolismo de los mamferos) y, se estn aislando
metabolitos de inters descubiertos en estos procesos para evaluar su posible uso. La
biotransformacin es clave para la evaluacin de los parmetros clnicos de los frmacos, como
la biodisponibilidad de los mismos.
Cuando se estudi el metabolismo de frmacos, la biotransformacin microbiana ofreci varias
ventajas en comparacin con el metabolismo de los mamferos, algunas de ellas fueron las
siguientes:
1. Un mantenimiento simple y barato de cultivos microbianos en comparacin con cultivos de
clulas o de tejidos o animales de laboratorio.
2. Un proceso de seleccin fcil y repetitiva en el que diferentes cepas se utilizan para
metabolizar el frmaco.
3. Metabolitos novedosos menos txicos en comparacin con la molcula original.
4. Condiciones suaves de reaccin y ecolgicamente inofensivos (presin normal, baja
temperatura, pH neutro) para la sostenibilidad.
Con todo y lo anterior, se han reportado un gran nmero de biotransformaciones microbianas
junto con los beneficios adicionales que conllevan para la industria farmacutica en particular.
Esto ha conducido a que se apoye de una forma significativa la investigacin en
biotransformacin de medicamentos nuevos y complejos, que a futuro contribuir a la mejora en
el descubrimiento de frmacos y el diseo en trminos de costo, efectividad, proteccin medio
ambiental y diversidad estructural en comparacin con los modelos animales utilizados para
estudiar el metabolismo.
Es justo decir que, la biotransformacin, sin duda, es una gran oportunidad de solucin a los
grandes problemas econmicos y financieros que enfrentan las industrias farmacuticas en
relacin con el descubrimiento y sntesis de nuevas molculas que tengan ciertas caractersticas
deseadas para lanzarse como un medicamento activo en el mercado.

INDUSTRIA QUMICA

BIOTRANSFORMCIN DE TERPENOS POR UN HONGO AMAZNICO DE LAS

PLANTAS CTRICAS.
A forma de investigacin, se hicieron las biotransformaciones de linalool, citronelol y sabineno
con hongos aislados del epicarpio de los frutos del gnero Citrus de la selva amaznica. El
citronelol es un alcohol monoterpnico, con grandes aplicaciones en la industria alimentaria, en
la perfumera y la cosmtica, as como en la medicina tradicional, como compuesto de partida
para la sntesis qumica de otros compuestos. El Linalool es un terpeno con un grupo alcohol
cuya forma natural es comn en muchas flores y plantas aromticas. Su olor floral con un toque
mentolado le ha conferido cierto valor para su uso en productos aromticos. El Sabineno es uno
de los compuestos qumicos que contribuyen al sabor picante de la pimienta negra y es un
importante componente del aceite de semilla de zanahoria.
A partir de las biotransformaciones que se hicieron, se obtuvieron diferentes productos en
funcin de la clase de hongos y sustratos utilizados. Las biotransformaciones tuvieron
rendimientos apreciables y los productos obtenidos tienen grandes aplicaciones en la industria
qumica, alimentaria y farmacutica.
-

INDUSTRIA DEL MEDIO AMBIENTE

BIOTRANSFORMACIN DE PROGESTERONA Y NORGESTREL POR DOS

MICROALGAS DE AGUA DULCE (OBLICUO SCENEDESMUS Y CHLORELLA
PYRENOIDOSA): CINTICA Y PRODUCTOS DE TRANSFORMACIN DE
IDENTIFICACIN.
Hormonas esteroides naturales y sintticas tales como la progesterona y el norgestrel presentes
en medios acuticos pueden causar efectos adversos en los organismos vivientes en estas zonas.
Este estudio investig la biotransformacin de la progesterona y el norgestrel en soluciones
acuosas por dos microalgas de agua dulce y sus mecanismos de transformacin. Ms del 95% de
la progesterona fue transformada por los dos microalgas dentro en 5 das. Para norgestrel, la
transformacin casi completa se observ despus de 5 das. Los resultados tambin mostraron
que estos dos compuestos no se acumulan en las clulas de algas. Se encontr que la
Biotransformacin era el principal mecanismo para su degradacin en las soluciones acuosas, y
se sigui el modelo establecido. Para la progesterona, hubo tres productos principales de
transformacin. Para norgestrel, slo dos productos de transformacin se identificaron. Se
proponen hidroxilacin, reduccin y oxidacin como las principales vas de transformacin.
Entre las dos especies de microalgas, S. oblicuo se encontr ms eficaz en la transformacin de
los dos compuestos que C. pyrenoidosa. Los resultados demostraron claramente la capacidad de
los dos microalgas para transformar los dos progestgenos. La biotransformacin y productos
podran tener implicaciones ambientales significativas en el destino y los efectos de los dos
esteroides.

4 ARTICULO.

ANLISIS DEL ARTCULO

Se decidi trabajar con un artculo relacionado al campo de la industria alimentaria y de la salud,
por eso se escogi el artculo Incrementar el potencial quimiopreventivo del jugo de naranja
por biotransformacin enzimtica. Escrito y supervisado por, Lvia Rosas Ferreira, Juliana
Alves Macedo, Marcelo Lima Ribeiro y Gabriela Alves Macedo.

4.1 INTRODUCCIN
El jugo de naranja es una de las bebidas a base de frutas ms consumidas en todo el mundo, y en
los ltimos aos se ha incrementado dramticamente su demanda, sobretodo la del jugo
concentrado de naranja, el cual tiene mltiples beneficios para la salud. Brasil es uno de los
pases que tiene mayor participacin en el mercado del jugo concentrado de naranja, acaparando
alrededor de un 53% de la produccin mundial de este alimento. Ahora bien, muchos
consumidores son cada vez ms conscientes de los problemas de salud relacionados con la dieta,
por ello estn optando por incluir muchos ms ingredientes naturales en lo que ingieren, pues
esperan que sean ms seguros y que favorezcan la salud.
De acuerdo a la literatura, se sabe que la alta capacidad antioxidante del jugo de naranja se debe
principalmente a la presencia de la vitamina C y los compuestos fenlicos (polifenoles). Adems,
recientes estudios demostraron que el jugo de naranja concentrado tiene un contenido de
flavonoides (compuestos fenlicos) mayor al jugo fresco normal. Los polifenoles estn
recibiendo un creciente inters por parte de los consumidores y los fabricantes de alimentos por
mltiples razones. Las investigaciones mdicas han sugerido asociaciones entre el consumo de
alimentos o bebidas ricas en polifenoles y una disminucin del riesgo de enfermedades
cardiovasculares y ciertos tipos de cncer. Asimismo, estos compuestos tienen aplicaciones en la
preservacin de los alimentos debido a su capacidad para proteger contra la peroxidacin de los
alimentos sensibles al oxgeno. Los polifenoles son los compuestos con capacidad antioxidante
ms abundantes de nuestra dieta. Sin embargo, la estructura molecular de estos compuestos
afecta a sus propiedades biolgicas.
La mayora de los compuestos fenlicos que se encuentran en las plantas se conjugan con
azcares como glucsidos. Esta combinacin reduce su capacidad de funcionar como buenos
antioxidantes y esto tiene implicaciones directas en la disminucin de la funcionalidad en la
salud cuando estos compuestos fenlicos se ingieren como alimento o como nutracuticos y
dependen de la actividad enzimtica microbiana. Por lo tanto, si los compuestos fenlicos libres
se sacan de sus glucsidos, la capacidad antioxidante y, por tanto, la funcionalidad en la salud, de
estos fitoqumicos, podra mejorarse.
Por otro lado, las hidrolasas acilo tanino, conocidas como tanasas, se obtienen a partir de fuentes
vegetales, animales y microbianas, siendo esta ultima la ms importante, ya que las enzimas
producidas por va microbiana son ms estables que las que se obtienen por otras fuentes.
Existen varias aplicaciones para la tanasa en las industrias de alimentos, jugos, cerveza,
cosmticos, farmacuticos y qumicos, sin embargo, debido a los altos costos de produccin y el

conocimiento limitado de su accin cataltica, actualmente slo hay unas pocas aplicaciones. Las
Tanasas se han caracterizado mayormente por su actividad en polifenoles complejos y son
capaces de hidrolizar el enlace ster y el enlace Dpsido de sustratos tales como el cido tnico,
galato de epicatequina y galato de epigalocatequina.
Los investigadores Battestin, Macedo, y De Freitas, estudiaron en 2008 la tanasa de
Paecilomyces variotti, que mediaba la hidrlisis del polifenol del t verde (galato de
epigalocatequina) y generaron epicatequina y cido glico. Esto tuvo como resultado un aumento
de la actividad antioxidante del extracto de t despus de la reaccin enzimtica.
Teniendo en cuenta estos datos, los investigadores que realizaron el artculo, obtuvieron la tanasa
de P. variotti y la aplicaron en el estudio con el fin de biotransformar los polifenoles del jugo de
naranja y, de esta manera, modificar de su actividad biolgica. Es por ello, que la investigacin
llevada a cabo en este artculo es de suma importancia para la industria de alimentos y de salud,
especialmente para la brasilea.

4.2 MATERIALES Y MTODOS.

Materiales
Para llevar a cabo el estudio, se necesitaron de los siguientes compuestos principalmente:
-Enzimas comerciales: Naringinasa.
-Flavonoides: Hesperidin, Naringina.
-Compuestos cidos: cido tnico, cido glico, cido tricloroactico.
-Otros compuestos orgnicos: 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) y buffers especficos.
-Jugo de naranja concentrado
Los dems compuestos, utilizados en los procedimientos de anlisis, fueron conseguidos segn
su disponibilidad en el mercado. El microorganismo utilizado fue el P. variotii miembro del Filo
Ascomycota. Es un moho ambiental comn normalmente encontrado en alimentos, la madera, el
suelo y el polvo de la alfombra. Las colonias son generalmente planas, inicialmente su color es
blanco pero cambia con el tiempo hasta tornarse amarillo o marrn.
Enzimas principales
La Tanasa fue aislada del microorganismo P. variotii usando un procedimiento publicado
anteriormente para su extraccin [1]. En donde, un matraz cnico, previamente esterilizado, se
utiliz para el proceso de fermentacin del moho. Los matraces se inocularon con esporas y se
incubaron por 120 h. Despus de la fermentacin, se les aadi 80ml de buffer para mantener
estable el pH de las disoluciones mientras se agitaban por 1h. La solucin resultante se filtr y
centrifug obtenindose un sobrenadante que se trat con sulfato amnico slido y se incub
durante la noche a 4C. El precipitado se recogi por centrifugacin, se re-suspendi en agua
destilada y se dializ durante 48 h frente a agua destilada. La preparacin dializada se liofiliz y
se utiliz como un extracto semi-purificado de tanasa.
La actividad biolgica de la tanasa se ensay para comprobar la eficacia del proceso anterior [2].
Entonces, el sustrato que se us fue una solucin de cido tnico en un buffer. La reaccin se

hizo adicionando 0.3 ml de solucin de sustrato a 0.5 ml del extracto semi-purificado de tanasa,
luego se incub por 10 min. Despus de la incubacin, la reaccin se detuvo mediante la adicin
de 3 ml de una solucin de albmina de suero bovino (nutriente). Luego de esto, la solucin total
se filtr y centrifug por 15 min a 4 C.
El precipitado se disolvi en 3 ml de SDS-trietanolamina y 1 ml de reactivo aadido FeCl3 para
estabilizar el color de la solucin. La absorbancia se midi a 530 nm y la actividad de la enzima
se calcul a partir del cambio de absorbancia. [3]
La actividad de la naringinasa comercial se ensay como prueba [4]. Entonces, el medio de
reaccin consisti en 0,9 ml de solucin de naringina en un buffer y 0,1 ml de solucin de
naringinasa comercial en el mismo buffer. La reaccin se produjo a 40 C y 30 min. Despus de
eso, se tom una pequea muestra de la solucin a la cual se le aadi 0,1 ml de hidrxido de
sodio y 0.5 ml de dietilenglicol y la absorbancia (420 nm) de las soluciones se midi despus de
20 min a temperatura ambiente
Biotransformacin enzimtica
El jugo de naranja concentrado y las muestras de control comerciales (hesperidina y naringina)
se utilizaron como sustratos para la hidrlisis enzimtica dada por la tanasa aislada de P. variotii.
El jugo de naranja concentrado se disolvi en un buffer con una proporcin de 1 g por 5 ml de:
buffer de fosfato para la reaccin de tanasa, y buffer de acetato para la reaccin de naringinasa.
Despus de eso, 1 ml de la solucin de jugo concentrado se incub con 5,0 U de tanasa y 0,85 U
de naringinasa a 40 C durante 60 min. El proceso de hidrlisis se detuvo mediante la
colocacin de la reaccin en un bao de hielo durante 15 min. Igualmente, las muestras de
hesperidina y naringina se disolvieron en 1 ml de buffer de fosfato y se incubaron con 5 mg de
tanasa a 40 C durante 60 min. El proceso de hidrlisis se detuvo mediante la colocacin de la
reaccin en un bao de hielo durante 15 min. Los polifenoles biotransformados se utilizaron para
el ensayo de antioxidante despus de la dilucin adecuada con el mismo buffer de fosfato para
ORAC y con una solucin de metanol 70% para DPPH.
Anlisis del polifenol del jugo de naranja
Los productos de biotransformacin de los polifenoles comerciales purificados, hesperidina y
naringina, se analizaron por cromatografa lquida de alta eficacia (CLAE-DAD) y por el
espectrmetro de masas. El jugo de naranja biotransformado se evalu igualmente mediante una
cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC). Las muestras biotransformadas de naringina y
hesperidina se disolvieron en metanol y agua, y luego se filtraron. Posteriormente, el jugo de
naranja biotransformado se centrifug y una parte del sobrenadante se disolvi con agua y se
filtr.

HPLC (CLAE-DAD)

La cromatografa lquida de alta eficacia o high performance liquid chromatography (HPLC) es

un tipo de cromatografa en columna utilizada frecuentemente en bioqumica y qumica analtica.
Es una tcnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en diferentes
tipos de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatogrfica.
El sistema utilizado para hacer la cromatografa se mantuvo a 30C mediante un termostato. Los
espectros se obtuvieron a 190 y 480 nm y los cromatogramas procesaban a 280 nm.
Espectrmetro de masas
Un espectrmetro de masa se utiliz para hacer un anlisis de huellas peptdicas (ESI-MS), que
es una tcnica analtica de identificacin de protenas. De esta forma, se obtuvieron unos
espectros de masas acumulador por ms de 60 s.
Potencial bioactivo de los polifenoles del jugo de naranja biotransformados
DPPH ensayo anti-oxidante
El potencial de actividad antioxidante del jugo de naranja se evalu en base a la actividad de
captacin del compuesto 1,1-difenil-2- picrylhydrazyl (DPPH) de radicales libres. Las
mediciones se realizaron por triplicado, y la actividad anti-radicales se calcul utilizando la
ecuacin de regresin lineal determinada por el trazado de la actividad anti-radical de soluciones
de Trolox (antioxidante) para concentraciones conocidas.
Ensayo antioxidante ORAC
El mtodo ORAC consiste en medir la disminucin en la fluorescencia de una protena como
resultado de la prdida de su conformacin cuando sufre dao oxidativo causado por una fuente
de radicales perxido (ROO). El mtodo mide la capacidad de los antioxidantes en la muestra
para proteger la protena del dao oxidativo. Los ensayos ORAC se realizaron con fluorescena
(FL) como la sonda fluorescente, en un lector de microplacas con filtros de fluorescencia. La
reaccin se realiz a 37 C, siendo que fue iniciada por la descomposicin trmica de AAPH en
un buffer de fosfato debido a la sensibilidad de FL al pH. Los valores ORAC se definieron como
la diferencia entre el rea bajo la curva de decaimiento de FL y el espacio en blanco (AUC neto).
Se calcularon las ecuaciones de regresin entre AUC neta y la concentracin de antioxidante para
todas las muestras. Se realiz un control de tanasa, y el valor ORAC obtenido se sustrado de las
muestras tratadas con la enzima.
El cultivo y el mantenimiento de la clula
La lnea celular del adenocarcinoma del colon humano de grado II, HT29, y la lnea celular de
carcinoma hepatocelular de hgado humano, HepG2, se compraron en el Ro de Janeiro Cell
Bank, RJ, Brasil. Las otras lneas de clulas tumorales humanas de panel antiproliferativo
(glioma, rin, pulmn, prstata, ovario y colon) son de un centro de investigacin (CPQBAUNICAMP). Las clulas se cultivaron en un tarrito (DMEM) suplementado con 5% de suero
bovino fetal y se mantuvieron a 37 C y 5% de CO2-95% de aire humidificado.
Ensayo de proliferacin celular.

96 placas de cultivo se inocularon con dos lneas celulares humanas, HepG2 y HT29. El mismo
proceso se aplic a las lneas celulares del panel antiproliferativo. Tras una incubacin de 24 h,
se lavaron las clulas adheridas con una solucin buffereada de fosfato y las clulas fueron
incubadas en un DMEM que contenia una solucin de jugo de naranja sin modificar o se poda
usar hesperidina y naringina. Despus ser incubados a 37 C durante 48 h, los cultivos se
ensayaron para detectar los efectos de los compuestos ensayados sobre la proliferacin celular.
La proliferacin celular se midi usando un ensayo de prueba [5]. Dicho brevemente, los cultivos
de clulas se fijaron con un cido y se incubaron. Luego, se lavaron las placas repetidas veces y
se secaron. Se aadi un compuesto (sulforrodamina B) para hacer una tincin que se solubiliz
con un buffer de Tris, y las densidades pticas fueron ledas a una sola longitud de onda de 515
nm usando un lector de placas espectrofotomtrico.

4.3 RESULTADOS Y DISCUSIN.

Biotransformacin enzimtica

Fig. 1. cromatogramas de CLAE de la tanasa de reaccin a 60 min a 40 C de:

(A) Muestra de Hesperidin con extracto de tanasa

(B) Se muestra el control de hesperetin formado.
Mediante las pruebas, se demostr la capacidad de la tanasa para catalizar la biotransformacin
de los polifenoles ctricos, hesperidin y naringina. La Fig. 1 presenta el cromatograma obtenido
para el control hesperidina (A) y para la reaccin de extracto de tanasa semi-purificada con
hesperidin (B).
Si se observa la Fig. 1 se puede ver que surge un segundo compuesto (hesperetin) despus de un
tiempo de reaccin entre la tanasa y el hesperidin. El Hesperidin es una molcula de hesperetin
con un disacrido unido en la posicin C7. Una hidrlisis de hesperidin conducira a la
formacin de hesperetin. Para confirmar la identidad, los productos de reaccin se analizaron con
un espectrmetro de masas (ESI-MS). En la fig. 2. Se presentan los espectros obtenidos para los
controles de hesperidin y hesperetin, generados por la reaccin de biotransformacin.

Fig. 2. Espectro de masas de la reaccin a 40 C y pH 7,4.

(A) Se muestra el control de hesperidin
(B) Reaccin de Hesperidin con extracto de tanasa, lo que demuestra la formacin de
hesperetin;
(C) Se muestra el control del hesperetin.
El espectro de masas obtenidos para el hesperidin en reaccin con el extracto de tanasa semipurificado (Fig. 2B), presenta la apariencia del compuesto con un m / z de 301,04, que coincide
con el m / z del hesperetin bajo las mismas condiciones (Fig. 2C).
La naringina, as como la hesperidina, tiene un disacrido unido a la aglicona por medio de un
enlace glucosdico en C7. La Fig. 3 presenta los cromatogramas obtenidos para la naringina
estndar (A) y para la reaccin de naringina con el extracto de tanasa semi-purificado de P.
variotti (B).

Fig. 3. cromatogramas de CLAE de la tanasa de reaccin.

(A) Muestra naringina con extracto de tanasa y espectro de absorbancia del producto de
reaccin.
(B) Se muestra el control de Naringenina.
Si se observa la Fig. 3B, un compuesto emerge, se deduce que fue generado por la reaccin de la
naringina con el extracto semi-purificado de tanasa. Si se comparan las grficas, hay una fuerte
indicacin de que el producto generado es naringenina. Para confirmar la identidad del producto
obtenido en la reaccin, se evaluaron las muestras en un espectrofotmetro de masas (ESI-MS).
Los espectros de masas obtenidos para la naringina, y para la naringina que reacciona con el
extracto de tanasa de P. variotii, estn representados en la Fig. 4, respectivamente.

Fig. 4. Espectro de masas de la reaccin a 40 C y pH 7,4

(A) Se muestra el control de naringina
(B) Reaccin de naringina con extracto de tanasa, lo que demuestra la formacin de
naringenina
(C) Se muestra el control naringenina.
El anlisis de los productos de la reaccin del extracto tanasa semi-purificada con naringina (Fig.
4B) presenta la formacin de un producto que muy posiblemente es naringenina si se comparan
las grficas. Ya que se confirm esto, se demostr la capacidad de la tanasa para actuar en
compuestos fenlicos representativos del jugo de naranja, as que lo siguiente que hicieron los
investigadores fue aplicar la enzima en la biotransformacin de la matriz del alimento complejo,
es decir, directamente al jugo de naranja concentrado.
Con el propsito de comparar, la fig. 5 muestra el perfil cromatogrfico de la composicin
general en polifenoles para la muestra de jugo de naranja sin biotransformacin (A) y para las
muestras tratadas con el extracto de tanasa semi-purificada (B), as como para la muestra tratada
con naringinasa comercial (C).

Fig. 5. cromatogramas de CLAE de la reaccin de tanasa a 40 C de:

(A) Muestra de jugo de naranja (pH 7,4),
(B) Muestra de jugo de naranja (pH 7,4) con extracto de tanasa
(C) Muestra de jugo de naranja (pH 4.0) con naringinasa.
Analizando el perfil fenlico del jugo de naranja despus de la reaccin con el extracto semipurificado de tanasa, se puede ver que la enzima elimina el pico 10 del cromatograma (Fig. 5), el
cual era el hesperidin. Los compuestos dados por los picos 8 y 12, no se identificaron, pero se
redujeron por la actividad de la tanasa. Algunas veces, la enzima naringinasa actu en los
mismos compuestos que la tanasa, sin embargo, no en la misma medida como la hidrlisis.
Los resultados del experimento muestran a la tanasa como una opcin interesante para aplicarla
en otros alimentos de la industria, aquellos con una composicin alta de polifenoles en donde la
enzima puede actuar de diferentes formas para su biotransformacin.
La bioactividad de las muestras biotransformadas por tanasa
Los productos que se obtuvieron de las reacciones de hesperidina y naringina con la tanasa, se
analizaron utilizando dos mtodos con diferentes capacidades antioxidantes, DPPH y ORAC.
Los resultados dados en la Tabla 1 se expresan como equivalentes de concentracin Trolox.

Los resultados se presentan como la media (n = 3) SD, y aquellos con diferentes letras de
superndice son significativamente diferentes.
La biotransformacin enzimtica de naringina a naringenina tuvo como resultado un aumento del
25% en la capacidad antioxidante de la molcula por el mtodo ORAC y un aumento de
aproximadamente 500% por el mtodo de DPPH. En el caso del hesperidin que se biotransform
en hesperitina, el aumento fue an ms impactante, llegando a alrededor de 180% en ORAC y
1,400% en DPPH. La reaccin de la eliminacin de las molculas de azcar esterificadas de los
cuerpos fenlicos demostr ser muy eficaz en el aumento de la capacidad antioxidante de estos
compuestos por los mtodos ensayados.
Una de las ventajas de este estudio fue la aplicacin de tanasa en la matriz primaria de alimento,
es decir, el jugo de naranja. Los resultados de las pruebas de la capacidad antioxidante llevadas a
cabo en la naringinasa, las muestras de jugo de naranja tratados con tanasa y el control sin
tratamiento enzimtico estn en la Tabla 2.

Los resultados se presentan como la media (n = 3) SD, y aquellos con diferentes letras de
superndice son significativamente diferentes.
Cuando se realizaron las pruebas ORAC y DPPH, el jugo de naranja que se trat con naringinasa
comercial no mostr diferencias significativas en la capacidad antioxidante en comparacin con
el jugo de naranja fresco. Sin embargo, el jugo de naranja que se trat con tanasa s mostr un
aumento relevante en la capacidad antioxidante. Esto sugiere que la tanasa acta de manera ms
amplia que la naringinasa en la biotransformacin de los polifenoles del jugo concentrado de
naranja.
Una de las aplicaciones ms importantes de los compuestos naturales con actividad antioxidante,
en el campo de la quimio-prevencin, es sin duda el mtodo de la actividad antiproliferativa para
ejercer control sobre el desarrollo de un tumor. Un compuesto prometedor debe ser probado en
tantas clulas tumorales humanas como sea posible, teniendo en cuenta que el mismo compuesto
no afecta en la misma manera los diferentes tejidos. Por esta razn, se eligieron las clulas

humanas de adenocarcinoma de colon (HT29) y el carcinoma hepatocelular (HepG2) para la

evaluacin inicial de modulacin antiproliferativa. Los resultados de la prueba de modulacin de
la proliferacin de clulas tumorales humanas (HepG2 y HT29) de las muestras de naringina y
jugo de naranja, tanto antes como despus de la biotransformacin por tanasa, se muestran en la
Tabla 3. Los resultados se expresan en relacin con el crecimiento de la misma lnea celular.

Los resultados se expresan como (%).

La muestra de naringina en (HepG2) present actividad pro-proliferativa moderada. Por otro
lado, la muestra de naringina biotransformada exhibi actividad antiproliferativa significativa. El
efecto antiproliferativo de la naringina biotransformada fue mayor al de la naringina normal en
todas las lneas tumorales. De hecho, alcanz niveles de reduccin de clulas citocidas (que
destruyen otras clulas) significantes en todas las muestras analizadas.
La muestra de jugo de naranja, sin embargo, con / sin tratamiento enzimtico, no present
variaciones significativas en el crecimiento celular de HepG2. Sin embargo, en la lnea HT29, la
muestra de jugo de naranja present actividad pro-proliferativa moderada, mientras que las
muestras de jugo biotransformado tanto con tanasa y naringinasa mostraron resultados de la
actividad antiproliferativa. En las muestras tratadas con tanasa, en general, la actividad
antiproliferativa fue ms pronunciada. Se hizo una prueba con el hesperidin antes y despus de
su biotransformacin con tanasa donde se ensay en un panel con 9 diferentes lneas tumorales
humanas, los resultados se presentan en la Fig. 6.

Fig. 6. La proliferacin de modulacin celular:

(A) Dada por el hesperetin.
(B) Dada por el hesperetin biotransformado (hesperetin + tanasa).
Como se ve en las grficas de la Fig. 6, la actividad antiproliferativa del hesperidin despus de su
biotransformacin con tanasa aument significativamente. En comparacin con el hesperidin no
tratado con la enzima, se observaron los efectos antiproliferativos del compuesto
biotransformado con una inhibicin muy significativa del crecimiento de las clulas tumorales.
En las concentraciones ms altas probadas, el compuesto biotransformado inhibi

completamente la proliferacin de varias lneas ensayadas, y en uno de ellos el compuesto tuvo

un efecto citocida, reduciendo la poblacin inicial de clulas que se incubaron durante la prueba.
Estos resultados hacen que del hesperetin producido por biotransformacin con tanasa un
compuesto prometedor en la investigacin de quimioprevencin.

4.4 CONCLUSIN.
En el desarrollo del artculo, se vio que el extracto de tanasa semi-purificado, que se haba
aislado inicialmente del microorganismo P. variotti, fue el causante del cambio en el perfil
cromatogrfico de la composicin polifenlica del jugo de naranja. Adems, de actuar en la
naringina y hesperidin eliminando sus glucsidos cuyo proceso demostr ser muy eficaz en el
aumento de la capacidad antioxidante de estos compuestos por los mtodos ensayados.
El hesperetin, que fue el resultado de la biotransformacin del hesperidin, se present en gran
cantidad en el jugo de naranja concentrado. Como resultado de su biotransformacin, este
compuesto exhibi un incremento en su bioactividad y, potencialmente, en su funcionalidad
quimio-preventiva.
Con todo y lo anterior, se vio claramente que los productos principales de las reacciones de
biotransformacin llevadas a cabo, mostraban que su actividad biolgica se haba incrementado
en comparacin con los compuestos originales (polifenoles iniciales). Esto se comprob cuando
se hizo el ensayo de su actividad anti-proliferativa en clulas tumorales y la prueba de mejora de
su actividad antioxidante.
Finalmente, se evidenciaron los beneficios de la modificacin biotecnolgica de algunas
molculas de alimentos naturales, que permitieron la mejora del potencial nutracutico de una
bebida tal como el jugo de naranja.

5. CONCLUSIONES.
La biotransformacin es un mecanismo en el cual una sustancia puede producir una
transformacin qumica sobre sus sustratos naturales o sintticos con el propsito de obtener un
compuesto con mayor actividad biolgica.
La biotransformacin es una herramienta biotecnolgica que se basa en la utilizacin de
microorganismos que actan sobre un sustrato especfico empleando la obtencin de metabolitos
en cuanto a la aplicacin de biotransformacin farmacuticas
El proceso de biotransformacin de compuestos orgnicos ocurre gracias a la presencia de un
microrganismo como bacterias, hongos, enzimas, etc.
La biotransformacin es una alternativa que permite obtener compuestos de manera ms
eficiente y ptima que por otros mtodos.
La biotransformacin lograra reducir el impacto ambiental mediante la reduccin del nivel de
contaminantes que se generar al producir una sustancia de otra.

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