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Efecto de la actividad enzimtica de inulinasas usando metales

Mg y Cu como posibles activador o inhibidor utilizando


Kluyveromyces marxianus
Garduo Del Razo Carla Stephania, Hernndez Rodrguez Miriam, Martnez Gonzlez
Luis Enrique, Rodrguez Calderas Gloria Estrella.
Licenciatura Qumica Farmacutica Biolgica
Universidad Autnoma Metropolitana

Resumen
El objetivo de este trabajo es obtener inulinasas a partir de inulina mediante la
fermentacin con Klyveromyces marxianus bajo las condiciones (medio aerobio y pH 5.5),
se incub durante 12 hrs en un agitador orbital a 200 rpm y a una temperatura de 30C.
Se llev a cabo la identificacin del microorganismo K. marxianus por la tcnica de tincin
de Gram esto para corroborar que est presente dicho microorganismo en la
fermentacin, por otro lado se llev a cabo una serie de mtodos para esta fermentacin
uno de ellos fue la determinacin de azucares reductores esto con la ayuda del mtodo de
colorimetra DNS; as como la determinacin de protenas utilizando el mtodo de Lowry,
tambin se emplearon metales Mg 2+ y Cu2+ como cofactores pudiendo actuar como
activadores o inhibidores para la produccin de inulinasas. Por ltimo se realizo la
determinacin de DNA mediante PCR punto final.
Palabras claves: Klyveromyces marxianus, Inulinasas, inulina y fermentacin.
Abstract
The objective of this study was to obtain inulin from inulinases by fermentation with
Klyveromyces marxianus under conditions (aerobic medium and pH 5.5), incubated for 12
hrs in an orbital shaker at 200 rpm and a temperature of 30 C. Was conducted organism
identification K. marxianus by Gram staining technique to corroborate this said
microorganism fermentation, on the other hand held a number of methods for this
fermentation one of them was the determination is present reducing sugars with the help
of this method DNS colorimetry; and protein determination using the Lowry method, metals
Cu2 + and Mg2 + as co-factors were also employed may act as activators or inhibitors for
the production of inulinases. Finally determining endpoint DNA by PCR was done.
Keywords: Klyveromyces marxianus, Inulinases, inulin and fermentation.

Introduccin

Kluyveromyces marxianus es una levadura de


grado alimenticio que produce enzimas de inters
industrial, tales como B-galactosidasa (lactasa),
endo-poligalacturonasa
(pectinasa)
y
Bfructofuranosidasa (inulinasa). (Guerrero 1995)

Determinacin de protenas por el Mtodo


de Lowry

Determinacin de azucares reductores por


el Mtodo colorimtrico DNS

La inulinasa es una enzima caracterizada por


hidrolizar la inulina en fructosa prcticamente pura,
ampliamente usada en la industria de alimentos
como edulcorante diettico con un poder de dulzor
de 1.5 a 2 veces ms que la sacarosa. De ah el
inters por su estudio para producirla, purificarla y
caracterizarla a partir de cultivos microbianos en
medios sintticos, siendo las levaduras o las ms
estudiadas. (Castillo 2010).

Usar Mg2+ y Cu2+ como posibles inhibidores


o activadores de la enzima inulinasa

Llevar a cabo la fermentacin


Klyveromyces marxianus

Muchas enzimas requieren la presencia de ciertos


constituyentes no proteicos para funcionar como
catalizadores. Tales como pueden ser cofactores y
coenzimas. (Tapia.2006).
Los cofactores son iones inorgnicos que facilitan
la unin enzima-sustrato o estabilizan la estructura
tridimensional de la enzima. El magnesio es un
catin intracelular que posee mltiples funciones:
es cofactor de enzimas del metabolismo glicdico y
de enzimas de la degradacin de los cidos
nucleicos, protenas y cidos grasos; regula el
paso de los iones transmembrana e interviene en
la actividad de varias enzimas. (Barbosa 2010).
Objetivo general

Inducir la sntesis de inulinasas a partir de


inulina
utilizando
Kluyveromyces
marxianus.
Evaluar el efecto de la actividad enzimtica
usando metales Mg y Cu.

Objetivos Especficos

Identificacin de K. marxianus por la tcnica


de tincin de Gram

Obtener inulinasas a partir de inulina

de

Materiales y Mtodos
Preparacin del medio de fermentacin
La fermentacin se llev a cabo en un medio
aerobio en un matraz Erlenmeyer de 150 mL
El contenido del medio de cultivo fue:
Inulina
11 g
Mg.SO4. 7 H2O
0.33 g
NH4cl2
3.85 g
kH2PO4
1.1 g
Extracto de levadura 1.65 g
pH
5.5
Se incub durante 12 hrs en un agitador orbital a
una temperatura de 30C con una agitacin de
200 rpm. Se inculo 7 mL del medio al matraz
Erlenmeyer en el que se llev a cabo la
fermentacin. (Cortes, 2013)
Se guard en un tubo eppendorf 1mL de inculo
para la extraccin del DNA.

Determinacin del Crecimiento

Se tomaron alcuotas de 10 mL a las 0h, 2h, 4h,


6h, 8h, 10h y 12h en tubos cnicos, los cuales se
centrifugaron a 4000 rpm durante 15 min a 4C.
El sobrenadante se recolect en un tubo
eppendorf para las pruebas de determinacin de
protenas y de azcares reductores y el
precipitado se resuspendi en 2mL de H 2O para
su anlisis espectrofotomtrico a 660 nm y as
determinar el crecimiento celular.

Actividad enzimtica empleando cofactores


Determinacin de azcares reductores
Para la determinacin de azcares reductores se
aplic el mtodo de colorimetra DNS (cido 3,5
dinitrosaliclico) usando el espectrofotmetro.

Se prepararon cuatro buffers de 1.5 ML,


2 de cobre (1mM y 5mM) y 2 de magnesio (1mM y
5mM) para determinar el efecto sobre la actividad
enzimtica. Se utiliz la prueba de DNS.

Se realiz una curva de calibracin (tabla 1) a


partir de una solucin de glucosa (2 g/L).

Preparacin del reactivo


dinitrosaliclico (DNS)

Cada una de las diluciones se les adicion 250 L


de DNS y 2.5 mL de agua destilada. Despus de la
realizacin de las diluciones, estas se llevaron a
bao mara a 50C para que el DNS reaccionara
con el azcar de las muestras.
Se ley en el espectrofotmetro a una longitud de
onda 540 nm, obteniendo de esa manera la curva
de calibracin.

Se pesaron 2 g de cido 3,5 dinitrosaliclico, 60 g


de tartrato de Na-K y 3.2 g de NaOH. Se disolvi el
NaOH en 200 ml de agua destilada y se aadi en
agitacin el tartrato de Na-K lentamente.
Se afor con agua destilada hasta 80 ml y se
aadi lentamente el cido 3,5 dinitrosaliclico. Se
dej en agitacin toda la
noche, por ltimo se llev a volumen de 100 ml y
se filtr.

Por otro lado se realizaron 4 tubos de 1.5 ml


cada una; como se muestra en la tabla 2.
Tabla 2. Preparacin de muestras problemas
para la cuantificacin de
azucares reductores.

Azucares reductores
muestra
abs

0
2
4
6
8
10
12

Se homogeneizaron en bao mara 50 C por


20 min, se incub en hielo por 10 min, se
tomaron 250 l del tubo de la muestra y se
adicion 250 l de DNS, se calent en bao mara
durante 5 min, se incub en hielo por 10 min y se
le adicion 2.5 ml de agua.

0.213
0.411
0.528
0.612
0.696
0.963
0.681

concentracin
g/ml

actividad
enzimtica
U

56.0639316
108.169195
138.958668
161.063932
183.169195
253.432353
179.221826

0
7.5
9.63
11.17
12.7
17.58
12.43

del

cido

3,5

actividad
especfica
mol/min
x
mg
0
470.51
522.6
390.96
556.77
577.52
553.18

Determinacin de protenas

Se tom 150L del sobrenadante de cada tiempo,


este se coloc en tubos de ensaye y
posteriormente se aadi 50L de NaOH y 1 mL
Posteriormente se ley en el espectrofotmetro y
de Reactivo A (50 mL de Na2CO3 al 2%, 0.5 de
con base a la curva de calibracin se cuantific la
CuSO4 al 1%, 0.5 mL de tartrato de sodio y potasio
glucosa presente en cada una de las muestras a
al 2 %), se dej reposar durante 15 min. despus
una longitud de onda 540 nm. Para el clculo de la
se adicion 100L del Reactivo B (Fenol Folinabsorbancia se calcul por la siguiente formula: ACiocalteau en proporcin 1:1 con agua destilada) y
(B+D). (Cortes, 2013)
se dej reposar durante 40 min. Al final se leyeron
las absorbancias de cada uno de los tubos a una
longitud de
Muestra
Blanco
de Blanco
Blanco TABLA 1. Curva de calibracin
onda de 560
problema
sustrato
de
de
azucares reductores
nm.
reactivo
enzima
Glucosa g/ml
Abs
4.1667
0.0083
Sustrato 0.5 ml
Enzima 0.5 ml Buffer
Sustrato
Se realiz
1.5 ml
0.5 ml
8.333
0.023
una curva
Enzima 0.5 ml
Buffer 1 ml
16.667
0.0543
de
Buffer
33.333
0.11
calibracin
Buffer 0.5 ml
0.5 ml
a diferentes
50
0.1696
66.667
0.2396
A
B
C
D
83.333
0.298
116.667
0.4353

concentraciones utilizando el mtodo de Lowry,


leyendo su absorbancia, segn lo muestra la tabla
3.
Como se observa en la tabla 4, se report los
datos en unidad enzimtica (U) y
actividad
especfica.
Tabla 3. Curva de calibracin de protenas por
el mtodo de Lowry
Curva de calibracin
mues absorban concentraci
tra
cia
n g/ml
1
0.0335
3.84615384
6
2
0.069
7.69230769
2
3
0.0915
11.5384615
4
4
0.127
15.3846153
8
5
0.2265
30.7692307
7
6
0.3395
46.1538461
5
7
0.4305
61.5384615
4
8
0.5125
76.9230769
2
9
0.531
84.6153846
2
10
0.5765
92.3076923
1
11
0.6115
100
12
0.6575
107.692307
7
Tabla 4. Curva de calibracin de
azucares reductores (datos en unidad
enzimtica y actividad especfica)
Extraccin de DNA
1.

Colocar 1.5 ml de cultivo de k.marxianus.

2.
Centrifugar a 12,000 rpm por 2 minutos y
eliminar el sobrenadante.

3.
Resuspender las clulas en 293 l de
EDTA 50 Mm.
4.
Agregar 7.5 l de liticasa y mezclar
suavemente con pipeteo.
5.
Incubar la mezcla a 37 C durante 60 min
(mezclando cada 20 min).
6.

Enfriar a temperatura ambiente.

7.
Centrifugar a 12,000 rpm y desechar el
sobrenadante.
8.
Adicionar 300 l de solucin de lisis
nuclear.
9.
Agregar 100 l de solucin de
precipitacin de protenas y agitar en vrtex por
20 seg.
10.

Incubar la muestra en hielo por 5 min.

11.

Centrifugar a 12,000 rpm por 3 min.

12.
Transferir el sobrenadante a un tubo de
1.5 ml que contenga 300 l de isopropanol.
13.
Mezclar por inversin hasta ver las
hebras de DNA.
14.

Centrifugar a 12,000 rpm durante 10 min.

15.
Agregar 300 l de etanol e invertir el
pellet varias veces.
16.
Centrifugar a 12,000 rpm por 5 min y
decantar el sobrenadante. Dejar el tubo drenado
sobre papel absorbente por 15 min.
17.
DNA.

Agregar solucin de rehidratacin de

18.
Agregar 1 l de Rnasa e incubar a 37C
por 15 min.
19.

Almacenar el DNA a 4C.

Determinacin de DNA por la tcnica de PCR


punto final

Se coloc en un tubo eppendorf:


H2O
40.9L
Buffer
5L
dNTP
5L
Polimerasa Taq 0.1L
Primer 1
1L
Primer 2
1 L
DNA
1 L
Esta mezcla se someti a un termociclador en el
cual se emplearon 30 ciclos de 1min. de altas y
bajas temperaturas para llevar a cabo la
desnaturalizacin, la unin de los primers y la
elongacin de la cadena. Al final se coloc en un
gel de agarosa con un colorante para observar la
separacin de las molculas de acuerdo a su peso.
(Somma, 2014)
Resultados

Determinacin de azucares reductores

Crecimiento

Actividad enzimtica

Curva de crecimiento
muestra
Abs
0
0.779
2
0.886
4
1.379
6
1.728
8
1.96
10
2.098
12
1.258

Cuantificacin de protenas de Lowry

Metales
Contro
l

12.43

inhibidor

activador

1
mM 5 mM 1 mM 5
Cu
Cu
Mg
mM
Mg
6.85
8.62
13.76
13.6
5

Discusin

Comparacin

En la determinacin de azucares reductores


podemos observar que no todos
nuestros
resultados de cada una de las muestras estn
dentro de la curva de calibracin, por lo cual
tuvimos que extrapolar con la frmula general de
nuestra de la tabla para saber las concentraciones
de azcar reductor tenamos de cada una de ellas.

La determinacin de azucares reductores es una


medicin indirecta de la actividad hidroltica de la
enzima por la cantidad de azcares reductores
presentes producto de la actividad (Casablanca
Alarcn Esther, Ros Manrquez Neida, lvarez
Mara Teresa, Terrazas Siles Enrique, 2009), por
ello se podemos deducir que existe una relacin
con la grfica de actividad enzimtica, y la grfica
de crecimiento. Como se observa en la grfica
donde se relacionan tanto la grfica de
crecimiento, actividad enzimtica y protenas de
Lowry;
desde un principio se observa un
crecimiento exponencial debido a que se inocul
bacterias metablicamente activas; puesto que se
al principio se dejaron en una cultivo de adaptacin
donde crecieron y al entrar al medio de
fermentacin e inocular slo las metablicamente
activo se elimin la fase de latencia, teniendo en la
grfica un crecimiento exponencial desde el
principio, esta fase se puede relacionar con la
grfica de azucares reductores; ya que al igual van
aumentando el nmero de azucares reductores, lo
cual indica que va en aumento la actividad
enzimtica (cantidad de enzimas); puesto que al
mismo tiempo aumenta el nmero de biomasa.
Tambin se observa una fase de desaceleracin en
la curva de crecimiento, aprecindose de igual
forma en la grfica de actividad enzimtica esto es
debido a que deja de reproducirse la levadura K.
marixianus al haber un dficit de nutrientes y por lo
tanto empieza a ver muerte de las clulas bajando
as la actividad enzimtica. En la cuantificacin de
protenas por el mtodo de Lowry, se puede
observar que la cantidad de protenas va en
aumento al igual que el crecimiento de la levadura
esto se debe a que se mide la cantidad total de
nitrgeno proteico, y teniendo en cuenta que este
elemento representa aproximadamente el 16% del
peso de una protena; por lo cual podemos decir
que si va en aumento el nmero de clulas
durante el crecimiento exponencial; aumentar el
nmero de protenas totales que son determinadas
por el mtodo de Lowry.

De acuerdo al anlisis de metales; podemos decir


que el cobre intervino como inhibidor enzimtico al
bajar la actividad enzimtica al aadir sulfato de
cobre, est compuesto en la mayora de las
biografas se ha reportado como cofactor (iones
metlicos participan con las enzimas en cantidades
adecuadas para que la enzima pueda actuar,
catalizando una reaccin bioqumica), entre ellos
los iones metlicos ms comunes son magnesio,
manganeso, molibdeno, cobalto, zinc, hierro,
nquel, potasio y cobre, una de las principales
funciones de los cofactores es sufrir las
transformaciones qumicas necesarias (oxidacin y
reduccin entre otras) para llevar a cabo la
catlisis enzimtica, de este modo la enzima queda
intacta pudiendo llevar a cabo la catlisis (Nues
de Castro I., 2001); sin embargo los resultados
reportados fueron una notable disminucin de la
actividad enzimtica; esto puede ser debido a que
el cobre es uno de los principales microelementos
(son nutrientes que se necesitan en menor
concentracin), por lo que al ser utilizados a
concentraciones de 1 y 5 mM sobrepasaron su
concentracin necesaria para las levaduras y de
esta forma en vez de actuar como activador,
inhibieron la actividad enzimtica, convirtindose
tan slo por las altas concentraciones en un
micronutriente txico, por otra parte se encontr
otro artculo donde se nombra este elemento como
un microelemento que puede causar sobre los
microorganismos una inhibicin causada por la
alteracin de las estructuras enzimticas, debido a
la presencia excesiva de estos elementos: cadmio,
zinc, cobalto, cobre, hierro, mercurio, nquel, plomo
(Godoy Sanchez Francisco,2012).
Por otro lado el magnesio en las bibliografas es
propuesto como activador enzimtico, el magnesio
es cofactor de casi todas las enzimas que actan
sobre sustratos fosforilados, por lo que es de una
gran importancia en el metabolismo energtico. El
magnesio presenta fenmenos de antagonismo
con otros iones, fundamentalmente con el calcio y
el potasio. Tal antagonismo es tan fuerte que la
presencia de uno de ellos en el medio puede
provocar deficiencia del otro elemento al impedir su
absorcin
(Cogua Jorge, 2008), por lo que
podemos apoyar nuestros resultados , ya que al
usar este elemento en compuesto sulfato de
magnesio, aumento su actividad enzimtica,
vindose un pequeo descenso al usar una

concentracin de 5mM sin embargo aun ayudando


a la enzima como activador; lo que nos hace
pensar que seguramente a cantidades mayores
podra actuar como inhibidor.

senescencia de lilium hbrido oriental en


postcosecha.2012.
5. Bioqumica de los procesos metablicos,

scar Cuamatzi Tapia.2006.


6. Casablanca

Conclusin

En base a los objetivos planteados se


puede concluir que se llev a cabo con
xito la induccin de la sntesis de
inulinasas a partir de inulina utilizando K.
marxianus.

Tambin se logr comprobar correctamente


la morfologa de la levadura (K. marxianus)

Alarcn Esther, Ros


Manrquez
Neida,
lvarez
Mara
Teresa,
Terrazas
Siles
Enrique,
Optimizacin de las condiciones de
cultivo anaerbico termfilo para
aumentar la produccin enzimtica de
xilanasas con cepas bacterianas
encapsuladas y libres, BIOFARBO 17(2)
2009 51-59.

7. M. Somma, M. Querci, Anlisis de la

As como se pudo conocer el efecto de la


actividad enzimtica usando metales Mg2+ y
Cu2+ y se observ que efectivamente el
magnesio acta como cofactor y el cobre
como inhibidor sobre las inulinasas, aunque
se encontr que la concentracin de los
metales juega un papel importante en el
efecto sobre la inulinasa, as como se
reporta en la bibliografa consultada.

1. Augusto Castillo Caldern, Rolando Chamy

de

inulinasa por
Kluyveromyces

2. Guerrero Cruz Alma Elizabeth, Regulacin

de la sntesis y excrecin de enzimas


extracelulares
de
Kluyveromyces
marxianus.1995.
3. Fabiano Timb Barbosa, Usos do sulfato de

magnsio em obstetrcia e em anestesia


2010.
4. Mandujano-Pia,

8. Nuez

de
Castro,
Pirmide, Madrid, 2001.

Enzimologa,

9. Godoy Snchez Francisco, Potencial de

Referencias

Maggi, produccin
levaduras
de
marxianus.2010.

Presencia de Organismos
Genticamente Modificados en
Muestras de Alimentos, obtenido el 08
de diciembre de 2014 de http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/m
anuals/Manual%20ES/Sesi
%C3%B3n6.pdf

Manuel; Colinas-Len,
Ma. Teresa; cobalto como retardante de la

cultivo de la chumbera para la


obtencin de biocombustible (tesis
doctoral) , Universidad Politcnica de
Madrid, 2001.
10. Cogua

Jorge, Funciones de los


nutrientes
minerales,
Universidad
Nacional de Colombia, 2008.