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Obtención de Etanol por la Fermentación Alcohólica de Bagazo de Caña de Azúcar

Production of Ethanol by Fermentation of Sugarcane Bagasse

Fontalvo. M, Gil. A, Monsalve. C, Patiño. Sara, Rivas. R.
Laboratorio de biotecnología para ingenieros. Departamento de ingeniería química. Facultad de
ingeniería. Universidad de Antioquia. Medellín, Colombia.

Resumen
En esta práctica se estudió el proceso de fermentación alcohólica que llevan a cabo las levaduras.
La levadura que se utilizó es Saccharomyces cerevisiae. En la fermentación alcohólica se produce
dióxido de carbono y alcohol etílico (etanol). Se usaron concentraciones de 15, 30, 45 y 50 g/L de
glucosa como azúcar total reductor, tomando muestras cada hora para medir absorbancia a 600nm
para la determinación de la concentración de la biomasa.

----- Palabras clave: fermentación, Saccharomyces cerevisiae, Azúcar,
Biomasa

Abstract
In this work we studied the alcoholic fermentation process carried out by yeasts. The yeast used
is Saccharomyces cerevisiae. In the alcoholic fermentation produces carbon dioxide and ethyl
alcohol (ethanol). Concentrations were used 15, 30, 45 and 50 g / L glucose as reducing the total
sugar, taking samples every hour to measure absorbance at 600nm for the determination of the
concentration of biomass.

----- Keywords: fermentation, Saccharomyces cerevisiae, Glucose,
Biomass

Introducción

es más relevante la conversión de sustrato considerando que la mayor parte de los costos de producción corresponden a la materia prima. aunque la productividad es importante. bajo control del proceso y menores productividades que los procesos continuos. que procesan los azúcares (carbohidratos. debido principalmente a las numerosas ventajas que ofrece. En la mayoría de las destilerías. NADH y ATP [1]. La inmovilización celular permite el aumento en la productividad. las levaduras mantienen una leve respiración utilizando para ello el oxígeno disuelto en el mosto. Los productos finales que se obtienen de este proceso son: etanol. el tiempo de fermentación es de 24 horas. la factibilidad del proceso en continuo. la estabilidad celular y los bajos costos de recuperación y reciclo en los procesos de separación. Los procesos por lotes tienen mayores costos del biorreactor. Generalmente el rendimiento es del 90% del máximo teórico. Las levaduras a 30°C tienen su temperatura óptima de desarrollo. dióxido de carbono. La concentración de sustrato al inicio del proceso es de 15-25% (p/v) y el pH se ajusta a un valor de 4-5 para disminuir los riesgos de infección. Los más relevantes son los siguientes: Temperatura: A mayor temperatura la fermentación transcurre más rápidamente. su implementación en los procesos industriales es aun limitada y su aplicación dependerá de los futuros desarrollos en los procedimientos de inmovilización que puedan ser fácilmente escalables. ha surgido un interés creciente en la inmovilización de células para la producción de alcohol. Por encima de 35°C la actividad disminuye rápidamente y mueren antes de 45°C. Sin embargo. La concentración de etanol al término de la fermentación es de 80-100 g/L. aumentándose 6 horas para la sedimentación de las levaduras en los tanques. es decir.La fermentación alcohólica es un proceso biológico en ausencia de oxígeno (O2). sin embargo es menos pura. En la actualidad. . Además de esto existen algunos factores que pueden afectar positiva o negativamente la fermentación ya sea actuando sobre el desarrollo de las levaduras o incidiendo directamente sobre la propia fermentación. se produce menos etanol y más cantidad de compuestos secundarios. a nivel industrial. Oxigeno: Aunque la fermentación es un proceso anaeróbico. Las levaduras son hongos microscópicos unicelulares importantes por su capacidad para realizar descomposición mediante la fermentación de varios compuestos orgánicos principalmente los carbohidratos [3]. originado por la actividad de algunos microorganismos como la levadura y bacterias. mayores requerimientos de mantenimiento y operación. El resto de sustrato es convertido en biomasa y otros metabolitos. El proceso se lleva a cabo a 3035ºC. La mayor parte del etanol es producido mediante fermentaciones por lotes. Sin embargo.

Porta objetos.7H2O KH2PO4 (NH4)2 SO4 Extracto de levadura Peptona universal Balanza Analitica Autoclave Agitadores Métodos En el laboratorio es de vital importancia conocer los requerimientos mínimos para el manejo de microorganismos [1]. Materiales y métodos       Erlenmeyer Tarro de vidrio de 4 litros Peachimetro Puntas de micropipetas Contenedores de muestras Alcohol 70 % Materiales                                  Bagazo de caña y zumo Cajas Petri con agar nutritivo Incubadora. superficie con levantamiento central. Mechero Cámara de flujo laminar Agar bacteriológico Cajas Petri con agar nutritivo con colonias. En la siembra que realizamos en el laboratorio a partir del bagazo de caña y del líquido en las cuales se pretendía obtener levadura obtuvimos en mayor cantidad hongos de color negro o blanco los cuales los caracterizamos porque son de crecimiento moderado. Figura1: Siembra por agotamiento . algodonosa. Aceite de inmersión. Todo microorganismo en el laboratorio se debe manipular como si fuera potencialmente perjudicial para la salud.Nutrientes: Los azúcares son fuente de energía para las levaduras [4]. Estereoscopio. Cubre objetos. predomina el aspecto cremoso y opaco. Micropipeta de 1000ƒÊL Micropipeta de 200ƒÊL Micropipeta de 100ƒÊL Bano termostatico Espectrofotometro Bano de hielo Tubos tapa rosca Gradillas Balones volumetricos de 100 ml Glucosa DNS Solución madre de levadura MgSO4. Colorantes Gram. Microscopio. abundante. posteriormente aislamos en el agar nutritivo levadura pura (sacharomyces cereviseae) proporcionada por la profesora y tratamos de aislar la poca levadura que se pudo observar de la obtenida del bagazo de caña y del líquido del mismo por el método siembra por agotamiento (figura 1). generalmente redondos o de forma irregular.

ya que se observaron los bacilos pseudomonas de color rosa-rojas. Figura 3: hongo Gram + 2) Se observó a 100X una bacteria la cual se le adiciono unas gotas de aceite de inmersión proveniente del pino o del árbol de sauce. procurando arrancarla desde la base y ponerlo con cuidado en una gota de agua que se había echado en el portaobjetos. la cual se secó con la ayuda del mechero para fijarla.(Figura 4) Se tomó una muestra de un hongo obtenido de la siembra del bagazo de caña en fresco se colocó en un portaobjetos le adiciono azul de metileno.Realizamos la caracterización de una bacteria por el método de gran en el cual tomamos el material a observar en una mínima cantidad con agujas finas o asa estéril.(Figura 3) 3) Se observó a 100X una bacteria la cual se caracterizó como Gram + ya que se observaron los filamentos de color azul oscuro o violeta. en la cual se caracterizó como Gram . un cubreobjetos y se llevó para la observación en el microscopio. (Figura 2). forma de capsula o puntos. base ensanchada.(Gram positiva en mayor parte) la muestra se encontraba contaminada ya que habían leves coloraciones rosadas. posteriormente se trató con cristal violeta(Impregna si es Gram +) por 1 minuto se lavó se le adiciono lugol (mordiente) por 1 minuto se lavó. (Figura 5) Figura 5: Bacteria Gram + Pre tratamiento del bagazo de caña . se lavó con alcohol cetona y finalmente se adiciono por safranina(Impregna si es Gram -) por 30 segundos se lavó y se dejó escurrir. crecimiento definido y algunas esporas. Figura 4: Bacteria Gram - Figura 2: Hongo en fresco Observaciones en el microscopio 1) En el microscopio se observó a 40X el hongo en fresco que se formó en nuestro cultivo de bagazo de caña en el cual se pudieron observar las hifas septadas.

se dejó reposar por 24 horas. Figura 7: Diluciones de glucosa Preparación del inoculo . se llevaron todas las soluciones al baño termostático a una temperatura de 80-90°C durante 5 minutos. para poder realizar la calibración cuyos datos serán presentados posteriormente Tabla 1: Diluciones para curva estándar de glucosa. obteniéndose 65 gramos de material sólido.5 g de NaOH a 2250 ml de agua en un recipiente de vidrio de tal forma que el NaOH adicionado se encontraba a 1 % (P/V). incluyendo al blanco. se colocó en el autoclave por 30 minutos. (Figura 7) Pasados los 5 minutos exactos.75 1 0 125 250 500 750 1000 1000 875 750 500 250 0 A las diluciones preparadas SE LE adiciono a cada una 1000 μL de DNS. Blanco 1 2 3 4 5 0 0. se llevaron las soluciones a un baño de hielo durante 5 minutos se leyeron las absorbancias de las soluciones a 540 nm. Solución Concentración (g/L) Volumen de solución madre (μL) Volumen de agua destilada (μL) Se tomaron 150 gramos de bagazo de caña triturado donde se adicionaron 22.5 0. posteriormente se procedió a neutralizar con HCl [5M] hasta que el PH se mantuviera estable en PH=5 (Figura 6).125 0. se procedió a escurrir el sólido y se puedo en secado por 24 horas. se revisó que la solución se encontrara neutra (PH=7). Se tapo cada tubo para evitar pérdidas de muestra por evaporación.Figura 6: Bagazo Neutralizado Elaboración de la curva estándar de glucosa Se preparó una solución madre de glucosa a 1g/L en un balón de 100ml y se hicieron las siguientes diluciones en tubos de ensayo usando las micropipetas (Tabla 1)[2].25 0.

se adicionó 54 mL de medio de cultivo y 6 mL de biomasa. Volumen del líquido en el reactor en litros. conociendo el volumen de líquido en el interior del reactor. Montaje con fermentómetro Mediante la relación estequiométrica de la reacción de fermentación se sabe que por cada mol de dióxido de carbono que se libera. 3. se adicionaron 10 gramos de bagazo de caña.6 A las condiciones: 30°C y 150 rpm durante 24 horas. Se centrifugar 1 muestra (5000 rpm por 5 min) . Montaje para la determinación de etanol.Se activó la levadura en incubándola en el siguiente medio de cultivo Reactivo Figura 7. Se tomaron muestra entre el rango de dos o tres horas durante un dia. se adicionaron en promedio 4 gramos de bagazo de caña. [4] La cantidad de etanol producido se cuantifica de manera indirecta a partir del CO2 liberado durante la fermentación. Se tomaron muestras de 1 ml cada una con micro pipeta en epperndorf de 2mL. La diferencia del montaje para la determinación con respecto al montaje para la determinación de biomasa y consumo de sustrato es que este montaje lleva un fermentómetro (ver figura 7 y 8)[3] Figura 8.135 mL de medio de cultivo y 15 mL de inoculo. en los cuales se realizaro el siguiente procedimiento: 1. 2.7H2O KH2PO4 (NH4)2 SO4 Extracto levadura Peptona universal 3. Fermentómetro Cantidad (g/L) 60 1 2 3 de 4 Glucosa MgSO4. así: Donde Es la concentración de etanol equivalente en el reactor en g/L. Se tomó el cultivo del agitador y llevarlo a la cámara de flujo laminar. Cantidad de dióxido de carbono liberado en gramos. apoyados en la relación estequiométrica: La determinación de etanol se realizan tres montajes con erlenmeyers de 100 mL con un volumen de fermentación de 60 mL. Toma de muestra de los montajes en batch [4] La determinación de glucosa se realizó en erlenmeyers de 250 mL con un volumen de fermentación de 150 mL. se produce una mol de etanol. lo que permite determinar la cantidad de etanol equivalente (g/L).

y una concentración alta influye tanto sobre el crecimiento como en la fermentación. Resultados Análisis de Resultados y Conclusiones De los datos experimentales podemos notar que la velocidad de la fermentación disminuye respecto a la concentración de sustrato. por el contrario. Se Cuantifico los azucares reductores (ATR) por el método de DNS. se debe tener en cuenta que al trabajar con concentraciones muy bajas. Por otra parte. Esto puede ser debido a que cuando se trabaja con concentraciones de azúcares muy altas. 2. esta práctica es muy importante para los futuros ingenieros químicos ya que podemos conocer todo el proceso de fermentación que se requiere para la producción de etanol y todo los aspectos . Cuantificación de Etanol indirecto: 1. el proceso resulta antieconómico ya que requiere un mayor volumen para la fermentación. con el fin de determinar la cantidad de CO2 producido. Se Trasvaso el sobrenadante de la muestra que fue centrifugada.Cuantificación de Glucosa: 1. Al montaje del fermentó metro se le registro el peso. se produce una deficiencia respiratoria en la levadura y un descenso de la velocidad de fermentación. De igual manera podemos ver que la levadura es afectada en alto grado por la concentración de alcohol dado que una pequeña concentración alcohólica ya influye sobre el crecimiento.

concentración de nutrientes. 40p. Manual estudiantes de biología para ingenieros. Manual estudiantes de biología para ingenieros. Manual estudiantes de biología para ingenieros.2014. [4]Universidad de Antioquia. [2]Universidad de Antioquia.2014. [3]Universidad de Antioquia. tales como las variables que lo afectan directa o indirectamente. 41p.2014. 35p. el PH.2014. y dado que el conocimiento de las levaduras y microorganismos influyentes en la industria no solo es importante para la elaboración de cervezas y vinos esto hace de este laboratorio una abertura de conciencia con respecto a los procesos industriales.que están relacionados con éste. como la temperatura. Manual estudiantes de biología para ingenieros. . 24p. aireación. Manual estudiantes de biología para ingenieros.2014. Referencias [1]Universidad de Antioquia. [2]Universidad de Antioquia. 35p.