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Calificacin de

Espectrofotmetro UV-Vis

Espectrofotometra UV-Vis:
Fundamento
Se basa en que las molculas absorben las
radiaciones electromagnticas y a su vez que la
cantidad de luz absorbida depende de forma
lineal de la concentracin. La espectroscopia de
absorcin UV-Vis involucra la absorcin de luz
UV/visible por parte de una molcula
promoviendo el paso de un electrn desde un
orbital molecular fundamental a un orbital
excitado. La separacin energtica entre estos
orbitales moleculares corresponde a las
longitudes de onda del visible.

Espectrofotmetro UV-Vis:
Instrumentacin
Fuente
Lmpara de deuterio e hidrogeno. (170-375 nm)
Lmpara de filamento de wolframio. (350-2500
nm)
Lmpara de arco de xenn. (200-1000 nm)

Selectores de longitud de onda


Recipiente para la muestra
Detectores de radiacin
Procesadores de seal y dispositivos de lectura

Espectrofotmetro UV-Vis:
Tipos de Instrumentos
Haz Sencillo

Doble Haz en el Espacio

Espectrofotmetro UV-Vis:
Tipos de Instrumentos
Doble Haz en el Tiempo

Calificacin de Equipos (EQ)


Actualizacin Mayor
Cambio de Uso
Seleccin de
Equipo

DQ

Recalificacin
DQ
IQ

Evaluacin
Proveedor

Uso

Mantenimiento
Preventivo

OQ

OQ
PQ
Reparacin

PQ

Avera
Validacin
Traslado
Reubicacin

Uso

EQ Es un proceso formal que aporta evidencia


documentada de que un instrumento es
apropiado para un propsito y se mantiene en
un estado de mantenimiento y calibracin
consistente con su uso.
Ciclo de vida de la calificacin de equipos.

Calificacin de Diseo (DQ)


Caracterstica

Consideraciones

Sistema de control y comunicacin

Parmetros del espectrmetro seleccionado/ controlado/


almacenado/ recuperado ya sea localmente dentro del instrumento
ptico, va una PC remota o un sistema controlador. Habilidad
para enviar/ aceptar/ almacenar/ recuperar seales y comunicar a
otros equipos.

Tipo de Fuente

Vida de lmpara, tiempo de calentamiento, susceptibilidad a la


deriva, longitud de onda.

Muestras

Tipo de muestra, habilidad para manejar muestra discretas o


continuas, rango de tamao de muestra, facilidad para controlar la
temperatura de la celda, fcil intercambio a otros tipos de celta.

Tipo de detector

Habilidad para monitorear longitudes de onda nicas, mltiples o


variables y/o caractersticas espectrales totales.

Precisin de la longitud de onda

Habilidad para seleccionar una longitud de onda con precisin y


reproducibilidad.

Rango de longitud de onda

Habilidad para seleccionar y monitorear una longitud de onda con


o sin cambio de fuente, filtro o detector

Rango linear dinmico

Habilidad para una cuantificacin precisa sobre un amplio rango


de absorbancia.

Ruido ptico y electrnico

Bajo ruido mejora la sensibilidad y bajos limites de deteccin.

Calificacin de Diseo (DQ)


Caracterstica

Consideraciones

Deriva de la longitud de onda

Baja deriva

Resolucin

Importante para un medida precisa en bandas estrechas

Precisin fotomtrica

Se requiere una buena precisin para medidas absolutas de


absorbancia.

Deriva fotomtrica

Estabilidad de la medida en el tiempo, haciendo comparaciones


significativas.

Luz parasita

Afecta la precisin y linealidad. Define el mtodo usado.

Recoleccin de datos

Expresin de datos en escalas de absorbancia o % T, facilidad para


uno o repetidos barridos, monitores de una o mltiples longitudes de
onda, datos de todo el espectro (ej. Arreglo de diodos)

Manipulacin de datos

Sustraccin espectral, derivadas espectrales, los datos crudos son


incompatibles, capacidad de back-up y restauracin.

Almacenamiento de datos

No almacenar, memoria incorporada, transmisin de archivos a un


dispositivo externo, salida almacenada por medio magntico u ptico,
sistema de seguridad.

Salida de datos

Procesamiento de datos basado en PC, generacin de reportes


personalizados.

Calificacin de Instalacin (IQ)


el instrumento ha sido entregado como se orden, es decir, de
acuerdo a la DQ u orden de compra?
se ha revisado y verificado que el instrumento no tiene ningn
dao?
se ha suministrado la documentacin apropiada, es la correcta
edicin y est identificado de forma nica por nmero de parte,
numero de versin y fecha?
han provedo todos los detalles requeridos de todos los
servicios y utilidades para operar el instrumento
(preferiblemente antes de la entrega)?
es claro cules son las instrucciones de mantenimiento,
calibracin y realizacin de ensayos que se deben llevar a cabo
para el uso y cuales son responsabilidad del proveedor o sus
agentes?
se han provedo los detalles de servicios recomendados e
intervalos de calibracin (llevados a cabo por el proveedor?

Calificacin de Instalacin (IQ)


se han provedo los intervalos, mtodos e instrucciones para el
mantenimiento por parte del usuario junto con los puntos de
contacto para el servicio y repuesto?
se ha provedo el hardware, firmware y software correcto, y es la
edicin correcta y est identificada de forma nica por nmero de
parte?
se ha provedo la informacin de insumos requeridos durante la
operacin normal del instrumento, particularmente durante los
procedimientos de encendido y apagado?
el ambiente seleccionado es adecuado para el instrumento, como
cuartos adecuado para el desempaque, instalacin, operacin y
servicio, y se le proporcionan los servicios y recursos apropiados
(electricidad, agua, etc.)?
se ha proporcionado informacin ambiental de salud y seguridad
relacionada a la operacin del instrumento y es el ambiente de
trabajo propuesto consistente con estos requerimientos?
la respuesta del instrumento a la aplicacin inicial de energa es
como se esperaba y cualquier desviacin ha sido registrada?

Calificacin Operacional (OQ)


OQ pruebas deben llevarse a cabo despus de la
instalacin inicial del instrumento
y luego a intervalos definidos durante toda la vida
del instrumento.
El propsito de OQ es verificar que aspectos clave
del rendimiento instrumental longitud de onda,
absorbancia, resolucin, la luz difusa, el ruido y
desviaciones. Los espectrofotometros uv- visible se
calibran en sus dos escalas fotometrica y de
longitud de onda, con materiales de ref. q deben ser
certificados, adicionalmente hay otras pruebas
instrumentales que se deben evaluar como

Las pruebas de verificacin requeridos


por las farmacopeas

La frecuencia o periodo de las pruebas OQ


tpicamente depender de:

Recomendaciones del fabricante


El rendimiento requerido del instrumento
Grado de utilizacin de los instrumentos
Entorno de funcionamiento
Uso inconsistente con las instrucciones del fabricante.
Ejemplos de eventos que pueden requerir repetir OQ incluyen:

- Rutina de mantenimiento, revisin y sustitucin de piezas


- Movimiento o traslado
- Interrupcin de los servicios y / o servicios (otros que por
aceptados cierran procedimientos)
- La modificacin o actualizacin, y
- Como parte de la solucin de problemas / fallas encontrando
siguiente fracaso PQ.

Escala longitud de onda (exactitud/)


precisin
Clculos

E = medida- ref.
Aceptable: UV 1 nm ;Vis 3 nm
3 repeticiones scans de el mismo pico deberian estar entre +-0.5nm
Existen muchos estndares que se utilizan comnmente para verificar la
exactitud de longitud de onda de un espectrofotmetro La desviacin de la
longitud de onda puede causar errores en los resultados cuantitativos de la
lectura en el UV-Vis. En este control se verifica el grado de concordancia
entre
la longitud de onda seleccionada para la mxima absorbancia y la longitud
de onda de referencia. Con una misma cubeta, ajustar el cero (0) del
instrumento
con la solucin de cido perclrico al 10%. Se recomienda medir segn el
rango espectral una longitud de onda para el espectro UV y tres longitudes
de onda para el espectro Vis. Dependiendo del ancho de banda del equipo,
la mxima absorcin de la solucin de xido de holmio en cido perclrico
se detectar a las longitudes de onda indicadas en la tabla 2

Patrn

Patrn

Ventajas

Desventajas

Cristal de
xido de
holmio

Patrn
Picos a muchas
absorcin longitudes de onda de
slidos
280 a 2000 nm

La posicin de los picos


vara de lote a lote

Cristal de
xido de
didimio

Patrn
Picos a muchas
absorcin longitudes de onda de
slidos
400 a 1920 nm

La posicin de los picos


vara de lote a lote
No hay picos por debajo
de 400 nm

Lneas de
emisin de la
lmpara de
deuterio

Patrn de
emisin

Afiladas lneas
espectrales presentes en
la fuente de luz U

Limitado a longitudes de
onda visibles (486,0 y
656,1 nm)

Lneas de
emisin de la
lmpara de
vapor de Hg

Patrones
de
emisin

Afiladas lneas
espectrales Cubre ambas
regiones ultravioleta y
visible

No comnmente
incorporado en el
instrumento

Oxido de
holmio en
cido
perclrico

Patron
Picos a muchas
absorcion longitudes de onda
liquido
de 240 a 650 nm

No hay picos utilizables


por encima de
650 nm

Ciertas fuentes de emisin, como las lmparas de


mercurio y deuterio, exhiben lneas agudas a longitudes
de onda especficas que son ideales para los test de
exactitud y precisin de longitud de onda. De hecho, en
muchos espectrofotmetros modernos, se utilizan las
lneas de deuterio a 486.0 y 656.1 nm de la fuente
incorporada, para comprobar y recalibrar la exactitud de
longitud de onda. Sin embargo, las fuentes de emisin
requieren alimentacin elctrica y, si el instrumento ha
sido auto-calibrado utilizando su lmpara de deuterio,
debe utilizarse otro patrn para verificacin. Adems,
debido a que las fuentes
de emisin no son muestras tpicas, no prueban el
sistema completo.

Escala fotomtrica
Exactitud

Precisin

= Am Aref

RSD =

Exactitud de 0,01 AU
6 mediciones de 0,006% w / v de
Dicromato de potasio en 235, 257,
313, y 350 nm debe ser inferior a
0,5% RSD.

EXACTITUD fotomtrica
Patrn

Ventajas

Desventajas

Cristal de
densidad
neutra

Perfil de absorbancia
muy llano en elrango
visible de longitud de
onda

No es adecuado para el rango UV


No es absolutamente estable; debe
recalibrarse regularmente

Dicromato
potsico en
cido
perclrico o
sulfrico

Picos anchos a 257 y 350 No absorbancia en el rango visible


nm y valles
Muy sensible al pH y, como agente
anchos a 235 y 313 nm
oxidante potente, puede ser inestable

La exactitud fotomtrica se determina comparando


la
absorbancia de una solucin de referencia (Tabla 3)
con la
lectura de sta, obtenida en el espectrofotmetro.
Para
cubrir satisfactoriamente el rango UV-Vis del
espectro, se
utilizan dos soluciones diferentes: dicromato de
potasio,
para el espectro UV y sulfato de cobre, para el
espectro Vis.

Luz dispersa

Aceptacin: la transmitancia de la solucin en


una celda de 1-cm debe ser inferior a 0,01, o el
valor de absorbancia debera ser mayor que 2.

La luz parsita se define como la luz detectada de cualquier


longitud de onda que est fuera del ancho de banda de la
longitud de onda seleccionada
La luz dispersa es el factor que ms afecta a la
relacin lineal entre la absorbancia y la
concentracin a absorbancias elevadas.
La luz parsita causa una disminucin de la absorbancia y se
reduce el rango lineal del instrumento. Absorbancia de alta
mediciones se ven afectados ms severamente por la luz
parsita.
La luz extraviada causa adems importantes desviaciones de
la Ley de Beer-Lambert. Tal como se aprecia en la figura N 1,
conforme aumenta la cantidad de luz extraviada que llega al
detector, disminuye la linealidad del mtodo.

Patrn

Ventajas

Desventajas

Disolucin de nitrito sdico Cortes a 390 nm


(50 g/l)
Usado para medir luz
dispersa a
340 nm o inferior

Ninguna

Disolucin de ioduro
potsico o
sdico (10 g/l)

Cortes a 260 nm
Usado para medir luz
dispersa a
200 nm o inferior

Tendencia a
descomponerse

Disolucin de cloruro
potsico
(12 g/l)

Cortes a 200 nm
Usado para medir luz
dispersa a
220 nm o inferior

Como la medida se realiza


en el lateral
de la pendiente de corte,
los errores de
exactitud de pueden
afectar a la
medida de luz dispersa

Linealidad fotomtrica
Graficar Am Absorbancia medida vs Aref Absorbancia de referencia .
A de la serie de soluciones de dicromato de
potasio (0,02; 0,04; 0,06; 0,08 y 0,1 g L-1), en Sl de cido sulfrico 0,005 mol L-1 235, 257,
313, y 350 nm
r 0,999 Aceptable
El estudio de la linealidad fotomtrica permite establecer el rango de absorbancia en el que
el instrumento tiene respuesta proporcional a los cambios de concentracin. Para ello se
determina la respuesta del espectrofotmetro a diferentes concentraciones de una
sustancia que cumpla con la ley de Lambert-Beer. Se evala la linealidad fotomtrica
realizando lecturas de absorbancia de la serie de soluciones de dicromato de potasio (0,02;
0,04; 0,06; 0,08 y 0,1 g L-1), utilizando la solucin de cido sulfrico 0,005 mol L-1 para
realizar el ajuste a 0 de absorbancia del equipo. Las longitudes de onda a que se realizan las
lecturas sern: 235, 257, 313 y 350 nm. Calcular con una regresin lineal el coeficiente de
regresin (r). Linealidad El rango lineal dinmico de la medicin est limitada por la luz
parsita en alta absorbancia y por el ruido en absorbancia baja. Para mediciones de rutina
con muestras y los estndares de referencia qumicas relacionadas, la exactitud de la
cuantificacin de la muestra depende de la precisin y linealidad de las mediciones.
Tests. Una serie de soluciones de dicromato de potasio de concentracin 20, 40, 60, 80, y
100 mg / L en 0,005 M de cido sulfrico se puede utilizar para comprobar la linealidad del
sistema. En primer lugar, 0,005 M de cido sulfrico como referencia se escanea y despus
las soluciones de dicromato de potasio en 235, 257, 313, y 350 nm. Los valores de
absorbancia a la longitud de onda diferentes se representan frente a la concentracin de las
soluciones y los coeficientes de correlacin se calculan. Aceptacin. Coeficiente de
correlacin r 0,999.

Ruido
Se origina principalmente a partir de la fuente de luz y componentes
electrnicos. El ruido en la medicin afecta a la precisin en ambos
extremos de la escala de absorbancia

El aire es escaneado en el modo de absorbancia para 10 min. pico a pico el ruido


se registra a 500 nm. La raz cuadrada media (RMS) de ruido se calcula. La
medicin del ruido RMS es una medida de la desviacin estndar de las seales
de fondo
Aceptacin. El ruido RMS normalmente debe ser inferior a 0,001 UA.

Un espectrofotmetro, tpicamente, tiene dos factores de ruido. El primero (ruido fotnico o Schott)
resulta de la distribucin estadstica de los fotones emitidos por una fuente de luz. Es proporcional a la
raiz cuadrada de la intensidad de luz. Cuando se miden muestras de baja concentracin con bajas
absorbancias, este factor puede evitar una medida exacta de la pequea diferencia entre dos niveles de
luz. El segundo factor es inherente a la
electrnica del instrumento (amplificador del detector, convertidor analgico-digital, etc.) y es
independiente de la intensidad medida. Este factor se convierte en significativo a altos niveles de
absorbancia, donde la seal de muestra es muy pequea. Puede minimizarse mediante un buen diseo.
El ruido afecta negativamente a la precisin de las medidas y, para una medida sola, puede introducir
tambin errores en la exactitud. Sin embargo, el ruido puede reducirse aumentando el tiempo de medida
(vea Promedio de tiempo en la pgina 67). uido
El ruido en la medicin de UV-Vis se origina principalmente a partir de la fuente de luz y componentes
electrnicos. El ruido en la medicin afecta a la precisin en ambos extremos de la escala de absorbancia.
Photon ruido de la fuente de luz afecta a la precisin de las mediciones de absorbancia baja. El ruido
electrnico de los componentes electrnicos afecta a la precisin de las mediciones de absorbancia alta
[8]. Un alto nivel de ruido afecta a la precisin de las mediciones y reduce el lmite de deteccin, haciendo
as que el instrumento menos sensible ruido
El ruido en la medicin de UV-Vis se origina principalmente a partir de la fuente de luz y componentes
electrnicos. El ruido en la medicin afecta a la precisin en ambos extremos de la escala de absorbancia.
Photon ruido de la fuente de luz afecta a la precisin de las mediciones de absorbancia baja. El ruido
electrnico de los componentes electrnicos afecta a la precisin de las mediciones de absorbancia alta
[8]. Un alto nivel de ruido afecta a la precisin de las mediciones y reduce el lmite de deteccin, haciendo
as que el instrumento menos sensible.
Tests. El aire es escaneado en el modo de absorbancia para 10 min. pico a pico el ruido se registra a 500
nm. La raz cuadrada media (RMS) de ruido se calcula. La medicin del ruido RMS es una medida de la
desviacin estndar de las seales de fondo. Espectrofotmetros modernos suelen estar equipados con la
funcin de estimacin de ruido. Para espectrofotmetros viejos , el ruido RMS puede estimarse
multiplicando el ms alto pico a pico de nivel de ruido en un factor de 0,7 (Figura 10,8). Aceptacin. El
ruido RMS normalmente debe ser inferior a 0,001 UA

Resolucin

Aceptacin. Sln tolueno 0.02% v/v en hexano La relacin de la


absorbancia a (269 nm) y la absorbancia a (266 nm) debe ser
mayor que 1,5.

Resolucin espectral La resolucin espectral es una medida de la


capacidad de un instrumento para diferenciar entre dos longitudes de
onda adyacentes. Dos se consideran resueltas, normalmente, si el mnimo
entre los dos picos de la seal de salida del detector es menor que el 80 %
del mximo. Esto se La resolucin est muy relacionada con la anchura de
banda espectral instrumental (SBW). La SBW se define como la anchura, a
la mitad de su intensidad mxima, de la banda de luz que sale del
monocromador La exactitud de cualquier absorbancia medida depende de
la relacin de la SBW a la anchura de banda natural (NBW) de la sustancia
absorbente. La NBW es la anchura de la banda de absorcin de la muestra a
la mitad de su mximo
de absorcin Una relacin SBW/NBW de 0.1 o menos, dar lugar a una
medida de absorbancia con una exactitud del 99.5 % o mejor.8,9 A una
relacin SBW/NBW mayor de 0.1, el espectro medido se distorsiona
progresivamente, como se muestra en la Figura 32. Las bandas no pueden
resolverse
correctamente y ocurrirn errores significativos en los valores de
absorbancia, a la mayora de las longitudes de onda. SBW es principalmente
una funcin de las anchuras de las rendijas de entrada y salida del
monocromador y de la dispersin generada por la red de difraccin. No son
inusuales resoluciones de 0.5, 0.2 y 0.1 nm, pero mayores resoluciones
pueden causar un considerable deterioro de la relacin S/N

Calificacin de Desempeo (PQ)

Bibliografa
Principios de anlisis instrumental 5 edicin. Pg.
348
D.G. Holcombre, M.C. Boardman. Guidance on
equipment qualification of analytical instruments:
UV-visible spectro (photo)meters (UV-Vis),
September 2000
Chow C. Analitical method validation and
instrumental performance verification.Jhon Willey
& son. New Jersey. 2004
Clare J.L. (2005) Calibration of UV-vis
spectrophotometers for chemical analysis.
Accreditation and Quality Assurance 10: 283-288