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PROTOCOLOS

FIXADORES

- Methacarn (imuno): p/ 100 mL

Fixação de 4 a 8 horas para peças
maiores, e de 3 horas para peças muito
pequenas. Depois, deixar em álcool 70%.

60 mL metanol
30 mL clorofórmio
10 mL ácido acético glacial

- Glutaraldeído 4% (luz / eletrônica): p/ 100 mL
8 mL glutaraldeído 50%
92 mL tampão fosfato 4% (0,05M)

* Tampão fosfato 0,05M (p/ 100 mL)

[guardar na geladeira]

Solução A: Fosfato de sódio monobásico [NaH2PO4 - H2O (mono-hidratado) 0,2M]
0,552 g

20 mL água destilada
PM = 138 g - 1 L 1M
x g - 1L 0,05 M

separar 19 mL desta solução

Solução B: Fosfato de sódio dibásico [Na2HPO4 (anidro) 0,2M]
2,555 g

90 mL água destilada

x = 6,9 g - 1 L
(1%) *4
x = 27,6 g - 1L
PM = 141,96 g - 1 L 1M
x g - 1L
- 0,05 M

separar 81 mL desta solução

Tampão = Solução A + Solução B (pH 7,2 ou 7,4)

x = 7,098 g - 1 L
(1%) *4
x = 28,392 g - 1L

- Bouin (imuno): p/ 1 L
714,3 mL ácido pícrico saturado
238,1 mL formal 40%
47,6 mL ácido acético glacial

Fixação de 24 horas. Depois, deixar em
álcool 70%.

Karnovsky [glutaraldeído 2% + paraformaldeído 4% + tampão de Sorensen (0. Acrescentar 8 g de paraformaldeído e agitar até dissolver.4.668 g 60 mL água destilada separar 56 mL desta solução Solução B: Fosfato de sódio dibásico [Na2HPO4 (anidro) 0.2M] 4.H2O (mono-hidratado) 0.2M] 1. * Tampão de Sorensen 0.523 g 19 mL água destilada . Adicionar 5 gotas da solução de hidróxido de sódio. mantendo a temperatura à 60°C.1M (p/ 200 mL) Solução A: Fosfato de sódio monobásico [NaH2PO4 .1M) * Solução de paraformaldeído 8% (p/ 200 mL) Aquecer 180 mL de água destilada a 60°C.H2O (mono-hidratado) 0. mantendo a temperatura à 60°C. mantendo a agitação e a temperatura até que a solução fique transparente.1M (p/ 100 mL) [guardar na geladeira] Solução A: Fosfato de sódio monobásico [NaH2PO4 .05M pH 7.Solução de paraformaldeído 4% (imuno): p/ 200 mL Aquecer 100 mL de água destilada a 60°C.2M] 0. * Tampão fosfatado 0. Acrescentar a mesma proporção de tampão fosfato 0.. mantendo a agitação e a temperatura até que a solução fique transparente. Adicionar 5 gotas da solução de hidróxido de sódio.2) . Acrescentar 16g de paraformaldeído e agitar até dissolver.248 g 150 mL água destilada separar 144 mL desta solução Tampão = Solução A + Solução B (pH 7.1M)] (luz / eletrônica): p/ 400 mL 34 mL glutaraldeído 25% 200 mL paraformaldeído 8% 186 mL tampão de Sorensen (0.

Inclusão em historesina (luz) 1) Álcool 70% por 2 horas (esta etapa é desnecessária caso o material esteja fixado em Karnovsky) 2) Álcool 95% por 2 horas 3) Álcool absoluto por 1 hora 4) Álcool absoluto + resina (1:1) por 1 hora 5) Resina overnight por 3 ou 4 dias (na geladeira) 6) Resina inclusão (cuidar do posicionamento dos tecidos / deixar endurecer na capela) * Preparação da resina 50 ml resina = 1 g ativador (p/ infiltração) 15 ml resina de infiltração = 1.294 g 81 mL água destilada Tampão = Solução A + Solução B (pH 7.Inclusão em parafina (luz) 1) Álcool 95% por 1 hora 2) Álcool absoluto 1 por 1 hora 3) Álcool absoluto 2 por 1 hora 4) Xilol 1 por 1 hora 5) Xilol 2 por 1 hora 6) Parafina (banho 1) por 2 horas 7) Parafina (banho 2) por 2 horas 8) Parafina (banho 3) overnight 9) Parafina inclusão (colocar nas caixinhas e cuidar do posicionamento dos tecidos / tomar cuidado para não formar bolhas) .4) PROCESSAMENTO .Solução B: Fosfato de sódio dibásico [Na2HPO4 (anidro) 0.2M] 2.2 ml endurecedor (p/ inclusão) obs: para inclusão deve-se trabalhar em capela. pois o endurecedor é cancerígeno .

ferver rapidamente levando a ebulição 4) Baixar a fervura e.Hematoxilina-Eosina * Hematoxilina de Harris 5g hematoxilina cristalizada 100 mL álcool 95% 20g sulfato de alumínio 1000 mL água destilada 2-4 mL ácido acético 3g óxido de mercúrio amarelo 1) Dissolver a hematoxilina no álcool 2) Dissolver o sulfato de alumínio em água quente (50°C) 3) Juntar as duas soluções. .COLORAÇÃO . * Eosina de Putt 1g eosina 0. juntar o óxido de mercúrio 5) Levar a solução novamente à fervura até tornar-se vermelho escuro 6) Retirar do fogo e deixar esfriar.Azul de toluidina-Borax 1g azul de toluidina dissolvido em 4 ml álcool absoluto 4g borato de sódio dissolvido em 400 ml água destilada Juntar as soluções * Procedimento Pingar o corante sobre todos os cortes e flambar em bico de bulsen.5g bicromato de potássio 10 mL ácido pícrico saturado 10 mL álcool absoluto 80 mL água destilada 1 gota de ácido acético 1) Dissolver a eosina no álcool absoluto 2) Dissolver o bicromato de potássio em água destilada 3) Juntar as duas soluções e mexer com bastão de vidro 4) Acrescentar a solução de ácido pícrico saturado e uma gota de ácido acético 5) Armazenar em vidro claro . com cuidado para não aspirar a solução. Em seguida lavar os cortes em água e fazer a bateria de desidratação para montagem de lâminas (3 minutos em cada banho para material processado em parafina e 30 segundos para os processados em resina). depois armazenar em vidro escuro 7) Adicionar o ácido acético (opcional) Obs: o ácido acético aumenta a especificidade do corante em corar o núcleo. esse corante é estável (filtrar antes de usar por causa do óxido de mercúrio.

xilol 1. agitar e deixar descansando 7) Filtrar e armazenar na geladeira para uso * Hematoxilina férrica de Weigert SOLUÇÃO A: 1g hematoxilina dissolvido em 100 mL álcool 95% (amadurecer por cerca de 1 mês em luz ambiente) SOLUÇÃO B: 1. e de 30 segundos para os incluídos em resina) Na montagem. sendo que o material incluído em resina não passa pelas etapas de xilol) Lavar em água corrente de torneira por 5 minutos Corar com hematoxilina por 2-5 minutos (parafina) / 15-20 minutos (resina) Lavar em água corrente de torneira por 5 minutos Contracorar com eosina por 1-2 minutos (parafina) / 8-10 minutos (resina) Desidratar na bateria de: álcool 95%. xilol+álcool (1:1). xilol 2. álcool 95%.* Procedimento Desparafinizar e hidratar as lâminas em: xilol 1. álcool absoluto. em ambiente escuro por 24h para a descoloração da solução (≈ cor de palha) 6) Acrescentar 0.25g de carvão ativado para cada 100 mL de solução. álcool 70% (banhos de 3 minutos. xilol 2.2g de cloreto de ferro dissolvidos em 4 mL água destilada. deixar por 2h em repouso 4) Filtrar e colocar o ácido clorídrico 5) Armazenar em frasco escuro. álcool absoluto.NÃO ESTOCAR! .5g fucsina básica 9g metabissulfito de sódio 3 mL ácido clorídrico 200 mL água destilada 1) Dissolver a fucsina básica em água destilada e ferver por 5 minutos (no momento da fervura abaixar o fogo) 2) Retirar do fogo e acrescentar o metabissulfito de sódio 3) Agitar a solução por 1h30 e. acrescentar mais 95 mL água destilada e 1 mL ácido clorídrico concentrado SOLUÇÃO FINAL = 50% solução A + 50% solução B Obs: preparar apenas o que será usado na hora . montar e deixar secar à temperatura ambiente ou na estufa à 37°C . limpar as lâminas com cuidado em volta do corte. xilol final para montagem (banhos de 3 minutos para material incluído em parafina. deixando o tecido úmido para uma melhor aderência da goma na lamínula e no corte Colocar a Goma de Damar. depois.PAS+Hematoxilina férrica+Metanil Yellow * Ácido periódico 1% 1g ácido periódico dissolvido em 100 mL água destilada * Reativo de Schiff 1.

se não fica muito amarelo) Tirar o excesso de Metanil yellow com uma passada rápida em água e. não ocorrendo. passar o material 30 segundos em xilol para montagem e montar as lâminas com Goma de Damar Obs: não desidratar o material corado com álcool.25 mL ácido acético global diluído em 50 mL água destilada Separar 25 mL desta solução SOLUÇÃO FINAL = solução A + solução B + 15 mL água destilada Obs: a solução fica vermelho bem forte e não é recomendado utilizar este corante quando está velho. agitar lâmina por lâmina como se agitasse um termômetro Colocar na estufa overnight para desidratar No dia seguinte. * Procedimento (para material incluído em resina) Desidratar os cortes em estufa 60°C overnight Hidratar em água destilada (só uma passada) Deixar em ácido periódico 1% por 10 minutos Lavar em 3 trocas de água destilada (ou água corrente por 10 minutos) Deixar no Reativo de Schiff durante 1h Lavar em água corrente por 10 minutos Corar com hematoxilina férrica por 5-6 minutos (o tempo varia de acordo com o animal e com a espessura dos cortes. a filtragem é dispensada.01g metanil yellow dissolvido em 10 mL água destilada Separar 10 mL desta solução SOLUÇÃO B: 0. assim quando o mesmo estiver alaranjado deverá ser descartado. caso isso ocorra recomenda-se filtrar o mesmo. uma outra razão para que a substância mude de coloração é a volatilização do ácido acético.* Metanil Yellow SOLUÇÃO A: 0. de forma que o recipiente de armazenamento do corante deve ser bem vedado. pois o Metanil yellow é solúvel no mesmo e pode sair da lâmina PROCESSAMENTO . é preciso fazer um teste com cada material a ser trabalhado a fim de se padronizar o tempo) Lavar em água corrente por 10 minutos Contracorar com Metanil yellow por 2 minutos (se for corar o material no mesmo dia em que foi feita a solução tem que deixar menos tempo. Obs2: verificar nas lâminas se o corante está deixando precipitados. em seguida.

Imuno por peroxidase (protocolo básico) 1) Desparafinizar e hidratar as lâminas em: xilol 1. xilol 2.2x 5 minutos 7) Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 3% por 30 minutos a temperatura ambiente (5 mL de H2O2 + 45 mL de PBS) 8) Lavar em PBS .9g NaCl 2.2x 5 minutos 14) Incubar com anticorpo secundário com polímero Leica por 30 minutos a temperatura ambiente 15) Lavar em PBS .2x 5 minutos 3) Recuperação antigênica com tampão citrato de sódio 0.94 µL para 100 mL água destilada) 4)Esfriar os cortes na mesma solução em temperatura ambiente por 20 minutos 5) Lavar em água corrente por 10 minutos 6) Lavar em PBS . xilol 3. álcool 70% (banhos de 10 minutos) 2) Lavar em PBS .2x 5 minutos 9) Bloqueio dos sítios inespecíficos com leite Molico 5% por 30 minutos a temperatura ambiente 10) Incubar com anticorpo primário a 4o C por 18h 11) Lavar em PBS .01M .. em torno de 5 minutos cada) 22) Montar as lâminas com Goma de Damar * PBS (p/ 10 L de solução) 87. xilol+álcool (1:1).74g KH2PO4 (fosfato de sódio monobásico) 11.4 . álcool 95%. álcool absoluto. xilol 1.2-7. xilol+álcool. álcool 95%.2x 5 minutos 12) Incubar com bloqueio pós-primário Leica por 30 minutos a temperatura ambiente 13) Lavar em PBS . xilol 2. xilol final para montagem (banhos de 3 minutos) (Os banhos com xilol podem ser mais longos.15 minutos a 90º C (Pode-se utilizar o kit Antigen Unmaskin Solution Vector .35g Na2HPO4 (fosfato de sódio dibásico) 10 L água destilada Diluir todos os sais em água destilada e acertar o pH 7. álcool absoluto.2x 5 minutos 16) Revelação com DAB (STOP em água destilada) 17) Contracorar com Hematoxilina de Mayer por 5 minutos 18) Lavar em água corrente por 1 minuto 19) Diferenciar em carbonato de lítio 3x 20) Lavar em água corrente por 1 minuto 21) Desidratar na bateria de: álcool 70%.