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FUNDAMENTOS EN CROMATOGRAFA DE

LQUIDOS DE ALTA RESOLUCIN. ACOPLAMIENTO


A DETECTORES DE ESPECTROMETRA DE MASAS

Manuel Gayo Gonzlez


Responsable de Ventas Zona Centro
Consultor GCMS&GCQQQ

Universidad de Vigo, 22 Junio 2010

TCNICAS DE SEPARACIN

TCNICAS DE SEPARACIN

Definicin de Cromatografa de Lquidos


En cromatografa de liquidos, los componentes a separar se distribuyen
entre dos fases: una fase estacionaria y una fase mvil .
Los componentes se separan debido a la diferencia de migracin entre la
fase estacionaria y la fase movil.La fase mvil introduce los analitos en la
columna y a travs del sistema.

Como fse mvil se utilizan lquidos.

COMPONENTES
Disolventes
Bomba
Sistema de Introduccin de la Muestra
Columna
Detector
Adquisicin de Datos

COMPONENTES: DISOLVENTES PARA HPLC


Pureza
Viscosidad
ndice de Refraccin
Punto de Ebullicin
Toxicidad
Trasparencia UV
Solubilidad

USO PREFERENTE DE ACETONITRILO


Tener en cuenta:
[cP]

a 20 C

Viscosidad

La alta viscosidad de las


mezclas metanol/agua
(mximo a 40/60)

2
CH3OH

n-Propanol
Perfiles de Presin con Gradientes Concentracin

~ 1.3
1

CH3CN

~ 0.6

1 Etanol
Presin CH3OH / H2O

Metanol
Acetonitrilo
20

40

60

% Orgnico [w/w]

Presin CH3-CN / H2O

100%
80
70/30 org. /agua

70%CH3OH 59%ACN permite Flujo x 1.9

Perfil de Concentracin

poder eluotrpico equivalente

El grfico de viscosidad vs % orgnico es til para poder calcular relaciones aproximadas de viscosidad entre
distintas composiciones de eluyentes y poder calcular presiones equivalentes:
p.e. 100 bars con ACN/H20 70/30 equivalen a 100 x (1.3/0.6) = 217 bars con CH3OH/H20 70/30

COMPONENTES: BOMBA DE HPLC

Gradiente a baja Presin

BOMBA CUATERNARIA

Gradiente a alta Presin

BOMBA BINARIA

COMPONENTES: SISTEMA DE
INTRODUCCIN DE LA MUESTRA
Disolver la muestra en la fase
mvil o en un disolvente miscible
Disolver la muestra en la mnima
cantidad posible de disolvente

COMPONENTES: COLUMNA
Tipo de Fase Estacionaria
Dimesiones
Tamao de partcula:

Importancia del tamao de partcula


0.0045

Prdidas de
eficiencia con
incrementos de
flujo

0.0040
0.0035

HETP (cm/plate)

0.0030

Mayor Velocidad

0.0025

5.0 m

0.0020
0.0015

Inyecciones en columnas
mas cortas con menores
tamaos de partcula a
mayores velocidades

3.5 m

0.0010
0.0005

Ganancias en velocidad:
5-10x

1.8 m

0.0000

2mL/min

-0.0005
Eficiencias 0.0
comparables
en zona de bajo
flujo

0.2

0.4

5.0 mL/min
0.6

0.8

1.0

1.2

Interstitial linear velocity (ue- cm/sec)

1.4

1.6

Particula

Hmin

5.0 m
3.5 m
1.8 m

9.3 m
6.0 m
3.8 m

Seleccin del D.I. de la Columna segn Tipo de


Sistema de Bombeo
Flujo
tpico

Ganancia Terica en
Sensibilidad UV

Seleccin de la Longitud Columna y Tamao de


Partcula del Relleno versus Eficacia
La Eficacia aumenta con la reduccin del tamao de partcula ( N= f(L / 2d p) )
El tiempo de anlisis se reduce acortando la longitud de la columna. ( Tr = f(L / F) )
Reduciendo Longitud y Tamao de partcula, pero manteniendo flujo y n platos proporcionados por la columna,
se conseguir reducir el tiempo de anlisis y consumo de disolvente sin perder Resolucin.

Aportaciones de la Temperatura en HPLC

Permite trabajar a flujos mayores.

Aumenta el poder de elucin de la fase mvil.

Aporta un parmetro adicional para cambiar la selectividad y


mejorar la resolucin en la separacin de algunos compuestos.

Traslada el flujo ptimo a valores mayores.

Reduce la prdida de eficacia al trabajar a flujos elevados.

Reduccin del Tiempo de Anlisis mediante


Incremento de la Temperatura
Columna: Zorbax SB-C18, 4.6 x 75 mm, 5
Eluyente:
74% 7.4 mM hexano sulfonato y
0.07% cido fosfrico
26% MeOH
Flujo:
1 mL/min (constante)
Deteccin:
UV 280 nm
Muestras:
Vitaminas B

Baja
Temperatura

Optimizacin
Mtodo
Trabajar a temperaturas ms altas
permitir reducir considerablemente los
tiempos de anlisis y en ocasiones
cambiar la selectividad de la separacin.

Alta
Temperatura

Acorta a 1/3 el
tiempo anlisis
min.

Efecto de la Temperatura en la Viscosidad


del Eluyente y Presin de Trabajo
Reduccin
viscosidad
-35%

-55%
-65%

Reduccin de los Tiempos y Cambios de


Selectividad con la Temperatura. Efecto de la
Temperatura en Tiempo Retencin y Resolucin

COMPONENTES: DETECTORES
Caractersticas del detector ideal:
Sensible
Selectivo
Lineal
Informacin cuantitativa
Fiable
Facil de usar
Universal

COMPONENTES: DETECTORES
Detectores de UV-Vis:

Detector de Diode Array

Detector de longitud de onda variable

PARAMETROS DEL DETECTOR: Frecuencia de


Adquisicin

PARAMETROS DEL DETECTOR: Ajuste Frecuencia


de Adquisicin
Rojo: 13 puntos medida/pico
Azul:

50 puntos

Verde: 125 puntos


S/N= 2.5

S/N= 7.5

Una pequea prdida en resolucin mejora considerablemente la sensibilidad

RSD% requerido
1%
2%
5%
10%

Mn. S/N (p/p)


100
50
20
10

MODOS DE OPERACIN EN HPLC

ACOPLAMIENTO DE DETECTORES DE
ESPECTROMETRIA DE MASAS

PERO QU DETECTOR?

.
MUESTRA

CUANTITATIVO

CUALITATIVO

MATRIZ SUCIA?

Sabemos lo que
Buscamos?

SI

Necesitamos
masa exacta

No

TOF

No

No

Menor de 5 pg
En columna?

SI

>1 ng en columna

QQQ

SI

No

SI

Necesitamos
SI

Qualifiers
Ions/Spectrum?

No
o Multi ion SIM

Aceptable
%RSD: >8%

No

No
SI

Si-spectrum
or MS/MS qualifiers
SI

Trampa

CONCENTRACIN?

Q
QQQ Trampa
TOF

SI

Necesitamos MS/MS?

Bbaja concentracin

$$$>

QQQ

$$>

No

TOF

ESQUEMA DEL DETECTOR DE CUADRUPOLO SIMPLE

video

Modos de trabajo. Cuadrupolo Simple: Full Scan MS


Detector
API
Fuente
El cuadrupolo monitoriza de
modo secuencial todas las m/z en
el rango seleccionado por el
usuario

Modos de trabajo.
Cuadrupolo Simple: Trabajo en SIM
La mejor sensibilidad para cuantificacin
Buena selectividad
La cromatografa puede mejorar la especificidad
No proporciona informacin estructural

Detector

API
Fuente

El cuadrupolo solo deja pasar


(transmite) iones de una unica m/z
hacia el detector
Gua de iones hacia el cuadrupolo

Formacin de iones +/- y de


especies neutras

Modos de trabajo. Cuadrupolo Simple: CID en la


fuente

Fuentes en LCMS

Aplicabilidad relativa de las tcnicas de ionizacin


API-Electrospray:
LC/MS

APIElectrospray

Peso Molecular

100,000

10,000

La tcnica de ionizacin ms suave.


Ideal tambin para compuestos lbiles.
Interfase con mayor sensibilidad y aplicabilidad.
Vlida para compuestos de baja-media a muy
alta polaridad que se puedan ionizar en solucin.
Mediante la formacin de iones con mltiples
cargas, permite el anlisis de compuestos de muy
elevado peso molecular.

APPI

APCI:
1000

APCI
GC/MS

no polar

FAB

Thermospray
Particle
Beam

Polaridad del analito/


Solubilidad en Agua

muy polar

Las interfases LC/MS tipo API (Electrospray


/APCI) son hoy en da las ms utilizadas

Vlida para compuestos de baja a alta polaridad;


no se requiere que estn ionizados en solucin.
Requiere compuestos con una cierta volatilidad.
Buena sensibilidad para compuestos de polaridad
y peso molecular intermedios.
Tcnica que complementa a API - Electrospray
para el anlisis de analitos poco polares.

APPI:
Vlida para compuestos de muy baja a alta polaridad;
no requiere que estn ionizados en solucin.
Requiere compuestos con una cierta volatilidad.
Posibilita el anlisis de compuestos apolares.

Robustez y Facilidad de uso


Despus de 635 inyecciones de una muestra con alta
concentracin sales (%)

Limpieza de la Fuente

RESUMEN: Ventajas del acoplamiento LCMS

Operacin robusta
Identificacin y confirmacin
Sensibilidad y Especificidad
Facilidad de Uso
Tecnologa asequible

LCMS 6150

1973

LCMS6120

GRACIAS!