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Introduo

A invertase (E.C. 3.2.1.26), ou -D-fructo-furanosidio-frutohidrolase, ou


sacarase, a enzima responsvel pela liberao do resduo L-Dfructofuranosidio
no-redutor, a partir da molcula de dissacardeo (GracidaRodrguez et al., 2005). Seu substrato preferencial a sacarose, resultando
na sua hidrlise uma molcula de glicose e outra de frutose, porm,
tambm, pode hidrolisar ramonose e estaquiose (Fiedurek et al., 2000).
Historicamente, esta enzima tem grande importncia, uma vez que foi a
primeira protena a ser identificada como um biocatalisador. Tambm, foi a
partir de estudos com invertase, que foram construdos os princpios
fundamentais da enzimologia, como a hiptese de chave-fechadura para
atividade enzimtica (Brown, 1902), a equao de Michaelis-Menten
(Michaelis & Menten, 1913), o conceito de ponto isoeltrico (Michaelis &
Davidsohn, 1911; Michaelis & Rothstein, 1920) e a hiptese de Briggs &
Haldane (1925), em que o complexo formado entre enzima e substrato no
representa um equilbrio, mas sim um estado estacionrio.
A invertase est presente em diversas frutas e tubrculos, como por
exemplo: mamo, manga, banana, peras, mas, batatas entre outras,
tendo grande participao nos seus processos de amadurecimento e
apodrecimento (Chapper et al., 2004; Torija et al., 1998).

Apresentao
As enzimas so biomolculas responsveis pela catlise de diferentes
reaes em sistemas biolgicos. Atravs da diminuio da energia de
ativao reacional, elas possibilitam que a vida possa ocorrer em condies
amenas de temperatura e presso. Industrialmente, esse fato vem despertando
muito interesse, pois permite a economia de energia a ser aportada
aos processos de converso, gera menos co-produtos e resduos, sendo
parte de um sistema ambientalmente amigvel.
Cintica enzimtica
Enzimas so protenas que catalisam reaes que, sob condies naturais,
seriam muito lentas. O aumento da velocidade de uma reao se deve diminuio
de energia livre de ativao. A cintica enzimtica tem por objetivo a compreenso
do mecanismo de ao das diferentes enzimas e da velocidade das reaes por elas
catalisadas. Este estudo tambm avalia as alteraes na velocidade da reao em
resposta a modificaes de parmetros experimentais, como a concentrao de
substrato, o tempo de incubao, a temperatura de incubao ou a variao do pH.

Ao enzimtica da invertase:
A enzima sacarase ou invertase (-fructofuranosidase) uma enzima que catalisa a
hidrlise da sacarose (acar no redutor) em glucose e frutose (dois acares
redutores, capazes de reduzir os ies frrico ou cprico, presente no reagente de
Fehling):
Sacarose + H2O Glucose + Frutose
Por definio, 1 unidade (U) de invertase hidrolisa 1 mol de sacarose a glucose e
frutose por minuto, a pH 4,6 (25C). A reao pode seguir-se facilmente
determinando a quantidade de acares redutores libertados por ao da enzima,
utilizando, por exemplo, a reao do cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS).

Materiais usados:
Sacarose 0,2 M
Invertase em tampo acetato de sdio 0,05 M pH 4,7
Tampo acetato de sdio 0,05 M pH 4,7
Reagente 3,5 dinitro saliclico (DNS) em meio alcalino
Banho-maria a 37
Espectrofotmetro

PREPARO DOS REAGENTES:


1. Soluo de enzima invertase (0,1 mg protena/mL): isolamento a partir de
leveduras. Pesar 50 mg de leveduras secas (fermento de po), suspender em 250
mL de bicarbonato de sdio 0,15 mol/L e manter em banho-maria a 37C durante 6
horas, com agitao ocasional. Centrifugar o sobrenadante por 20 min. a 3.500 rpm.
Coletar o sobrenadante, o qual contm a enzima ativa. Conservar a temperatura de
4C. Normalmente a concentrao de enzimas para os ensaios de 0,1 mg
protena/mL.
2. Substrato: Sacarose 0,2 mol/L (68 g para 1L de gua, balo volumtrico) usar
esta soluo para obter as solues mais diludas.
3. Soluo tampo acetato 0,05 mol/L, pH 4,7: Acetato de sdio 0,05 mol/L(A),
cido actico 0,05 mol/L (B). Misturar 150 mL da soluo A e 300 mL da soluo B.

4. Soluo alcalina de 3,5-dinitro-salicilato: dissolver sob aquecimento 5g de


cido 3,5-dinitro-saliclico em 100 mL de NaOH 2 mol/L. Separadamente dissolver
sob aquecimento 150 g de tartarato duplo de sdio e potssio em 250 mL de gua
destilada. Misturar as duas solues e completar o volume para 500 mL com gua
destilada.

Adicionar os reagentes conforme a tabela:

Reagentes (ml)
Tubo
Tubo
1
2
Tampo acetato (50
mM pH 4,7)
Agua
Sacarose (0,2M)
Soluo de enzima
(0,05 mg/ml)

Tubo
3

Tubo
4

Tubo
5

1
0,5

0,8
0,5

0,8
0,5

0,8
0,5

0,8
0,5

0,2

0,2

0,2

0,2

Metodologia
Identificar os tubos; o primeiro com a letra 1B, o segundo com o nmero 2, o terceiro
com nmero 3, e assim por diante at o nmero 5.
Adicionar Tampo acetato aos tubos de ensaio 1ml, em cada tubo
Adicionar gua aos tubos de ensaio. No tubo B foi adicionado 1ml de gua, no tubo
2 foi adicionado 0,8ml, no tubo seguinte 0,8ml, o tubo 3 adicionou-se 0,8ml, no tubo
4 foi adicionado 0,8ml, e no ultimo.
Em seguida, adicionou-se Sacarose em cada um dos tubos, No tubo 1 B foi
adicionado 0,5ml, no 2 foi 0,5ml, no 3 foi 0,5ml, no 4 foi 0,5ml, e no tubo 5 foi
adicionado 0,5 de glicose.
Em seguida, adicionou-se soluo enzima, com exceo do tubo nmero 1B, 2 foi
adicionado 0,8ml, no tubo seguinte 0,2ml, o tubo 3 adicionou-se 0,2ml, no tubo 4 foi
adicionado 0,2ml, e no ultimo.
Os tubos 3, 4 e 5 foram levados a o banho-maria ao a 25 0C, onde ficaro por cerca
de 5 mim, logo aps o banho foram incubados por tempos diferentes durante 5 min.
(tubo 3), 10 min. (tubo 4), 15 min. (tubo 5).

Em quanto isso foi adicionado 1,0 mL de soluo de 3,5-dinitrosalicilato aos tubos 1


e 2.
Imediatamente aps a retirada do tubo do banho-maria, foi adicionado 1,0 mL de
soluo de 3,5-dinitrosalicilato.
Ao trmino da incubao do tubo 5, todos os tubos aqueceram em banho fervente
durante cinco minutos , logo aps deixamos resfriar por 5 min.
Adicionamos 6,5 mL de gua destilada a cada tubo.
A uma mudana de colorao nos tubos que foram adicionados DNS juntamente
com a enzima com a sacarose ficando com uma cor amarelada, Tubos 4 e 5 porem
o tubo 1 no muda de cor ps no foi adicionado a enzima.
Depois foi medida a absorbncia dos tubos no comprimento de onda de 540nm tubo
1B . Foram encontrados os seguintes valores de absorbncia
Tubos
Valores de
absorbncia

1
540

2
3
4
1.175 0,552 0,602

5
...

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