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MARCO TEORICO

EL METODO DE KJELDAHL
El Metodo de Kjeldahl se emplea para la determinacin del nitrgeno total y
la posterior cuantificacin de protena bruta o verdadera de una muestra. Se
basa en la digestin del analito en cido sulfrico concentrado a ebullicin,
con la adicin de un catalizador. La muestra se digiere hasta disolucin y
oxidacin de la misma. El nitrgeno contenido en la muestra se convierte en
sulfato de Amonio.
Aadiendo un exceso de solucin de sodio hidrxido, el ion amonio es
liberado , destilado y recogido sobre una solucin de cido brico. El borato
acido de amonio producido se titula con una solucin de un acido fuerte
como el HCl previamente valorado. Este mtodo fue desarrollado en 1883
por el investigador Johann Kjeldahl.
REACCIONES EN LA PAGINA 132
METODO DE BIURET
Este mtodo se emplea para la cuantificacin de protenas ya que los
compuestos que contienen enlazes peptidicos al formar complejos de
coordinacin con los iones cpricos y 4 atomos de nitrgeno provenientes
de los pptidos, producen
un color violeta-rosado
bajo condiciones
alcalinas. la intensidad del color (absorbancia) es proporcional al contenido
protico de la muestra. se cuantifica espectrofotomtricamente a (540nm).
el reactivo incluye sulfato de cobre, naoh, y tartrato de sodio y potasio el
cual se utiliza para estabilizar el in cobre en la solucin alcalina
METODO DE BRADFORD
Este mtodo se basa en la reaccin de la forma anionica de residuos de
arginina, lisisna histidina, triptfano tirosina y fenilalanina de la protena,
con la forma cationica del reactivo azul de comassie G-250; SE ADHIERE A
LA PROTENA y vira DE un color ROJIZO A AZUL al encontrarse en el entorno
hidrofbico del interior de la protena, EL MXIMO DE ABSORCIN DEL
COLORANTE se presenta A 595nm. La mayor interferencia que se puede
presentar son los detergentes como el sds y el triton x-100.
METODO DE ABSORCIN EN EL ULTRAVIOLETA
las protenas muestran un fuerte grado de absorcin a 280nm en uv,
principalmente debido a los residuos de aminocidos aromaticos como el
triptfano, la tirosina y fenilalanina, dado que cada protena tiene una
compoasicin nica de aminocidos aromticos, el coeficiente de absorcion
molar
deben ser determinados para protenas individuales para la
estimacin del contenido protico.

La absorcin esta relacionada linealmente con la concentracin, de acuerdo


con la ley de Lambert-Beer
(PAG 133: ECUACION)

TABLAS DE DATOS Y RESULTADOS


Harina empleada: arveja
Metodo de Kjeldahl
Peso de la harina: 40 mg
EXTRACCION DE FRACCIONES PROTEICAS
Peso de la harina para la extraccin: 2,006 g
Volumen de cada ext: 25,0 ml
Vol. Alcuota analizada: 5,0 ml
Blanco de reactivos: Volumen de HCl: 3,68 M HCL: 0,0106 M
%de
proteina
%Nitrog en la
Muestra vol HCl eno
muestra
Harina 1
5,60
0,712
4,45
Harina 2
12,90
3,42
21,38
Albumin
as
20,75
1,37
3,95
Globulin
as
16,45
0,47
2,95
Prolami
nas
7,90
0,16
0,98
Glutelin
as
29,65
0,96
6,00
MUESTRA DE CALCULOS
a) Para la harina completa
b) Para una de las fracciones

Metodo de Biuret
Curva de calibracin concentracin del patrn: 5mg/ml

Metodo de Biuret
0.3
0.2
Absorbancia 540 nm

f(x) = 0.17x + 0.04


R = 0.97

0.1
0.0
0

0.2 0.4 0.6 0.8

1.2 1.4 1.6

[Proteina]

Tub Concentrac
o
ion
1
0,1
2
0,3
3
0,5
4
0,7
5
0,9
6
1,2
7
1,5
MUESTR
AS
ABS
%PROT

Abs 540
nm
0,043
0,078
0,124
0,164
0,215
0,224
0,277

ALBUMIN GLOBULI GLUTELI PROLAMI


AS
NAS
NAS
NAS
0,092
0,072
0,107
0,03
4,129
1,420
2,625
0,839

Preparacion de tubos:

Prolaminas y albuminas: (tubo 8) vol. Extracto: 0,5 mL


Vol. Final: 5 ml

Globulinas y glutelinas: (tubo 9) vol. Extracto: 1,0 mL


Vol. Final: 5 ml

(MUESTRA DE CALCULOS METODO DE BIURET)

METODO DE BRADFORD
Curva de calibracin concentracin del patrn: 1mg/ml

Metodo de Bradford
0.6
0.5
0.4
Absorbancia 595 nm 0.3
0.2

f(x) = 0.13 ln(x) + 0.63


R = 0.95

0.1
0
0

0.05 0.1

0.15 0.2 0.25 0.3

[Proteina] (mg/ml)

Tubo
1
2
3
4
5
6

Concentra Abs 280


cion
nm
0,032
0,153
0,064
0,307
0,12
0,353
0,16
0,412
0,24
0,417
0,32
0,485

*Abs 5950 %
muestra
nm
Proteina
Prolamin
as
0,058
0,40
Glutelina
s
0,316
2,80
*Factor de dilucin 25. (respecto a la solucin original)
(muestra de clculos)

METODO DE ABSORCION EN EL ULTRAVIOLETA


Curva de calibracin concentracin del patrn: 5mg/ml

0.35

Absorcion U.V
1.2
1

f(x) = 0.79x + 0.04


R = 0.99

0.8
Absorbancia 280 nm 0.6
0.4
0.2
0
0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

1.4

[Proteina] mg/ml

Tubo
1
2
3
4
5
6

Concentra
cion
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2

Abs
280 nm
0,191
0,342
0,506
0,695
0,854
0,955

F.
*Abs
%
proteica
280 nm Proteina
albuminas
2,623
20,35
Globulinas
2,018
15,59
Prolaminas
1,056
8,02
Glutelinas
1,898
14,65
*Factor de dilucin: 5. (respecto a la solucin original)
(muestra de clculos)
RESUMEN DE RESULTADOS
MUESTRA
HARINA
ALBUMIN
AS
GLOBULI
NAS
PROLAMI
NAS

KJELDAH
L
21,38

BIURET

UV

ND

BRADFOR
D
ND

ND

LITERATU
RA*
21-26%

3,95

4,129

ND

20,35

4,5

2,95

1,420

ND

15,59

14,1

0,98

0,839

0,40

8,02

0,2

GLUTELIN
AS

6,00

2,625

2,80

14,65

2,6

*http://www.samconet.pe/productos/producto7/descripcion7.htm. A partir de estas


referencias se calcula el porcentaje de protena presente en la harina de arveja.
Tomando como el 100% el valor hallado por el mtodo de kjeldahl; ya que el
reportado en la literatura no es un valor exacto sino un intervalo el cual contiene el
valor determinado experimentalmente.

DISCUSION DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES


El principal objetivo de la practica realizada fue cuantificar la protena total y
parcial; (albuminas, globulinas, glutelinas, prolaminas) presentes en la
harina de arveja, por medio de cuatro diferentes mtodos para luego
compararlos entre s.
El primero de ellos es el mtodo de kjeldahl, en el se debe emplear un
blanco con solo reactivos para sustraer el nitrgeno reactivo del nitrgeno
de la muestra. Con este mtodo se obtuvo un valor de protena total,
bastante preciso si se compara con el reportado en la literatura: (21,38%
pertenece al intervalo [21-26%]), con este primer valor se puede afirmar
que el mtodo es bastante exacto si se tiene en cuenta cada factor
influyente en los resultados. No obstante, al realizar los clculos respectivos
a las fracciones extradas de la harina se puede notar que los valores
difieren de los esperados, mucho ms en las muestras de glutelinas y
globulinas.
Antes de continuar vale la pena resaltar prioritariamente el mtodo de
absorcin U.V ya que fue el que mayor discrepancia presenta con respecto a
los valores tericos y en cada una de las fracciones arroja valores muy
superiores, sin embargo no se tiene una idea clara del porque de este
hecho, siendo que la curva de calibracin y los tubos de las muestras se
realizaron siguiendo estrictamente lo sealado en la bibliografa y los
clculos fueron revisados minuciosamente, este incidente obliga a descartar
las medidas realizadas en esta prueba para la comparacin y anlisis de
resultados.
Ahora, para las albuminas se verifica que se cuantifico relativamente lo
mismo en los tres mtodos en cuestin, y estos valores son bastante
cercanos a los esperados, la pequea diferencia pudo ser evitada
probablemente con una extraccin mas con agua desmineralizada realizada
al residuo obtenido despus de la centrifugacin. Anlogamente en el
anlisis de globulinas (mtodos de kjeldahl y Biuret) la diferencia del valor
experimental es desmesurado respecto al valor terico; este hecho se
puede justificar fcilmente afirmando que en el momento de la extraccin

esta fraccin proteica no fue aislada completamente ya que los dos ensayos
arrojan valores muy bajos (1,42-2,95), siendo que el porcentaje real est
alrededor del 14%. Sin embargo esta hiptesis no es del todo viable puesto
que las globulinas son muy solubles en soluciones salinas diluidas y se
habran extrado escasamente el 20% de la protena. Por otro lado, las
glutelinas el porcentaje se mantiene casi constante en los mtodos de
Biuret y Bradford y aumenta drsticamente en el kjeldahl, lo que sugiere un
error netamente experimental en este mtodo, posiblemente se deba a que
en el momento de darle paso al NaOH al 50 % a travs del embudo se filtro
un poco de base hacia el erlenmeyer que contena el destilado, siendo as el
volumen de HCl gastado al titular la muestra seria mucho mayor al que
gastara el NH4+ generado por la protena, afectando de esta forma los
resultados. Por ltimo las prolaminas, se cuantificaron alrededor de [0,440,98] valores bajos pero cercanos al terico ya que el contenido de esta
protena en la arveja es bastante bajo con respecto a las dems.
Se puede concluir entonces que:

El contenido total de protena en la harina de arveja es 21,38%


El mtodo que mayor inconvenientes o margen de error presento fue
el de absorcin U.V.
Se obtiene un porcentaje promedio de 3,97% de albuminas, y 2,65%
de glutelinas, siendo esta la cuantificacin mas exacta.