Practicas de Laboratorio de Bioquimica Sep 08

Gua para Prcticas de Laboratorio
Mdulo de Bioqumica - UNAD
GUA PARA PRCTICAS DE LABORATORIO DE

BIOQUMICA
ING. RUBN DARO MNERA TANGARIFE
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

UNAD
ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGA E INGENIERA
PALMIRA, SEPTIEMBRE DE 2008
1
Nota aclaratoria:
Las prcticas mnimas a realizar son las que corresponden a los numerales 5.1.1;
5.1.2; 5.2.1; 5.3.1 y 5.3.2. En donde exista la disponibilidad de equipos y
materiales de laboratorio se harn las dems prcticas, de acuerdo con las
indicaciones de Coordinador de Prcticas de Laboratorio o Tutor asignado para tal
fin.
TABLA DE CONTENIDO
Pgina
1. INTRODUCCIN ................................................................................................ 4
2. INFORME DE LABORATORIO .......................................................................... 4
3. ASPECTOS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO ..................................... 4
3.1 NORMAS PERSONALES ............................................................................. 5
3.2 NORMAS PARA EL MANEJO DE REACTIVOS Y SOLUCIONES .............. 6
3.3 MANEJO DE SUSTANCIAS QUMICAS ...................................................... 6
3.4 CAMPANA DE EXTRACCIN...................................................................... 7
3.5 SMBOLOS DE RIESGO............................................................................... 7
4. PREPARACIN DE REACTIVOS ...................................................................... 9
4.1 DISOLUCIN DE YODO............................................................................... 9
4.2 REACTIVO DE LUGOL DETECCIN DE ALMIDN .............................. 10
4.3 REACTIVO DE TOLLENS DETECCIN DE ALDEHDOS...................... 10
4.4 REACTIVO DE FEHLING DETECCIN DE AZCARES REDUCTORES
........................................................................................................................... 11
4.5 REACTIVO DE BIURET DETECCIN DE PROTENAS ......................... 12
5. PRACTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUMICA ....................................... 13
5.1 PRCTICAS DE LA UNIDAD 1: BIOMOLCULAS ................................... 13
5.1.1 Degradacin enzimtica de polisacridos ........................................ 13
5.1.2 Determinacin de la vitamina C en alimentos .................................. 14
5.1.3 Fraccionamiento de protenas en semillas de leguminosas y
cereales por solubilidad .............................................................................. 15
5.1.4 Estudio cintico de la ureasa ............................................................. 20
5.1.5 Determinacin de vitamina C en frutas y verduras .......................... 27
5.1.6 Determinacin de actividad de inhibidores de tripsina en
leguminosas ................................................................................................. 31
5.2 PRCTICAS DE LA UNIDAD 2: CIDOS NUCLEICOS, BIOENERGTICA
Y METABOLISMO ............................................................................................ 34
5.2.1 Propiedades fisicoqumicas de los carbohidratos........................... 34
5.2.2 Hidrlisis de polisacridos................................................................. 35
5.3 PRCTICAS DE LA UNIDAD 3: CATABOLISMO Y BIOSNTESIS........... 40
5.3.1 Determinacin de almidn y glucosa en alimentos ......................... 40
5.3.2 Identificacin de algunos aminocidos presentes en alimentos.... 41
5.3.3 Fraccionamiento de tejidos en sus principales constituyentes:
carbohidratos, lpidos, protenas y cidos nucleicos ............................... 43
5.3.4 Caracterizacin de las fracciones obtenidas a partir de diferentes
tejidos............................................................................................................ 46
5.3.5 Extraccin de la yema de lpidos del huevo ..................................... 53
5.3.6 Determinacin cuantitativa de protenas en harinas de leguminosas
y cereales por el mtodo de Micro Kjeldahl............................................... 57
1. INTRODUCCIN
Uno de los cursos fundamentales es la Bioqumica el cual permite comprender los
mecanismos de formacin y transformacin de los nutrientes que componen un
determinado alimento.
La presente gua de prcticas de laboratorio contiene una serie de experimentos
bsicos que complementan los conceptos fundamentales.
El trabajo de laboratorio utiliza como materiales de experimentacin, materias
primas de uso comn como harinas de cereales y leguminosas, fculas, frutas y
verduras, tejidos de origen animal, que ayudan al estudiante a asimilar las tcnicas
de uso comn en la investigacin bioqumica con fuentes alimenticias o
potencialmente alimenticias.
La investigacin no es completa sino se divulgan los resultados obtenidos en la
experiencia. Es importante que el estudiante aprenda la forma de reportar sus
datos y a saber interpretar las conclusiones obtenidas por otros investigadores,
con el fin de evaluar su propia investigacin. Esto hace necesario que elabore un
informe donde presente sus datos, resultados y conclusiones obtenidos durante el
trabajo experimental.
2. INFORME DE LABORATORIO
Antes de realizar las prcticas, cada estudiante debe adelantar el informe de
laboratorio hasta el punto 7, incluyendo la bibliografa. Los dems puntos se
completan despus de realizar la prctica.
1. Ttulo de la prctica.
2. Objetivo general.
3. Objetivos especficos.
4. Marco terico.
5. Reacciones qumicas que ocurren en la prctica.
6. Lista de materiales y reactivos.
7. Diagrama de flujo del procedimiento.
8. Tabla de datos, resultados y observaciones.
9. Clculos.
10. Grficas, si se necesitan.
11. Anlisis de resultados y de grficas.
12. Aplicaciones en su profesin.
13. Conclusiones.
14. Recomendaciones.
15. Bibliografa.
3. ASPECTOS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
4
El trabajo en el laboratorio requiere la observacin de una serie de normas de de

seguridad que eviten posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se
est haciendo.
3.1 NORMAS PERSONALES
Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su

material.
Es conveniente la utilizacin de bata, ya que evita que posibles
proyecciones de sustancias qumicas lleguen a la piel. Por supuesto
adems, evitars posibles deterioros en sus prendas de vestir.
Use gafas de seguridad.
Si tienes el pelo largo, es conveniente que lo lleve recogido.
En el laboratorio est terminantemente prohibido fumar, ni tomar bebidas ni
comidas.
Antes de utilizar un compuesto, asegurarse bien de que es el que se
necesita, fijarse bien el rtulo.
No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos
utilizados sin consultar con el profesor.
Verifica el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo. Cuando
los instrumentos no estn siendo usados deben permanecer
desenchufados.
Usa siempre guantes de asbesto, para el aislamiento trmico, al manipular
material caliente.
Es muy importante que cuando los productos qumicos de desecho se
viertan en la pila de desage, aunque estn debidamente neutralizados,
debe dejarse que circule por la misma, abundante agua.
No tocar con las manos y menos con la boca, los productos qumicos.
No pipetear con la boca, se debe utilizar una pera manual o dispositivo que
se disponga para tal fin.
Los cidos requieren un cuidado especial. Nunca se debe adicionar agua
sobre ellos, cuando se quiera diluirlos; siempre al contrario, es decir, cido
sobre agua. Tenga en cuenta que normalmente hay desprendimiento de
calor.
Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) no deben estar cerca
de fuentes de calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se har
al bao Mara, nunca directamente a la llama.
Si se vierte sobre ti cualquier cido o producto corrosivo, lvate
inmediatamente con mucha agua y avisa al profesor.
Al preparar cualquier disolucin se colocar en un frasco limpio y rotulado
convenientemente.
Cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio.
5
El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio fro. Para evitar
quemaduras, dejarlo enfriar antes de tocarlo.
Las manos se protegern con guantes o trapos cuando se introduzca un
tapn en un tubo de vidrio.
Si tienes que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo,
observa cuidadosamente estas dos normas:
o Ten sumo cuidado y ten en cuenta que la boca del tubo de ensayo
no apunte a ningn compaero. Puede hervir el lquido y salir
disparado, por lo que podras ocasionar un accidente.
o Calienta por el lateral del tubo de ensayo, nunca por el fondo; agita
suavemente.
Cuando se determinan masas de productos qumicos con balanza, se
colocar papel de filtro sobre los platos de la misma y si es necesario,
porque el producto a pesar fuera corrosivo, se utilizar un vidrio de reloj.
Se debe evitar cualquier perturbacin que conduzca a un error, como
vibraciones debidas a golpes, aparatos en funcionamiento, soplar sobre los
platos de la balanza, etc.
3.2 NORMAS PARA EL MANEJO DE REACTIVOS Y SOLUCIONES

La alta calidad en un anlisis qumico requiere reactivos y soluciones de excelente
pureza. Las siguientes normas deben observarse para prevenir la contaminacin
accidental de los reactivos y de las soluciones:
Seleccionar el reactivo qumico de mejor calidad que se encuentre
disponible. Elegir la botella de menor volumen para obtener la cantidad
deseada.
Tapar la botella inmediatamente despus de haber tomado la cantidad
deseada. Por ningn motivo delegue a otro esta accin.
Mantener los tapones de las botellas de los reactivos entre los dedos,
nunca debe colocarse un tapn sobre la mesa.
A menos que se diga otra cosa, nunca se debe devolver el reactivo a una
botella. El dinero ahorrado por retornar el exceso de reactivo rara vez
supera el riesgo de contaminar toda la botella.
A menos que se diga otra cosa, nunca se deben insertar esptulas,
cucharas, o cuchillos en una botella que contenga un reactivo slido.
3.3 MANEJO DE SUSTANCIAS QUMICAS
La seguridad en el laboratorio no se limita nicamente a la proteccin personal o
de la infraestructura, sino tambin a un manejo adecuado de los reactivos
qumicos encaminado a preservarlos de la contaminacin y del desperdicio.
Sustancias slidas
Como costumbre se debe leer la etiqueta de un reactivo antes de usarlo.

Los reactivos slidos normalmente se almacenan en recipientes de boca
ancha y antes de abrirlos se gira e inclina la vasija de tal manera que algo
del contenido pase a la tapa plstica. A continuacin se remueve
cuidadosamente la tapa con slido dentro de ella y se golpea suavemente
hasta obtener la cantidad deseada. Cuando se requieren cantidades
apreciables comparadas con el contenido del frasco, se inclina la botella
suavemente y se gira hacia atrs y hacia adelante hasta retirar lo necesario.
Si el reactivo se encuentra compactado, se tapa el recipiente y se agita
fuertemente para lograr romper los terrones. Evitar introducir elementos
como destornilladores, esptulas de hierro u otro objeto que pueda
contaminar el slido. Si el reactivo es muy fino y libera polvo fcilmente,
debe utilizarse una mascarilla apropiada.
Sustancias lquidas
Los lquidos se almacenan por lo general en recipientes de boca angosta o
en frascos con gotero. Para medir una cantidad de lquido, sea una solucin
o un lquido puro, se debe sacar una pequea porcin a un vaso limpio y
seco, y de all se toma la cantidad requerida mediante una pipeta. No deben
introducirse pipetas o cualquier otro dispositivo directamente dentro de la
botella que contiene el lquido, esto conduce generalmente a la
contaminacin de todo el contenido.
Cuando se van a transferir lquidos desde un gotero tipo medicinal, la
manera ms correcta es verter el lquido sin introducir el gotero en el
recipiente en el cual se va a almacenar el lquido, para evitar la posibilidad
de contaminacin del gotero y de la solucin original.
3.4 CAMPANA DE EXTRACCIN

Las reacciones que liberan gases txicos o corrosivos deben realizarse dentro de
una vitrina o campana de extraccin. Este dispositivo es una cabina provista de un
ventilador que succiona el aire del laboratorio llevando los gases fuera de l.
3.5 SMBOLOS DE RIESGO
Para manejar con seguridad las sustancias qumicas se han ideado diversos
cdigos dependiendo de la casa fabricante, pero en general los sistemas clasifican
las sustancias en las siguientes categoras:
Sustancias explosivas
Peligro. Este smbolo sealiza sustancias que pueden explotar bajo
determinadas condiciones. Ejemplo: dicromato de amonio.
Precaucin. Evitar choques, percusin, friccin, formacin de chispas y
contacto con el calor.
Sustancias oxidantes (comburentes)

Peligro: Los compuestos comburentes pueden inflamar sustancias
combustibles o favorecer la amplitud de incendios ya declarados,
dificultando su extincin. Ejemplo: permanganato de potasio, perxido de
sodio. Precaucin: Evitar cualquier contacto con sustancias combustibles.
Sustancias fcilmente inflamables

Sustancias autoinflamables: Ejemplo: alquilos de aluminio, fsforo.
Precaucin. Evitar contacto con el aire. Gases fcilmente inflamables:
Ejemplo: butano, propano. Precaucin. Evitar la formacin de mezclas
inflamables gas-aire y aislar de fuentes de ignicin. Sustancias sensibles a
la humedad: Productos qumicos que desarrollan emanaciones de gas
inflamable al contacto con el agua. Ejemplo: litio, borohidruro de sodio.
Precauciones: evitar contacto con agua o con humedad.
Lquidos inflamables
En trminos muy sencillos, los lquidos inflamables son aquellos que
fcilmente pueden arder. El que un lquido arda con ms o menos facilidad
depende de su punto de llama. Entre ms bajo sea este punto ms
fcilmente arde el reactivo y por lo tanto mayor cuidado se ha de tener en
su manejo, almacenamiento y transporte. Con estos lquidos se ha
realizado una clasificacin teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto y
su solubilidad en el agua:
o Peligro Clase A
8
Esta clasificacin se le asigna a lquidos que tienen un punto de

llama por debajo de 100 C y que no se disuelven en el agua a 15 C.
AI
Lquidos con punto de llama por debajo de 21 C.
AII
Lquidos con punto de llama entre 21 y 55 C.
AIII
Lquidos con punto de llama entre 55 y 100 C.
o Peligro Clase B
Esta clasificacin se le asigna a lquidos que tienen punto de llama
por debajo de 21 C y que se disuelven en agua a 15 C, o a aquellos
cuyos componentes inflamables se disuelven en agua tambin a 15
C. Este tipo de lquidos no se puede apagar con agua.
Sustancias txicas
Peligro: Tras una inhalacin, ingestin o absorcin a travs de la piel
pueden presentarse, en general, trastornos orgnicos de carcter grave o
incluso la muerte. Ejemplo: trixido de arsnico, cloruro de mercurio (II).
Precaucin: Evitar cualquier contacto con el cuerpo y en caso de malestar
acudir inmediatamente al mdico.
Sustancias nocivas
Peligro: La incorporacin de estas sustancias por el organismo produce
efectos nocivos de poca trascendencia. Ejemplo: tricloroetileno. Precaucin:
Evitar el contacto con el cuerpo humano as como la inhalacin de vapores.
En caso de malestar acudir al mdico.
Sustancias corrosivas
Peligro: Por contacto con estas sustancias se destruye el tejido vivo y
tambin otros materiales. Ejemplo: bromo, cido sulfrico. Precaucin. No
inhalar los vapores y evitar el contacto con la piel, los ojos y la ropa.
Sustancias irritantes
Peligro: Este smbolo destaca en aquellas sustancias que pueden producir
accin irritante sobre la piel, los ojos y sobre los rganos respiratorios.
Ejemplo: amonaco, cloruro de bencilo. Precaucin. No inhalar los vapores y
evitar el contacto con la piel y los ojos.
4. PREPARACIN DE REACTIVOS
4.1 DISOLUCIN DE YODO
Reactivos
1. Yodo, 1.0 g
2. Agua destilada, 300.0 mL
9
Procedimiento
Se mezclan ambos reactivos y se filtra la solucin.
4.2 REACTIVO DE LUGOL DETECCIN DE ALMIDN
En la deteccin de almidn se emplea el reactivo Lugol. El almidn y el yodo
forman un complejo de color violceo. Si se le agrega unas gotas de lugol a una
muestra y esta permanece de color amarillento, la reaccin es negativa. Si da un
color azul violceo es positivo.
Reactivos
1. Yodo (I), 1.0 g
2. Yoduro potsico (KI), 2.0 g
3. Agua destilada, 300.0 mL
Procedimiento
Se mezclan los tres reactivos y se filtra la solucin. La solucin final que se
obtiene presenta color mbar.
4.3 REACTIVO DE TOLLENS DETECCIN DE ALDEHDOS
En las pruebas que se utiliza este reactivo se forma un precipitado de plata que se
deposita en la superficie de los recipientes de vidrio, formando un espejo de plata,
por lo que no se recomienda la agitacin. Se debe utilizar recin preparado porque
de lo contrario no se forma el espejo de plata.
La reaccin para la preparacin del reactivo de tollens es la siguiente:
AgNO3 + NH4OH = Ag(NH3)2OH
Se estabiliza por la adicin de NaOH.
Se utiliza para identificar aldehdos ya que ocurre la siguiente reaccin:
RCHO + 2 Ag(NH3)2OH = RCOONH4 + 2Ag + 3NH3 + H2O
En donde la plata se precipita formando un espejo de plata o un precipitado gris.
Reactivos
1. NaOH al 5%, dos gotas
2. AgNO3 al 5%, 1.0 mL
3. NH4OH, 2N
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Procedimiento
Cuando se requiera el reactivo, se debe mezclar en un tubo de ensayo dos gotas
de una disolucin de NaOH al 5% y 1.0 mL de disolucin acuosa de AgNO3 al 5%.
Agitar el tubo y aadir gota a gota NH4OH 2N, hasta que se consiga disolver el
precipitado de AgOH, que previamente se haba formado. Si es necesario se debe
filtrar la solucin.
No se debe exceder en el uso del NH4OH 2N para que el reactivo as preparado
sea bastante sensible. Debe trasladarse a un frasco opaco ya que la solucin
puede ser alterada por la accin de la luz.
Precaucin
El isocianato de plata, AgNCO, compuesto muy explosivo en seco, puede estar
presente en los residuos de las soluciones del reactivo de Tollens; por esta razn,
es conveniente tirar el resto de la disolucin de Tollens no utilizada y lavar los
tubos con HNO3 diluido (disuelve el espejo de plata formado).
4.4 REACTIVO DE FEHLING DETECCIN DE AZCARES REDUCTORES
El reactivo de Fehling, tambien conocido como Licor de Fehling, es una disolucin
descubierta por el qumico alemn Hermann von Fehling y que se utiliza como
reactivo para la determinacin de azcares reductores. Sirve tambin para
demostrar la presencia de glucosa en la orina.
El ensayo con el licor de Fehling se funda en el poder reductor del grupo carbonilo
de un aldehdo. ste se oxida a cido y reduce la sal de cobre (II) en medio
alcalino a xido de cobre (I), que forma un precipitado de color rojo. Un aspecto
importante de esta reaccin es que la forma aldehdo puede detectarse fcilmente
aunque exista en muy pequea cantidad. Si un azcar reduce el licor de Fehling a
xido de cobre (I) rojo, se dice que es un azcar reductor.
Se utiliza como reactivo para la determinacin de azcares reductores, y es til
para demostrar la presencia de glucosa en la orina, y tambin para detectar
derivados de la glucosa como la sacarosa o la fructosa.
Al mezclar las soluciones A y B de Fehling se forma complejo con el in cprico
que es reducido por los aldehdos. Si la reaccin es positiva se forma un
precipitado rojo de CuO2. Al reaccionar con monosacridos, se torna verdoso; si lo
hace con disacridos, toma el color del ladrillo.
La reaccin que se produce es la siguiente:
RCHO + 2Cu++ + OH- RCOOH + CuO2 + H2O
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Reactivos
1. Sulfato de cobre (CuSO4), 34.64 g
2. Tartrato sdico potsico (KNa(C4H4O6) 4H2O), 17.6 g
3. Hidrxido sdico en escamas (NaOH), 7.7 g
Procedimiento
Se preparan las soluciones A y B de la siguiente manera:
Solucin A: Se disuelven 34.64 g de sulfato de cobre en 500 mL de agua.
Solucin B: Se disuelven 17.6 g de tartrato sdico potsico y 7.7 g de
hidrxido sdico en 50 mL de agua.
Cuando se requiera su utilizacin se mezclan volmenes iguales de cada una de
las soluciones. Ambas soluciones se guardan separadas hasta el momento de su
uso para evitar la precipitacin del hidrxido de cobre (II).
4.5 REACTIVO DE BIURET DETECCIN DE PROTENAS
Para la deteccin de protenas en los alimentos se usa el reactivo de Biuret. cual
se fundamenta en la formacin de un complejo coordinado entre los iones cpricos
del reactivo y el enlace peptdico de la protena, reaccin que transcurre en medio
alcalino.
Si al agregar unas gotas del reactivo la muestra no cambia de color, la reaccin es
negativa; en este caso se puede decir que la muestra no contiene protenas o
presenta una cantidad que no es posible detectar. Si la muestra cambia de color,
primero a un tono rosado, luego se pone azul y, finalmente, violeta, la reaccin es
positiva, lo que indica la presencia de protena.
Reactivos
1. Sulfato cprico (CuSO4.5H2O), 2.5 g
2. Hidrxido de sodio en escamas, 440g
3. Agua destilada
Procedimiento
Disuelva 2.5 g de sulfato cprico en un litro de agua destilada. Disuelva 440 g de
hidrxido de sodio en un litro de agua destilada. Luego mezcle estas dos
soluciones. Esta preparacin debe almacenarse en botellas oscuras (color mbar)
12
5. PRACTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUMICA

5.1 PRCTICAS DE LA UNIDAD 1: BIOMOLCULAS
5.1.1 Degradacin enzimtica de polisacridos
Reactivos
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Saliva
Solucin de almidn al 5%
Lugol
Solucin de HCl al 5%
Solucin de NaOH al 5%
Hielo y agua caliente
Materiales
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Gradilla
Seis tubos de ensayo
Termmetro
Papel indicador universal o pHmetro
Gotero
Vaso de precipitado
Mechero
Trpode
Malla de asbesto
Procedimiento
1. Coloque 3.0 mL de solucin de almidn y 2 gotas de saliva en tres tubos de
ensayo previamente marcados A, B y C.
2. Determine el pH en cada tubo, utilizando un pHmetro o papel indicador
universal. Registre los resultados.
3. Agregue al tubo A 1.0 mL de cido clorhdrico al 5%; al tubo B 1.0 mL de
NaOH al 5%; y al tubo C 1.0 mL de agua.
4. Prepara un bao Mara con una temperatura de 37 C y coloque los tres
tubos de ensayo durante 10 minutos.
5. Retire los tubos de ensayo del bao Maria y aada cinco gotas de lugol a
cada uno. Registre los cambios de color, olor, temperatura, etc.
6. En otros tres tubos de ensayo, previamente marcados como D, E y F,
adicione tres mL de almidn y dos gotas de saliva, a cada uno.
13
7. Durante diez minutos coloque el tubo D en hielo, el tubo E en el bao

Mara a 37 C y el tubo F en agua hirviendo.
8. Retire los tubos de ensayo D, E y F de las anteriores condiciones y agregue
cinco gotas de lugol a cada uno. Registre todos los cambios que observe.
Anlisis
1. En qu situacin se registr la mayor actividad enzimtica y como la
evidencia?
5.1.2 Determinacin de la vitamina C en alimentos
Reactivos
1.
2.
3.
4.
Almidn
Reactivo de lugol
Jugos de naranja, limn, tomate, zanahoria y durazno
Tabletas de vitamina C
Materiales
1.
2.
3.
4.
Gradilla
Tubos de ensayo
Pipeta
Tapones de caucho
Procedimiento
1. Disuelva 0.5 g de almidn en 10.0 mL de agua.
2. En un tubo de ensayo adicione 2.0 mL de la solucin de almidn y 1.0 mL
de lugol. Adicione media tableta de vitamina C. Registre sus observaciones.
La decoloracin de la mezcla es una indicacin de la presencia de vitamina
C; tenga en cuenta este resultado como patrn de referencia.
3. Identifica cinco tubos de ensayo como A, B, C, D y E y coloca en cada uno
de ellos 1.0 mL de la solucin de almidn y 1.0 mL de lugol. Aada unas
gotas de jugo de naranja al tubo A; unas gotas de jugo de limn al tubo B;
1.0 mL de jugo de tomate al tubo C; 1.0 mL de jugo de zanahoria al tubo D;
y 1.0 mL de jugo de durazno al tubo E. Tape cada tubo con un tapn de
caucho y agtelos. Registre sus observaciones para cada tubo.
Anlisis
1. Identifique cual de los alimentos empleados contiene mayor cantidad de
vitamina C.
14
2. Consulte un mtodo sencillo de laboratorio para identificar otras vitaminas

diferentes a la C.
5.1.3 Fraccionamiento de protenas en semillas de leguminosas y cereales
por solubilidad
Objetivos
Realizar la extraccin fraccionada de los componentes protenicos de las

semillas de leguminosas y cereales, utilizando para ello la diferencia de
solubilidades de los diferentes tipos de protenas.
Cuantificar cada una de las fracciones obtenidas utilizando el mtodo de Biuret.
Fundamento terico
Solubilidad y precipitacin de las protenas
La solubilidad de una buena cantidad de protenas es funcin de la fuerza lnica,
el pH y la concentracin de solventes orgnicos.
A bajas concentraciones salinas del solvente, las protenas (como electrolitos
multivalentes que son) se comportan de manera muy similar a los iones simples,
es decir cumplen la teora de Debye-Huckel, o sea en esta regin de
concentraciones de sal, el aumento de sta estabiliza los grupos cargados sobre
la protena y por lo tanto aumenta su solubilidad (solubilizacin por salado: saltlngIn). El fenmeno contrario (precipitacin por salado: saltlng-out) que se observa a
altas fuerzas inicas, es probablemente el resultado de la competencia entre la
protena y los iones de la al por las molculas de agua del medio para solvatarse.
Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas, la
concentracin efectiva de las molculas de agua (solvente) disminuye y son
insuficientes para la solvatacin total de la protena, por lo tanto la interaccin
protena-protena predomina sobre la interaccin protena-agua y ocurre la
precipitacin. En esta regin la solubilidad de la protena est a menudo
relacionada en una forma logartmica con la fuerza lnica y se rige por la ecuacin:
log S = - Ks.
donde:
S = Solubilidad
= log. de la solubilidad hipottica a fuerza lnica (ji) igual a cero.
Ks = Constante de precipitacin por salado, que varia considerablemente
con la naturaleza de la sal y muy poco con la naturaleza de la protena.
15
La solubilidad de la mayora de las protenas a una fuerza inica constante,

presenta un mnimo cerca del punto isoelctrico. A este pH, las repulsiones
electrostticas intermoleculares entre las molculas de soluto estn en su mnimo,
lo mismo que las interacciones electrostticas entre los grupos polares cargados y
el agua, por lo tanto las protenas precipitan ms fcilmente.
La mayora de los solventes orgnicos son buenos precipitantes pues en general
tienen baja constante dielctrica. El dimetilsulfxido y la formamida, con
constantes dielctricas relativamente altas, son buenos solventes.
Clasificacin de Osborne de las protenas, por el criterio de solubilidad
La clasificacin comnmente usada no se basa en aspectos estructurales de stas
sino principalmente en su solubilidad frente a diferentes solventes.
Desafortunadamente entre los grupos clasificados no existe un lmite fijo, pero de
todas maneras permite el fraccionamiento de las protenas provenientes de una
misma fuente. Segn Osborne, las protenas vegetales pueden clasificarse segn
su solubilidad en: albminas, globulinas y glutelinas. Las albminas corresponden
al grupo de protenas que son solubles en agua destilada y en soluciones salinas
diluidas.
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas. Con base en las
propiedades de solubilidad no es posible distinguir entre albminas y
seudoglobulinas.
Si se aplican los conceptos de precipitacin por salado, se observa que las
globulinas precipitan en soluciones de sulfato de amonio del 50% de saturacin,
mientras que las albminas lo hacen a concentraciones mayores del 75% de
saturacin. Estas precipitaciones son mejores si se hacen a pHs cercanos a sus
puntos isoelctricos.
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en soluciones acuosas
de alcoholes de bajo peso molecular, en concentraciones entre el 50 y el 90%.
Las glutelinas son insolubles en los solventes anteriores pero se solubilizan en
soluciones diluidas de cido o bases.
Estos dos ltimos grupos solo se encuentran en materiales vegetales, mientras
que las protenas animales estn constituidas bsicamente por albminas y
globulinas.
Mtodo Biuret
16
La reaccin de Biuret es una medida del nmero de enlaces peptdicos presentes.

Los compuestos que contienen dos o ms enlaces peptdicos entre ellos pptidos
y protenas dan un color rosado o lila caracterstico cuando se tratan con sulfato
de cobre diluido en solucin alcalina.
El color se debe al complejo de coordinacin que se forma entre el tomo de cobre
y cuatro tomos de nitrgeno provenientes de enlaces peptdicos (dos de cada
pptido).
La estructura del complejo es la siguiente:
Los espectros de absorcin de los complejos de cobre formados con diferentes

protenas, son similares aunque no idnticos. Por consiguiente, es posible utilizar
cualquier protena como patrn de coloracin. Esta es bastante reproducible, para
una protena dada, aunque se requiere de cantidades relativamente grandes de
protena (de 1 a 20 mg por mI) para obtener coloracin. Por otra parte, no es
necesaria una digestin previa de la muestra.
Reactivos
H2O desmineralizada, NaCI al 1%, Etanol al 75%, NaOH 0.1 N, reactivo Biuret,
solucin patrn de albmina de huevo de concentracin conocida.
Procedimiento
Recordar que el tratamiento de la harina, con cada uno de los siguientes
solventes, extrae la fraccin indicada as:
Solvente Extractor
Agua desmineralizada
Cloruro de sodio al 1%
Etanol al 75%
Hidrxido de sodio 0.1 N
Fraccin Extrada
Albminas
Globulinas
Prolaminas
Glutelinas
17
Preparacin de la muestra
Pesar 2.0 g de muestra (en cada caso ser una de las harinas de: arveja, soya,
frjol, haba, trigo, cebada, etc.); pasarla a un tubo de ensayo, agregar 10 ml de
H2O desmineralizada, agitar manualmente durante 10 minutos y centrifugar la
suspensin a 2500 rpm por 3 minutos. Vaciar el sobrenadante a un baln aforado
de 25 ml. Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O desmineralizada y
repetir exactamente el proceso anterior.
Despus de centrifugar, el sobrenadante de esta segunda extraccin se adiciona
al baln que contiene al primer sobrenadante. Se completa su volumen a 25 ml
con H2O desmineralizada hasta el enrase. As se tiene separada la fraccin de las
albminas.
Proceso de Extraccin
18
Sobre el residuo que queda de la separacin de las albminas, se repite ahora

todo el proceso anterior, pero agregando esta vez NaCl al 1%. Despus de
centrifugar, los sobrenadantes de la primera y segunda extraccin con NaCl al 1%,
se llevan a otro baln aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el
mismo NaCI al 1%. Esta es la fraccin de las globulinas.
Sobre el residuo anterior se extrae en idntica forma la fraccin de las prolaminas,
usando esta vez alcohol etlico al 75% y una temperatura de extraccin cercana a
60C.
Por ltimo sobre el mismo residuo, con la adicin de solucin de NaOH 0.1 N y
aplicando el mismo procedimiento general, se separa la fraccin de las glutelinas.
Mtodo de Biuret
Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada
grupo proceder a la determinacin de protenas, aplicando el mtodo de Biuret.
La curva de calibracin se har utilizando como patrn una solucin de albmina
de huevo de concentracin conocida.
Para las muestras de soya, arveja y frjol, de las fracciones de albminas y
glutelinas deber tomarse para cada una y por aparte, una alicuota de 0,5 ml y
llevarse a un volumen de 5 ml (dilucin 1 a 10) con agua desmineralizada para las
albminas y con NaOH 0,1 N para las glutelinas. Estas diluciones se usarn como
extractos problemas para dichas fracciones.
En 15 tubos de ensayo rotulados pipetear en c/u las cantidades de reactivos que
se indican en el siguiente cuadro.
Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o introducir
los tubos en un bao de agua a 30C durante 10 minutos para desarrollo del color.
Leer en cada tubo porcentaje de transmitancia a 540 nm usando el tubo B para
ajustar el 100% de transmitancia.
Clculos y resultados
Consultar tablas de conversin para pasar porcentajes de transmitancia a los
correspondientes valores de absorbancia o calclelos utilizando la frmula:
A = 2 - log (%T)
Trazar en papel milimetrado la grfica de calibracin (absorbancia en ordenadas
vs. concentracin (mg/mI) en abcisas) e interpolar las absorbancias de los tubos
problemas; proceder, teniendo en cuenta las diluciones de cada caso, a calcular
los porcentajes de cada fraccin protenica.
19
Tubos
B 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14
Sol. patrn 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.2
albumina, ml
Fraccin
0.5 1.0
albuminas,
ml
Fraccin
0.5 1.0
globulinas,
ml
Fraccin
0.5 1.0
prolaminas,
ml
Fraccin
0.5 1.0
glutelinas, ml
H2O
2 1.9 1.7 1.5 1.3 1.1 0.8 1.5 1.0 1.5 1.0 1.5 1.0 1.5 1.0
destilada, ml
Reactivo de Biuret en todos los tubos: 4 ml
Condiciones
Debern compararse los valores obtenidos con los que se hallen en la literatura
consultada.
Calcular tambin los rendimientos de las extracciones, los cuales se deducen de la
comparacin con los porcentajes de protena total, obtenidos por micro Kjeldahl,
en la siguiente prctica (No.6).
Cuestionario
1. Qu se entiende por pl de una protena? Explique por qu las protenas
precipitan en este punto.
2. Discuta un mtodo colorimtrico alternativo para la determinacin de protenas
indicando en que se fundamenta.
3. Cmo se clasifican las protenas de origen animal de acuerdo con su
solubilidad?
4. Qu ventajas en panificacin ofrece el hecho de que una harina de
leguminosa tenga mayor o menor contenido de glutelinas y de prolaminas?
5.1.4 Estudio cintico de la ureasa
Objetivos
20
Determinar el efecto del pH, la concentracin del sustrato y la temperatura

sobre la velocidad de la reaccin enzimtica de la ureasa.
Determinar la presencia de ureasa en leguminosas y tortas de oleaginosas

midiendo su actividad biolgica.
Fundamento terico
El estudio cintico persigue la caracterizacin de la actividad cataltica de la
enzima, determinando las condiciones ptimas bajo las cuales presentan la mayor
actividad.
La ureasa es una enzima muy difundida en el reino vegetal especialmente en
semillas de leguminosas (soya, canavalia). Esta enzima cataliza la siguiente
reaccin:
Un buen mtodo para seguir el curso de la hidrlisis es la titulacin del NH3

producido con un cido de normalidad conocida y en presencia de un indicador
adecuado.
Esta enzima tuvo mucha importancia en el desarrollo de la enzimologa moderna
ya que merced a los trabajos de Summer fue la primera aislada y cristalizada. La
ureasa tiene un PM de 483000, consta de 6 subunidades estructurales iguales y
es de las enzimas que exhibe especificidad absoluta por su sustrato.
Las investigaciones sobre la ureasa tambin permitieron deducir un principio
importante de las reacciones enzimticas como es la funcin de los grupos -SH
(sulfidrilo) en ciertas enzimas. La ureasa posee 3 o 4 grupos sulfidrilos activos,
siendo un representante de un gran nmero de enzimas cuya actividad depende
de la existencia de grupos -SH intactos formando parte de la cadena peptdica de
la enzima como cisteina.
La oxidacin de estos grupos puede ocasionar una inactivacin reversible de la
enzima. Por ejemplo:
Oxd
2E SH
E S S E + 2H +
Forma activa
Forma inactiva
Estas formas ESSE inactivas muy probablemente pueden ser reactivadas

mediante el efecto de compuestos ricos en -SH, como el glutatin o la cisteina.
E SS E
2GSH
G SS G + ESH
21
Inactiva
Glutatin
reducido
Glutatin
oxidado
Activa
Una alteracin ms estable, en particular en el caso de la ureasa, es la reaccin

de los grupos -SH con ciertos iones de metales pesados como Hg++, Ag+ o Cu++,
formando una mercptida:
E SH + Ag +
E SAg + H +
Activa
Merctiptida de placa inactiva
Reactivos
Solucin de Ureasa en buffer fosfato 0.05 M y pH 6.3

Buffer fosfato 0.05 M, a pH 5.0; 6.0; 7.2; 8.0 y 10.0.
Solucin de Urea 0.25 M
Solucin de HgCI2 al 1%
Indicador de tashiro
Solucin de HCI aproximadamente 0.1 N (titulada exactamente)
Procedimiento
El trabajo experimental se har en dos sesiones consecutivas de laboratorio as:
En la primera sesin se determinar el efecto del pH, concentracin de
sustrato, temperatura sobre la velocidad de la reaccin enzimtica.
En la segunda sesin se determinar la presencia de ureasa en leguminosas y

tortas de oleaginosas midiendo su actividad por el mismo mtodo utilizado en
la sesin anterior.
Primera sesin
Determinacin de la actividad a diferentes pH
Preprese 2 series de 5 tubos: 5 servirn como blanco y 5 para determinar el
efecto de pH. (Tubos p) rotulados claramente. Agregue lo indicado en el cuadro,
incubndolos como se indica. Terminada la incubacin transfiera el contenido de
cada tubo a un erlenmeyer diferente, agregando a cada uno 3 gotas de indicador
de tashiro; finalmente titule con HCI de normalidad conocida.
Primera Serie
Condiciones
Urea 0.25 M, ml
TUBOS BLANCO
1
5
2
5
Tubo
3
5
4
5
5
5
22
Buffer Fosfato pH 5, ml
4.5
4.5
Buffer Fosfato pH 7.2, ml
4.5


HgCl2 1%, gotas
4
4
4
Incubar a 50 C durante cinco minutos agitando.
Extracto de Ureasa, ml
0.5 0.5 0.5
Incubar a 50 C durante 25 minutos. Titular con HCl 0.1 N
Volumen de HCl gastado en la titulacin
Segunda Serie
4.5
4.5
4
0.5
0.5
TUBOS PROBLEMA
Tubos P
1p 2p 3p 4p
Urea 0.25 M, ml
5
5
5
5
4.5
4.5
Buffer Fosfato pH 7.2, ml
4.5
4.5

Extracto de Ureasa, ml
0.5 0.5 0.5 0.5
Incubar a 50 C durante 30 minutos. Titular con HCl 0.1 N
HgCl2 1%, gotas
4
4
4
4
Titular con HCl 0.1N
Condiciones
5p
5
4.5
0.5
4
Expresin de resultados
Tabular los resultados obtenidos as:
Tubo nmero ml de HCl gastado
Titulacin corregida
Micromoles/ml de
HCl gastado
1p
2p
3p
4p
5p
El valor corregido de la titulacin es la diferencia entre el volumen de HCl 0.1 N

gastado en el blanco y el gastado en el problema (p) al mismo pH.
Exprese grficamente (grfica 1 de su informe) en papel milimetrado, los
micromoles de urea hidrolizados (en las ordenadas) vs el pH (en las abscisas). De
acuerdo con los resultados de su grfica, deduzca el pH ptimo, con el cual va a
trabajar en las siguientes etapas.
Tubo nmero
1p
Micromoles de urea hidrolizada
pH correspondiente
23
2p
3p
4p
5p
Efecto de la concentracin de sustrato en la velocidad de reaccin

enzimtica
En 8 tubos de ensayo marcados, pipetear en cada uno las cantidades de reactivos
que a continuacin se indican:
Tubos
B
1
2
3
4
5
6
Urea 0.25 M, ml
5
1.0 1.5 2.0 3.0 6.0 8.0
Buffer de fosfato pH ptimo, ml
5
8.5 8.0 7.5 6.5 3.5 1.5
HgCl2, gotas
4

Colocar todos los tubos en un bao mara a 50 C por cinco minutos y sin
sacarlos agregar:
Ureasa, ml
0.5
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Dejar en bao mara a 50 C durante 25 minutos y al final agregar:
HgCl2 1%, gotas
4
4
4
4
4
4
4
Mezclar y sacar los tubos del bao
Condiciones
7
9.5
0.5
4
Transferir cuantitativamente el contenido de cada tubo a un erlenmeyer marcado,

agregar a cada uno 3 gotas de indicador, titular con el HCI (normalidad conocida)
y comparar las diferentes titulaciones con el blanco.
Tabular los resultados obtenidos as:
Tubo
Micromoles ml de HCl Titulacin Micromoles de
nmero de urea
gastados
corregida HCl gastados
1
2
3
4
5
6
7
Titulacin corregida, corresponde a: ml de HCl gastados - ml de HCl del blanco.
Tubo
Micromoles Velocidad
nmero de
urea en
hidrolizada
moles/min
1
2
1/v
[S]
moles
de
urea
inicia/ml
1/[S]
24
3
4
5
6
7
En papel milimetrado y con datos de la tabla anterior construir las siguientes

grficas:
Grfica No. 2 de su informe: En ordenadas datos de y o sea micromoles de
urea hidrolizados por minuto. En abscisas datos de [S] o sea micromoles de
urea iniciales/ml.
Grfica No. 3 de su informe: Siguiendo el procedimiento Lineweaver-Burk, en
ordenadas datos de 1/v y en abscisas 1 / [S].
De estas dos grficas, deducir la constante de Michaelis y la velocidad mxima
para esta reaccin. El valor de Km (constante de Michaelis) debe expresarse en
moles/litro.
Determinacin de la actividad a diferentes temperaturas
Se usarn cinco baos de agua a diferentes temperaturas y cada tubo se incubar
como se indica a continuacin:
Tubo nmero
1
2
3
4
5
Incubar en:
bao de agua con hielo
bao de agua a temperatura ambiente aproximadamente 16 C
bao de agua a 37 C
bao de agua a 60 C
bao mara (92 C)
Luego proceda a agregar los reactivos y a mantener las condiciones que se

indican enseguida:
Tubos
B
1
2
3
4
5
Urea 0.25 M, ml
5
5
5
5
5
5
Buffer de fosfato pH ptimo, ml
4.5
4.5 4.5 4.5 4.5 4.5
HgCl2, gotas
4
Temperatura de incubacin, C
16
0
16
37
60
92
Colocar cada tubo en bao de agua a la temperatura indicada por
cinco minutos y sin sacarlos agregar.
Solucin de ureasa, ml
0.5
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Agitar e incubar por 25 minutos a la temperatura correspondiente
HgCl2 1%, gotas
4
4
4
4
4
Titular con HCl (normalidad conocida)
Resultados, ml de HCl
Condiciones
25
Con los resultados de la anterior serie de temperaturas y el obtenido a 50 C (ver
determinacin de la actividad a diferentes pH, tubo No. 3p), grafique en papel
milimetrado (grfica No. 4 de su informe) los micromoles de urea hidrolizada
(ordenadas) vs temperatura C (abscisas). Explique el efecto de cada temperatura
en la actividad de la ureasa.
Segunda sesin
Extraccin de la ureasa
Pesar 5 g de muestra (en cada caso ser una de las harinas de leguminosas o de
las tortas de oleaginosas), pasarla a un erlenmeyer, agregar 10 ml de NaCl 1%;
agitar mecnicamente durante 15 minutos y centrifugar la suspensin a 2.500 rpm
por 15 minutos; transferir el sobrenadante a un baln aforado de 25 ml. Al residuo
agregar de nuevo otros 10 mI de NaCI 1% y repetir exactamente el procedimiento
anterior.
Reunir los dos sobrenadantes y completar a 25 ml con NaCI 1%. Este es el
extracto que contiene ureasa.
En 5 tubos de ensayo marcados pipetear en cada uno las cantidades de reactivos
como en la tabla siguiente se indica.
Mezclar y sacar los tubos del bao. Transferir cuantitativamente el contenido de
cada tubo a un erlenmeyer marcado, titular con el HCI (normalidad conocida) y
comparar las diferentes titulaciones con el blanco.
Condiciones
Tubos
Urea 0.25 M, ml
5
5
5
5
Buffer de PO4 pH ptimo, ml
5
5
4.5
4
HgCl2 1%, gotas
4
Colocar todos los tubos en bao mara a 50 C por cinco

minutos y sin sacarlos agregar:
Extracto de ureasa, ml
0.5
0.5
1
1.5
Dejar en bao mara a 50 C durante 25 minutos y al final
agregar:
HgCl2 1%, gotas
4
4
4
5
2.5
3
4
Nota: Si la actividad de la enzima es muy baja con las alcuotas utilizadas, repetir
el ensayo usando una alcuota del extracto de ureasa mayor. Por el contrario si la
26
enzima presenta una actividad afta repita el ensayo utilizando una dilucin del
extracto de ureasa (por ejemplo: 1:5 v/v).
Determine la actividad uresica de la leguminosa o la torta analizada,
expresndola como micromoles de urea hidrolizado / ml del extracto de ureasa.
Compare la actividad uresica de su extracto con los obtenidos por los dems
grupos y con los datos bibliogrficos.
Cuestionario
1. Qu tipo de inhibicin enzimtica se presenta con el uso de metales
pesados?
2. Qu representan los valores de Vm y Km?
3. Qu entiende por metalo-enzimas? D ejemplos.
4. Qu sucedera si se reemplaza el HgCl2 por CaCI2? Explique su respuesta.
5. Todas las enzimas tienen CySH en su sitio activo? Especifique cules son los
aminocidos presentes en el sitio activo de las enzimas cuyos sitios activos
usted conoce.
6. Para qu se utiliza generalmente el test de la ureasa?
5.1.5 Determinacin de vitamina C en frutas y verduras
Objetivo
Determinar el contenido de esta vitamina en frutas y verduras utilizando el

mtodo de Moor.
Fundamento terico
Las vitaminas son factores dietarios esenciales requeridos por los organismos en
pequea cantidad y cuya deficiencia produce ciertas enfermedades. Hay
organismos que pueden sintetizar algunas de ellas, por lo tanto el tipo y cantidad
de vitaminas que necesitan los diferentes seres vivos no es igual para todos.
La vitamina C es esencial para la formacin del tejido conjuntivo, huesos,
cartlagos, dentina y tambin para el mantenimiento de la funcin normal de dichos
27
tejidos. Adems la vitamina C estimula las funciones de defensa del organismo

(actividad fagocitaria de los leucocitos, formacin de anticuerpos).
Como el cido ascrbico se oxida fcilmente a cido dehidroascrbico y ste
puede volver a reducirse a cido ascrbico, se ha propuesto que la vitamina C,
como sistema de xido-reduccin, partcipe en procesos de oxidacin celular,
interviniendo en la hidroxilacin de hormonas esteroidales (principalmente, las
sintetizadas en las suprarrenales y aminocidos aromticos).
Se ha relacionado la inhibicin de la formacin de sustancia intercelular de los
tejidos de sostn por carencia de vitamina C, con los trastornos de la hidroxilacin
de la prolina en hidroxiprolina, constituyente fundamental del colgeno.
La forma oxidada, cido dehidroascrbico, puede ser reducida nuevamente por el
glutatin en forma reducida (GSH).
Por tratamiento con la 2-nitroanilina diazotada, el cido ascrbico la convierte en la

2-nitrofenilhidrazida del cido oxlico, la cual en presencia de un exceso de
hidrxido de sodio forma la sal sdica de coloracin rojo-violeta que presenta un
mximo de absorcin a 540 mm.
28
Para el anlisis de la vitamina C total (cido ascrbico + cido dehidroascrbico)

es necesario reducir primero el cido dehidroascrbico; esto se logra tratando la
muestra con cido sulfhdrico ya que este no presenta interferencia con el mtodo.
Reactivos
2-nitroanilina 0.16% en actico HCI
Nitrito de sodio 0,08% en H2O
Etanol 96%
Acido oxlico 0.15%
Solucin de vitamina C, recin preparada (0.2 mg/mI)
Procedimiento
Cada grupo traer una fruta y una verdura de acuerdo con lo convenido
previamente con el profesor.
Para obtener el extracto problema se procede de la siguiente manera: En el caso
de las frutas ctricas se toma 1 ml de jugo, se pesa y luego se agregan 4 ml de
cido oxlico al 0,15%, se mezcla bien y se filtra, el filtrado se conserva para hacer
la determinacin colorimtrica.
Para otras frutas y verduras, se pesa lg que se macera en mortero lo mejor posible
con 4 ml de solucin de cido oxlico al 0,15%. Despus de filtrar completar el
filtrado con la solucin de oxlico hasta un volumen final de 5 ml. De ah tomar 1
ml de cada extracto problema para tubos D1 (fruta) y D2 (verdura).
Si la extraccin se va a hacer en licuadora, se recomienda pesar 6 g y adicionar
30 ml de cido oxlico al 0.15%.
Si el extracto exhibe coloracin se recomienda adicionar una pequea cantidad de
carbn activado (aproximadamente 1 g por cada 10 mI de extracto coloreado) se
agita y luego se centrifuga a 2500 rpm durante 10 minutos. La solucin patrn de
cido ascrbico contiene 0.2 mg/ml y debe estar recientemente preparada.
El nitrito de sodio tambin debe estar fresco y debe asegurarse que la 2-nitro
anilina se diazotice bien. Esto se logra cuando al mezclar esta con el nitrito se
decolora la solucin.
29
Rotular 9 tubos de ensayo y adicionar los siguientes reactivos:

Condiciones
2-nitroanilina, ml
0.1
0.1
Nitrito de sodio, ml
0.1
0.1
Mezclar y esperar la decoloracin
Etanol 96%, ml
3.8 3.8
Patrn vitamina C, ml
0.1
cido oxlico, ml
1.0
0.9
Extracto problema, ml
Mezclar bien y dejar en reposo cinco minutos

NaOH 10%, ml
1.2 1.2
Agua destilada, ml
3.8 3.8
Tubos
4
5
Fruta Verdura
D1
D2
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1 0.1
0.1 0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
3.8
0.2
0.8
3.8 3.8
0.4 0.6
0.6 0.4

3.8
0.8
0.2
3.8
1.0
3.8
1.0
3.8
1.0
1.2
3.8
1.2 1.2
3.8 3.8
1.2
3.8
1.2
3.8
1.2
3.8
1.2
3.8
Se mezcla bien el contenido de cada tubo y se lee en el espectrofotmetro las

absorbancias correspondientes a una longitud de onda de 540 nm.
Elabore la curva de calibracin e interpole las absorbancias de sus muestras.
De acuerdo con los resultados calcular el contenido de vitamina C en la fruta y
verdura correspondiente, expresndolo como mg/100 g de fruta o verdura o como
mg/100 ml de jugo. Finalmente compararlo con el valor reportado en la
bibliografa.
Cuestionario
1. Compare el mtodo que utiliz con otro mtodo de determinacin de la misma
vitamina.
2. Qu ocurrira si no se decolora por completo la solucin de 2-nitroanilina al
adicionar nitrito de sodio?
3. Cul es la funcin del hidrxido de sodio en la determinacin de la vitamina
C?
4. Cmo se afectara la determinacin si la muestra ha sido tratada previamente
con calor?
5. Cmo se encuentra la vitamina C generalmente en los materiales vegetales?
30
6. Cite seis alimentos (verduras, frutas, leguminosas, tubrculos) ricos en

vitamina C.
5.1.6 Determinacin de actividad de inhibidores de tripsina en leguminosas
Objetivos
Determinar la actividad cataltica de la tripsina utilizando como sustrato

casena.
Determinar el efecto de los inhibidores de tripsina presentes en extractos de

leguminosas o fracciones protenicas de leguminosas.
Fundamento terico
La tripsina y la quimotripsina pertenecen a un grupo de enzimas del tubo digestivo
que tambin incluye la pepsina, producida por la mucosa gstrica. La tripsina y la
quimotripsina son secretadas por el pncreas en forma de precursores inactivos o
zimgenos que adquieren su forma activa inmediatamente antes de actuar.
El tripsingeno est constituido por una cadena de 249 aminocidos de secuencia
conocida; se convierte en tripsina por accin de la enteroquinasa, una enzima
segregada por el intestino, quien remueve un hexapptido del extremo amino
terminal del zimgeno.
La tripsina que se encuentra en el jugo pancretico, acta sobre las protenas y
pptidos provenientes de la digestin parcial realizada en el estmago originando
pptidos que son ms fcilmente atacados por otras enzimas, para facilitar la
asimilacin de los aminocidos producidos, contribuyendo as a la digestin de las
protenas.
La tripsina ataca del lado del grupo carboxilo de la usina y la arginina unido a un
grupo amino de cualquier aminocido o al grupo hidrxilo de un alcohol; su
especificidad es muy alta y esto ha sido aprovechado para ayudar a elucidar
secuencias de aminocidos en protenas.
En la bsqueda de fuentes vegetales de protenas es importante considerar la
familia de las leguminosas que en general presentan un alto contenido de
protena; sin embargo en ensayos biolgicos se ha encontrado una baja calidad
debido a la presencia de factores antinutricionales tales como los inhibidores de
tripsina, hemaglutininas, alcaloides y otros.
Los inhibidores de tripsina estn ampliamente distribuidos no solo en el reino
vegetal sino tambin en el reino animal como protenas de bajo peso molecular.
31
En el reino vegetal se conocen como buenas fuentes de inhibidores de tripsina, las

semillas de las leguminosas y los tubrculos de las solanceas.
Las plantas ms estudiadas son entre otras: leguminosas como soya, haba, frjol,
garbanzo, solanceas como la papa; gramneas como sorgo, maz opaco, trigo y
cebada.
La actividad de la tripsina y su inhibicin se pueden conocer fcilmente
determinando el porcentaje de casena hidrolizada. En este mtodo se utiliza
casena como sustrato el cual se somete a la digestin trptica por un tiempo
determinado a 37 C, luego se detiene la reaccin con cido tricloro actico y la
casena no hidrolizada se remueve por centrifugacin. La cantidad de aminocidos
libres en el sobrenadante se determina colorimtricamente con ninhidrina.
Reactivos
Solucin de caseinato de sodio 1% en Buffer PO4 pH 7.6.
Solucin de tripsina de concentracin conocida (4-5 mg/100 mI) en HCI 0.001 M
Acido tricloroactico (ATA) 5%
Solucin de ninhidrina (etanol) al 1%
NaOH 10 M
Procedimiento
Cada grupo recibir dos soluciones de inhibidores de tripsina de concentracin
conocida las cuales fueron extradas previamente a partir de harinas de
leguminosas.
Determinacin de la actividad de la tripsina y los inhibidores
Marcar nueve tubos de ensayo y agregar los siguientes reactivos:
Tubos
B
Bi
1
2
3
4
5
6
Solucin tripsina, ml
1
0.2
0.5
1
1
1
1
Buffer PO4 0.1 M, pH 7.6, ml
1
1
1.8
1.5
1
0.5
0.5
Solucin inhibidor 1

0.5 1.0
Solucin inhibidor 2
0.5
Mezclar e introducir los tubos en bao termostatazo a 37 C por cinco minutos.
ATA 5%, ml
4
Solucin casena 1%, ml

2
2
2
2
2
2
2
2
Incubar por 20 minutos a 37 C. Luego adicionar:
ATA 5%, ml
4
4
4
4
4
4
4
Condiciones
7
1
1.0
2
4
32
Centrifugar a 2500 rpm por 10 minutos y con el sobrenadante efecte la reaccin

colorimtrica siguiente.
Determinacin del porcentaje de hidrlisis
Marque 9 tubos de ensayo y adicione los siguientes reactivos.
Condiciones
B
1
1
1
Tubos
2
3
1
1
4
1
5
1
Sobrenadante, ml
Llevar a neutralidad con NaOH 10 M

Solucin de Ninhidrina 1%, ml
1
1
1
1
1
1
1
Calentar a ebullicin en bao mara por 10 minutos. Deje enfriar y adicione:
Agua destilada, ml
8
8
8
8
8
8
8
Leer las absorbancias a 540 nm usando el blanco para ajustar el 100% de
transmitancia.
6
1
1
8
Resultados
Los AA libres que quedan despus de la hidrlisis de la casena, en ausencia del
inhibidor y con mayor concentracin de tnpsina (tubo No. 3), representan el
mximo porcentaje de conversin de casena en AA, libres en las condiciones
experimentales usadas. Igualando el valor de absorbancia de este tubo al 100%
de hidrlisis, calcular el porcentaje de hidrlisis en los dems tubos.
Comparar la actividad de los inhibidores (disminucin del porcentaje de hidrlisis)
de las leguminosas utilizadas con los otros grupos de laboratorio.
Cuestionario
1. En qu consiste la reaccin de la ninhidrina?
2. Cul es el pH ptimo de actividad de la tripsina, quimotripsina y pepsina?
3. Cmo difieren en su accin cataltica la pepsina y la quimotripsina de la
tripsina?
4. Cul es el efecto del ATA sobre la casena digerida y no digerida?
5. Cmo podra eliminarse la accin de los inhibidores de tripsina de las
leguminosas?
6. Qu otros factores antinutricionales se encuentran presentes en las
leguminosas?
33
7. Investigue un mtodo de extraccin de inhibidores de tripsina.

5.2 PRCTICAS DE LA UNIDAD 2: CIDOS NUCLEICOS, BIOENERGTICA Y
METABOLISMO
5.2.1 Propiedades fisicoqumicas de los carbohidratos
Reactivos
1. Glucosa
2. Fructosa
3. Sacarosa
4. Almidn
5. Trozo de pan
6. Una papa
7. Solucin de yodo o reactivo de lugol
8. Solucin diluida de HCl
9. Alcohol etlico
10. Reactivo de Tollens
11. Reactivo de Fehling (soluciones A y B)
Materiales
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Gradilla
Tubos de ensayo
Vaso de precipitado de 250 ml.
Pipeta de 10 ml.
Mechero de gas o de alcohol
Malla de asbesto
Termmetro
Lpiz vidriograf
Procedimiento
Parte A: solubilidad
1. Se toma 0.5 g de un azcar en cada uno de los tubos de ensayo,
debidamente rotulados. Organice los tubos de ensayo en la gradilla.
2. Aada 2.0 ml. de agua a cada tubo de ensayo. Agite cada tubo de ensayo
fuertemente durante un minuto y deje en reposo durante 30 segundos.
Anote sus observaciones.
3. Repita los dos pasos anteriores utilizando otros tubos de ensayo, pero en
vez de agua utilice 2.0 mL de alcohol etlico. Anote sus observaciones.
4. Construya un cuadro en donde cualifique cualitativamente el grado de
solubilidad de las diferentes muestras.
34
Parte B: prueba con los reactivos de Tollens y Fehling

1. Realice un montaje de bao de Mara y caliente a 60C.
2. Prepare soluciones de cada azcar al 10%. Tome 1.0 mL de cada solucin
y llvela a diferentes tubos de ensayo, previamente rotulados. Organice los
tubos de ensayo en la gradilla.
3. Adicione 1.0 mL del reactivo de Tollens a cada tubo de ensayo.
4. Verifique que la temperatura en el bao Mara se sostenga a 60 C.
Coloque dentro un vaso de precipitado los diferentes tubos de ensayo y
lleve este conjunto al bao Mara por 5 minutos. Anote sus observaciones.
5. Repita los pasos dos, tres y cuatro, pero en lugar del reactivo de Tollens
utilice 0.5 mL del reactivo A de Fehling y 0.5 ml. del reactivo B de Fehling.
6. Ahora, tome 2.0 mL de solucin de sacarosa y agregue tres o cuatro gotas
de solucin diluida de HCL Agite y caliente suavemente por un minuto.
Permita que se enfre y luego agregue 0.5 mL de reactivo A de Fehling y
0.5 mL de reactivo B de Fehling. Caliente en el bao de Mara por tres
minutos. Anote sus observaciones.
Parte C: polisacridos
1. Prepare una solucin concentrada de almidn en agua. Caliente
suavemente hasta que se forme engrudo. Djela en reposo hasta que
enfre. Luego aada dos gotas de solucin de yodo o de reactivo de lugol.
Anote sus observaciones.
2. Repita esta prueba utilizando reactivo de lugol en una rebanada de papa o
de pan. Anote sus observaciones.
Anlisis
1. Qu resultados muestra la prueba con el reactivo de Tollens? y con el
reactivo de Fehling?
2. Qu resultados muestra la prueba de solubilidad?
5.2.2 Hidrlisis de polisacridos
Objetivo
Comparar tres mtodos de hidrlisis de polisacridos, determinando la

cantidad de azcar reductor formado mediante la reaccin de la glucosa con
3,5-dinitrosalicilato de sodio.
Fundamento terico
35
Los polisacridos almidn, glicgeno y celulosa, son polmeros de la glucosa, de

elevado peso molecular y por hidrlisis dan un nmero grande y muy variable de
molculas de oligosacridos segn el tipo de carbohidrato.
El almidn es el carbohidrato de reserva de las plantas y se encuentra
almacenado en todos los granos, semillas, races y tubrculos. Est formado por
dos fracciones: un componente cristalino soluble, la amilosa (10-20%) y un
componente amorfo insoluble, la amilopectina (80-90%).
La amilosa est formada por largas cadenas sin ramificaciones en las cuales todas
las unidades de D-glucosa estn enlazadas por uniones -1 ,4. La amilopectina es
altamente ramificada por uniones glicosdicas -1,6 que se presentan ms o
menos cada 12 residuos de glucosa.
La hidrlisis de una macromolcula puede llevarse a cabo usando diversos
procedimientos: Empleando cidos y/o bases fuertes, con catalizadores
inorgnicos u orgnicos o mediante enzimas hidroltcas adecuadas.
El almidn por ejemplo puede ser hidrolizado enzimticamente por dos clases de
enzimas. La -amilasa sintetizada principalmente por las glndulas salivares y el
pncreas; hidroliza las uniones glicosidicas -1,4 presentes en la estructura interna
de la molcula de polisacridos; esta hidrlisis no sigue orden alguno lo que la
diferencia de las -amilasas vegetales, cuya hidrlisis se verifica desde el final no
reductor de la cadena hidrocarbonada. Como consecuencia de la hidrlisis final
por la -amilasa resultan entonces: glucosa, maltosa e isomaltosa y en etapas
intermedias se forman dextrinas ramificadas de peso molecular menor y
oligosacridos.
La hidrlisis de los polisacridos puede seguirse midiendo el incremento en
azcares reductores mediante el reactivo 3,5-dinitrosalicilato en solucin alcalina.
El cido 3,5-dinitrosaliclico (de color amarillo) se reduce a cido 3-amino-5
nitrosaliclico, (rojizo oscuro) produciendo una coloracin que se mide
espectrofotomtricamerite a 540 nm.
La reaccin de la glucosa con el 3,5-dinitro salicilato de sodio es:
36
La extensin o porcentaje de hidrlisis se determina comparando la cantidad de

azcar reductor presente en cualquier tiempo, con la cantidad de azcar presente
despus de la hidrlisis cida total.
La hidrlisis de los polisacridos tambin puede efectuarse por medios qumicos.
Los cidos fuertes diluidos catalizan el rompimiento indiscriminado de los enlaces
glicosdicos, dando como producto final glucosa.
La estructura polisacrida se demuestra en este experimento, ya que el nmero de
grupos reductores en el medio de reaccin aumenta a medida que transcurre la
hidrlisis. El progreso de la hidrlisis se mide de la misma forma que en la
hidrlisis enzimtica.
Reactivos
Solucin de almidn soluble (6 mg/ml) en buffer fosfato de sodio 0.02 M y

pH 6.9
NaOH2, 4 N
HCI 4 N
Reactivo 3,5-dinitro salicilato de sodio: (disolver 5 g de cido 3,5-dinitro
saliclico en 100 ml de NaOH 2N, calentar. Por separado, adicionar 150 g
de tatrato de sodio y potasio a 250 ml de H2O, calentar. Mezclar las dos
soluciones y completar a 500 ml)
Buffer fosfato de sodio 0.02 M pH 6.9 en NaCI 0.005 M.
NaOH 20%
Reactivo de Lucas. (134 g de ZnCI2 en 89 ml de HCI concentrado)
Procedimiento
37
El profesor en el momento de la prctica distribuir el trabajo de tal manera que

cada grupo realice una hidrlisis diferente sobre el mismo polisacrido; por
ejemplo el grupo 1 efectuar hidrlisis cida sobre almidn proveniente de
maizena y el grupo 2 efectuar la hidrlisis enzimtica sobre la misma muestra a
fin de que puedan comparar los resultados.
La solucin del polisacrido tendr una concentracin de 6 mg/ml y se preparar
en Buffer fosfato de sodio 0.02 M pH = 6,9.
Todos los grupos realizarn la hidrlisis cida de la celulosa en presencia de ZnCl2
(o reactivo de Lucas)
Hidrlisis cida
Rotular ocho tubos de ensayo y agregar en orden los siguientes reactivos:
Tubos
B
0
1
2
3
4
5
6
Solucin almidn, ml
0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4

Agua destilada, ml
0.4

NaOH, 2.4 N
1
1

HCl 4N, ml
0.6
0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
Colocar los tubos 1 a 6 en un bao mara a ebullicin y dejarlos en los
siguientes tiempos:
Tiempo de incubacin, minutos
0
0
3
6
9
12 15 25
Finalizado el tiempo de incubacin, sacar cada tubo y detener la hidrlisis
agregando:
NaOH, 2.4N, ml
1
1
1
1
1
1
Reactivo 3,5-dinitrosalicilato, ml
1
1
1
1
1
1
1
1
Introducir todos los tubos en el bao a ebullicin durante cinco minutos, enfriar
y agregar 7 ml de agua destilada. Agitar y medir transmitancia a 540 nm.
Utilice el B para ajustar el 100% de transmitancia.
Condiciones
Hidrlisis enzimtica
Recoger 2 ml de saliva en un vaso de precipitados. Cuando est todo listo para la
hidrlisis enzimtica, diluya la saliva original tomando 0.3 ml de saliva y 19.7 ml de
buffer de fosfato de sodio pH 6.9 en NaCI 0.005 M. Use inmediatamente la saliva
diluida.
Si la velocidad de hidrlisis es muy rpida para obtener una rata lineal en los
primeros minutos o demasiado lenta, para observar una rata apreciable, repita el
ensayo usando otra dilucin de saliva.
Rotular ocho tubos de ensayo y agregar los siguientes reactivos:
38
Tubos
B
0
1
2
3
4
5
6
Solucin almidn, ml
0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4

Agua destilada, ml
0.4

Saliva diluida, ml
0.6
0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
Inmediatamente adicione la saliva a los tubos B y 0, agregue el siguiente
reactivo:
1
1

Agite todos los tubos y deje incubar a temperatura ambiente:
Tiempo de incubacin, minutos
0
0
3
6
9
12 15 25
Luego de terminar la incubacin, agregue:
1
1
1
1
1
1
Coloque todos los tubos en un bao a ebullicin durante cinco minutos, enfre
y agregue 8 ml de agua destilada. Mida la transmitancia a 540 nm y use el
tubo B para ajustar el 100% de transmitancia.
Condiciones
Hidrlisis cida de la celulosa en presencia de ZnCI2

Colocar en una cpsula un trozo de algodn bien desmenuzado o vanos pedacitos
pequeos de papel de filtro. Agregue 3 ml del reactivo de Lucas y caliente durante
tres minutos, agitando energticamente. Deje enfriar y neutralice rpidamente con
NaOH al 20%. Si se forma un precipitado centrifugue a 2.500 rpm durante 10
minutos y luego pase 0.5 ml del sobrenadante a un tubo, adicione 1 ml de NaOH
2,4 N y 1 ml del reactivo, 3,5-dinitro salicilato y proceda en igual forma a la
utilizada en las hidrlisis anteriores. Repita el procedimiento calentando durante 6
minutos.
La glucosa libre que queda despus de la hidrlisis completa del almidn, (tubo
No. 6 de la hidrlisis cida), representa el 100% de conversin del polisacrido en
glucosa.
Tomando el valor de absorbancia de este tubo como el 100% de hidrlisis, calcule
el porcentaje de hidrlisis en los dems tubos de las diferentes hidrlisis.
Grafique el porcentaje de hidrlisis o formacin de azcar reductor vs tiempo para
la hidrlisis cida y enzimtica del almidn.
Compare el porcentaje de hidrlisis a los 3 minutos de cada polisacrido para la
hidrlisis cida, la hidrlisis cida en presencia de ZnCI2 e hidrlisis enzimtica.
Cuestionario
39
1. Cules son los productos de la hidrlisis enzimtica parcial y total del

almidn, del glicgeno y de la celulosa?
2. Cul es el efecto de la adicin de NaCI al buffer fosfato usado para diluir la
saliva?
3. Explique la diferencia estructural entre la celulosa y el almidn. Cmo puede
degradarse enzimticamente la celulosa?
4. Qu son los compuestos llamados dextrinas y cul es su importancia en la
elaboracin de alimentos?
5.3 PRCTICAS DE LA UNIDAD 3: CATABOLISMO Y BIOSNTESIS
5.3.1 Determinacin de almidn y glucosa en alimentos
Reactivos
1. Reactivo de lugol
2. Reactivo de Fehling
3. Almidn
4. Solucin del glucosa al 2%
5. Agua destilada
6. Un trozo de pan
7. Una papa
8. Un pltano
9. Una manzana
10. Jugo de zanahoria, de durazno y de uva
11. Azcar de mesa (comn)
Materiales
1. Pipeta
2. Esptula
3. Gradilla
4. Tubos de ensayo
5. Mortero y pistilo
6. Vasos de precipitados de 50 y de 300 mL
7. Gotero
8. Mechero
9. Trpode
10. Malla de asbesto
Procedimiento
40
1. Prepare una solucin disolviendo 0.5 g de almidn en 10.0 mL de agua;

para esto utilice un vaso de precipitado de 50 mL. Tome 5.0 mL de la
solucin por medio de una pipeta y aade tres gotas de lugol, por medio de
un gotero. Observe el cambio de coloracin de la solucin. Este tubo de
ensayo debe ser colocado en la gradilla y se debe utilizar como muestra
patrn de referencia.
2. Haga un pur con la papa, el pltano o el pan, partiendo o cortando
pequeos trozos y luego triturando; se puede utilizar un mortero para esto.
3. Para cada muestra utilice un tubo de ensayo diferente, aada 2.0 mL de
agua destilada y agite. Luego adicione tres gotas de lugol y agite. Compare
la coloracin obtenida para cada alimento con la muestra patrn. Registre
los resultados.
4. Aliste un bao Mara y ajuste la temperatura a 50C. Adicione 2.0 mL de la
solucin de glucosa y adicione 2.0 mL de reactivo de Fehling (1.0 mL de
reactivo de Fehling A y 1.0 mL de B). Caliente durante tres minutos.
Observe los cambios que se producen y guarde esta muestra como patrn.
5. Nuevamente, para cada muestra utilice un tubo de ensayo diferente, aada
2.0 mL de agua destilada y agite. A cada tubo de ensayo adicione 2.0 mL
de reactivo de Fehling (1.0 mL de A y 1.0 mL de B). Caliente en el bao
Mara durante cinco minutos. Registre los cambios y compare con la
muestra patrn.
Anlisis
1. Indique los alimentos que contienen almidn y los que contienen glucosa.
2. Es posible ordenar los alimentos con base en su contenido de almidn?
5.3.2 Identificacin de algunos aminocidos presentes en alimentos
Reactivos:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Un huevo
Queso
Leche
Una manzana
Etanol
cido clorhdrico concentrado
Solucin de hidrxido de sodio al 10%
Solucin de sulfato de cobre al 1.0%
Solucin de acetato de plomo
Materiales
1. Diez tubos de ensayo
2. Gradilla
41
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Dos vasos de precipitado de 250 mL

Trozo de tela
Embudo
Mechero de gas o de alcohol
Pinza para tubo de ensayo
Vidrio de reloj
Pipeta
Procedimiento
1. Realice un orificio pequeo en la cscara de un huevo y separe
cuidadosamente la clara en un vaso de precipitado. Agite la clara durante
un tiempo y agregue dos veces su volumen de agua.
2. Filtre la mezcla para as obtener una solucin de albmina homognea.
Tome siete tubos de ensayo y mrquelos como A, B, C, D, E, y F y agregue
2.0 mL de esta mezcla en cada tubo.
3. Tome el tubo A y calintelo suavemente en la llama del mechero. Registre
sus observaciones.
4. Tome los tubos B, C, D y E y adicione 2.0 mL de etanol al B; 1.0 mL de
hidrxido de sodio al 10% al C; 1.0 mL de cido clorhdrico concentrado al
D; y 1.0 de cido ntrico concentrado al E. Registre las observaciones para
cada tubo.
5. Al tubo de ensayo C agregue nuevamente 1.0 mL de la solucin de
hidrxido de sodio al 10% (se ha agregado en total 2.0 mL de hidrxido de
sodio). Mezcle suavemente y aada dos gotas de solucin de sulfato de
cobre al 1%. Registre sus observaciones.
6. Al tubo de ensayo E adicione unas cuantas gotas de la solucin de
hidrxido de sodio al 10%. Registre sus observaciones.
7. Tome el tubo de ensayo F y aada 2.0 de la solucin de acetato de plomo y
1.0 mL de la solucin de hidrxido de sodio al 10%. Caliente hasta
ebullicin. Observe el color del precipitado formado y su apariencia general.
8. En un vidrio de reloj coloca un trozo de queso y agregue unas gotas de
cido ntrico concentrado. Registre sus observaciones.
9. Repita el procedimiento anterior con un trozo de manzana en lugar del
queso.
10. Coloque en un tubo de ensayo 2.0 mL de leche y aada 1.0 mL de cido
ntrico concentrado. Caliente suavemente. Registre sus observaciones.
Anlisis
1.
2.
3.
4.
Qu comportamiento comn observa para los tubos A, B, C, D y E?

Cual es la finalidad de la prueba del paso cinco?
Qu nombre recibe la prueba efectuada en el tubo de ensayo E?
Qu tipo de aminocidos se puede identificar mediante la prueba con
acetato de plomo?
42
5. Qu puede identificar con las ltimas tres pruebas?

5.3.3 Fraccionamiento de tejidos en sus principales constituyentes:
carbohidratos, lpidos, protenas y cidos nucleicos
Objetivos
Utilizar las tcnicas de solubilidad diferencial y de centrifugacin en el
fraccionamiento de un tejido animal en sus principales constituyentes.
Comparar los tejidos tratados de acuerdo con sus componentes principales.
Fundamento terico
Debido a las diferencias qumicas que existen entre las molculas de
carbohidratos, lpidos, protenas y cidos nucleicos, stas presentan diferente
solubilidad en solventes orgnicos y adems en cidos semejantes al
tricloroactico (ATA) de acuerdo con la temperatura. Es posible entonces utilizar
tales solubilidades diferenciales para separarlos, una vez que los tejidos han sido
triturados y se han roto sus membranas.
Accin del cido tricloroactico a baja temperatura
Sobre carbohidratos
A baja temperatura los monosacridos son estables en medio cido, mientras que
si se tratan en caliente, sufren deshidratacin producindose los furfurales.
Los polisacridos en medio cido sufren hidrlisis del enlace glicosdico, reaccin
que aumenta su velocidad a medida que se eleva la temperatura. A temperaturas
interiores a 4C, la velocidad de hidrlisis es tan lenta que para fines prcticos se
considera que no ocurre reaccin.
En general se puede decir que los carbohidratos son solubles en solucin de cido
tricioroactico al 20% a temperaturas inferiores a 4C y que no sufren cambios
qumicos en estas condiciones.
Sobre lpidos
Segn sus propiedades fisicoqumicas, estos compuestos son poco solubles en
soluciones acuosas y no son extrados si se trata el tejido con soluciones acuosas
de cido tricloroactico.
Sobre protenas
43
Forman sales insolubles en cidos como tricloroactico o perclrico, por tanto no

son solubles en soluciones de cido tricloroactico al 20% en fro.
Sobre cidos nucleicos
Lo mismo que las protenas, estos cidos son insolubles en soluciones fras de
cido tricloroactico. Por otra parte el cido deoxirribonucleico (DNA) est unido a
histonas, lo cual lo hace ms insoluble en estas condiciones.
En conclusin, al tratar un tejido previamente triturado con cido tricloroactico al
20% y a 4C y someter a centrifugacin la suspensin resultante, en el
sobrenadante se obtienen los azcares, mientras que los lpidos, protenas y
cidos nucleicos quedan en el residuo.
Accin del etanol-ter-cloroformo (2: 2: 1 v/v)
Si el residuo de la extraccin con cido tricloroactico a 4C, se trata con solucin
de etanol-ter-cloroformo, al solvente solo pasan los lpidos, mientras que las
protenas y los cidos nucleicos quedan en la fase slida.
Accin del cloruro de sodio al 10% en caliente
Si el residuo anterior se suspende en una solucin de NaCI al 10% y se calienta
en bao mara (92C) durante 40 minutos, se desnaturalizan las protenas, en
tanto que los cidos nucleicos, principalmente el ribonucleico (RNA), quedan en
solucin. Por este procedimiento es posible separar las protenas de los cidos
nucleicos. Si al sobre nadante se le agrega ahora etanol absoluto en un volumen
igual al doble de la solucin original y se enfra en bao de hielo durante 10
minutos, se obtiene un precipitado que puede ser separado por centrifugacin y
que contiene los cidos nucleicos.
Reactivos
ATA al 10%
Arena lavada
Etanol del 95%
etanol ter cloroformo (2: 2:1)
NaCI al 10%
Tejidos: hgado, corazn, pncreas de un animal utilizado en el trabajo
experimental.
Procedimiento
Cada grupo har el fraccionamiento qumico sobre un tejido determinado. Para
comparar los diferentes tejidos desde el punto de vista del contenido de
carbohidratos, lpidos, protenas y cidos nucleicos, deber confrontar sus
resultados con los obtenidos por los otros grupos.
44
NOTA: Las diferentes fracciones obtenidas en esta prctica, deben guardarse para
la siguiente sesin de laboratorio.
A cada grupo se le entregar una muestra de tejido en ATA al 10% con los
siguientes datos:
peso del tejido.
origen del tejido.
ATA al 10% adicionado (1,5 mI/g de tejido).
Este tejido se tratar conforme al diagrama esquemtico del mtodo para
fraccionar un tejido en sus constituyentes que se encuentra en la siguiente pgina.
Cada grupo recibir cinco frascos donde guardar y marcar adecuadamente
cada fraccin que obtenga.
Cuando tenga que evaporar las fracciones, lo har en una plancha de
calentamiento sobre una malla de asbesto; para secar, debe utilizar la estufa.
Compare sus resultados con los obtenidos por los dems grupos y con los datos
bibliogrficos. De acuerdo con la funcin fisiolgica y con los resultados, diga
cules son los tejidos que cualitativamente contienen ms protenas, lpidos,
cidos nucleicos y carbohidratos.
Cuestionario
1. Por qu se recomienda mantener los tejidos que se fraccionan a baja
temperatura?
2. Qu sucede al contenido celular si la temperatura a que se mantiene es de
37C?
3. Cul es el fundamento de la centrifugacin? Haga una explicacin breve de
los principios.
45
5.3.4 Caracterizacin de las fracciones obtenidas a partir de diferentes

tejidos
Objetivo
Investigar la presencia de carbohidratos, lpidos, protenas y cidos nucleicos en
las tracciones obtenidas de diferentes tejidos del animal empleado, utilizando para
ello reacciones caractersticas para cada uno de los componentes anteriores.
46
Fundamento terico
Carbohidratos
Los organismos vivos contienen carbohidratos que pueden estar formando
polisacridos de reserva, pueden ser componentes estructurales o pueden estar
participando en el metabolismo en forma monomrica.
Las propiedades qumicas de tales compuestos permiten diferenciarlos, as:
Los polisacridos son solubles en soluciones acuosas cidas, pero
insolubles en etanol.
Los polisacridos como el almidn, el glicgeno y los dextranos, forman
compuestos coloreados caractersticos cuando se combinan con yodo
molecular.
A pesar de que la naturaleza de estos complejos no est bien definida, la
evidencia disponible indica a formacin de complejos de absorcin entre las
cadenas helicoidales del polisacrido y el yodo. Para que haya estructura
helicoidal se necesita por lo menos una cadena con ocho unidades de
monosacrido.
Los polisacridos que a todo lo largo de su molcula muestran estructura
helicoidal, dan coloracin azul intensa, ej. la amilosa. Aquellos que son
ramificados con hlices interrumpidas, producen coloraciones menos intensas, ej.
la amilopectina. Los altamente ramificados con segmentos cortos de ramificacin,
producen color pardo o rojizo, ej. el glicgeno.
Reaccin de Molisch
Un azcar tratado con a-naftol y cido sulfrico concentrado, produce una
coloracin violeta. Se presume que el cido sulfrico acta como deshidratante
formando derivados del tipo de los furfurales que reaccionan con el a-naftol para
dar productos coloreados.
Reaccin de Benedict
Azcares reductores tratados con solucin alcalina suave (citrato-carbonato de
sodio) de in cprico, lo reducen a xido cuproso de color ladrillo.
Lpidos
En cuanto a solubilidad, los lpidos son insolubles en agua pero solubles en
solventes orgnicos.
47
Los triglicridos forman un complejo coloreado (vino tinto) con el cido

hidroxmico y el hierro en medio cido y oxidante.
Los hidroxiesteroides con insaturacin en la posicin 5 reaccionan con el anhdrido
actico para dar steres, que en medio sulfrico se deshidratan produciendo una
coloracin verde.
Los fosfolpidos por accin del NaOH se hidrolizan produciendo fosfatos
inorgnicos, que con el cido molbdico dan fosfomolibdato y estos, por accin de
reductores como el cido 1,2,4-aminonaftolsulfnico o el cido ascrbico,
producen complejos de xidos de molibdeno de color azul.
Si los jabones resultantes de la hidrlisis alcalina se someten a la accin del ter,
los jabones se sedimentan y en el sobrenadante queda el glicerol. Los
compuestos que en su estructura tienen grupos ( > CHOH)n forman complejos con
iones metlicos como el Cu+2 por tanto si el sobrenadante anterior se evapora al
bao de mara el residuo se disuelve en agua caliente y se acidifica con HCI; si los
jabones no se haban separado totalmente, los cidos grasos de estos se separan
en una capa insoluble en agua. Despus de evaporar la capa acuosa, el residuo
se disuelve en etanol y por la adicin de solucin de sulfato de cobre se formar
un quelato de cobre de color verde, luego de agregar NaOH 0.1 N.
cidos nucleicos
Hidrlisis
Los lcalis diluidos (0.3 a 1.0 N) hidrolizan los enlaces ster del cido ribonucleico.
En cambio los enlaces ster del cido deoxirribonucleico son relativamente
estables, lo mismo que los enlaces N-glicosdicos de DNA y RNA. La facilidad de
hidrlisis en el RNA parece estar asociada a la presencia de hidroxilos en los
carbonos 2 y3, lo cual permite la formacin de intermedios cclicos 2, 3fosfonucletidos, que finalmente dan los complejos monofosfonucletidos- 2 o 3.
Como la deoxirribosa del DNA no forma tales intermediarios, es relativamente
48
estable en presencia de lcali diluido. La acidificacin de la solucin despus del

tratamiento alcalino precipita las molculas de DNA intactas.
Los nucletidos obtenidos en la hidrlisis anterior fluorecen a la luz ultravioleta.
Con orcinol
Los nucletidos del RNA, debido a la presencia de ribosa, reaccionan con el
reactivo cido de orcinol (cloruro frrico en HCI concentrado + solucin alcohlica
de orcinol), dando coloracin verdosa.
Desnaturalizacin de protenas
Por accin de pHs extremos se destruyen los puentes de hidrgeno que
mantienen la estructura secundaria de las protenas. Las protenas a temperaturas
mayores de 50C precipitan, por formacin de agregados que resultan de la
destruccin de la estructura secundaria y terciaria.
Millon
Las protenas que contienen tirosina reaccionan con mercurio disuelto en cido
ntrico, produciendo nitroderivados mercuriales de color rojo.
Ninhidrina
Los grupos amino terminales de las protenas reaccionan con la ninhidrina en
caliente, dando complejos de color violeta. En ellos, el amonaco desprendido
reacciona con una molcula de ninhidrina en estado oxidado y con otra en estado
reducido.
Biuret
Los nitrgenos del enlace peptdico forman complejos coloreados con los iones
cpricos en medio alcalino.
49
Reaccin Xantoproteica
Esta reaccin se basa en la nitracin del anillo bencnico por el HNO3
concentrado, dando derivados amarillos de nitrobenceno. Las protenas que
contienen tirosina y triptfano dan esta reaccin, pero el color amarillo resultante
se transforma en naranja si se le adiciona NH4OH. Para nitrar la fenilalanina se
requiere H2SO4 como catalizador.
Reactivos
Etanol
HCI 2N
Solucin de lugol
Reactivo de Molisch
Acido sulfrico concentrado
Reactivo de Benedict
ter etlico
NaOH al 15% y 50%
Hidroxilamina al 10%
KOH 2N
Reactivo de Millon
Ninhidrina al 0.2%
Reactivo de Biuret
cido ntrico concentrado
Hidrxido de amonio concentrado
Almidn
Glucosa
FeCl3 al 5%
Cloroformo
Anhdrido actico
AcOH 10%. Fenolftalena
Acido molbdico
Acido 1,2,4-aminonaftolsulfnico
o cido ascrbico (150 mg/100 mI)
Bencidina al 4% en c. actico
Triglicridos
Colesterol
Lecitina
Albumina
Reineckato de amonio al 2% en etanol
Glicina
Tirosina
Solucin de pentosa
3 Procedimiento
Con las muestras M1, M2, M3, M4 y M5 obtenidas en la prctica anterior, se harn
las siguientes pruebas de caracterizacin.
Carbohidratos
Muestras M1, M2 y patrones de mono y polisacridos.
50
Lugol
A una fraccin de cada una de las muestras agregarles 3 gotas de solucin de
Lugol. Observar las coloraciones. A otras porciones iguales de estos compuestos,
adicioflanes 1 ml de HCI 2N y colocarlos al baflo mara durante 25 minutos. Dejar
enfriar y agregarles nuevamente Lugol. Obsrvese los resultados y explquelos en
el informe.
Molisch
A una nueva fraccin de los compuestos anteriores, agrgueles 1 ml de agua
destilada, 2 gotas de reactivo de Molisch. Mezcle cuidadosamente y con los tubos
inclinados agregue 1 ml de cido sulfrico concentrado de manera que se forme
una capa de cido debajo de la fase acuosa. Anote el color del anillo formado en
la interfase.
Benedict
Coloque al bao mara durante 2 minutos, fracciones de las muestras y patrones,
con 2 ml de solucin de Benedict. Observe los resultados y contine calentando
por 15 minutos. De nuevo observe los tubos.
Lpidos
Muestra M3 y patrones de lecitina, colesterol y triglicridos.
cidos hidroxmicos
A una fraccin de las muestras, agregue 1 mI de hidroxilamina al 10% a la cual se
le ha incorporado 0.01% del indicador timolftalena. Adicione lentamente solucin
de NaOH al 10% hasta color azul permanente. Caliente en bao mara por 10
minutos, enfre al chorro y adicione HCI al 10% lentamente y con agitacin, hasta
desaparicin del color azul. Agregue unas 2 gotas del mismo cido en exceso. Por
ltimo adicione 0.5 ml de solucin de FeCl3 al 5%. Observe los cambios de
coloracin que ocurren y anote los resultados.
3.2.2 Prueba de Lieberman-Burchard
Tome una fraccin de cada una de las muestras, agrgueles 3 ml de cloroformo,
mezcle bien. Agregue despus 1 ml de anhdrido actico, agite y adicione con
cuidado 3 gotas de cido sulfrico, por las paredes del tubo. Observe la coloracin
en la interfase al minuto y a los 15 minutos. Explique.
3.2.3 Saponificacin
51
A una cantidad anloga a la anterior de las fracciones, agregue 3 ml de NaOH al

15% coloque en la boca del tubo una estera de vidrio y ponga al bao mara
durante 20 minutos. Aada 15 ml de ter etlico y filtre los jabones resultantes.
Despus de la hidrlisis neutralizar con cido actico al 10% usando fenolftalena
como indicador.
Colina
A 10 ml del filtrado anterior aadir 6 ml de Reineckato de amonio al 2% en etanol y
colocarlo en nevera por 30 minutos hasta que cristalice.
cidos nucleicos
Muestra M5
Tome una traccin de la correspondiente a los cidos nucleicos, adicione 3 mI de
KOH 2 N y coloque en la boca del tubo una esfera de vidrio. Ponga el tubo al bao
mara durante 30 minutos. Acidifique la solucin con HCI y observe si se forma
precipitado. Separe ste por centrifugacin.
Pentosas
A 0,5 ml del sobrenadante anterior adicione 0,5 ml de solucin de bencidina al
0,4% en cido actico caliente la solucin al bao mara durante 10 minutos,
colocando una bola de vidrio en la boca del tubo. Observe la coloracin. Repita la
experiencia con 0,5 ml de solucin patrn de pentosa.
Fosfatos
A 1 ml del mismo sobrenadante acidificado, agregar 1 ml de cido molibdico,
mezcle bien y despus de dejar en reposo 10 minutos adicione 0,5 ml de cido
1,2,4-aminonaftolsulfnico o 1 ml de cido ascrbico. Observe la coloracin.
Protenas
Muestra M4 y patrones de protena y de aminocidos.
Millon
A una traccin de la muestra y de los patrones, suspendidas en 1 mI de agua,
agregue 3 gotas del reactivo de Millon; caliente durante unos minutos al bao
mara; observe el precipitado.
Ninhidrina
52
A una fraccin de la muestra y los patrones agregue 1 ml de la solucin de

ninhidrina al 0,2%. Caliente al bao mara durante 10 minutos y observe el color.
Biuret
Tome una fraccin de la muestra y de los patrones, agregue 1 ml del reactivo de
Biuret. Mezcle, espere 10 minutos y observe el color.
Xantoproteica
Caliente una traccin de la muestra y de los patrones con 1 ml de cido ntrico
concentrado, enfre y observe el color. Agregue cuidadosamente un exceso de
hidrxido de amonio concentrado. Observe la interfase.
De acuerdo con los resultados, deduzca qu tipo de polisacridos, aminocidos en
las protenas, lpidos y cidos nucleicos estn presentes en el tejido.
Cuestionario
1. Explique la reaccin con el reactivo de Lugol, de las fracciones de
carbohidratos y patrones, antes y despus del tratamiento con HCI 2N.
2. Por qu el colesterol no es saponificable?
3. Escriba las reacciones de las diferentes pruebas realizadas en esta prctica.
4. En qu tejidos se almacena el glicgeno? y cul es su funcin?
5. Si en su muestra de protenas estn presentes sales de amonio, Cul de las
reacciones de reconocimiento de aminocidos no se debe usar? D sus
razones.
5.3.5 Extraccin de la yema de lpidos del huevo
Objetivo
Extraer y caracterizar los fosfolpidos, colesterol y triglicridos presentes en la

yema de huevo.
Fundamento terico
La separacin de los lpidos es extremadamente difcil por extraccin con vanos
solventes orgnicos puros. Se hace uso de la propiedad que tienen la mayora de
53
los lpidos de ser solubles en mezclas de etanol: ter o etanol: cloroformo. La

yema de huevo contiene buenas cantidades de grasas neutras, lecitinas y
colesterol.
Las lecitinas tienen un pH aproximadamente neutro, ya que contienen grupos
cidos (HPO4-2) y bsicos (Colina) formando zwitteriones muy polares. Se
dispersan coloidalmente en agua en contraste con las grasas neutras que no se
emulsionan. Las lecitinas se precipitan a partir de una solucin etrea por adicin
de acetona y su reconocimiento se basa en un test para saponificacin y en un
test para Colina. Las esfingomielinas tambin tienen Colina pero son solubles en
ter y se presentan en cantidades despreciables en el huevo crudo.
El colesterol no precipita por tratamiento con acetona de una solucin etrea y
como no es saponificable despus del tratamiento con KOH puede extraerse con
ter, en tanto que los triglicridos se han saponificado dando jabones solubles en
agua. Para el reconocimiento del colesterol se aplica el test de LiebermannBurchard. El colesterol requiere de 15 a 20 minutos para el desarrollo de un color
verde profundo, precedido de un color lila.
Se requieren condiciones completamente anhidras para esta reaccin.
Reactivos
Yema de huevo cocida
Mezcla de alcohol-ter (2:1)
ter etlico
Acetona
Ba(OH)2 saturado
Acido actico al 10%
Fenolftalena
Reineckato de amonio 2%
KOH alcohlico 10%
Cloroformo anhidro
Anhdrido actico
H2SO4 concentrado
Procedimiento
Trate la muestra como se indica en el esquema de extraccin:
54
Preparacin de Lecitina
55
Amasar la yema de huevo cocido y mezclarla con 40 ml de la mezcla de alcoholter (2:1). Dejar reposar 10 minutos con agitacin ocasional, filtrar con papel
humedecido con alcohol. Remover el residuo del papel filtro y mezclarlo con otros
10 ml de la mezcla de alcohol-ter y filtrar. Combinar los dos filtrados en una
cpsula previamente pesada.
El filtrado se evapora hasta sequedad en un bao mara. Pesar y disolver el
residuo en 5 ml de ter y agregar esta solucin lentamente y con agitacin a 15 ml
de acetona y con ayuda de un polica agitar de manera que las partculas de
lecitina se aglomeren y formen una bola. Guardar la solucin de ter-acetona para
la segunda parte.
Solubilidad
Mezclar un poco de lecitina con agua. Observar que se dispersa formando un
coloide.
Hidrlisis
Agregar 20 ml de Ba(OH)2 saturado al resto de lecitina y luego hidrolizar durante
30 mm en un erlenmeyer con varilla para reflujo.
Despus de la hidrlisis neutralizar con CH3COOH al 10% usando fenolftalena
como indicador. Filtrar y descartar el residuo. Al filtrado aadir 6 mI de reineckato
de amonio al 2% en etanol y colocarlo en la nevera por 20 30 minutos hasta que
cristalice.
Preparacin del Colesterol
La solucin de ter-acetona obtenida durante la preparacin de la lecitina,
evaporarla en un bao de vapor hasta obtener una pasta. (El residuo no debe oer
a ter o acetona). Enfriar y pesar. Aadir 10 ml de KOH alcohlico al 10%, perlas
de vidrio y colocar en reflujo por 30 mm. Enfriar y luego aadir 30 ml de ter. Filtrar
el precipitado de jabn si se forma. La solucin de ter contiene entonces el
colesterol.
Evaporar hasta sequedad en un vidrio de reloj, descartar los restos de agua o
secar con un papel de filtro.
Extraer el colesterol calentando el residuo con 5 ml de alcohol en un bao de
vapor y pasar la solucin a un tubo de centrfuga de 15 ml. Al residuo sobre el
papel agregar otros 3 ml. de alcohol con el fin de lograr una extraccin completa,
combinar los dos extractos alcohlicos, centrifugar durante 5 minutos. Pasar el
lquido sobrenadante que contiene el colesterol a otro tubo de centrfuga y aadir
56
agua gota a gota hasta que no se forme ms precipitado. Dejar en reposo durante
15 minutos y centrifugar. Decantar el lquido sobrenadante.
Si se desea, el colesterol puede purificarse por recristalizacin con unos pocos
mililitros de alcohol caliente. Cuando est fro, la adicin de unas gotas de agua
asegura la cristalizacin. Centrifugar. Dejar secar el precipitado y sobre el
producto seco realizar el test de Liebermann-Burchard as: en un tubo de ensayo
seco colocar unos pocos mg de colesterol, 1,5 ml de cloroformo anhidro, 0,5 mI de
anhdrido actico y 2 gotas de cido sulfrico concentrado. El desarrollo del color
generalmente demora de 15 a 30 minutos y durante este tiempo debe colocarse
en la oscuridad.
Calcular el porcentaje de lpidos totales, lecitina, colesterol y triglicridos presentes
en la yema de huevo.
Comparar con los valores reportados en la bibliografa.
Escribir las reacciones de caracterizacin de cada uno de los lpidos extrados.
Cuestionario
1. Cules son los productos de hidrlisis completa de la lecitina?
2. Si la extraccin del colesterol no se realiza en condiciones anhidras qu
resultado esperara?
3. Por qu la lecitina forma una emulsin en presencia de H2O?
4. Es el colesterol saponificable? Explique su respuesta.
5. Escriba las estructuras del colesterol, cido desoxiclico, estradiol,
progesterona, vitaminas A y D Qu similitud estructural encuentra entre ellas?
6. Cules son las ventajas y desventajas del mtodo de extraccin utilizado?
5.3.6 Determinacin cuantitativa de protenas en harinas de leguminosas y
cereales por el mtodo de Micro Kjeldahl
Objetivo
Determinar el contenido total de nitrgeno en harinas de leguminosas y

cereales utilizando el mtodo de micro Kjeldhal.
57
Fundamentos tericos
Mtodo Kjeldahl
Este mtodo, diseado para la determinacin de nitrgeno total, puede aplicarse al
anlisis de protena bruta de una muestra o de protena verdadera, haciendo una
extraccin previa de sta o tambin determinando el nitrgeno no protenico.
El resultado de los anlisis por Kjeldahl se expresa como protena bruta,
multiplicando el porcentaje de nitrgeno en la muestra por 6.25. Esta conversin
se basa en el contenido promedio de nitrgeno del 16% de muchas protenas.
Aunque este promedio puede no ser vlido para protenas especficas purificadas,
es suficientemente exacto para la mayora de propsitos.
Para la determinacin del nitrgeno presente en la muestra, es necesario hacer la
digestin del compuesto hasta CO2 e iones NH4+, por tratamiento en caliente con
H2SO4 concentrado y en presencia de mezcla catalizadora. Cuando se trata de
determinar el nitrgeno de compuestos que contengan enlaces N-N, NO y NO2,
previamente debe practicarse tratamiento con agentes reductores para
convertirlos en grupos amina.
La cantidad de amonio producido se determina agregando un exceso de lcali a la
solucin cida que los contiene, con lo cual se desplazan tales iones del bisulfato
amnico y en la forma de hidrxido de amonio son arrastrados por una corriente
de vapor de agua a un sistema cerrado y absorbidos en una solucin de cido de
concentracin conocida.
El exceso de cido que queda en la solucin, despus de haber recogido todo el
amoniaco desprendido, se valora con un lcali de ttulo conocido.
Tambin el amonio desprendido puede recogerse sobre una solucin de cido
brico, y el borato cido de amonio producido se titula por retroceso con solucin
de un cido fuerte de concentracin conocida.
El mtodo que se usa en la realidad se ha ajustado a la tcnica micro.
Las reacciones que ocurren durante todo el proceso son:
Digestin:
N orgnico + H 2 SO 4
NH 4 SO 4 + CO 2 + SO 2 + SO 3
Mezcla Caral
Destilacin:
Absorcin:
NH 4 HSO 4 + NaOH
NH 4 OH + NaHSO 4
Arrastre con Vapor
58
NH 4 OH + H 3 BO 3
NH 4 H 2 BO 3 + H 2 O
Titulacin:
NH 4 H 2 BO 3 + HCl
NH 4 Cl + H 3 BO 3
La suma miembro a miembro de las ecuaciones de absorcin y titulacin, da la

ecuacin definitiva de titulacin:
NH 4 OH + HCl
NH 4 Cl + H 2 O
Indicador
El mtodo es reproducible, requiere el tratamiento de muestras con un contenido

de protena mayor de 3 mg y puede calificarse como consumidor de tiempo y
dispendioso en general. Sin embargo, como es posible conocer el contenido de
nitrgeno no protenico (haciendo una extraccin previa de este y determinndolo
en la solucin de extraccin), se obtienen entonces valores bastante exactos del
contenido real de protena.
Se recomienda usarlo para determinar protena en mezclas crudas y relativamente
grandes, pero no es rpido ni muy aconsejable para aplicarlo a gran nmero de
muestras de protena soluble relativamente pura.
Reactivos
Mezcla catalizadora Sysoev: K2SO4 100 g, CuSO4 25 g, KMnO4 7.5 g y Se

metlico 0.5 g.
H2SO4 concentrado, del 98% y d = 1.84 g/ml
Solucin de cido brico al 4%.
Indicador Taschiro: rojo de metilo (al 0.2% en Etanol) 1 volumen + verde de
bromocresol (al 0.2% en Etanol) 5 volmenes.
NaOH al 50%.
HCI 0.01 N.
Procedimiento
Digestin
En un baln de digestin marcado colocar en su orden lo siguiente:
Muestra de harina de leguminosa, 30 a 35 mg; o en su defecto muestra de
harina de cereal, 45 a 50 mg
Mezcla catalizadora, aproximadamente 100 mg.
H2SO4 concentrado, 1 ml.
Para todo el grupo se corrern nicamente dos blancos. En tales balones se
coloca lo mismo a excepcin de la muestra.
59
Llevar los balones al digestor, calentar al principio suavemente-aproximadamente

durante 15 minutos-con el fin de sacar por evaporacin la mayor parte de la
humedad que acompaa a la muestra. Aumentar luego gradualmente el calor
hasta una temperatura tal, que los vapores de SO3 (precaucin: estos son
producidos por descomposicin del H2SO4, causan irritacin y producen tos de no
hacerse la operacin en vitrina) no alcancen sino la mitad del cuello del baln de
digestin.
Mantener estas condiciones aproximadamente por una hora, hasta obtener una
solucin de color verde esmeralda. Dejar enfriar los balones al aire.
Destilacin y absorcin
En la figura 66 se muestra el aparato correspondiente. Al baln del generador de
vapor se agregan perlas de vidrio o trozos de corcho o vidrio para ayudar a regular
la ebullicin.
Operar el generador de vapor hasta alcanzar un flujo constante de vapor, lo que
se consigue aumentando o disminuyendo el calor. Entre tanto, la llave de doble
paso debe conducir el vapor al vertedero. Agregar con cuidado un poco de agua
destilada al baln de digestin y agitar para disolver la suspensin. Transferir
totalmente la mezcla digerida al baln de destilacin que tiene cuello esmerilado.
Lavar unas tres veces el baln de digestin con pequeas porciones de agua
destilada y agregar estas aguas de lavado al baln de destilacin.
Medir 10 ml de H3BO3 al 4% en un erlenmeyer de 125 ml, agregar 3 gotas de
indicador y colocarlo debajo del refrigerante, de modo que la punta del tubo interior
del mismo quede sumergida en el cido brico, ver figura 66.
Coloca el baln de destilacin que contiene la mezcla digerida en el extremo del
tubo que conduce el vapor y asegurarse que quede perfectamente ajustado para
prevenir escapes. Levantar la tapa del embudo (cuidando de dejar un pequeo
nivel en el mismo para que acte como sello) para permitir el paso de
aproximadamente unos 5 ml de NaOH del 50%. Tapar rpidamente el embudo y
operar la llave de doble paso para que el vapor penetre al baln de destilacin al
cual se le acaba de agregar la soda concentrada.
60
Figura 1: Montaje para destilacin en el mtodo de Micro Kjeldahl
A partir del momento en que empiecen a condensarse vapores de NH3 en la parte

superior del refrigerante, lo cual se conoce porque la solucin de cido brico vira
a un violeta o azul, cronometre cinco minutos. Transcurrido este tiempo, baje el
erlenmeyer de modo que el extremo del tubo interior del refrigerante quede por
encima del nivel del lquido en el erlenmeyer. Hecha la anterior operacin, esperar
tres minutos ms para que el refrigerante escurra y se lave.
Con el frasco lavador, lave la punta del refrigerante y reciba estas aguas de lavado
en el erlenmeyer. Desmontar el baln de destilacin y dejar pasar el vapor para
efectos de lavado. Operar enseguida la llave de doble paso para dirigir el vapor
hacia el vertedero.
Por ltimo, con el frasco lavador, lavar tambin el extremo del tubo que conduce el
vapor al baln de destilacin, con el fin de dejarlo limpio para la prxima
destilacin.
Titulacin
Titular el destilado del blanco recogido sobre el cido brico, con el HCI estndar,
hasta alcanzar la misma coloracin que tena antes de recibir el destilado.
El destilado de cada muestra recogido sobre el cido brico, que por efecto del
NH3 absorbido ha tomado color azul, se titula con el mismo cido, hasta obtener
una coloracin final igual a la alcanzada con el blanco.
61
A partir de los volmenes de cido gastados en las titulaciones de la muestra (Vm)

y el blanco (Vb), calcular el porcentaje de nitrgeno total con la ecuacin:
%N =
(Vm Vb ) x N HCl x 14 x 100

Peso Muestra en mg
Donde:
Nt = nitrgeno total
Vm = Volumen de HCI gastado en la muestra
Vb = Volumen de HCI gastado en el blanco
N = Normalidad del HCI
y el porcentaje de protena bruta, aplicando la ecuacin:
100
16
% Pr otena Bruta = %Nt x 6.25
% Pr otena Bruta = %Nt x
Comparar los valores obtenidos con los que se hallen en la literatura consultada
para la leguminosa o el cereal analizado.
Incluir en su informe el contenido de protenas en: soya, maz, trigo, cebada, frjol,
arveja, lenteja, garbanzo, papa y leche.
Cuestionario
1. Qu se conoce con el nombre de protena bruta?, de protena real? Cmo
se determinara cada una utilizando el mtodo de micro-Kjeldahl?
2. Al comparar los mtodos de Biuret y Kjeldahl qu ventajas y desventajas
encontrara en cada uno?
3. Explique porqu el contenido total de protena determinado sobre una muestra
de harina vegetal, no es el mismo que se determina sobre un extracto de la
misma harina con NaCI 1%.
4. El factor de conversin usado (6,25) es vlido cuando se determina el
contenido de protena en leches? Explique su respuesta.
62

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