ESTANCIAS

LICENCIATURA EN
CIENCIA Y
TECNOLOGÍA DE LOS
ALIMENTOS

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA | Sandra Pinto González

LICENCIATURA EN
CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
ESTANCIAS

ESTANCIAS
Laboratorio Agroalimentario Gómez-Beser

Sandra Pinto González

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
FACULTAD DE VETERINARIA
Licenciatura en Ciencia y Tecnología de los Alimentos
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LICENCIATURA EN
CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
ESTANCIAS

ÍNDICE
1.

Aspectos generales ..................................................................................... 4
1.1.

Laboratorio de Microbiología ............................................................. 5

1.2.

Laboratorio Físico – químico .............................................................. 6

1.3.

Laboratorio Enológico......................................................................... 7

1.4.

Laboratorio Clínico ............................................................................. 8

2.

Actividades profesionales realizadas .......................................................... 9
2.1.

Elaboración de medios de cultivo ....................................................... 9

2.2.

Análisis de aguas ............................................................................... 14

2.2.1. Filtración de aguas por membrana ................................................. 14
2.2.2. Lecturas .......................................................................................... 18
2.2.3. Confirmaciones .............................................................................. 19
2.2.4. Investigación de Legionella en aguas ............................................ 22
2.3.

Análisis de alimentos ........................................................................ 26

2.3.1. Microbiología de alimentos ........................................................... 26
2.3.2. Lecturas .......................................................................................... 32
2.3.3. Confirmaciones .............................................................................. 33
2.3.4. Investigación de Salmonella en alimentos ..................................... 35
2.3.5. Investigación de Listeria monocytogenes en alimentos ................. 40
Bibliografía ......................................................................................................... 43

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LICENCIATURA EN
CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
ESTANCIAS

1. Aspectos generales
Gómez-Beser es un laboratorio agoralimentario y de análisis clínicos dotados de
la más avanzada tecnología para el análisis de todo tipo de productos alimentarios
(materias primas, productos intermedios y productos terminados) y muestras clínicas.
Actualmente los Laboratorios cuentan con un equipo humano de profesionales
con diferente formación pero complementaria, consiguiendo formar un equipo
multidisciplinar, capaz de dar respuesta a todas las demandas de todos los clientes.
Entre ellos se encuentran Biólogos, Tecnólogos de Alimentos, Farmacéuticos,
Químicos, Enólogos, técnicos superiores en Medio Ambiente y Técnicos superiores en
Análisis Clínico.
Las muestras que se trabajan en el laboratorio y las técnicas analíticas que
emplean se centran en:
Análisis microbiológicos, físico-químicos y de aguas (alimentos)
Análisis enológicos
Análisis de aguas y residuos
Análisis clínicos
Análisis de piscinas
Análisis de tierras y residuos
Análisis Legionella
Además, consta de un equipo especializado que realizan consultoría y asesoría
técnica tanto en productos como en procesos, para así dar una respuesta a los problemas
que la industria alimentaria encuentra en su producción. Ofrecen:
Control de la Industria (Auditoría e inspección)
Asesoramiento en Legislación Técnica alimentaria
Estudio de etiquetado de productos alimenticios
Diseño de fichas técnicas de productos
Servicio de tramitación ante la administración
Estudios y Proyectos
Mejora de Rendimientos y Procesos
Implantación de Sistemas de Calidad:
• PGH (Planes Generales de Higiene)
• APPCC (Análisis de Peligros y Puntos de Control Crítico)
• ISO 9000
• ISO 2000
• BRC

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LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Las instalaciones constan de varios laboratorios: Laboratorio de Microbiología Laboratorio Físico – químico Laboratorio Enológico Laboratorio Clínico 1. Las determinaciones que se realizan son las siguientes: Aguas • • • • • • • • • • • • Recuento de aerobios a 37 ºC Recuento de aerobios a 22 ºC Recuento de Coliformes totales Recuento de Coliformes fecales Recuento de Clostridium perfringens Recuento de Clostridium sulfito reductores Recuento de E. una prestigiosa credencial que avala la calidad de los servicios.1. Las determinaciones que se realizan abarcan todo el espectro de determinaciones microbiológicas que legislativamente se exige a los distintos sectores. Este laboratorio realiza determinaciones microbiológicas basadas en los métodos oficiales y/o métodos recomendados por organismos internacionales. productos intermedios y productos terminados. junto con los sistemas de calidad que se siguen. La organización del laboratorio cuenta con una distribución diferenciada en zonas de preparación y zonas limpias. La profesionalidad y capacidad técnica de los Laboratorios Gómez-Beser son ratificadas por la Entidad Española Nacional de Acreditación (ENAC). la calidad de los resultados. Coli Investigación de E. Coli Recuento de Estafilococos aureus Investigación de Estafilococos aureus Recuento de Estreptococos fecales Detección y recuento de Legionella pneumophila 5 . sin cruces de líneas y con departamentos estancos que aseguran. Laboratorio de Microbiología En esta área se realizan determinaciones microbiológicas sobre materias primas.

Coli Recuento de Estafilococos aureus Investigación de Estafilococos aureus Recuento de Levaduras Recuento de Mohos Recuento de Mohos y Levaduras Recuento de Listeria monocytogenes Investigación de Listeria monocytogenes Recuento de Pseudomona aureginosa Investigación de Salmonella Investigación de Shigella Laboratorio Físico – químico Este laboratorio está altamente especializado.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS • • • Recuento de Pseudomona aureginosa Investigación de Salmonella spp. Recuento de Aerobios mesófilos Recuento de Aerobios psicotróficos Recuento de Clostridium sulfito reductores Recuento de Clostridium perfringens Recuento de Coliformes fecales Recuento de Coliformes totales Recuento de Enterobacterias Recuento de E. y cuenta con un alto número de determinaciones sobre productos alimenticios. entre las que se encuentran: • • • • • • • • • • Composición nutricional Estudios de caducidad Estudios de potabilidad del agua Caracterizaciones físicas Composición química Estudio de vinos y vinagres Caracterización de sales Elaboración fichas técnicas de producto Análisis de aguas residuales Caracterizaciones físicas 6 . Coli Investigación de E.2. Recuento de nematodos/ huevos de nematodos Alimentos • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1.

Las determinaciones que se realizan son las siguientes: Vino y vinagre • • • • • • • • • • • • • • Extracto seco Cenizas Masa volúmica Nitrógeno Densidad pH Plomo Proteínas • Hierro Cobre Acidez total (acética) Grado alcohólico Anhídrido sulfuroso Relación extracto seco / acidez total Metanol Bebidas alcohólicas • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Acidez volátil Acidez total Ácido ascórbico Ácido cítrico Anhídrido sulfuroso Arsénico Azúcares Cadmio Calcio Cenizas Cloruros Densidad • • 7 Extracto seco Grado alcohólico Hierro pH Plomo Sacarosa Ferrocianuro Cobre Nitrógeno fácilmente asimilable Ácido málico IP . y análisis sensorial.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Entre los equipos disponibles encontramos: - 1. asesoría enológica.3. Cromatografía Iónica Cromatografía de Gases Espectrofotometría de Absorción Atómica Espectrofotometría molecular: Visible y UV Laboratorio Enológico La empresa cuenta con un equipo de enólogos de reconocida experiencia en las áreas de análisis enológicos. seguimiento de vendimias.

los laboratorios han ido adaptándose a los avances científicos procurando incorporar la tecnología de vanguardia y someterse a los controles de calidad nacionales en internacionales. se realizan análisis de sangre y orina gracias al trabajo de ATS.4. así como las BPL (Buenas Prácticas de Laboratorio) en las instalaciones. . que garantizan la calidad de los servicios analíticos.• • • • 1. Abs. 280nm ºBE Tartárico Láctico • • • Metanol Succínico Acético Laboratorio Clínico En los últimos años. Técnicos de Laboratorio y administrativos. En esta estancia.

5 7-7.4-7. lisina y desoxicolato) 56.1 g/L Sólido Crecimiento S/S 7.4 7-7. es decir.A.7 MKTTN 26.2-7. un medio de cultivo puede ser inoculado. Una vez que ha sido preparado. Coli en aguas Confirmación CT y E. Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios. y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante.) Crecimiento S.2-7.4 7-7. Confirmación de Coliformes totales (CT) Crecimiento CT Confirmación CT y E. Coli en aguas Crecimiento CT y E.6 Caldo cerebro corazón 37 g/L Líquido Baird Parker (BP) 58 g/L Sólido* Verde Brillante 40 g/L Líquido VRB 38 g/L Sólido TSA (Trypticase soja agar) 40 g/L Sólido Caldo Triptófano 16 g/L Líquido TTC (Cloruro trifenil tetrazolio) 56 g/L Sólido Confirmación Staphylococcus aureus (S. Actividades profesionales realizadas 2.4 7.1-7.2-7.2-7. se la añaden organismos. podemos observar los diferentes medios que se utilizan en el laboratorio y sus características.8 g/L Líquido* Eniquecimiento S/S 7.A. y a continuación.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS 2.6 7. Medio de cultivo g/L Estado Utilidad pH Rappaport 76 g/L Líquido Enriquecimiento Salmonella/Shigella (S/S) 7. Elaboración de medios de cultivo Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio para el desarrollo de los microorganismos. incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano.6 7. Coli en aguas 9 7-7.6 S/S (Salmonella/Shigella) 63.4 .8 XLD (xilosa. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo. En la siguiente tabla.1.68 g/L Sólido Crecimiento S/S 7.3-7.

7-7 .2 Sólido Crecimiento Clostridium sulfito reductor 6.8-7.8-7.6 YEAST 20g/L Sólido 17.2 Sólido Confirmación Enterococos intestinales 6.4 39.2 m-CP (medio Clostridium Perfringens) 35.8-7.2-7.8 DG18 (Dichloran Glicerol) 31.2 Sólido Crecimiento Clostridium sulfito reductor 6.8-7.4 Agar nutritivo 28 g/L Sólido 7.4 6.5 g/L Sólido Confirmación E.2 Sólido* Crecimiento Pseudomona aeruginosa 7-7.5 g/L Sólido Agar púrpura 41.5 g/L Sólido* Crecimiento Clostridium perfringens para pozos 7.8-7.5 g/L Sólido Crecimiento de Enterobacterias (EB) Confirmación EB Agua de peptona 20 g/L Líquido Crecimiento de bacterias 7-7.3 g/L plimixina) TSC (Agar Triptosa-Sulfito45 g/L Cicloserina) BE 64.8 OGYEA (Sabouraud Oxitetraciclina) 37 g/L Sólido Crecimiento de Mohos y Levaduras 6.3 g/L (Agar Cetrimida) KAA (Kanamicina. Coli) 7-7.2 6-6.2-7.5 g/L (Bilis Esculina) (* Medios que tienen suplemento) 10 7.8-7. esculina.2 6.4 Sólido Crecimiento Estreptococos fecales 6.6 6.8-7.5 g/L Sólido Crecimiento Escherichia Coli (E.2-7.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS TBX (Tryptone Bile Agar) EMB (Eosina azul metileno) 36. 48 g/L azida) SPS (Sulfito Sulfadiazina 41.2 PCA (Plate count agar) PCA + LD (Leche descremada) CET 45. Coli 6.7 g/ 820mL Sólido* Crecimiento de Mohos y Levaduras 5.5 g/L Sólido Relación 1:1 Sólido Resiembra para aislamiento Crecimiento de Aerobios Mesófilos en aguas Crecimiento de Aerobios Mesófilos en alimentos Crecimiento de Aerobios Mesófilos en lácteos SB (Slanetz y Bartley) 43.8-7.4-5.4 g/L Sólido Crecimiento Enterococos intestinales para pozos 6.1 VRBG 39.7-7.

Mecheros Bunsen .Autoclave Procedimiento: 1.Reactivos para el medio de cultivo .Tubos estériles . exceptuando aquellos marcados con un asterisco.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS El fundamento de la actividad es la preparación de los medios de cultivo y reactivos asépticos con las características fisicoquímicas adecuadas que permiten el crecimiento de los microorganismos a investigar. Material: - Probeta de 1 litro Matraces Erlenmeyer de 1 litro Baño maría Balanza analítica Agitador Algodón Imanes Botes de 200 y 500 mL . 11 . medir 1 litro de agua destilada y añadirla al matraz. Colocar en el baño maría para aumentar su temperatura. Pesar los reactivos necesarios para preparar 1 litro de medio (cantidad indicada por el fabricante). indicado por el fabricante. que será el estado donde daremos por acabada la preparación del medio. se coloca en un calefactor. La realización de medios es similar para los distintos tipos. 2.Cinta testigo para autoclave .Placas Petri estériles desechables . Tapar el matraz con algodón para evitar la evaporación del agua. Una vez homogeneizado. donde estará en continua agitación hasta alcanzar el estado de ebullición. Verter el contenido en el matraz con agua destilada. durante o tras su elaboración. Esto facilitará tanto la disolución del medio. los cuáles precisan la adición del suplemento correspondiente. colocado sobre un agitador con un imán en su interior con el fin de disolver y homogeneizar el medio.pHmetro Equipo: . como el posterior estado de ebullición con el que deben concluir. 3. En la probeta.

. se colocan en las canastas del autoclave para esterilizarlos a 121ºC durante 20 minutos. la duración máxima es de un mes. .LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Para los medios señalados con un asterisco (*). Una vez sólidas. se extrae el imán con ayuda de otro imán y. y año de la realización del medio. Se vierte el medio en placas Petri estériles. 7. 9. y para los medios sólidos 2 meses tras su preparación. se le añade el suplemento adecuado: . 12 . 6.Para m-CP: suplemento específico del medio. Posteriormente.Para BP: Yema de huevo con telurito. siguiendo la técnica aséptica. posteriormente. y el otro para. con el fin de comprobar que el medio está totalmente estéril. una vez llegado al estado de ebullición. se pega un trozo de cinta de testigo para autoclave. por ejemplo: BP. se debe trabajar próximo a la llama de un mechero Bunsen. Verter en los botes. . Guardar en la cámara frigorífica para su almacenamiento. se etiquetan con el tipo de medio. se secan y se espera que se atemperen. Por ejemplo: L29/13. Tras retirar el Erlenmeyer del calefactor. que en el caso de las placas. Preparados los tarros. 4. se introducen dos muestras del medio en dos tubos estériles. esterilizar e incubar en la estufa. y para medios líquidos botes de 500ml. . antes de verter el medio en los botes donde se conservarán. lote y fecha de caducidad.Para MKTTN: suplemento específico del medio. Por ejemplo: 20/09/13 5. donde uno se utilizará para medir el pH del medio.Para CET: Glicerina.Nombre del medio. 8. y se espera a que solidifiquen.Fecha de caducidad: Siendo ésta para los medios líquidos 3 meses desde su elaboración. Una vez terminado el autoclave. . .Para DG18: Glicerina. para medios sólidos se emplearán botes de 200 ml. Para mantener las condiciones asépticas.Lote: nº de la semana del año. y se rotulan con la siguiente información: .

Kit Microbat: para la confirmación de Listeria. 13 . existen otros específicos y reactivos que llegan directamente preparados. Placas de GVPC: para el crecimiento de Legionella. Reactivo oxidasa. Kit de confirmación de Legionella. Placas de agar sangre de cordero: para el protocolo de confirmación de Legionella. Enterotube: para la confirmación de Salmonella. Placas de Brillance: para el crecimiento de Listeria.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Además de los medios de cultivo que se realizan en el laboratorio. como son: - Caldo One: para enriquecimiento de Listeria. Placas de BCY y BCYE: para el protocolo de confirmación de Legionella. Plasma de conejo (Coagulasa test): polvo liofilizado con suero que se reconstituye y se utiliza para la confirmación de Staphylococcus aureus.

2. Material: - Recipiente estéril para toma de muestras con capacidad de 100 ml. Clostridium perfringes y Enterococos intestinales.2. y Estreptococos fecales. las determinaciones de: coliformes totales.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS 2.45 micras de diámetro de poro.1. Análisis de aguas 2. coliformes fecales. de piscinas y potabilidades. Filtración de aguas por membrana La técnica de filtración por membrana (MF) se basa en hacer pasar la muestra de agua problema a través de un filtro de membrana microporosa. la filtración será de 1 litro de agua. La normativa para abastecimiento y control de calidad de agua potable de consumo público. 14 . Sistema de filtración y fuente de vacío. Placas con medios de cultivo necesario. Mechero Bunsen. se usan filtros más pequeños. de 0. Membranas de filtración de 0. establece como análisis microbiológicos a realizar. Para el análisis de aguas con posible Legionella. Para el análisis de aguas con posible Legionella y aquellas con posible Clostridium perfringens en aguas de pozo. ya sea mínimo o completo. Pinzas de acero con bordes biselados. en cuya superficie quedan retenidos los microorganismos.45 micras. Para el análisis de aguas de pozos. ya que la mayoría de microorganismos tienen un tamaño (diámetro) superior. También se determinará Stapyilococcus aureus. se filtrarán 100 ml de agua. Pseudomonas. Para cada una de estas determinaciones. Placas Petri. El número de determinaciones se establece según el tipo de análisis. se utilizan filtros que tienen un tamaño de poro de 0.22 micras.

Situar un recipiente estéril sobre el soporte hasta que esté fijo. Para ello. Proceso de filtración de aguas 15 .LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Procedimiento: Para realizar la filtración de aguas por membrana utilizaremos un mechero Bunsen para trabajar en condiciones estériles. 2. Se coloca el filtro dentro de una plaza Petri sobre el medio de cultivo adecuado. con la cuadrícula hacia arriba. Colocar un filtro de membrana sobre el soporte con la ayuda de unas pinzas de acero previamente flameadas con alcohol. Limpiar con alcohol la superficie del portafiltros. 1. Con las pinzas flameadas el filtro del soporte. 6. Romper el vacío y extraer el recipiente. y aplicar el vacío hasta que el líquido se haya filtrado. 7. 4. Verter 100 ml del agua problema en el recipiente. 3. Las placas se incuban en posición invertida en la estufa con la temperatura adecuada. vertemos alcohol en el portafiltros y flameamos con el mechero Bunsen. procurando que no se formen burbujas entre la membrana y el medio de cultivo. 5.

5ºC 24 horas Staphylococcus aureus Filtro en placa de BP 37ºC 48 horas Pseudomonas Filtro en placa de CET 37ºC 48 horas 16 . se realizan las mismas determinaciones exceptuando la de Estreptococo fecal.5ºC 24 horas Staphylococcus aureus Filtro en placa de BP 37ºC 48 horas Pseudomonas Filtro en placa de CET 37ºC 48 horas Estreptococos fecales Filtro en placa de KAA 37ºC 48 horas Análisis mínimo de agua de piscinas Para el análisis mínimo de las aguas de piscina. Microorganismos a analizar Aerobios mesófilos a 37ºC Medio de Crecimiento Temperatura de incubación Tiempo de incubación 1 ml de agua en placa Petri y se emplaca con YEAST 37ºC 48 horas Coliformes totales Filtro en placa de VRB 30ºC 24 horas Coliformes fecales Filtro en placa VRB 44.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Análisis completo de agua de piscinas El análisis completo de aguas de piscina abarca la determinación de los siguientes microorganismos: Microorganismos a analizar Aerobios mesófilos a 37ºC Medio de Crecimiento Temperatura de incubación Tiempo de incubación 1 ml de agua en placa Petri y se emplaca con YEAST 37ºC 48 horas Coliformes totales Filtro en placa de VRB 30ºC 24 horas Coliformes fecales Filtro en placa VRB 44.

5ºC en campana de anaerobiosis 24 horas Filtro en placa SB 37ºC 48 horas Filtro en placa de TTC 37ºC 24 horas Enterococos intestinales Coliformes totales 17 . Microorganismos a analizar Aerobios mesófilos a 22ºC Medio de Crecimiento Temperatura de incubación Tiempo de incubación 1 ml de agua en placa Petri y se emplaca con YEAST 22ºC 48 horas Clostridium perfringens Filtro de 0. sólo se estudian dos parámetros: Microorganismos a analizar Coliformes totales y Escherichia coli Medio de Crecimiento Temperatura de incubación Tiempo de incubación Filtro en placa TTC 37ºC 24 horas Análisis de aguas de pozo Para el análisis de aguas de pozo se realizan las siguientes determinaciones.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Análisis de potabilidad en aguas de consumo humano Para el análisis de aguas de consumo humano.22 micras en placa de m-CP 44.

fluorescentes bajo la aplicación de luz UV Estreptococos fecales Colonias negras y medio cambiado a color negro Clostridium sulfito reductor Colonias negras y producción de gas (medio roto y/o elevado) Coliformes totales y E. Lecturas Transcurrido el tiempo de incubación a la temperatura indicada. normalmente con forma de elipse con precipitado alrededor Coliformes fecales Colonias rosas/rojas con precipitado alrededor Staphylococcus aureus Colonias negras con halo blanco alrededor Pseudomonas Colonias claras con reflejo verdoso.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS 2.2. marrones o rosadas 18 .2. excepto aquellas que lo hagan en la superficie Coliformes totales Colonias rosas. coli Colonias amarillas/naranjas siendo apreciable su color por debajo de la membrana Clostridium perfringens Colonias normalmente de color amarillo opaco o púrpuras Enterococos intestinales Colonias rojas. Lecturas Colonias características Aerobios mesófilos Todas aquellas que crezcan. se procede a las lecturas.

5ºC durante 24 horas. se toman colonias de la placa de agar nutritivo con un asa de siembra. Confirmación de Staphyloccus aureus Se siembra una colonia típica (negra con halo) en un tubo estéril con 3 ml de Caldo Cerebro-Corazón y se incuba a 37ºC durante 24 horas. y negativo en el test oxidasa de la placa AN. También se siembra una colonia típica en una placa de Agar Nutritivo (AN). se concluye que la muestra es positiva en Coliformes totales.1 ml del tubo anterior y se adicionan 0. Si al cabo de ese tiempo aparece gas en la campana y el líquido tiene un aspecto turbio. Confirmación de Coliformes fecales Se siembra una colonia típica un tubo de verde brillante con campana de Durham y se incuba a 44. Transcurrido ese tiempo. En cambio.2.3 ml de Plasma de Conejo (Coagulasa test). y se incuba a 37ºC durante 24 horas. sería oxidasa negativo y habría que pasar las colonias a un tubo de verde brillante para confirmar la presencia de Coliformes fecales. se dice que es positivo en el test oxidasa. se procede a las confirmaciones. Posteriormente se le echa una gota de oxidasa. Se considera resultado positivo en Staphylococcus aureus cuando se observa coagulación en el tubo de hemólisis. Para realizar el test oxidasa. y negativo en Coliformes fecales. y se incuba a 30ºC durante 24 horas. si no se produce cambio de color.3. se echa en un tubo de hemólisis 0. diremos que el resultado es positivo en Coliformes fecales. y se añaden a un papel de filtro. Al cabo de ese tiempo si aparece gas y turbidez en el tubo de verde brillante. Confirmación de Coliformes totales Se siembra una colonia típica en un tubo de verde brillante con campana de Durham. Confirmaciones Si hay presencia de alguna colonia sospechosa en las lecturas realizadas. y se incuba durante 24 horas a 37ºC. si la colonia se tiñe de azul.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS 2. 19 .

se toman colonias de la placa TSA con el asa de siembra. si es negativo en el test oxidasa (no cambian de color) se procede a la siguiente confirmación. coli. Confirmación de Estreptococos fecales Se siembra el filtro en una placa de KAA. y se incuba a 37ºC durante 24 horas. se dice que el resultado es positivo en Pseudomonas. coli. y se pasan a un tubo con 3 ml de Caldo triptófano. coli. Pasadas las 24 horas de incubación. y se pasan a un papel de filtro. Confirmación de Clostridium Perfringens Se exponen las colonias presentes a vapores de amonio dentro de la campana de extracción de gases. se concluye que es positivo en E. Se le añade una gota oxidasa y se observa si se produce un cambio de color instantáneo o no. o de amarillo a rojo. Si se forma un anillo amarillo. que se incuba a 44. Se cogen algunas colonias de la placa TSA con ayuda de un asa de siembra estéril. Confirmación de Coliformes totales y Escherichia coli Se siembra una colonia típica (amarillas/naranjas que clarean tras la membrana) en placa de TSA incubándola a 37ºC durante 24 horas.2-0. Si el resultado es oxidasa positivo (las colonias se tiñen de azul). estaremos hablando de resultado positivo en Clostridium Perfringens. pero si el anillo formado es de color rojo.5ºC durante 24 horas. Transcurrido este tiempo. se concluye que es negativo para Coliformes totales y y E.3 ml de reactivo de Kovacs (un par de gotas con la pipeta Pasteur). acabando aquí la confirmación. se realiza la prueba del indol al tubo de caldo triptófano añadiendo 0. 20 .LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Confirmación de Pseudomonas Si al aplicar la luz UV en la placa se observan colonias claramente fluorescentes. se realiza el test oxidasa a la masa de crecimiento presente en la placa TSA. Para ello. Si se aprecia que el color de las colonias pasa de púrpura a azul. el resultado será positivo para Estreptococos Fecales. En cambio. el resultado es negativo en E. Si el medio se tiñe de negro y aparecen colonias negras.

21 .LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Confirmación de Enterococos intestinales Se pasa el filtro de la placa SB a una placa de BE (Bilis Esculina). Si aparecen colonias marrones/negras y el medio se tiñe a esta tonalidad. Los Aerobios mesófilos no precisan confirmación. se concluye que es positivo en Enterococos intestinales. y se incuba a 37ºC durante 24 horas.

2. El problema radica en su facilidad para colonizar los sistemas de agua caliente sanitaria. bien por cuadros neumónicos graves conocidos como la “enfermedad del legionario”.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS 2.2. Situar un recipiente estéril de 250 ml sobre el soporte hasta que esté fijo.22 micras de diámetro de poro sobre el soporte. 1. Material: - Recipiente estéril para toma de muestras (250 ml) Sistemas de filtración y fuente de vacío Membranas de filtración de 0. los humidificadores y otros sistemas de conducción de aguas. Limpiar con alcohol la superficie del portafiltros. Colocar un filtro de membrana de 0. Investigación de Legionella en aguas Las bacterias del género Legionella están muy extendidas en la naturaleza. a partir de los cuales es capaz de infectar al hombre y ocasionarle trastornos respiratorios. 3. con la ayuda de unas pinzas de acero previamente flameadas con alcohol.22 micras de diámetro de poro Pinzas de acero con bordes biselados Mechero Bunsen Tubos estériles Pipetas automáticas de 1 ml Pipetas manuales de 10 ml Agua esterilizada Agitador Vortex Placas de GVPC Asas de siembra estériles Procedimiento: Para realizar la filtración de aguas por membrana utilizaremos un mechero Bunsen para garantizar las condiciones estériles.4. especialmente en los ambientes acuáticos naturales. 22 . los sistemas de refrigeración. o bien por procesos febriles leves denominados “fiebre de Pontiac”.

Verter la muestra de agua problema en el recipiente (250 ml). con el fin de destruir el microorganismo sen el caso de que lo hubiera.1 ml del tubo en una placa preparada de GVPC con una pipeta automática. se prepara un tubo estéril con 10 ml de agua esterilizada usando una pipeta manual de 10 ml. Microorganismo a investigar Medio de crecimiento Temperatura de incubación Tiempo de incubación Legionella Siembra masiva en placa de GVPC 37ºC 10 días 23 . 5. y realizar una siembra masiva. 6. Sembrar 0. Existen otras técnicas de investigación como son las técnicas de acidificación y térmica. ya que se trata de una investigación para ver presencia o ausencia. 9. pero no se emplean en el laboratorio Gómez-Beser. 8. La membrana se debe limpiar filtrando lejía (sin añadir ningún filtro). Una vez terminado el proceso de filtración. Esa operación se debe repetir 4 veces hasta filtrar 1 litro del agua problema a través del mismo filtro. se enrolla el filtro y se introduce en el tubo de ensayo con el agua estéril. Agitar el tubo que contiene el filtro durante 2 minutos en el agitador Vórtex.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS 4. 7. y aplicar vacío hasta que el líquido se haya filtrado. y evitar que contamine futuros filtros. Romper el vacío y extraer el recipiente. Con las pinzas flameadas y con ayuda de un asa estéril. La placa se incuba en posición invertida en la estufa a 37ºC durante 10 días.

DR802: Reactivos para la prueba de Legionella pneumophila. se efectúa la confirmación con un kit comercial de confirmación de Legionella. A continuación. con ayuda de un asa estéril. En el caso de sospecha de Legionella. se descarta la posibilidad. Las colonias típicas de Legionella son colonias blancas con un halo más claro alrededor. En el caso de que las colonias sean sospechosas. Una vez sembradas las placas. Transcurrido ese tiempo. serogrupos 2-14. es posible que sea Legionella y se procedería a la siguiente confirmación.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Lectura de Legionella Las lecturas se realizan desde el tercer o cuarto día hasta el final de la incubación. Se atemperará una placa de BCY (sin cisteína) y otra de BCYE (con cisteína). se introducen en la estufa de 37 ºC durante 4 días. DR806: Suspensión de Látex. DR804: Suspensión de control positivo. Posteriormente. nombrándolos de la misma manera. debe observarse que en la placa BCYE ha habido crecimiento. nombrándolas como A. Suspensión Tampón (diluyente) y Tarjetas de Reacción o de Aglutinación. serogrupo 1. se realiza lo mismo con la placa BCYE. DR805: Suspensión de control negativo. o lo ha habido en todas. similar al antígeno de Legionella. Si no se ha producido crecimiento en ninguna placa. DR803: Reactivos para la prueba de especies de Legionella. Confirmación de Legionella La placa de GVPC se divide en 3 cuadrantes. B y C. se toman varias colonias del cuadrante A de la placa de GVPC y se siembran en el cuadrante A de la placa BCY. y se dividirán también en 3 cuadrantes. y en la de BCY hay ausencia de éste. se procederá a su confirmación. El Kit de confirmación está compuesto por: - DR801: Reactivo para la prueba de Legionella pneumophila. y así con el resto de cuadrantes. que se basa en la aglutinación del látex. 24 . Si es así.

3. tras mezclarlos con la colonia a investigar. se coge una colonia de la placa BCYE con ayuda de un asa estéril. Posteriormente. y se mezcla con los reactivos vertidos anteriormente en los círculos 3.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Procedimiento: 1. se interpreta que es Legionella positivo. en el círculo número 1 se añadirá una gota de control positivo. 4. En una tarjeta de aglutinación. 4. 5 y 6. una gota de control negativo. 25 . A continuación. Se tomarán como Legionella positivo aquellos círculos que. y en el círculo 2. 2. aparece aglutinación. ausente en el círculo 2. Si se observa que en el círculo número 1 se produce un precipitado. se vierte una gota de suspensión tampón y una gota de Legionella látex en cada uno de los círculos numerados de la tarjeta.

1. dejando la apertura hacia arriba y se fija mediante un adhesivo. Antes de comenzar la homogeneización de alimentos. se toman 5 gramos del alimento a analizar.3. de manera que la proporción sea de 1:10. se coloca la bolsa de Stomacher sobre la balanza. se debe crear un ambiente estéril encendiendo un mechero Bunsen.Campana de flujo laminar . Por legislación. Material: - Mechero Bunsen Agua de peptona Probeta de 100 ml Bolsas estériles Stomacher Balanza analítica Hojas de bisturí Depresores estériles - Pipeta automática de 1 ml Pipeta manual de 10 ml Asas estériles Tubos de ensayo estériles Placas preparadas de Baird Parker y DG18 Equipos: .Homogeneizador Stomacher Procedimiento: 1. 26 .LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS 2. las muestras se deben preparar con 25 g de muestra y 225 ml de agua de peptona. Microbiología de alimentos La microbiología en alimentos es una actividad con la que se pretende averiguar si el alimento está contaminado. Análisis de alimentos 2. En ese momento. En el laboratorio. para mantener la proporción 1:10. y se le añaden 45 ml de agua de peptona. Posteriormente.3. la balanza debe ser tarada.

se saca la bolsa y se prepara para realizar la microbiología. EB. Se precisarán tantos tubos como diluciones haya que efectuar. 3. LIST 10-3 Seco-salado AM. LIST 10-4 Pescado cocido AM. EB. EC. LIST - Pan. SA. EB. S/S. SAL. harina y picos AM. Éste es un sistema de palas con movimientos peristálticos que homogeniza la muestra. SAL. EC. MyL. LIST 10-3 B (alimentos calientes) AM. 4.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS 2. Se llenan tubos estériles con 9 ml de agua de peptona para realizar las posteriores diluciones. S/S. Una vez homogeneizado. SA. SAL. MyL 10-4 Pescado crudo AM. CT. LIST 10-2 Dulce EC. se añaden 45 ml de agua de peptona con ayuda de una probeta esterilizada. CSR. 5. Seguidamente. con el fin de crear un ambiente estéril para la siembra. SA. S/S. CSR. SA. EC. se mezcla el agua de peptona con el alimento y se introduce durante varios segundos en el homogeneizador Stomacher. se toman 5 g de muestra y se vierten en la bolsa de Stomacher. Las determinaciones y diluciones que hay que realizar varían según el grupo de alimentos al que pertenece la muestra. CP - Fruta / Verdura EC. LIST - 27 . SAL - Conserva AM. A continuación. CT. S/S. Grupos Determinaciones Diluciones A (alimentos fríos) AM. LIST - Molusco bivalvo CF. EC. S/S. Con ayuda de un depresor estéril y una hoja de bisturí si fuera necesario. con la luz y el flujo laminar encendidos. La microbiología de alimentos se realiza en la campana extractora.

SA. SAL. LIST - AM = Aerobios mesófilos S/S = Salmonella/Shigella CT = Coliformes totales SAL = Salmonella EC = Escherichia coli LIST = Listeria SA= Staphylococcus aureus CSR = Clostridium sulfito reductor CP = Clostridium perfringens MyL = Mohos y levaduras El número del exponente en las determinaciones indica en número de diluciones que se deben realizar.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Productos aperitivos EB. EB. se coge 1 ml del tubo anterior (disolución 10-2) y se añade a otro tubo con 9 ml de agua de peptona (dilución -3). SAL - Preparados cárnicos EC. se agita en el Vórtex. - Para la dilución de 10-3. SA. - Para la dilución de 10-2. Las disoluciones se realizan de la siguiente forma: . LIST 10-4 Carne cruda EC. y se pipetea 1 ml de este tubo a una placa Petri estéril. Las diluciones necesarias se calculan a partir del número de microorganismos que suele tener cada alimento. EF. se agita en el agitador Vórtex. S/S. se vierte 1 ml del contenido en la bolsa Stomacher a un tubo con 9 ml de agua de peptona (dilución -2). Se realizan diluciones para facilitar el recuento posterior. SAL. se calcula el número total de bacterias que tiene la muestra de alimento. LIST 10-4 Huevos AM. LIST - Especias EC. SAL 10-4 Helados AM. 28 . multiplicando por el número de dilución en el que se realiza la lectura de microorganismos en placa. SA. CSR. 6. se toma 1 ml directamente del contenido de la bolsa Stomacher (dilución -1) y se vierte en una placa Petri estéril. SAL. y se vierte 1 ml de este tubo a una placa Petri estéril. de esta forma. EB.Para la dilución de 10-1.

El proceso de investigación de Salmonella se explicará detalladamente más adelante. la placa de BP se divide en 2 mitades para sembrar 2 alimentos distintos. Normalmente.1 ml de la dilución de la bolsa. Se realiza siembra masiva con ayuda de un asa estéril. se añaden 9 ml de medio de cultivo SPS. Para los alimentos con una aw entre 0. Con ayuda de un asa estéril.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS - Para la dilución de 10-4. y se hace siembra masiva en una placa ya preparada de DG18. se toma 1 ml del tubo anterior (disolución 10-3) y se añade a otro tubo con 9 ml de agua de peptona (dilución -4). en función de la actividad de agua del alimento. y una capa de parafina para proporcionarle condiciones de semi-anaerobiosis.6 -0. - Para la determinación de Staphylococcus aureus (SA). - Para la determinación de mohos y levaduras se emplearán diferentes medios de cultivo. y se añaden a una placa de Baird Parker ya preparada. - La determinación de Salmonella se realiza tras haber incubado la bolsa de Stomacher a 37ºC durante 24 horas. se toma 1 ml de la dilución de la bolsa Stomacher y se vierte a un tubo estéril. Posteriormente.1 ml de la dilución 10-1 (directamente de la bolsa Stomacher). 29 . se toma 1 ml de dilución directamente de la bolsa Stomacher y se añade a una placa de Petri estéril. se siembra 1 ml de la dilución de la bolsa Stomacher en placas ya preparadas de KAA.6. se agita en el agitador Vórtex.95. se toma 0. con ayuda de un asa estéril. Para aquellos con una aw menor a 0. - Para la determinación de Clostridium sulfito reductor. se toma 0. y posteriormente se le añadirá el medio necesario. - Para la determinación de Estreptococos fecales (EF). se realiza siembra masiva. y se vierte 1 ml de este tubo a una placa de Petri estéril.

dentro de una bolsa de plástico. 30 . que deben ser previamente derretidos. Previamente. Es importante esperar a que éstos se atemperen antes de verterlos en las placas. Se vierte el medio de forma que cubra la base de las placas Petri. Para el vertido de los medios de cultivo en las placas. se debe continuar trabajando en condiciones estériles. se añaden a las placas correspondientes. Ya que si están demasiado calientes. Esta segunda capa se vierte para crear un ambiente de anaerobiosis. Una vez atemperados los medios. éstas se llevan a incubar en la estufa adecuada en posición invertida (con la tapa hacia abajo). Se agita de forma circular. se le adiciona a las placas los medios de cultivo correspondientes.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS - La determinación de Listeria se realiza tras haber incubado la bolsa Stomacher a 30ºC durante 24 horas. para homogeneizar la muestra con el medio. Las Enterobacterias y los Coliformes totales necesitan dos capas del medio correspondiente. o próximo a la llama de un mechero Bunsen. Una vez que el medio esté solidificado en las placas. 8. la cual se añadirá tras haberse secado la primera capa. que se introducen con la tapa hacia arriba. excepto las placas de mohos y levaduras. Este procedimiento se explicará posteriormente. Una vez preparadas las placas con las diluciones necesarias. ya sea en la campana de extracción. pueden ocasionar la destrucción de los posibles microorganismos que estamos investigando. hacia un lado y hacia el otro. 7. los medios de cultivo se introducen en el baño maría para que se derritan.

5ºC 24 horas Enterobacterias VRBG (doble capa) 37ºC 24 horas Escherichia coli TBX 44.5 ºC 24 horas Clostridium sulfito reductor SPS 37ºC 24 horas Staphylococcus aureus BP 37ºC 48 horas Estreptococos fecales KAA 37ºC 48 horas OGYE cuando aw < 0.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Microorganismos a analizar Medio de Crecimiento Temperatura de incubación Tiempo de incubación Aerobios mesófilos PCA 30ºC 72 horas Coliformes totales VRB (doble capa) 30ºC 24 horas Coliformes fecales VRB (doble capa) 44.95 20ºC 10 días DRBC cuando aw ≥ 0.6 – 0.95 20ºC 5 días Mohos y levaduras 31 .6 20ºC 5 días DG18 cuando aw = 0.

Lecturas Transcurrido el tiempo de incubación a la temperatura indicada.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS 2. se procede a las lecturas de placas.2.3. con o sin halo Placa S/S: colonias incoloras. excepto aquellas que lo hagan en la superficie Colonias rosas. con o sin halo Colonias verdes con un halo blanco 32 . transparentes o negras. verdosas o blancas con o sin vellosidades Salmonella/Shigella Listeria Monocytogenes Placa XLD: colonias negras. normalmente con forma de elipse con precipitado alrededor Coliformes fecales Colonias rosas/rojas con precipitado alrededor Enterobacterias Colonias rosa fucsia/violeta con precipitado alrededor Escherichia coli Colonias verdes Clostridium sulfito reductor Staphylococcus aureus Colonias negras y producción de gas (medio roto y/o elevado) Colonias negras con halo blanco alrededor Estreptococos fecales Colonias negras y medio cambiado a color negro Mohos y levaduras Colonias negruzcas. rosas o amarillas. Lecturas Aerobios mesófilos Coliformes totales Colonias características Todas aquellas que crezcan.

transcurrido el tiempo de incubación. Si la prueba oxidasa da negativo (no vira a color azul). Pasado este tiempo. se concluye que es positivo en Coliformes fecales. Confirmación de Coliformes totales Se siembra una colonia típica en un tubo de verde brillante con campana de Durham. Si transcurrido este tiempo aparece gas y turbidez en el tubo de verde brillante. y es oxidasa negativo en la placa de AN. y se incuba a 30ºC durante 24 horas. se realiza la prueba de la oxidasa al crecimiento presente en la placa de AN. Confirmaciones Si existe presencia de alguna colonia sospechosa en las lecturas realizadas se procede a las confirmaciones. se siembra una colonia típica en una placa de Agar Nutritivo (AN). Confirmación de Enterobacterias Se pasa una colonia típica (rosa fucsia/violeta con precipitado alrededor) a una placa de Agar Nutritivo (AN) y se realiza siembra masiva.5ºC durante 24 horas. y se incuba a 37ºC durante 24 horas. Esta placa se incuba a 37ºC durante 24 horas.3. Por otra parte. 33 . se pasa a una placa de Agar Púrpura (AP). realizando siembra masiva con ayuda de un asa de siembra estéril. y se incuba a 37ºC durante 24 horas.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS 2. Si al cabo de ese tiempo aparece gas en la campana y el líquido tiene un aspecto turbio se dice que es positivo en Coliformes totales. el medio de la placa de AP vira a amarillo. Se concluye el resultado positivo a la presencia de Enterobacterias en el alimento si. Confirmación de Coliformes fecales Se siembra una colonia típica en un tubo de verde brillante con campana de Durham y se incuba a 44.3.

3 ml de Plasma de Conejo (Coagulasa test). 34 .1 ml del tubo anterior y 0. Confirmación de Estreptococos fecales Se siembra una colonia típica en una placa de KAA. y se incuba a 37ºC durante 24 horas.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Confirmación de Escherichia coli Se siembra una colonia típica en una placa de EMB y se incuba a 30ºC durante 24 horas. Confirmación de Staphylococcus aureus Se siembra una colonia típica en 3 ml de Caldo Cerebro-Corazón. y los mohos y levaduras no requieren confirmación. Los Aerobios mesófilos. podemos decir que el resultado es positivo para la presencia de E. Si el medio se tiñe de negro y aparecen colonias negras. coli en el alimento. el resultado será positivo para Estreptococos fecales. Se considerará resultado positivo en Staphylococcus aureus si se produce coagulación en el tubo de hemólisis tras la incubación. y se incuba en la estufa de 37ºC durante 24 horas. Tras la incubación. Si pasado este tiempo se produce crecimiento de colonias color tornasol. Clostridium sulfito reductor. y se incuba a 37ºC durante 24 horas. se añade en un tubo de hemólisis 0.

35 . se vierten 5 ml de MKTTN con ayuda de una pipeta manual estéril. y se realiza siembra masiva en placas de Agar Nutritivo (AN). y otra placa de AN para la siembra de una colonia típica de la de XLD. Confirmación de Salmonella / Shigella Si se observa crecimiento de colonias típicas tanto en la placa de XLD como en la de S/S. se toma una colonia típica de cada placa con ayuda de un asa de siembra estéril. durante 24 horas. En primer lugar. y otro con el medio Rappaport. Si transcurrido el tiempo de incubación se observan colonias típicas. En el otro tubo.4.1 ml de muestra con ayuda de una pipeta automática. Transcurrido este tiempo.3. Ambos tubos se incubarán a 37ºC y 41. se procede a la siguiente confirmación. se realiza la siembra en placas con el medio S/S y XLD. si incuba la bolsa Stomacher con 5 gramos de alimento y 45 ml de agua de peptona. Transcurrido este tiempo. y se le añade 1 ml de muestra de la bolsa Stomacher. uno con el medio MKTTN. se realiza la prueba de la oxidasa al crecimiento presente en ambas placas de AN. Investigación de Salmonella en alimentos Para el estudio de Salmonella en alimentos. se procede a su confirmación. En un tubo. Se utilizará una placa de AN para la siembra de una colonia típica de la placa S/S. se preparan 2 tubos estériles. Para facilitar la posterior lectura de las placas. empleando un test comercial denominado Enterotube para cada placa.5ºC. Si el resultado es negativo para la oxidasa (no cambian a color azul). Se debe repetir el mismo procedimiento con el tubo de Rappaport en la otra mitad de cada placa. se deben rotular indicando el tubo proveniente de la siembra en cada una de las mitades. Dividimos ambas placas en 2 mitades.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS 2. Ambas placas se incuban a 37ºC durante 24 horas. se agregan 5 ml del medio Rappaport y se le añade 0. a 37ºC durante 24 horas. respectivamente. Estas placas se incubarán a 37ºC durante 24 horas. y sembramos con ayuda de un asa impregnada del contenido del tubo de MKTTN en una de las mitades de cada placa. se efectuará su confirmación. Pasadas las 24 horas de incubación.

permite la identificación de Enterobacterias con importancia clínica. Está concebido para la inoculación simultánea de los 12 medios con una sola colonia. que permiten la determinación de 15 reacciones bioquímicas. junto con la guía de interpretación (libro de códigos). Las reacciones químicas que tienen lugar en este test son las siguientes: Prueba Reacción Negativo Positivo Glucosa Fermentación de glucosa De rojo a naranja De amarillo a dorado Producción de gas en la fermentación de la glucosa Descarboxilación de la lisina Descarboxilación de la ornitina Sin desprendimiento de cera Con desprendimiento de cera Amarillo Morado Amarillo Morado Gas Lisina Ornitina H2S Producción de H2S De beige a ámbar claro Negro Indol Producción de indol Incoloro Rosa o rojo Adonitol Fermentación de adonitol De rojo a naranja De amarillo a dorado Lactosa Fermentación de lactosa De rojo a naranja De amarillo a dorado Arabinosa Fermentación de arabinosa De rojo a naranja De amarillo a dorado Sorbitol Fermentación de sorbitol De rojo a naranja De amarillo a dorado VP (VogesProskauer) Producción de acetoína De incoloro a ámbar claro Rojo Dulcitol Fermentación de dulcitol Verde De amarillo a dorado PA Desaminación de fenilalanina De negro a gris oscuro Urea Hidrólisis de la urea Cualquier tono de verde De incoloro a ámbar claro Citrato Utilización del citrato Verde 36 De rosa claro a rosa Azul . formado por 12 medios de cultivo diferentes. utilizando la aguja de inoculación dispuesta en el centro. La combinación de reacciones resultante.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Enterotube test El test Enterotube consiste en un tubo de plástico con distintos compartimientos.

e incubamos a 37ºC durante 24 horas. colocamos la aguja de manera que permanezca en contacto con todos los medios. inoculando así las colonias en cada uno de los compartimentos. nos aseguramos de que la aguja atraviese todos los compartimentos. 4. 37 . Posteriormente. 5.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Procedimiento: 1. y colocamos las capuchas a cada extremo. se arrastran colonias de la placa de AN con la punta de la aguja de inoculación dispuesta en el centro del Enterotube. Una vez arrastradas las colonias. 6. 3. de manera que no sobresalga por ningún extremo del Enterotube. A continuación. En el extremo derecho de la aguja encontraremos una marca por la que debemos romperla. de modo que el compartimento de la glucosa quede hacia arriba. Colocamos el Enterotube en una gradilla en posición vertical. llevamos la aguja de inoculación hacia atrás y hacia adelante para que pase por todos los medios. En primer lugar. 2.

con excepción de indol y Voges-Proskauer. La lectura de las demás pruebas debe efectuarse antes de realizar las pruebas de indol y Voges-Proskauer. o haciendo un orificio mediante calor en la película plástica con ayuda de una aguja de inoculación caliente o pipeta desechable y vertiendo el reactivo en el compartimiento. Una prueba positiva se indica por la aparición de color rojo en el reactivo añadido sobre la superficie del medio o la película de plástico a los 10 segundos aproximadamente. y se observa si se produce la reacción tras 20 minutos de la adición. 38 . se coloca el Enterotube en posición horizontal y se añaden unas gotas de reactivo Kovacs a través de la película plástica del compartimiento de H2S/indol con una aguja o jeringa. para la prueba de Voges-Proskauer.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS 7. 8. Se debe permitir que el reactivo entre en contacto con la superficie del medio o la superficie interna de la película de plástico para poder observar si se produce o no la reacción. Para realizar la prueba de indol. Por otra parte. Transcurrido el tiempo de incubación. puesto que los reactivos añadidos en estas pruebas pueden alterar las demás reacciones del Enterotube. se procede a la interpretación y registro de los resultados con ayuda de la guía comercial. se inyectan los reactivos VP al compartimento indicado.

39 . no suele tratarse de Salmonella. Por último. y se busca el código obtenido en la guía de interpretación para verificar de que Enterobacteria se trata. por lo que se concluye la confirmación como negativo en la presencia de Salmonella/Shigella. se suman estas puntaciones.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS 9. se interpretan los resultados marcando con un círculo las puntuaciones de las reacciones que han sido positivas. Por lo general.

muy extendido en el medio ambiente.3. Se coloca la bolsa de Stomacher sobre la balanza. con la apertura hacia arriba y fijada mediante un adhesivo. y actividad de agua menor o igual a 9.0. en el laboratorio Gómez-Beser. se añaden 45 ml de Caldo One y se homogeniza introduciendo la bolsa en el Stomacher durante varios segundos. también se incluye la investigación de Listeria en todos los productos donde se estudie la caducidad. este microorganismo no suele encontrarse en los alimentos. Investigación de Listeria monocytogenes en alimentos La Listeria monocytogenes es un microorganismo telúrico. Por lo general.4. Por ello. Procedimiento: Para el estudio de Listeria en alimentos se realiza una dilución 1:10. Taramos la balanza. Para estos productos. se debe comprobar previamente si cumplen las condiciones adecuadas para la proliferación de Listeria. y productos en los que se estudia la caducidad. se debe crear un ambiente estéril encendiendo un mechero Bunsen.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS 2. pescados secosalados. y añadimos 5 gramos del alimento a investigar con ayuda de un depresor estéril y una hoja de bisturí. Alimentos con un pH menor o igual a 5. Al igual que anteriormente. si fuera necesario. preparados cárnicos. pescados marinados.2. y actividad de agua menor o igual a 9. tomando 5 gramos de alimento y 45 ml de Caldo One. Estos alimentos pertenecen a los siguientes grupos: - A (alimentos en crudo) B (alimentos tratados con calor) Pescados crudos Pescados cocidos - Pescados seco-salado Frutas y verduras Carnes Helados Especias Actualmente. 40 .4. A continuación. sólo se investiga en aquellos más propensos a su presencia. como son: las carnes y pescados crudos. como son: - Alimentos con un pH menor o igual a 4. El procedimiento de investigación de Listeria se realiza en aquellos alimentos propensos a su presencia.5.

cerramos la bolsa con un clip y la introducimos en la estufa de 30ºC durante 24 horas. - Prueba de la catalasa: Sobre una placa vacía se vierten varias gotas de agua oxigenada con ayuda de una pipeta Pasteur. se produce la formación de burbujas.1 ml de la disolución de la bolsa. y se observa si se produce reacción o no. Confirmación de Listeria En primer lugar. un procedimiento de confirmación de Listeria basado en la colorimetría. Catalasa (+). 41 . y vertimos unas gotas de reactivo oxidasa. Tras unos segundos. determinaremos que la prueba es positiva si las colonias se tiñen de azul. Transcurrido el tiempo de incubación. y test de látex aglutinación (-). y se mezclan con el KOH. se procede a la confirmación con el kit de Microbact.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Tras la homogeneización. presenta un aspecto viscoso. tomamos 0. La prueba será positiva si al mezclarlas se produce aglutinación. y sembramos en una placa de medio Brillance. Se mezclan varias colonias con el agua oxigenada empleando un asa de siembra. Se toman varias colonias con un asa de siembra estéril. Si pasadas las 24 horas se observa crecimiento de colonias sospechosas (verdes con un halo blanco). y prueba de látex aglutinación (-). se realizan 3 pruebas de forma directa: Oxidasa (-). con ayuda de una pipeta Pasteur. al mezclar las colonias. Catalasa (+). - Prueba de látex aglutinación: Se vierten varias gotas de una disolución de KOH al 30% sobre una placa vacía. - Test oxidasa: Sobre un papel de filtro se colocan varias colonias sospechosas de Listeria monocytogenes. es decir. e introducimos la placa en la estufa de 37ºC durante 24 horas. se procede a su confirmación. La prueba será positiva si. Se realiza la siembra de forma masiva con ayuda de un asa estéril. Si los resultados de las pruebas coinciden con el protocolo de confirmación. Oxidasa (-). o negativa si no hay cambio de color.

se toma la mayor cantidad posible de colonias sospechosas. Cada prueba tiene un número asociado. La lectura puede realizarse transcurridas entre 4-24 horas de incubación. Este código nos muestra el tipo de Listeria presente en el alimento analizado. y se introducen en un bote que contiene una solución que provoca la estabilidad y la proliferación de la bacteria. La única especie con importancia en la investigación de Listeria es la Listeria monocytogenes. 6. en el último pocillo se añade 0. Además. con ayuda de una pipeta automática. Con un asa estéril. 42 .1 ml de hemolisina. Terminado el tiempo de incubación. Una vez homogeneizado. Comprobamos los resultados obtenidos con los de la plantilla y anotamos las reacciones positivas y negativas. 2. Se homogeniza durante unos segundos con el agitador Vórtex. El kit Microbact incorpora una plantilla en la que se explican los posibles cambios de color y su significado (positivo o negativo). 5. se observa un cambio de color debido al contacto de la bacteria con los reactivos de cada pocillo. dando como resultado final un código que deberemos introducir en el programa informático de Microbact. 3. se inoculan 0.1 ml en casa pocillo del Microbact. 4.LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Kit Microbact 1. Incubamos el Microbact a 37ºC en posición horizontal.

LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS ESTANCIAS Bibliografía Programas Normalizados de Trabajo de Gómez-Beser Colaboración de Elena Berejano Parajó http://www.msc.es/AESAN/web/cadena_alimentaria/detalle/criterios_micr obiologicos.com/ http://www.laboratoriosgomezbeser.aesan.shtml 43 .