Meccanismi per riparare il DNA

In una cellula, quando esiste un “maleappaiamento”,
cioè ad esempio G-T, la cellula deve avere un modo per
riconoscere qual’è il filamento di nuova sintesi rispetto
a quello parentale perché deve sapere qual’è la base
sbagliata delle due. Noi sappiamo che il DNA è metilato,
e controlla lo stato di aggregazione della cromatina, e
ovviamente il pattern di metilazione del DNA anche
viene trasmesso al DNA di nuova sintesi. Soltanto che
questo meccanismo è sfalsato rispetto alla duplicazione
del DNA, quindi prima avviene la duplicazione del DNA e
poi dopo vengono copiate nel nuovo filamento tutte le
modificazioni epigenetiche. Quindi c’è un istante in cui il
DNA è semimetilato, cioè, in cui è metilato soltanto da
una parte. Chiaramente i gruppi metilici stanno ad
indicare che quello è il filamento prentale, quindi e c’è
un errore viene corretto solo nel filamento di nuova sintesi, che è quello senza gruppi
metilici.
Un meccanismo comune di correzione, se c’è una base male appaiata, interviene una
endonucleasi,che tagli a monte del “maleappaiamento”, creando così un’intaccatura, a
questo punto interviene la DNA polimerasi I, che fa sempre la stessa cosa. Quando
vede un’intaccatura sul DNA, ci si siede sopra, prende come primer il DNA che sta
prima diggerendo quello che sta davanti sostituendo il DNA correggendo la base
maleappaiata. Le basi azotate possono subire una reazione di deamminazione
ossidativa. Esiste un apparato enzimatico apposta per rimuovere queste basi anomale.
Interviene una DNA glicosidasi, che taglia il legame glicosidico, che unisce cioè il
ribosio alla base azotata, quindi esiste una DNA glicosidasi specifica per ogni base,
creando così un sito dove manca la base. Ancora lo scheletro zuccherofosfato è
intatto, dopo che si è creato questo sito detto apurnico perché manca una purina
interviene una endonucleasi, che taglia in corrispondenza del sito apurinico lo
scheletro zucherofosfatoe così facendo crea un’intaccatura. A questo punto interviene
sempre la DNA polimerasi I, che fa sempre la stessa cosa, usa il DNA precedente come
primer e sostituisce il DNA che gli sta davanti. Questo è il motivo per cui la DNA
plimerasi è è un enzima poco veloce e poco processivo, proprio perché non deve
copiare tutto il genoma, serve soltanto per sostituire 10, 20 nucleotidi che gli stanno
davanti, siano essi primer di RNA che devono essere sostituiti durante la duplicazione
oppure errori che devono essere corretti.
Il folato è una vitamina che serve per trasportare gruppi monocarboniosi, gruppi CH3,
o al massimo bicarboniosi, CH3-CH2. Questi gruppi monocarboniosi servono per la
sintesi delle purine, oppure servono per la metilazione (da desossi UTP al desossi TTP)
e quindi si tratto di una vitamina molto importante per il metabolismo del DNA, tra
l’altro questo è il motivo per il quale, alle donne in gravidanza, si da sempre
un’integrazione di acido folico, perché nel bambino che si sta formando, si passa in
nove mesi da una cellula a una cosa che pesa più o meno tre chili, quindi c’è una
sintesi del DNA molto veloce e quindi serve un sacco di acido folico per la sintesi della

La presenza dei 4 nucleotidi trifosfato dei quali uno è marcato. Chiaramente se questa cosa non viene corretta. Ovviamente. utilizza praticamente il gruppo fosfato per attaccarlo all’ossidrile in 3’ del DNA nascente. cioè un enzima che prende questi gruppi metilici che stanno dove non dovrebbero stare. delle purine e per tutte le modificazioni epigenetiche. Un altro meccanismo che interviene per la rimozione dei dimeri di timina. mentre questo tipo di metilazione non deve essere presente normalmente e quindi questa metil transferasi la riconosce e toglie il gruppo metilico. Se non c’è la timina normale. quando questo nucleotide viene incorporato nel DNA nascente. Oltre a questo c’è il didesossinucleotide . l’irraggiamento con luce UV può portare alla formazione di un anello di ciclobutano che porta una distorsione localizzata della doppiaelica. allora ci possono essere dei problemi come losviluppo di tumori. con la stessa geometria di un appaiamento secondo la gemotria di Watson e Crick. C’è uno stamp a singola elica. si divide in 4 provette. una volta che si ha quella roba li. perché nella divisione successiva. Vediamo un esempio. per sostituire quella base. vediamo un metodo per determinare la sequenza del DNA che si basa proprio sulle conoscenze acquisite da questi studi sulla duplicazione del DNA. Se c’è qualche gene che controlla il ciclo cellulare che dovrebbe essere spento e invece è acceso. che manca oltre all’ossidrile in 2’ anche dell’ossidrile in 3’. Chiaramente. per la metilazione corretta del DNA. Un’altra mutazione che può avvenire. Il metodo si chiama metodo Sanger. ma c’è l’idrogeno la sintesi si blocca. E quindi nella divisione successiva in quel sito verrà incorporato un nucleotide a caso e quindi c’è lo sviluppo di tumore. è quella ad opera di agenti alchilanti che sono delle sostanza chimiche che ossono introdurre i gruppi metilici ad esempio nella guanina. Se non ci sono abbastana gruppi metilici per la formazione di Timina. per queso metodo c’è bisogno di uno stampo a singola elica. così ci permette di poter vedere soltanto il DNA di nuova intesi. e noi conosciamo un pezzo della sequenza di quel DNA che sta attaccato alla sequenza che noi vogliamo determinare. Adesso che abbiamo parlazo della duplicazione del DNA. che contengono tutte quante i quattro nucleotidi. Un meccansimo per rimuovere questo tipo di danno è l’intervento di una endonucleasi e successivamente di una elicasi. serve un pezzettino di doppio filamento per poter funzionare.timina. La conosciamo perché possiamo sintetizzare un oligonucleotide lungo una ventina di nucleotidi da usare come primer e. che abbiamo visto ieri. la reazione di sintesi del DNA si blocca. qui siccome non c’è nessun ossidrile. che è una cosa importante. Poi ovviemnte c’è il solito intervento della DNA polimerasi I. Questo riparo viene riparato da un enzima che è una metil transferasi. che svolge il DNA contenente il dimero di timina. a questo punto. allora viene incorporato l’uracile nel DNA. c’è la sequenza che noi vogliamo determinare. perché la DNA polimerasi che cosa fa. rappresentato dal DNA di cui si vuole determinare la sequenza. quindi se c’è una citosina metilata in posizine 5’. poi serve un primer per le DNA polimerasi. rimane un sito a purinico. Questo composto che si forma si appaia perfettamente con la timina. in realtà si usano pezzi di DNA lunghi qualche centinaio di nucleotidi. la cui formula è questa qua. verrà introdotta una base che non era presente. una DNA . quando abbiamo parlato della chimica degli acidi nucleici. un pezzetto di DNA lungo 6 nucleotidi. va incontro a mutazione. quella è una metilazione corretta. che viene riconosciuto come estraneo da quel sistema di riparo di cui si parlava prima. e fa parte del bagaglio epigenetico della cellula. un sito senza nessun nucleotide. ed è stato praticamente usato con qualche modifica che dopo vedremo per il completamento del progetto genoma umano.

Ed è per questo che i ricercatori . si legge direttamente la sequenza partendo dal basso andando verso l’alto. saranno più in basso. inoltre. avrò una miscela di fammenti a tutte le adenine presenti nel DNA stampo. Che cosa succede. prendiamo ad esempio la reazione con la didesossiadenina. visto che il nostro genoma è lungo tre miliadi di nucleotidi. quindi se uso una quantità tale che in media viene incorporata una sola molecola di desossiadenina per molecole di DNA di nuova sintesi. ma se è 600 e 601. se ce ne metto troppo poca. Per determinare quali sono i polimorfismi degli individui bisogna ovviamente sequenziare non uno. A questo punto. siccome è un metodo che si basa sulla separazione delle varie bande che differiscono in lunghezza di un solo nucleotide. La stessa cosa vale per gli altri tre nucleotidi. sarà una certa distanza. Ora questo metodo. la distanza sarà talmente piccola da essere invisibile all’occhio umano. Quelli più piccoli sono più veloci. ma centinaia di individui diversi. in un’altra la didesossicitosina. innanzi tutto. e così via per i quattro nucleotidi e facciamo avvenire la sintesi. Questo significa sequenziare centinaia di miliardi di nucleotidi.polmerasi. Questo metodo viene chiamato sequenziamento di Sanger. se io ci metto tanta didesossiadenina. al contrario. Ovviamente questo metodo non andava bene perché. e in una provetta ci mettiamo la didesossiadenina. la sintesi viene completata perché la didesossi è raro che ci vada a finire. e quindi la sintesi si blocca subito. una volta avvenuta la separazione. per ogni singola sequenza c’è bisogno dello spazio di quattro lane sul gel di sequenza. il che consente di separare le molecole cariche secondo la loro dimensione. ogni frammento di nuova sintesi incorporerà subito il didesossinucleotide. era poco adatto per un progetto così ambizioso come il progetto genoma umano. si mette su un gel e si sottopone a un campo elettrico (elettroforesi) in quattro campioni diversi (le quattro lane). chiaramente la differenza di mobilità di queste due bande. se una è lunga 100 e l’altra 101. a questo punto si prende la reazione.

dipende dal nucleotide. che altrimenti sarebbe stato impossibile realizzare. e quindi a un certo punto diventa difficile distinguere due bande quando sono quasi sovrapposte. si è scoperto che ben il 40% del nostro DNA è fatto da sequenze ripetute. non èpiù lo sperimentatore che con l’occhio deve guardare una lastra fotografica. ma fa uso di questi didesossinucleotidi ai quali è stata attaccata una sonda fluorescente. qui è invece un computer che raccoglie le informazioni e di coneguenza è molto più preciso. il tutto viene dato ad un computer che elabora il tutto. a questo punto. Poi con l’elettroforesi si separano tutti i frammenti in base alle loro dimensioni e a questo punto si puù leggere la sequenza. Ovviamente si utilizzano colori diversi per i quattro nucleotidi e questo ci permette di caricare le quattro lane che abbiamo visto prima. una cosa che quando viene illuminata dalla luce ultravioletta emette luce di un certo colore. siccome i nucleotidi hanno 4 colori diversi.hanno sviluppato un’altro metodo. si possono facilmente distinguere. Questo è quello che esce fuori chiaramente. Inoltre. cioè sequenze più o meno lunghe e che vengono ripetute decine o anche centinaia di volte. C’è un illuminatore di luce ultravioletta. per visualizzare il DNA di nuova sintesi. che non fa più uso del radioattivo. il computer interpreta se il segnale che gli arriva ha una certa lunghezza d’onda e lui sa quale base è. . ognuno è marcato da un colore diverso. Questo è praticamente il metodo che è stato usato per il progetto genoma umano. in una singola miscelaperché le quattro bande. Quando si andava ad analizzare quello che è venuto fuori dal progetto genoma umano. Si formano tutti i frammenti possibili. un detector che capta la luce emessa. siccome tutto quanto avviene automatizzato.

Questo poteva essere un problema qualche anno fa. ovviamente serve una quantità discreta di DNA. quando si fa l’analisi del DNA sulla scena del delitto. quello che bisogna avere per poterla utilizzare. Un DNA quando ha la stessa sequenza ripetuta tutte queste volte. Questo fatto. solo che sulla scena di un delitto. DA quel punto in poi la tecnica si è molto sviluppata e ora. spesso la polizia trova un capello al quale sono attaccate poche cellule del bulbo pilifero. C’è un sottosito sul sito del NIH dove c’è tutta la . Quindi l’analisi di questo particolare DNA. ma adesso non o è più visto che la sequenza del genoma umano è stata completamente determinata. Solo che la DNA polimerasi che si usava allora era la DNA polimerasi estratta da E. quindi bastano delle quantità minime di DNA per poter essere amplificate. in biologia molecolare non ci sono esperimenti che non la richiedano. ripetuto per milioni di generazioni. ha generato la situazione in cui abbiamo questo DNA ripetuto.coli. Questa tecnica è la PCR. che si possa sbagliare persona. Ora. chiaramente è molto difficile. e siccome la probabilità che due persone hanno lo stesso numero di 5 regioni ripetute è di uno su 20 miliardi.coli. ovviamente viene cambiato il numero delle ripetizioni. visto che siamo solo 7 miliardi. bisogna conoscere la squenza di DNA che fiancheggia la sequenza che vogliamo amplificare. significa che si va ad analizzare proprio queste regioni ripetute. Questo ha impedito lo sviluppo di questa tecnica finché a qualcuno non è venuto in mente che esistono sulla terra degli organismi che sono dei procarioti che vivono anche a temperature superiori a 100 gradi. la probabilità di trovare due individui con lo stesso numero di ripetizioni è uno si 20 miliardi. I loro enzimi devono resistere ad alte temperature al contrario di quella di E. Serve ad amplificare un tratto di DNA. reazione a catena della polimerasi (polimerase chain reaction). Quando si dice che sulla scena del delitto di fa l’analisi del DNA. pressoché impossibile. quando questo accado. da una parte dimiuisce e dall’altra aumenta. quando c’è il crossing over è possibile che i due cromatidi facciano il crossing over mettendosi non appaiati correttamente. nelle pozze solforiche. PCR Adesso vediamo un’altra tecnica che sfrutta la presenza di una DNA polimerasi. C’era questo grosso impedimento che ad ogni ciclo bisognava aggiungere una nuova quantità di DNA polimerasi. per analizzare quelle 5 regioni ripetute di cui di diceva prima. Questa tecnica serve ad amplificare queste regioni di DNA che si vogliono amplificare. che non si sa a che serve tra l’altro. permette di individuare una persona. o per l’analisi della paternità. la quale come la maggior parte delle polimerasi degli organismi che vivono a temperatura ambiente viene denaturata con il calore.Il numero di ripetizioni è tale che se io analizzassi 5 di queste regioni ripetute. e si basa sul riscaldamento ciclico di una soluzione che contiene DNA polimerasi e i quattri nucleotidi. La soluzione viene ciclicamente riscaldata. Questa tecnica è stata ideata molto tempo fa. ma il numero di ripetizioni è diverso da individuo a individuo. per separare il DNA e poi viene abbassata la temperatura per far avvenire la sintesi.

sequenza del DNA e si può vedere tutto il cromosoma. c’è il segmento a 95 gradi. la DNA polimerasi allunga il primer e questa è la fine del primo ciclo. quando ancora non avevano pensato alla DNA polimerasi termostabile. Durante la reazione sintesi. adesso ovviamente tutto è automatizzato. Alla fine del terzo ciclo cominciano a comparire delle molecole che hanno la lunghezza esattamente uguale al tratto di DNA contenuto fra i due oligonucleotidi. perché quasta tecnica fa uso della DNA polimerasi che fa uso di un ossidrile in 3’ da poter allungare. Alla fine del terzo ciclo compaiono le molecole che noi volevamo amplificare. Da notare che la sequenza di DNA contenuta all’interno dei due oligonucleotidi. Tutto ciò che . arriva la DNA polimerasi e si formano queste quattro molecole di DNA alla fine del secondo ciclo. l’olgonucleotide che ci abbiamo messo è in eccesso. due oligonucleotidi che fiancheggiano la regione che si vuole amplificare. oltre al fatto di aggiungere l’enzima nuovamente nella miscela di reazione si dovevano avere tre termstati e lo doveva passare a mano queste provette da un termostato all’altro. siccome la DNA polimerasi è la polimerasi di un organismo che vive ad alte temperature. perché abbiamo messo all’inizio nella provetta un eccesso di oligonucleotidi primer. Poi si rialza di nuovo. funziona bene ad alte temperature. ad ogni ciclo raddoppia. Serve il DNA stampo che si vuole amplificare. Vediamo che cosa accade all’interno della provetta quando si verificano questi cambiamenti di temperatura. quindi è lo stesso termostato che automaticamente cambia la temperatura della provetta. Si ripete l’operazione quindi abbiamo questa volta quattro eliche. circa a 72 gradi. perciò se si conosce la sequenza da amplificare si va a vedere la sequenza di ciò che fiancheggia la regione che bisogna amplificare. È da notare che la reazione è termodinamicamente favorita rispetto al riappaiamento del DNA che vogliamo amplificare. il prodotto della reazione termodinamicamente favorito è proprio questo. e quindi si porta la temperatura a 72 gradi e inizia la sintesi. Poi una DNA polimerasi termostabile e i quattro desossinucleotidi trifosfato. i primer si appaiano ognuno su una singola elica di DNA. Però mettendo un eccesso di primer. quindi si porta la soluzione a 95°C per separare le due eliche. poi c’è l’appaiamento. quindi ognuno si lega al proprio posto. Dopo questo ciclo si ripete di nuovo. Da notare anche che i due ossidrili in 3’ guardano ognuno verso il segmento che si vuole amplificare. All’inizio. cresce in maniera esponenziale. All’inizio abbiamo il DNA che vogliamo amplificare. prima c’è la denaturazione del DNA stampo. Il processo prevede diversi cicli che si ripetono con questa modalità. poi la temperatura si abbassa a circa 55°C per permettere l’appaiamento con i due primer. la tecnica veniva poco usata perché.La freccia sta a simboleggiare l’ossidrile in 3’ quindi è il punto che verrà riconosciuto dalla DNA polimerasi e che verrà allungato. altrimenti il rischio è quello che abbassando la temperatura il DNA si riappaia e quindi non succede più niente.

teoricamente ottengo 268 milioni di molecole contenute all’interno dei due oligonuceotidi. Vantaggi e Svantaggi (37:06) . All’inizio sono due poi tre. Basta anche una singola copia di DNA per poterla amplificare moltissime volte. aumenta però soltanto in maniera aritmetica.sta all’esterno. poi quattro poi 5. Chiaramente ho amplificato solo quello che stava all’interno dei due oligonucleotidi. mentre ci sono soltanto una trentina di molecole di DNA. Questo sta a significare che se faccio 30 cicli.