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Streptococcus mitis Induce Conversin de

Helicobacter pylori a clulas cocoides durante


Co-cultivo in vitro.
Resumen
Helicobacter pylori (H. pylori) es un patgeno gstrico importante que se ha
asociado con los seres humanos durante ms de 60.000 aos. H. pylori causa
diferentes enfermedades gstricas como dispepsia, lceras y cnceres
gstricos. El desarrollo de la enfermedad depende de varios factores,
incluyendo los factores que infectan cepa de H. pylori, ambientales y del
husped.
Otro factor que podra influir en la colonizacin de H. pylori y otras
enfermedades es la microbiota gstrica que fue pasada por alto por mucho
tiempo debido a la creencia de que el estmago humano era un ambiente
hostil que no podra soportar vida microbiana. En este estudio, se analizaron
las interacciones entre H. pylori y dos bacterias, Streptocccus mitis y
Lactobacillus fermentum que estn presentes en el estmago tanto de
pacientes sanos como de personas con enfermedades gstricas.
Hemos encontrado que S. mitis producidas y liberadas son factores difusibles
que inducen la inhibicin del crecimiento y la conversin de las clulas
cocoides H. pylori. En contraste, H. pylori y L. fermentum secretan factores
que promueven la supervivencia de S. mitis durante la fase estacionaria de
crecimiento. Utilizando un enfoque de la metabolmica, se identificaron los
compuestos que podran ser responsables de la conversin de H. pylori de
espiral a las clulas cocoides. Este estudio proporciona evidencias de que las
bacterias gstricas influye en la fisiologa H. pylori y por tanto, posiblemente,
las enfermedades Esta bacteria causa.
Introduccion:
Helicobacter pylori (H. pylori) es un importante patgeno gstrico que se ha
asociado con los seres humanos durante ms de 60.000 aos [1]. La mayora
de las personas infectadas por H. pylori desarrollan una gastritis asintomtica y
puede albergar esta bacteria durante toda su vida. En un subgrupo de
huespedes, H. pylori causa diferentes enfermedades gstricas como dispepsia,
lceras y cnceres gstricos. Un factor que est emergiendo con un papel
importante en las enfermedades causadas por H. pylori-es la microbiota
gstrica del husped, El papel de la microbiota gstrico fue pasado por alto
previamente debido a la creencia por mucho tiempo que el estmago humano

era un ambiente hostil que no puede soportar vida microbiana. Estudios


posteriores al descubrimiento de H. pylori en 1981 mostraron que, de hecho,
estmago humano constituye un ecosistema muy diversa y compleja con una
densidad bacteriana comparable a la del duodeno [4].
La microbiota intestinal desempea un papel importante en varias funciones
del huesped, incluyendo la cosecha y almacenamiento de energa de la dieta
[5], el desarrollo y la regulacin del sistema inmune de la mucosa intestinal
asociada [6], la regulacin del sistema nervioso central [7], desintoxicacin de
xenobiticos y carcingenos, y la proteccin contra la colonizacin por
patgenos [8].
Aunque la microbiota gstrica ha sido menos estudiada que la microbiota en
otros sitios, es obvio que su composicin y la diversidad son fundamentales
para la homeostasis intestinal.
Una vez establecido que H. pylori reside principalmente en la mucosa gstrica,
un sitio que tiene una microbiota especfica estrechamente asociado con el
hospedero [9]. H. pylori interacta continuamente con las bacterias gstricas
residentes, que afectan no slo a la colonizacin por H. pylori, sino tambin la
respuesta inmune a la infeccin [10]. Aunque no demostrado anteriormente, es
probable que estas interacciones influyen en la colonizacin por H. pylori y
desarrollo de la enfermedad. Esta pregunta ha sido poco abordado en los seres
humanos. Sin embargo, los estudios en modelos animales de infeccin por H.
pylori han aportado importantes conocimientos.
Estudios en jerbo identificaron bacterias gstricas que inhiban la colonizacin
de H. pylori. Adems, la infeccin a largo plazo por H. pylori modific
significativamente la composicin de la microbiota gstrica de jerbos [14]. Una
observacin similar se hizo en ratones donde infeccin por H. pylori alterado la
composicin y la diversidad de la flora gstrica [15].
Estudios que analizaron la microbiota gstrica de los humanos infectados con
H. pylori presentan la limitacin de tener poca cantidad de pacientes
afectados, lo que ha producido resultados conflictivos. Sin embargo se puede
suponer que la modificacin inducida por la colonizacin de H pylori Incluye la
elevacin del pH gstrico, destruccin de clulas epiteliales y la produccin de
metabolitos que favorece el desarrollo de cierta especie bacteriana e inhibe
otras.
En este estudio, hemos querido investigar las interacciones entre H. pylori y
dos bacterias, Streptoccus mitis y Lactobacillus fermentum, que han sido
aislados a partir de biopsias gstricas de ambos de pacientes humanos sanos y
con enfermedades gstricas incluyendo personas infectadas con H. pylori.

Considerado durante mucho tiempo como un comensal, S. mitis actualmente


se considera al menos como un patgeno oportunista como lo demuestran
varios estudios que han demostrado su implicacin en enfermedades orales y
sistmicas [22].
L. fermentum pertenece al grupo de GRAS (generalmente considerado como
seguro) cido lctico
bacterias. Es un miembro de la microbiota gastrointestinal humano y cepas de
L. fermentum han demostrado propiedades probiticas proporcionar proteccin
contra las infecciones respiratorias [23-25] o ser utilizado en alimentos
funcionales [26].

Hemos encontrado que S. mitis produce y libera factores que inducen la


conversin a celulas cocoides de H. pylori clulas durante el cocultivo in vitro.
En contraste, tanto H. pylori y L. fermentum liberan productos que mejoraron la
supervivencia S. mitis durante la fase estacionaria de crecimiento. Estas
interacciones posiblemente impacten en las enfermedades causadas por H.
pylori y podra explicar el aumento de S. mitis en el estmago de ciertos
pacientes con enfermedades gstricas.

MATERIALES Y METODOS.
Cepas bacterianas, condiciones de crecimiento y de ensayo de co-cultivo.
La cepa H. pylori NCTC 11637, la cepa de S. mitis ATCC 6249 y la cepa L.
fermentum ATCC 8289 se obtuvieron de la American Type Culture Collection
(ATCC, EE.UU.). la cepa H. pylori UM032 es un aislado clnico de la Universidad
de Centro Mdico de Malasia, Kuala Lumpur, Malasia, que fue descrito
anteriormente [28]. Todas las bacterias se cultivaron en agar de chocolateplate o en infusin cerebro corazn (BHI) suplementado con 0,4% de extracto
de levadura y 1% b-ciclodextrina, y se incubaron a 37C en un incubadora
humidificado con 10% de CO2.
Esta condicin microaerofilica es necesaria para el crecimiento in vitro de H.
pylori, pero no es un requisito de S. mitis y L. fermentum. Sin embargo, para
mantener la coherencia, cultivamos todos los organismos en las mismas
condiciones durante todo el estudio. Para co-cultivo bacteriano, utilizamos
insertos de cultivo celular (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) que se
pueden colocar dentro de los pozos de la placa A12-bien (BD Biosciences, San
Jose, CA, EE.UU.) (Fig. 1).

Un cultivo bacteriano se inocul en la placa de 12 pocillos mientras que el otro


microorganismo se coloca dentro en una cavidad. Los dos compartimentos de
co-cultivo se separaron por una membrana de Tereftalato de polietileno (PTE)
con porros de 0,4 mm.
El contacto fsico impedido entre las dos bacterias, mientras que permiti la
libre difusin de macromolculas. Para verificar la ausencia de cruce bacteriana
de la membrana entre los 2 compartimentos, cultivos de BHI de H. pylori, S.
mitis y L. fermentum se inocularon en los prospectos que se colocaron en los
pocillos de una placa de 12 pocillos que contienen caldo BHI fresco y se
incubaron durante 5 das en una incubadora como se ha descrito
anteriormente.

Efecto de sobrenadante en el cultivo bacteriano


Sobrenadante de cultivos de H. pylori se obtuvieron mediante la inoculacin
Caldo BHI con clulas de una placa de agar chocolate de edad de 2-3 das y
incubaron a 37uC como se describe anteriormente. Despus de 1, 2 y 4 das de
el crecimiento, el cultivo se centrifug a 5000 g durante 5 min. y la
sobrenadante recuperado y se filtr con un filtro de jeringa de 0,22 mm
(Terumo Europe N. V., Lovaina, Blgica). El sobrenadante se filtr se us
inmediatamente. S. mitis sobrenadante se prepar de manera similar, excepto
que el caldo BHI se inocul (1/100dilucin) a partir de un cultivo lquido durante
la noche.
Para probar el efecto de los sobrenadantes, 2 ml de H. pylori y de S. mitis en
suspensin
Caldo BHI en OD600, y 0,02, 0,008, respectivamente, preparado como se ha
descrito anteriormente se distribuyeron en cada pocillo de una placa de 12
pocillos. Quinientos microlitros de sobrenadante filtrado de 1, 2 y 4 das de
edad culturas de la otra bacteria se aadieron a los pocillos y las placas se
incubaron a 37uC como se describe anteriormente. En cada da, diluciones de
los cultivos se sembraron en placa de agar chocolate y se incubaron a 37uC y
el recuento de bacterias determinaron como se describe anteriormente.
Adems, las clulas de H. pylori se recuperaron, se tieron con Gram y se
examinaron en el microscopio para controlar la presencia de coccoids.
Estos resultados sugieren que los productos de liberacin ambos H. pylori y L.
fermentum que promueve cultivabilidad de S. mitis clulas durante la fase
estacionaria de crecimiento in vitro.
Para completar el anlisis de los efectos de las tres bacterias en s durante la
co-cultura, que supervis el crecimiento de L. fermentum en presencia de H.

pylori y de S. mitis. L. fermentum co-cultivadas con cualquiera de las especies


muestra un patrn de crecimiento similar a la de mono-cultivos de la bacteria
(Fig. 3b). Todos juntos, estos resultados sugieren que H. pylori y L. fermentum
liberan factores difusibles que promovieron la supervivencia de S. mitis durante
la fase estacionaria del cultivo in vitro.

Streptococcus mitis induce la conversin de Helicobacter pylori a cocoides.


Queramos seguir investigando la detencin del crecimiento de las clulas de
H. pylori co-cultivadas con S. mitis. En primer lugar, verificamos si la H. pylori
clulas todava estaban vivos o murieron por la medicin de su nivel de ATP, un
indicador de la actividad metablica. Clulas de H. pylori en los monocultivos o
co-cultivadas con L. fermentum tenan niveles similares de ATP (Fig. 4a).
Cuando los niveles de co-cultivadas con clulas S.mitis, H. pylori se muestra de
ATP significativamente ms bajos que en los monocultivos en los das 1, 2, 4 y
5 las veces puntos ensayados en este experimento (Fig. 4a).
Sin embargo, estos niveles de ATP fueron significativamente mayores que los
encontrados en las bacterias matadas con formalina (Fig. 4d), sugiriendo que
las clulas H. pylori en co-cultivo con S. mitis estaban vivos. Como controles, se
midi el contenido de ATP de S. mitis (Fig. 4c) y L. fermentum (Fig. 4b) que,
contrariamente a H. pylori, no experiment la detencin del crecimiento. En
ambas condiciones de mono- y de co-cultivo, las bacterias muestran niveles
similares de ATP que fueron comparables a la de las clulas de H. pylori en
monocultivo (Fig. 4a), pero mayores que los niveles de ATP en H. pylori cocultivadas con S. mitis . En conjunto, estos resultados mostraron que H. pylori
clulas que experimentaron la detencin del crecimiento cuando se cocultivaron con S. mitis estaban vivos, aunque con un menor