You are on page 1of 70

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS BACTERIOLOGICOS

Elaboracin:

Blgo. Ana Mara Daz Montes

CONTENIDO

SECCION 1: PROCEDIMIENTOS PARA DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO


1.1
SIEMBRA PRIMARIA DE MUESTRA DE ORINA
1.2
SIEMBRA PRIMARIA DE MUESTRA DE SECRESIONES
1.3
SECCION 2: IDENTIFICACION BACTERIANA
2.1 IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:
Staphylococcus y Enterococcus
IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES:
Eschercha col, Klebsella pneumonae y Enterobacter IDENTIFICACION DE BACILO GRAM
NEGATIVO NO FERMENTADOR:
Pseudomonas aerugnosa.
SECCION 3: PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA POR EL METODO DE DISCO
DIFUSION
SECCION 4: CONTROL DE CALIDAD

Tabla 1
Tabla 2
Tabla 3
Tabla 4
Tabla 5
Tabla 6
Tabla 7
Tabla 8
Tabla 9

Anexo A
Anexo B
Anexo e
Anexo D

Condiciones ptimas de la muestra para su Procesamiento, Transporte y Almacenamiento 17


Asas de siembra recomendadas para cada mtodo de muestras de orina
Principales caractersticas fenotpicas de las especies de Staphylococcus comnmente
aislados en infecciones
Principales caractersticas fenotpicas de Cocos Gram positivos en cadena, catalasa
negativos
Principales caractersticas fenotpicas usadas para la identificacin de
Enterococcus de mayor importancia clnica y gneros relacionados
Principales caractersticas bioqumicas de Eschercha spp
Principales caractersticas bioqumicas de Klebsella spp
Principales caractersticas bioqumicas de Enterobacter spp
Caractersticas de Pseudomonas aerugnosa y otras Pseudomonas que producen
Pigmento, encontradas en muestras clnicas
RECOMENDACIONES PARA LAS PRUEBAS BIOQUIMICAS
METODO DE COLORACION DE GRAM
MEDIOS: PREPARACION y RECOMENDACIONES
FICHA PARA ENVIO DE CEPAS

INTRODUCCION
Las infecciones intrahospitalarias cada vez ms constituyen un serio problema de salud pblica, ya sea por su
efecto sobre la salud de los pacientes, como por los costos que este problema implica. Esto hace, que en el pas se
estn aunando esfuerzos para implementar sistemas de vigilancia, prevencin y control, orientados a enfrentar este
problema, lo cual a su vez repercutir en la calidad de atencin de los servicios hospitalarios.
Los pacientes con procesos infecciosos intrahospitalarios, pueden presentar una gran variedad de signos y
sntomas, algunos de ellos pueden ser evidentes y fciles de reconocer, mientras otros pueden pasar inadvertidos;
por lo que el clnico debe basar su diagnstico en otras evidencias disponibles, como son los aspectos
epidemiolgicos, y la importante contribucin del laboratorio, que adems de permitir el diagnstico etiolgico,
orienta el manejo clnico teraputico del paciente.
En este contexto, el Instituto Nacional de Salud en su rol de Centro de Referencia Nacional, establece
procedimientos de laboratorio que se realizan en los diferentes establecimientos y niveles de la Red de
Laboratorios, ha aprobado, previa validacin con los expertos de microbiologa de los principales hospitales
nacionales del Ministerio de Salud - MINSA, el MANUAL DE PROCEDIMIENTOS BACTERIOLOGICOS EN
INFECCIONES INTRAHOSPITALARIAS.
Este manual tiene por objetivo establecer los procedimientos de diagnstico bacteriolgico y susceptibilidad
antimicrobiana de los agentes ms frecuentes de las infecciones intrahospitalarias, como Staphylococcus,
Enterococcus, Enterobacter, Eschercha coH, Klebsella pneumonae, Pseudomonas aerugnosa siendo su
propsito estandarizar los procedimientos bacteriolgicos en los establecimientos de salud que desarrollan
actividades vinculadas al manejo de las infecciones intrahospitalarias. La primera seccin establece los objetivos,
los campos de aplicacin, responsabilidades y definiciones; en la segunda seccin se orienta sobre la
Bioseguridad; la tercera, est referida a los procedimientos de obtencin de muestras; la cuarta sobre el envo y
transporte de muestras, y la ltima sobre los procedimientos de diagnstico bacteriolgico.
El Instituto Nacional de Salud, organismo tcnico normativo, pone a disposicin del personal de salud este manual
que representa el resultado del esfuerzo de los profesionales de la institucin y otros destacados especialistas en el
tema en nuestro pas.

GENERALIDADES
OBJETIVO
Establecer los procedimientos para realizar el diagnstico microbiolgico de infecciones
intrahospitalarias causadas por Staphylococcus spp, Enterococcus spp, Eschercha col, Klebsella
pneumonae, Enterobacter y Pseudomonas aerugnosa.
CAMPO DE APLlCACION
Comprende:
%%1 Obtencin de muestras de los pacientes.
%%2 Envo de muestras al laboratorio.
%%3 Procedimientos de laboratorio para el aislamiento e identificacin de las bacterias
involucradas en el proceso de la vigilancia en Infecciones Intrahospitalarias (IIH).
%%4 Prueba de susceptibilidad antimicrobiana.
%%5 Control de calidad y registros necesarios para su control.
RESPONSABILIDADES

Los Directores de los establecimientos de salud, son responsables de autorizar, proporcionar los
recursos necesarios y designar al personal responsable para la aplicacin de las disposiciones
contenidas en el presente Manual.
El personal de los establecimientos de salud, es responsable de planificar las acciones, organizar,
controlar y capacitar al personal para cumplir las disposiciones contenidas en el presente Manual.
Los jefes o responsables de los laboratorios, deben asegurar el control interno de la calidad, la
idoneidad del personal, equipos, materiales, reactivos e instalaciones.
El personal mdico, tcnico y operativo, es responsable de seguir las especificaciones contenidas en el
presente Manual y aplicar los procedimientos especficos indicados.

DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
absceso: Acumulacin localizada de pus en un tejido u rgano.
aerbico: Un organismo que requiere oxgeno o aire atmosfrico para su crecimiento y reproduccin.
aglutinacin: Reaccin por la que se provoca la agrupacin de partculas, bacterias y clulas
suspendidas en un medio lquido.
aislamiento primario: Desarrollo inicial de microorganismos a partir de una muestra clnica.
antimicrobiano: Agente biolgico o qumico que inhibe el crecimiento de microorganismos.
asepsia: Desinfeccin de un tejido vivo o piel.
bacteria: Microorganismo unicelular microscpico perteneciente a los procariotes que se multiplica
por fisin binaria y carece de clorofila. Se diferencian por la coloracin de Gram.
bacteria Gram negativa: Aquella bacteria que no retiene el colorante primario (violeta de genciana o
cristal violeta) en el mtodo de Gram, son decoloradas por el alcohol y toman el color del colorante
contraste (safranina fucsina) dando un color rojizo.
bacteria Gram positiva: Aquellas bacterias que retienen el colorante primario del mtodo de Gram,
resisten la decoloracin por el alcohol y no son coloreadas por el colorante de contraste reteniendo el
color azul prpura inicial.
bioseguridad: Conjunto de medidas preventivas para proteger la salud y la seguridad humana y del
ambiente frente a diferentes riesgos producidos por agentes biolgicos, fsicos, qumicos o mecnicos.
cepa bacteriana: Cultivo puro de bacterias formada por los descendientes de un solo aislamiento.
colonia: Crecimiento visible de microorganismos, generalmente en medios slidos, originado por la
multiplicacin de un solo organismo. Todos son la progenie de una nica bacteria preexistente.
Coloracin Gram: Mtodo de tincin basado en la propiedad de retener o no el colorante cristal
violeta en la pared celular bacteriana debido a su composicin bioqumica despus de ser sometido a
un tratamiento de decoloracin.
chorro medio de orina: Muestra de orina obtenida despus que el paciente deja discurrir cierta
cantidad inicial.
desinfeccin: Destruccin de las formas vegetativas de las bacterias en objetos inanimados. Se
realiza con agentes qumicos en estado lquido o con agua a temperaturas superiores a 75 C.
desinfectante: Agente qumico utilizado para el proceso de desinfeccin.
establecimiento de salud: Hospital, clnica, centro de salud o lugar debidamente autorizado y
equipado para la atencin de pacientes.

esterilizacin: Proceso validado que permite la eliminacin de toda forma de vida microbiana
incluyendo endosporas bacterianas. Puede conseguirse por medio de mtodos qumicos, fsicos o
gaseosos.
fermentacin: Utilizacin de carbohidratos en forma anaerobia.
hemlisis: Presencia de restos de eritrocitos lisados alrededor de una colonia desarrollada en una
placa de agar sangre de carnero.
hemlisis alfa: Las colonias estn rodeadas por una destruccin parcial de los eritrocitos y prdida
de algo de hemoglobina en el agar lo que resulta en una coloracin verde (hemlisis incompleta).

hemlisis beta: Las colonias estn rodeadas por una zona de hemlisis completa (clara,
transparente) debido a una destruccin total de los eritrocitos.
incubacin: Mantenimiento de cultivos bacterianos en condiciones favorables para su desarrollo y
multiplicacin.
infeccin: Invasin y multiplicacin de microorganismos en un husped, pudiendo progresar hacia
una enfermedad. El trmino enfermedad infecciosa se aplica cuando aparecen signos y sntomas
como resultado de la infeccin.
infeccin intrahospitalaria (IIH): Infeccin que se adquiere luego de 48 horas de permanecer en el
establecimiento de salud y que el paciente no portaba a su ingreso. Se consideran tambin a aquellos
procesos infecciosos que ocurren hasta 30 das luego del alta.
inculo: Alicuota de una muestra que es transferida a un medio de cultivo.
limpieza: Es la remocin mecnica de toda materia extraa con el objeto de disminuir el nmero de
microorganismos. Se realiza a travs del arrastre mecnico, sin embargo no se asegura la eliminacin
de stos.
medio de cultivo: Medio artificial de sustancias nutritivas necesarias para el crecimiento y
multiplicacin de las bacterias in vitro, que puede encontrarse en estado slido, semislido o lquido.

metabolismo: Proceso de degradacin y biosntesis enzimtica que tiene lugar dentro de una clula
y por medio del cual se mantienen las actividades nutricionales y funcionales.
microaeroflico: Organismo que crece y se reproduce mejor en la presencia de una tensin del 5%
de oxgeno, 10% de anhdrido carbnico y 85% de nitrgeno.
Microorganismo viable: Es aquel que es capaz de reproducirse.
oxidacin: Reaccin qumica que implica la prdida de electrones de los tomos. Mezcla de una
sustancia con el oxgeno y un aumento en la valencia.
reconstituir: Restablecer la forma original de una sustancia previamente alterada para su
conservacin y almacenamiento, mediante la combinacin con un lquido adecuado.

registro: Documento que provee evidencias objetivas de las actividades efectuadas o de los resultados
obtenidos.
sepsis: Patologa compleja de respuesta sistmica con compromiso multiorgnico, secundaria a la
invasin del organismo por alguna bacteria u hongo.
siembra primaria: Inoculacin de una muestra a un medio de cultivo simple, selectivo o de
enriquecimiento.
subcultivo: Pasaje de bacterias viables derivadas de otro cultivo a un medio de cultivo nuevo.
UFC: Unidad formadora de colonia.

PROCEDIMIENTOS PARA DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO


Las bacterias para su desarrollo requieren de sustancias nutritivas cuyos componentes bsicos deben satisfacer
las mnimas exigencias nutricionales y condiciones de atmsfera (aerobiosis, anaerobiosis, microaerofilia), pH y
temperatura ptima para su crecimiento in vitro.
La eleccin de los medios de cultivo se realiza en funcin a la localizacin de las infecciones y las bacterias a
investigar. Los errores cometidos durante este paso del ciclo de procedimientos pueden invalidar la lectura e
interpretacin de los cultivos.
SIEMBRA PRIMARIA DE MUESTRA DE ORINA
Objetivo
Describir el procedimiento para la siembra primaria de muestra de orina
Campo de aplicacin
Se aplica para el cultivo de muestra de orina en el diagnstico bacteriolgico de infecciones del
tracto urinario
Materiales y equipos
%le
Asa calibrada de platino o descartable de 0.001 mL, 0.01 mL
%lf
Estufa de 35 - 3r C
e) Mechero Bunsen o Cabina de Flujo laminar
%ld
Guantes de ltex
o0 Contenedor de material contaminado
Pinza estril
0 Propipeta o pipetor automtico
1 Medios de cultivo
- Placas con agar sangre de carnero (AS)
- Placas con agar Mc Conkey (McC)

Procedimiento
gl Mantener las muestras en refrigeracin (4 o C) hasta su procesamiento por cultivo.
hl Los cultivos deben realizarse en una cabina de bioseguridad o cerca del mechero Bunsen.
al Las placas con AS y McC que se utilizarn en el urocultivo deben estar a temperatura
ambiente. Rotular las placas.
dl Si el asa calibrada no es descartable, esterilizar el asa de siembra flamendola en el mechero
Bunsen hasta que se ponga rojo vivo. Dejar enfriar el asa contando hasta 20.
el Tomar el frasco con la muestra de orina, abrir la tapa y ftamear la boca del frasco en el
mechero Bunsen.
gl Tomar la muestra de orina con el asa de siembra estril introducindola y sacndola del frasco
en forma vertical (Vase Figura 7a). Tapar el frasco con la muestra.
al Inocular en el centro de la placa con AS a partir del cual se extiende la muestra, hacia delante
y hacia atrs (Vase Figura 7b).

al Luego, sin quemar el asa, el inoculo se disemina uniformemente con trazos perpendiculares
a la siembra inicial en toda la placa (Vase Figura 7c).
bl Proceder de la misma forma para el agar Mc Conkey.
cl Esterilizar el asa de siembra en el mechero.
dl Concluida la siembra, cerrar la placa y colocarla con la parte que tiene el medio de cultivo hacia
arriba. Incubar la placa de AS y Mc Conkey a 35 - 3r C en condiciones aerbicas por 24 horas.

Tabla 2:
Asas de siembra recomendadas para cada mtodo de muestras de orina
Asa recomendada
Fuente I METODO
Chorro medio
Catter
Aspiracin suprapbica

0.001 mL (*)
X
X

0.01 mL (**)

(*) Una colonia = 1000 UFC/ mL

Figura 7a. Mtodo para introducir el asa calibrada en la muestra de orina para
asegurar que se retire una cantidad apropiada.

Lectura

dl Realizar la evaluacin a las 24 horas, si no hay crecimiento bacteriano dejar incubar hasta las
48 horas.
gl La evaluacin consiste en el recuento de colonias y se multiplica por el factor de dilucin para
obtener las UFC por mL.
Interpretacin

al En pacientes sin sonda vesical, la cuenta significativa de bacterias en orina es la presencia de


mas de 105 UFC / mL de un solo germen.
el Los recuentos intermedios (103 - 104 UFC / mL) indican infeccin si el procedimiento de
recoleccin de orina fue realizado correctamente.
dl Generalmente, el aislamiento de tres o mas especies bacterianas indican que la muestra se ha
contaminado por recoleccin inadecuada o demora en la siembra.
o0 En pacientes con sonda vesical, cuentas bacterianas menores de 10 5 UFC / mL pueden tener
significado, as tambin se pueden encontrar bacteriurias polimicrobianas hasta en casi 15%
de enfermos.
0 En pacientes sin catter se puede comprobar si el procedimiento de obtencin de muestra fue
realizado correctamente observando la frecuencia con la cual se informan recuentos de
colonias intermedias entre 103 - 104 UFC / mL. En pacientes sin infecciones del tracto urinario,
el recuento es nulo o se reduce a pocas colonias.
gl En muestras obtenidas por puncin suprapbica, el desarrollo de una sola colonia en el medio
de cultivo indica infeccin del tracto urinario.
NOTA 1: Se usar asas de siembra 0.001 mL para todas las muestras de orina a excepcin de aquellas
procedentes de aspirados suprapbicos, de infantes, de nios y de pacientes con tratamiento
antimicrobiano, las cuales se inocularn con asas de 0.01 mL debido a que en dichos pacientes pueden
haber infecciones del tracto urinario asociados a recuentos menores de 10 5 UFC/ mL.
NOTA 2: De no contar con asa calibrada, utilizar tips estriles y micropipeta de 1 J..lL o 10J..lL.
Referencias

al

Koneman E, Allen S, Dowell V, Sommers H. Diagnstico microbiolgico. 3a ed Buenos Aires.


Editorial Mdica Panamericana. 1992.

dl

Reisner B, Woods G, Thomson R, Danse L, Garca L , Shimizu R. Specimen processing. En:


Figura
Sin flamear
el asa
estriar atravesando
Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken
RH. 7e.
Manual
of Clnical
Microbiology.
7a ed. la
lnea
del
inoculo
en
el
sentido
de
las
flechas.
Washington DC: American Society for Microbiology; 1999. pp 64 - 104.

Figura 7: Mtodo para sembrar con asa calibrada

SIEMBRA PRIMARIA DE MUESTRA DE SECRESIONES


Objetivo
Describir los procedimientos de cultivo de muestra de herida para el diagnstico bacteriolgico
en infecciones de herida abierta y abscesos.
Campo de aplicacin
Se aplica para el cultivo de muestra de herida para el diagnstico bacteriolgico en infecciones de
herida abierta y abscesos.
Materiales y Equipos
dl Estufa de 35 - 3r C.
0 Cabina de Flujo laminar o mechero Bunsen.
e) Guantes de ltex.
0 Contenedor de material contaminado.
1 Medios de cultivo.
Agar sangre de carnero
Agar Mc Conkey
Pueden incluirse otros medios (ejm. Manitol salado, agar Columbia CNA con 5% de
sangre de carnero, etc.)
Procedimiento
al Realizar los cultivos en una cabina de bioseguridad o cerca del mechero Bunsen.
bl Utilizar placas con medios de cultivo cuando stas hayan alcanzado la temperatura ambiente.
bl Inoculacin de la muestra:
Muestra de aspirado purulento: Con una pipeta pasteur inocular una gota de la muestra
en un extremo de la superficie de la placa de agar sangre de carnero, agar Mc Conkey
y/o otros medios.
Hisopado de secrecin: Frotar rotando el hisopo sobre la superficie de los medios de
cultivo tratando que toda su superficie haga contacto con el agar, empezando con el agar
sangre de carnero, Mc Conkey y/o otros medios.
Esterilizar el asa de siembra en el mechero de Bunsen hasta que se ponga rojo vivo.
Dejar enfriar el asa contando hasta 20.

0
g)
h)
i)
j)

Utilizando el asa de siembra y tomando como referencia central el inoculo de la muestra,


realizar la siembra por dispersin agotamiento en cuatro cuadrantes de la placa, con el
propsito de obtener colonias aisladas (Vase Figura 8).
Incubar las placas de AS a 35 C por 24 horas y el agar McC en condiciones aerbicas y por 24
horas.
Esterilizar el asa de siembra en el mechero.
Concluida la siembra, cerrar la placa y colocarla con la parte que tiene el medio de cultivo hacia
arriba.
Incubar las placas a 35 - 3r C por 24 - 48 horas en condiciones aerbicas.

Lectura
A las 24 horas observar el crecimiento de colonias. Si no se observa crecimiento seguir incubando
hasta las 48 horas.
Referencia
Koneman E, Allen S, Dowell V, Sommers H. Diagnstico microbiolgico. Editorial Mdica
Panamericana. 3a ed. 1992, Buenos Aires.

IDENTIFICACION BACTERIANA
Para un adecuado sistema de vigilancia de las infecciones intrahospitalarias es necesario realizar la identificacin
de casos y su etiologa, la determinacin de las caractersticas epidemiolgicas, aplicar medidas de control y una
continua supervisin para determinar el xito de esas medidas. El laboratorio de microbiologa tiene
responsabilidades importantes relacionadas a cada paso de este proceso, pero tal vez su rol ms relevante es la
identificacin del microorganismo causante de una infeccin, ms an cuando el espectro de los agentes
responsables de infecciones intrahospitalarias han cambiado en los ltimos aos.
Esta seccin describe los protocolos bsicos de trabajo recomendados para la identificacin de las bacterias
involucradas en el sistema de la vigilancia de infecciones intrahospitalarias. Si bien es cierto que el desarrollo de
sistemas de multipruebas, pruebas bioqumicas rpidas y pruebas enzimticas nos brindan facilidades en la
identificacin de las bacterias, su uso no est al alcance de todos los laboratorios, debido a ello se describen
protocolos de trabajo con pruebas bioqumicas convencionales para la identificacin de bacterias.
En la identificacin bacteriana es necesario considerar las caractersticas macroscpicas de las colonias teniendo
en cuenta el medio de aislamiento original y sus caractersticas microscpicas para poder elegir las pruebas
diferenciales correspondientes.
Se deben mantener las medidas de bioseguridad en el manejo de reactivos y cultivos, siguiendo los procedimientos descritos en la SECCION 2 de Normas de Bioseguridad. Serie de Normas tcnicas N 18.
IDENTIFICACION BACTERIANA DE COCOS GRAM POSITIVOS: Staphylococcus y Enterococcus
Objetivo
Describir los procedimientos para la identificacin de Cocos Gram positivos: Staphylococcus y
Enterococcus aisladas a partir de muestras clnicas.
Campo de aplicacin
Esta parte comprende la identificacin de Cocos Gram positivos: Staphylococcus y Enterococcus .
Condiciones generales
%le La primera consideracin prctica a tomar en cuenta es determinar, si un aislamiento es
estafilococo, estreptococo o enterococo. Esta diferenciacin se realiza en base a la morfologa
de la colonia, tipo de hemlisis, forma de las bacterias por coloracin Gram a partir de un cultivo
y de la prueba de reaccin de la catalasa.
%lg Las colonias de estafilococos son comnmente grandes (2 mm a 3 mm a las 24 horas),
convexas, lisas, enteras, opacas y con frecuencia pigmentadas, a diferencia de las colonias

de estreptococos y enterococos que son ms pequeas (menos de 2 mm de dimetro),


puntiformes, con aspecto translcido a semiopaco.
%la Los estafilococos pueden ser fuertemente p hemolticos en agar sangre de carnero, pero las
zonas de hemlisis son menores en relacin al tamao de las colonias que las generadas por los
enterococos y estreptococos hemolticos.
%le Los estafilococos se agrupan generalmente en racimos, a diferencia de los estreptococos y
enterococos que se renen en pares o cadenas.
6.1.4

Identificacin de estafilococos

6.1.4.1 Lectura de Cultivos en Agar sangre de carnero y Agar Columbia CNA-sangre


a)

Morfologa de las colonias

Las colonias de la mayora de Staphylococcus son lisas, enteras, algo elevadas. Miden
aproximadamente de 1 a 3 mm de dimetro a las 24 horas. Si las placas se siguen incubando
tres das a 34 - 3r C las colonias pueden medir de 3 - 8 mm dependiendo de las especies.

Las colonias de Staphylococcus aureus normalmente son grandes, stas siguen


desarrollando si se deja en incuban por unos das ms. Son de borde entero, de superficie
lisa, la mayora de ellas presentan un pigmento que va desde el amarillo crema hasta el
naranja.
Las colonias de Staphylococcus epdermds son algo ms pequeas dependiendo de las
cepas, usualmente no se detecta pigmentos. Las colonias de Staphylococcus saprophytcus
son ms grandes que S. epdermds, son lustrosas y ms convexas que otras colonias de
estafilococos. Un 50% de las cepas son pigmentadas (Foto N 1).
b)

Coloracin Gram

Hacer una coloracin Gram de las colonias sospechosas y observar al microscopio. Aplicar el
procedimiento descrito en el anexo B. Mtodo de Coloracin Gram.
Si se observan cocos Gram positivos en racimos, realizar la prueba de la catalasa.
c)

Prueba de la catalasa (1)

Determina la presencia de la enzima catalasa, esta enzima descompone el perxido de


hidrgeno en agua y oxgeno (Foto N 2).
Reactivo
Perxido de hidrgeno 3%
Procedimiento
%ld Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18 a 24 horas y colocar
sobre un portaobjetos limpio.
%le Agregar una gota de H202 al 3% usando un gotero o una pipeta pasteur.

o0 No es necesario mezclar el cultivo con el H202.


o1 Observar una inmediata efervescencia (formacin de burbujas) lo que indica una prueba
positiva, de lo contrario se considera la prueba negativa.
o2 Desechar el portaobjetos colocndolo en un desinfectante
o3 Realizar este procedimiento en forma paralela con cepas controles: Control positivo : S. aureus.
- Control negativo: Streptococcus spp
NOTA: Al coger la colonia con el asa de siembra tener cuidado de no llevar algo del medio de agar
sangre debido a que la catalasa presente en los eritrocitos, puede dar resultados falsos positivos.
No invertir el orden del mtodo porque pueden producirse resultados de falsos positivos.
Si son catalasa positivas primeramente determinar si el organismo es o no Staphylococcus a ureus,
para ello se realiza la prueba de la coagulasa.
d)
gl

Prueba de la coagulasa

Se realiza para comprobar la facultad de la bacteria de coagular el plasma por accin de la


enzima coagulasa, la cual aumenta la velocidad de coagulacin del plasma. El resultado
final es la formacin de un cogulo de fibrina.
- Prueba en lmina (detecta factor de aglutinacin o coagulasa ligada).
- Prueba en tubo (detecta coagulasa libre y ligada).

al La prueba de coagulasa en tubo es definitiva, y la prueba de coagulasa en lmina puede ser


usada como una tcnica de tamizaje rpida para la identificacin de S. aureus. Todas las
pruebas negativas en lmina deben repetirse utilizando la tcnica en tubo.
Reactivo
Plasma de conejo deshidratado. (Reconstituir de acuerdo a las instrucciones del fabricante).
NOTA: El plasma humano no debe ser usado a menos que haya sido cuidadosamente probado de
no contener algn agente infeccioso, capacidad de coagulacin e inhibidores.
Controles:
Positivo: S. aureus
Negativo: S. epdermds o S. Saprophytcus
Prueba en Lmina
La prueba de la coagulasa en lmina es un mtodo nicamente presuntivo. Por esa razn todos los
resultados negativos o retardados (ms de 20 segundos) deben ser confirmados por la prueba en
tubo.

Procedimiento
dl
el
fl
gl
hl

Preparar una suspensin densa de la colonia en agua destilada o solucin fisiolgica


mezclando bien para homogenizar.
Si hubiera autoaglutinacin no continuar y realizar la prueba en tubo.
Agregar una gota de plasma y mezclar con movimientos circulares.
Observar la formacin de aglutinacin o precipitado dentro de 20 segundos.
Todas las pruebas negativas y positivas retardadas (20 a 60 segundos) debe confirmarse
con la prueba en tubo.

NOTA: Es una prueba bastante rpida y econmica pero del 10 a 15 % de S. aureus pueden dar
un resultado negativo, por eso, todos los resultados negativos deben repetirse utilizando la tcnica
en tubo.
Prueba en Tubo
Procedimiento
gl
hl
il
jl
kl
ll

ml
nl

Transferir una colonia aislada del agar sangre de carnero a 0,5 mL de plasma reconstituido
(en un tubo de vidrio estril de 13 x 100).
Girar el tubo suavemente para lograr la suspencin del organismo. No agitar.
Incubar la mezcla a 35 - 3r C (en bao mara de preferencia) por 4 horas; observar si hay
formacin de coagulo inclinando lentamente el tubo.
Observar cuidadosamente si hay formacin de coagulo inclinando lentamente el tubo (sin
agitar) en intervalos hasta 4 horas. Cualquier grado de coagulacin es una prueba positiva.
La mayora de los S. aureus formarn coagulo dentro de una hora.
Si es negativa a las 4 horas seguir incubando hasta el da siguiente a temperatura
ambiente. Esto es recomendado porque un pequeo nmero de cepas de S. aureus
pueden requerir ms de cuatro horas para la formacin del cogulo. Considerar que
Staphylococcus produce fibrinolisina, la cual puede lisar el coagulo.
Realizar el control de calidad del reactivo utilizando controles positivos y negativos. Si es
coagulasa positiva se identifica como Staphylococcus aureus.
Si son estafilococos coagulasa negativos, realizar las pruebas de resistencia a la polimixina
B y novobiocina (disco de 5ug) para tener una identificacin presuntiva. S. saprophytcus es
resistente a la novobiocina y S. epdermds es resistente a la polimixina B.

NOTA: Es preferible utilizar bao mara para esta prueba (Foto N 3).
e)

Resistencia a la novobiocina

Esta prueba se realiza principalmente para distinguir S. saprophytcus de otras especies de


importancia clnica.
Medios y Reactivos
al
bl
cl

TSA con sangre de carnero o Agar Mueller Hinton


Suero fisiolgico o Caldo tripticasa soya
Discos de novobiocina (5 IJg por disco)

el
fl
gl

Escala 0.5 de Mc Farland


Incubadora a 35 - 3r C
Vernier o regla

Procedimiento
dl
el

fl
gl
hl
il

A partir de colonias aisladas y cultivadas por 24 horas hacer una suspensin equivalente a la
escala 0.5 de Mc Farland.
Sumergir un hisopo estril dentro de la suspensin ajustada y rotarlo varias veces
presionando sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del lquido. Esto remover el
exceso de inoculo del hisopo.
Inocular sobre la superficie seca de una placa con agar sangre de carnero estriando
homogneamente con el hisopo sobre la superficie del agar. Repetir el procedimiento dos
veces ms rotando la placa 90.
Dejar de 3 a 5 minutos a temperatura ambiente para que cualquier exceso de humedad
superficial sea absorbido.
Colocar el disco de novobiocina y presionar suavemente con una pinza estril
Incubar a 35 - 3r C toda la noche o 24 horas.

Lectura
Medir el halo de inhibicin. Un halo s 16 mm es resistente a la novobiocina, si es mayor es sensible.
La resistencia a novobiocina es intrnseca en S. saprophytcus

f)

Resistencia a la polimixina B

Medios y Reactivos
o0
o1
o2
o3
o4

TSA con sangre de carnero.


Suero fisiolgico o Caldo tripticasa soya
Discos de polimixina B (300 U por disco)
Escala 0,5 de Mc Farland
Vernier o regla

Procedimiento
Realizar el mismo procedimiento descrito para detectar la resistencia a novobiocina. Ambas pruebas
pueden realizarse en la misma placa.
Lectura
La resistencia a la polimixina B se define por una zona de inhibicin menor de 10 mm. S. aureus y S.
epdermds son usualmente resistentes.
Resultados:
Comparar los resultados con la tabla N 1 que muestra las principales caractersticas de S. aureus y
estafilococos coagulasa negativos comnmente asociados a infecciones.

Nota: Las identificaciones de los estafilococos coagulasa negativos son presuntivas y deben ser
confirmadas en el Laboratorio Referencial.

Tabla 3. Principales caractersticas fenotpicas de las especies de Staphylococcus comnmente


aislados en infecciones
Pigmento
de colonia

Hemolisina
(*)

Estafilo
coaqulasa

Factor de
aqlufinacin

Resistencia a
novobiocina

Resistencia a
polimixina B

Ornitina
descarboxilasa

Acidez de
manitol

(d)

(d)

(+)

S. aureus
subespecie aureus
S. epdermdis
S haemolytcus
S. lugdunenss
S.saprophytcus
subespecie
Foto N 1
saprophytcus
S.schlefer
schlefer
S. warner
+
d
(+)
(*)
+
(+)
(d)

d
d
d

(+)
(+)

(+)

(d)

90% O ms especies, o cepas positivas


90% o ms especies, o cepas negativas
11 % - 89% de especies o cepas positivas
Reaccin retardada
En agar sangre de carnero de carnero
Zona amplia de hemlisis dentro de 24 - 36 horas.
Hemlisis retardada, de una zona moderada a amplia dentro de las 48 - 72 horas
No hay hemlisis o es retardada
No hay hemlisis o hay una zona muy angosta (::;1 mm) dentro de las 72 horas. Algunas de las
cepas pueden producir un ligero color verdusco o marrn en agar sangre de carnero.

Fuente: Kloos W, Bannerman T. Staphylococcus. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH. Manual
of Clinical Microbiology. 7a ed. Washington OC: American Society for Microbiology; 1999. pp 264 - 282.

6.1.5

Identificacin de enterococos:
c) Prueba
de la
catalasa como clulas nicas, en pares o en cadenas cortas. Se ven de
Los enterococos
pueden
presentarse
forma cocobacilar cuando la coloracin de Gram se realiza de una placa de agar y pueden verse en
cadenas
cuando
se prepara ladescritos
coloracin
deidentificacin
Gram a partir
de caldo thioglicolato.
Son anaerobios
Seguir
los procedimientos
en la
de Staphylococcus.
Enterococcus
es
facultativos
y sunegativo.
crecimiento ptimo es a 35 C. Muchas cepas crecen a 10 y 45 C.
catalasa

6.1.5.1 LecturaNota:
de cultivos
en Agar
de carnero
y Agar catalasa
Columbiay CNA
Algunas
vecessangre
se produce
una seudo
se puede observar una dbil efervecencia.
Esto ocurre cuando E. faecals desarrolla en medios que contienen sangre, (2) en este caso
subcultivar
la coloniadeenlas
estudio
en TSA o agar Mueller Hinton y repetir la prueba.
a) Apariencia
colonias
Usualmente son alfa hemolticas o no hemolticas en agar sangre de carnero 5% aunque tambin
d) haber
Prueba
de labeta
esculina
en medio
bilis cepas de E. durans.
puede
especies
hemolticas
comocon
algunas
(Foto N 4)
Para determinar la facultad de un organismo de hidrolizar el glucsido esculina en esculetina y
b) en
Coloracin
Gram
glucosa,
presencia
de bilis (Foto N 5).
Procedimiento
Si se observan cocos Gram positivos y se presentan solos, en pares o en cadenas cortas, algunas
veces cocobacilares, realizar la prueba de la optoquina. Aplicar el procedimiento descrito en el anexo
B. Mtodo
Gram.haciendo estras sobre la superficie del pico de ftauta o de la
gl
Inoculardeelcoloracin
cultivo en de
estudio
placa de agar bilis esculina.
hl Incubar a 35 - 3r C hasta 72 horas.
%lh Se puede controlar peridicamente, y esperar hasta las 72 horas antes de informar como
Tabla 4. Principales
negativo.caractersticas fenotipicas de cocos gram positivos en cadena, cata lasa negativos
Lectura:
Crecimiento
Bilis
esculina
CINa
Hemlisis
Positivo: En tubo:
Ennegrecimiento
difuso6.5%
en el agar inclinado
10C
45C
En placa: Se
de las colonias
en la
placa.
Enterococcus
+ observa un halo+negro o marrn alrededor
+
+
a,~,
n
Negativo:
No
se
produce
ennegrecimiento
del
medio
o
ennegrecimiento
de
menos
de
la
mitad
_
b
_
a
Streptococcus
V
.B, n del
tubo despus de 72 horas de incubacin.
Lactococcus
+
V
+
V
a, n
Vagococcus Controles
+
+
+
V
a, n

De los estreptococos viridans 5% -10% son bilis esculina positivas


- Control negativo: Staphylococcus aureus
Algunos estreptococos ~ hemolticos crecen en 6,5% CINa.
- Control positivo: Enterococcus spp
No hemoltico
2':
95%
reacciones
e) Tolerancia al cloruro de sodio
positivas ::; 5 % reacciones
positivas
reacciones
V
Para determinar la facultad de un organismo de desarrollar en presencia de una concentracin de
variables
6.5 % de cloruro de sodio.
Fuente: Facklam R, Sahm O, Martins L. Enterococcus. En: Murray PR, Barn EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH.
Manual of Clinical
Microbiology. 7a ed. Washington OC: American Society for Microbiology; 1999. pp 297 - 305.
Procedimiento
b
n
+

Fofo N1: Colonias de Staphylococcus aureus en agar sangre


%
li Inocular en el caldo TSB con cloruro de sodio un cultivo de 18 - 24 horas de incubacin.
Fofo N2: Prueba de catalasa
%lj Incubar a 35 - 3r C por 24 horas.
Fofo N3: Prueba de coagulasa en tubo
%lh Se puede controlar peridicamente, y esperar hasta las 72 horas antes de informar como
negativo.

Lectura:
Positivo:
Negativo:

Hay desarrollo bacteriano


No se observa crecimiento en el caldo

Controles
- Control negativo: Eschercha col
- Control positivo: Staphylococcus aureus
6.1.5.2 Observar el oscurecimiento del agar indicando si hubo hidrlisis de la esculina y el crecimiento en el
caldo con cloruro de sodio. Con estas pruebas tenemos dos identificaciones presuntivas posibles:
Casi todos los enterococos (95%) son esculina positivos y crecen en medios con 6.5% de cloruro
de sodio produciendo acidez.
5% -10% de Streptococcus del grupo viridans son bilis esculina positivos.
NOTA: Una vez que se ha establecido que el microorganismo en estudio es presuntivamente un
Enterococcus o un gnero cercano a l (Lactococcus o Vagococcus) se puede hacer la
identificacin de las especies de acuerdo a la Tabla N 2.
Lactococcus, Leuconostoc, Pedococcus y Vagococcus han sido aislados de infecciones humanas.
a)

Crecimiento en telurito de potasio

Es til para la identificacin presuntiva de E. faecals (Foto N 6).


Procedimiento:
%li Sembrar la cepa en estudio en TSA con 0.04% de telurito de potasio.
%lj Incubar a 35 - 3r C. Si hay desarrollo de colonias negras se identifica presuntivamente
como E. faecals.
6.1.5.3 Sembrar en caldo para fermentacin de carbohidratos con manitol, sorbosa, rafinosa, sorbitol y
arabinosa, yen caldo base descarboxilasa con arginina.
a)

Metabolismo de carbohidratos

Procedimiento
%a A partir de un cultivo puro de 24 horas inocular los caldos conteniendo los diferentes
carbohidratos con las colonias sospechosas cultivos puros.
%b
Incubar a 35 - 3r C hasta por 4 das.
Lectura
%b Positivo: Viraje de color hacia el amarillo (indicador prpura de bromocresol), indica
produccin de acidez.
%c Negativo: No hay viraje de color.

b) Descarboxilacin de la arginina
Seguir los pasos descritos en el procedimiento: Produccin de descarboxilasas en IDENTIFICACION
DE BACILOS GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES: Eschercha col, Klebsella pneumonae y
Enterobacter (Foto N 7)

Tabla 5. Principales caractersticas fenotpicas usadas para la identificacin de Enterococcus de


mayor importancia clnica y gneros relacionados
E. avium
E. raffinosus
E. saccharolyticus
E. faecalis
E. faecium
E. durans
E. hirae
E. gallinarum
E. mundtii
Lactococcus

v
*

TELURITO

MANITOL

SORBOSA

+
+
+
+*
+*

+
+
+

+ N 4
Foto

+*
+
+

ARGININA

ARABINOSA

+
+

+*
+
+
+
+*
+
+

RAFINOSA

SORBITOL

+
+
+
+

+
+
Foto N 5

+
+

+
+

2':
90%
reacciones
positivas ::; 10 % reacciones
positivas reacciones variables
Excepciones ocasionales 3 % de cepas muestran reacciones aberrantes)

Fuente: Facklam R, Sahm O, Martins L. Enterococcus. En: Murray PR, Barn EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH.
Manual of Clinical Microbiology. 7a ed. Washington OC: American Society for Microbiology; 1999. pp 297 - 305.

Foto N 6

Instituto Nacional de Salud

6.2

IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS FERMENTADORES: Escherichia coli,


Klebsiella pneumoniae y Enterobacter

6.2.1

Objetivo
Describir los procedimientos de cultivos e identificacin de bacilos Gram negativos fermentadores:
Eschercha col, Klebsella pneumonae y Enterobacter.

6.2.2

Campo de aplicacin
Comprende el cultivo e identificacin por pruebas bioqumicas de las colonias desarrolladas en
agar Mc Conkey de las siguientes bacterias: Eschercha col, Klebsella pneumonae y Enterobacter

6.2.3

Condiciones generales
Las bacterias Gram negativas fermentadoras se desarrollan en agar sangre de carnero y agar Mc
Conkey, pero en agar sangre de carnero no podemos hacer mayor diferenciacin entre las
colonias, sin embargo, en el agar Mc Conkey podemos diferenciar las colonias lactosa positivas y
lactosa negativas.

6.2.4

Lectura de cultivos en Agar Mac Conkey


En agar Mc Conkey, Eschercha col lactosa positiva son colonias de borde entero, de color
fucsia, opacas, de 2 mm - 3 mm de dimetro, usualmente rodeadas de una zona opaca alrede dor
de la colonia (bilis precipitada). Las cepas de E. col que son lactosa negativas dan colonias
incoloras de 3 - 4 mm.
(Foto N 8)
En agar Mc Conkey, K. pneumonae son colonias de borde entero, de color rosado a rosado
oscuro, de 3 - 4 mm de dimetro y mucoide.
(Foto N 9)
En agar Mc Conkey Enterobacter spp. son colonias de borde entero, de color rosado de 2 - 4
mm de dimetro, no tan mucoides como K. Pneumona.
(Foto N 10)
Las colonias con estas caractersticas son subcultivadas en medios diferenciales.

6.2.5

Pruebas bioqumicas
%a Utilizacin de lactosa
%b Utilizacin de glucosa
e) Produccin de gas de glucosa
%b Descarboxilacin de lisina
%c Produccin de cido
sulfhidrico
f) Utilizacin
del citratofaecalis en agar sangre
Fofo N4: Colonias
de Enterococcus
Produccin
Fofo
Hidrlisisdedeureasa
la esculina en medio bilis esculina
g) NS:
Prueba
MR de Efaecalis en agar telurito de potasio 0.04%
Fofo
Desarrollo
h) N6:
Prueba
VP
Fofo
Descarboxilacin
de la arginina en medio de Moeller
i) N7:
Motilidad
j)
k) Produccin de indol
1) Prueba de ONPG

Foto N 7

6.2.5.1 Procedimiento
%e Identificar la colonia sospechosa que se encuentra en la placa de agar Mc Conkey.
%f Esterilizar al rojo vivo el asa de siembra recta en un mechero de Bunsen.
e) Enfriar el asa.
%d Obtener la colonia seleccionada con el asa recta, tratando de no tocar el fondo del medio de
cultivo ni otra colonia vecina.
%e Sembrar por estra en los medios diferenciales empezando por el agar citrato, urea (en la
superficie) , TSI, LlA (introduciendo el asa por el centro hasta tocar el fondo del tubo, retirar por el
mismo trazo y sembrar en estra la parte inclinada), caldo para la prueba de indol, MRVP.
%e
Sembrar por puntura en el centro del agar movilidad hasta una profundidad
aproximada de 1.5 cm.
o0 Incubar a 35 - 3r C de 18 a 24 horas.

6.2.5.2 Lecturas
a) Agar T51
En estos medios se determina la capacidad de la bacteria de utilizar la lactosa, glucosa y sacarosa
(en TSI), con produccin o no de gas y la produccin de cido sulfhdrico.
Lectura
Es importante hacer la lectura entre las 18 - 24 horas para no obtener resultados errneos.
La lectura se hace sobre la base de tres caractersticas: Utilizacin de hidratos de carbono,
produccin de gas y produccin de cido sulfhdrico.

Utilizacin de hidratos de carbono:


Utilizacin de lactosa: Reaccin cida en el pico de flauta (color amarillo) Abreviatura:
(A).
Utilizacin de glucosa: Reaccin cida en la columna del medio (color amarillo)
Abreviatura: (A).
No hay utilizacin del carbohidrato: Se puede observar una reaccin alcalina (color
rojo) o que no hay cambio de color (permanece del mismo color que el medio no
inoculado) Abreviaturas: (K) o (N) respectivamente.

NOTA: Cuando el microorganismo tambin produce H2 S el precipitado negro puede ocultar la acidez.

Produccin de gas de glucosa:


Se considera positivo: Presencia de una sola burbuja de gas, burbujas en el medio,
divisin del medio, desplazamiento completo del medio del fondo del tubo dejando un
rea clara o una ligera muesca del medio en el costado del tubo.
Se registra la lectura por medio de cruces (+).

Produccin de cido sulfhdrico:


Se manifiesta por un color negro distribuido por toda la columna del medio de cultivo o
slo en la parte superior.
Se registra la lectura por medio de cruces (+).

MPR-CNLSP-004

4
4

Instituto Nacional de Salud

Resultados
Ejemplo de simbolizacin e interpretacin:
K/A - + : Significa alcalinidad en la inclinacin y acidez en el fondo (fermentacin de glucosa), gas
negativo y H2S poslivo.
N/N - - : Significa que no hay utilizacin de la lactosa y glucosa ni produccin de H 2S_
Controles

E col (lactosa positivo)


Shigella
Sa/monella paratyphi B

Columna vertical (fondo)

amarillo/ gas
amarillo/sin gas
amarillo/negro/con gas

Superficie inclinada (Pico de flauta)

amarillo
rojo
rojo

Recomendaciones
Si se observa que no hay cambio de color en el tubo hasta las 24 horas seguir incubando hasta las 48
horas, Si no se observa viraje de color y hay desarrollo, se trata de una bacteria no fermentadora
(Foto N 11)_
b)

Agar Lisina Hierro

En este medio se determina simultneamente la produccin de lisina descarboxilasa y de la formacin


de cido sulfhdrico
Lectura
Es importante hacer la lectura entre las 18 - 24 horas; si la lectura se realiza antes podemos obtener
resultados falsos positivos, as como falsos negativos si se lee despus de las 24 horas.
Realizar la lectura en la columna yen la superficie inclinada y observar la formacin de cido
sulfhdrico el cual se evidencia por una coloracin neqra.

NOTA: Generalmente las cepas del grupo Proteus y Providencia, desaminan la lisina a cido cetocartnico. Este ltimo forma compuestos pardo-rojizos en la regin superficial del medio de
cultivo con la sal de hierro y bajo la inftuencia del oxiqeno,
Recomendaciones
No incubar ms del tiempo necesario para no ocasionar una alcalinizacin en la superficie del medio y
por lo tanto producir un viraje hacia el violeta
Controles

E coli
Proteus mirabls
Morganella morgani
(Foto N 12)

Columna vertical (fondo)

amarillo
amarillo y negro
amarillo

Superficie inclinada (pico de flauta)

violeta
rojo-parduzco
rojo parduzco-violeta,

c)

Utilizacin de citrato

Para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como nica fuente de carbono
para su metabolismo.
Procedimiento
0 Incubar a 35 - 3r C 24 horas - 48 horas. En algunos casos es necesario una incubacin hasta
por 4 das.
1 Ver el viraje de color.
Resultados
0 Prueba positiva: Crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta, o presencia de
colonias en ausencia del color azul.
1 Prueba negativa: No se observa crecimiento ni cambio de color (verde).
Controles
Positivo: Enterobacter cloacae
Negativo: Eschercha col
(Foto N 13)
d)

Hidrlisis de la urea (produccin de ureasa)

Es til para determinar la capacidad de un organismo de degradar la urea, formando dos molculas
de amoniaco por accin de la enzima ureasa.
Procedimiento
Realizar la lectura despus de 18 horas - 24 horas de incubacin observando el viraje de color.
Resultados
Prueba positiva: Color rojo rosado intenso en el pico de flauta o todo el agar. Puede haber una
reaccin positiva retardada despus de 24 horas y hasta 6 das de incubacin (algunas cepas de
Klebsella por ejemplo).
Prueba negativa: No se produce cambio de color.
Controles
Negativo. Eschercha col Positivo:
Klebsella pneumonae (Foto N
14)
e)

Rojo de metilo

Permite comprobar la capacidad del microorganismo para producir y mantener estables los
productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa determinando cualitativamente el pH
del medio.

Procedimiento
El caldo debe ser incubado a 35 - 3r C durante 48 a 72 horas.
Aspticamente retirar 2,5 mL de caldo a un tubo estril.
Aadir directamente al caldo 5 gotas del reactivo rojo de metilo (indicador de pH)
Interpretar el resultado del viraje de color inmediatamente
Si la lectura fuera negativa continuar la incubacin para repetir la prueba
NOTA: No debe realizarse la lectura antes de las 48 h de incubacin para evitar resultados
errneos.
El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la produccin de cido es
suficiente como para bajar el pH a 4,4 y es una prueba positiva. Un color naranja (pH 5 a 5,8) indica
una prueba negativa.
Resultados
Prueba positiva: Color rojo
Prueba negativa: Color amarillo o naranja.
Controles
Control positivo: Eschercha col
Control negativo: Klebsella pneumonae
(Foto N 15)

f)

Voges Proskauer

Es til para determinar la capacidad de algunos microorganismos de degradar la glucosa hasta


acetilmetilcarbinol (acetona) a travs de un proceso de fermentacin.
Medios y reactivos
Medio MRVP
a naftol al 5 %
KOH al 40%.
Procedimiento
Incubar por 24 - 48 horas a 35 - 3r C.
Transferir 1 mL de caldo a un tubo de ensayo limpio. Aadir con una pipeta pasteur 0,6 mL de a
naftol al 5 % Y 0,2 mL de KOH al 40%.
Agitar el tubo cuidadosamente (para exponerlo al oxgeno atmosfrico) y dejarlo reposar durante 10
15 minutos.
Resultados
Prueba positiva: Desarrollo de un color rojo - rosado en la superficie del medio.
Prueba negativa: Mantiene su color

Controles
Control positivo: Klebsella pneumonae
Control negativo: Eschercha col
(Foto N 16)
g)

Motilidad (Medios SIM, o MIO o agar movilidad)

Para determinar si un organismo es mvil o inmvil.


Procedimiento
Incubar a 35 - 3r C durante 24 a 48 horas.
Resultados
Positivo: Los microorganismos migran de la lnea de siembra y se difunden en el medio
provocando turbidez. Tambin puede manifestarse semejando "vellosidades" a lo largo del trazo de
siembra.
Negativo: Se observa un crecimiento bacteriano acentuado siguiendo el trazo de siembra, y el
medio circundante se mantiene claro.
Controles
Control positivo: Eschercha col
Control negativo: Klebsella pneumonae
(Foto N 17)
h)

Prueba de indol

Es til para determinar la capacidad de un microorganismo de producir indol a partir del aminocido
triptfano.
Medios y Reactivos
Caldo de triptfano o de peptona o caldo de triptona.
Reactivo de indol de Kovacs.
Procedimiento
a Retirar asptica mente 2 mL de caldo de cultivo con 24 horas de incubacin.
b Agregar 5 gotas de reactivo de Kovacs.
c Mover suavemente el tubo y realizar la lectura.
d Evaluar el cultivo a las 24 horas si la lectura es negativa, deber incubarse otras 24 horas. El
cultivo restante y repetirse la prueba.
Resultados
Prueba positiva: Formacin de un anillo rojo en la superficie del medio (la capa alcohlica) Prueba
negativa: No se produce color en la capa alcohlica, y toma el color del reactivo empleado

Controles
Control positivo: Eschercha col Control
negativo: Klebsella pneumonae (Foto N
18)
i)

Prueba de la B galactosidasa (ONPG)

Es til para demostrar la presencia o ausencia de la enzima p-galactosidasa utilizando el


compuesto orgnico o - nitrofenil - p-D galactopiransido (ONPG) y para diferenciar los
organismos con reaccin retardada a la lactosa de los organismos lactosa negativos.
Reactivo
Discos o tabletas de ONPG.
Procedimiento
Seguir las instrucciones del fabricante.
Resultados
Prueba positiva: Formacin de un color amarillo (formacin de ortonitrofenol a partir del ONPG).
Prueba negativa: No hay cambio de color.

Controles
Control positivo: Eschercha col
Control negativo: Proteus spp
NOTA 1:
b
Todas las Eschercha col producen acidez de glucosa en el TSI o KIA (5% no producen
gas) y un 98% son indol positivo, VP -, MR+ (99%), mviles (95%
c
Todas las Klebsella pneumonae son Indol negativo, ornitina descarboxilasa negativa, no
mviles. VP + (98%), citrato + (98%), urea +(95%), lisina descarboxilasa (98%), gas de
glucosa (97%).
NOTA 2: Si se dispone de los medios y reactivos adicionalmente se pueden realizar pruebas de
produccin de descarboxilasas como:
a
Descarboxilacin de la ornitina (*)
bDescarboxilacin de arginina
(*) Si no se dispone del medio MIO.
j)

Produccin de descarboxilasas

Las pruebas de descarboxilacin se realizan para medir la capacidad enzimtica de un


microorganismo para descarboxilar un aminocido, el que da lugar a una amina, produciendo la
alcalinizacin del medio.

Procedimiento
bInocular el cultivo en dos tubos con caldo descarboxilasa, uno de los cuales deber contener el
aminocido a estudiar
c Cubrir con aceite mineral los tubos e incubar a 35 - 3r C durante 24 - 48 horas.
Lectura
Positivo: Color azul prpura en el tubo que contiene el aminocido
Negativo: Color amarillo
e Anotar los resultados de las pruebas de utilizacin de carbohidratos y produccin de
descarboxilasas.
f Realizar la identificacin de acuerdo a las Tablas N 4, 5, 6.

Tabla 6. Principales caractersticas bioqumicas de Escherichia spp


LAl:T NEIiIH lAGT POSIT
CONTROL IiLUl: POSIT IiLUG POSIT

Prueba
Indol
Rojo de metilo
Voces Proskauer
Citrato (Simmons)
Hidrogeno sulfurado (TSI)
Hidrlisis de urea
Lisina descarboxilasa
Arginina descarboxilasa
Ornitina descarboxilasa
Motilidad
Hidrlisis gelatina (22C)
Acidez O-qlucosa
Gas O-glucosa
Lactosa (fermentacin)
ONPG

E. coli
98
99
O
1
1
1
90
17
65
95
O
100
95
95
95

E. coli inactiva
80
95
O
1
1
1
40
3
20
5
O
100
5
25
45

E. fergusoni
98
100
O
17
O
O
95
5
100
93
O
100
95
O
83

E. hermanni
99
100
O
1
O
O
6
O
100
99
O
100
97
45
98

E. vulneris

O
100
O
O
O
O
85
30
O
100
O
100
97
15
100

Cada nmero representa el porcentaje de reacciones positivas despus de dos das de incubacin a 36C. La
mayora de estas reacciones positivas suceden dentro de las 24 horas. Las reacciones que se vuelven positivas
despus de los dos das no se consideran.
Fuente: Farmer 111 J. Enterobacteriaceae: Introduction and identification. En: Murray PR, Barn EJ, Pfaller MA, Tenover
FC. Yolken RH. Manual of Clinical Microbiology. 7a ed. Washington OC: American Society for Microbiology; 1999. pp
447-458

roSITIVO NEGATIVO

Fofo N8: Colonias de Escherichia coli en agar Me conkey


Fofo N9: Colonias de Klebsiella pneumoniae en agar Me Conkey
Fofo NlO: Colonias de Enterobacter cloacae en agar Me Conkey
Fofo Nn: Reacciones bioqumicas en el agar TSI

AGAAMlO
POSIT
NEGAr

VP P05lT
VP IlEGAl

NEGATIVO
POSITIVO

Fofo N12: Reacciones bioqmicas en el agar LIA


Fofo N13: Reaccin bioqumicas en el agar citrato.
Fofo N14: Produccin de ureasa.
Fofo N15: Prueba del Rojo de metilo.

NEGAr

6.3
6.3.1
PRUEBA

IDENTIFICACiN DE BACILO GRAM NEGATIVO NO FERMENTADOR: Pseudomonas


Tabla 8. Principales caractersticas bioqumicas de Enterobacter spp
aeruginosa
Tabla 7. Principales caractersticas bioqumicas de Klebsiella
Objetivo

E. aerogenes

E.

E. grupo

E.

E.

E. taylonae

E.

E. asburiae

ornthnolytca

plantcola

E.

E.

Describir
los procedimientos
de identificacin
de Pseudomonas
aerugnosa por medio de
pruebas hormaechi
cloacae
agglomerans gergovia
amnigenus
amnigenus
e sakazakii
biogrupo 1
biogrupo 2
bioqumicas.
Prueba
K.
K.
K.
K.
K.
K.
20

pneumonae

oxytoca
11

ozaeneae

rhnoscleromats

E.
intermedium

O
O
O
O
O
O
O
O
O
6.3.2
Condiciones
generales
Indol
100 7
20 100
O 65
5
5
50
5 O
5 99
5
57 O
100
98 de metilo100
70
10010
100
100
100100
100
Rojo
20
96 100 100 2
98 100
95 Pseudomonas
100
50
99
99
100
96
65
aerugnosa
es fcilmente
reconocida
en medios
primario por
sus
Voges
Proskauer
98
95
70 de70aislamiento
98 100
O 100
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
caractersticas:
Citrato (Simmons)
98
95
100
100
30
O
2
65
93 O
1 O
1
87 O
O
Hidroqeno
sulfurado
(TSI)20
O O
O 60
O O
98 Morfologa
90
O de la colonia
O
O 90
O
O O
O
Hidrlisis
de urea
95
100 O
98 O
10 O
97 de pigmentos
99 presentes
94
9
21
35
78
O
O
O
O
Produccin
difusibles
si
estn
Lisina
100 55
100 95
40 100
98 descarboxilasa
96
10098
9199
99
91 O
89
O
caracterstico.
97 Olor
95
85
90 O
96 O
99
52 O
89
Arqinina
descarboxilasa
O 92
O O
O 100
2
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
Ornitina descarboxilasa
100
3
O
O
O
O
6.3.3
Identificacin
Motilidad
O 100
O 100
O 100
100
100
100
100 O
100 O
100
100 O
100
100
100 (22C) 20
98 O
98 O
100
100
95
100
83 O
100
Hidrlisis
qelatina
O
O
O
6.3.3.1
95 Morfologa
93 de las colonias
40
55
99
10
70
75
35
9
100
Acidez O-glucosa
100
100
100
100
100
100
100
99
90
97
100
100
91
100
100
95
100
Gas O-glucosa
97
97
100
100
50
O
Las colonias
generalmente
sondas
planas,
algo extendidas,
bordes aserrados
y tienen positivas
un brillosuceden
metlicodentro de las 24 h, las
Cada nmero es el porcentaje de reacciones
positivas
despus de dos
reacciones
Lactosa (fermentacin)
98de incubacin
100 a 36C. La mayora
100 de estas100
30
O
Nde19).
reacciones que se vuelven positivas (Foto
despus
los dos das no son consideradas.
ONPG
99
100
100
100
80
O
NOTA: Algunas cepas de P. aerugnosa pueden no producir pigmentos, frecuentemente estas cepas son
Fuente: Farmer 111 J. Enterobacteriaceae: Introduction and identification. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH. Manual of Clnical Microbiology.
bastante mucoides y1999.
se aislan
a partir de muestras de secreciones respiratorias de pacientes con fibrosis
7a ed. Washington OC: American Society
447-458.
Cada nmeroforesMicrobiology;
el porcentaje depp
reacciones
positivas despus de dos das de incubacin a 36 C. La mayora de
qustica.
estas reacciones positivas suceden dentro de las 24 horas. Las reacciones que se vuelven positivas despus de
los dosDeterminacin
das no se consideran.
6.3.3.2
de las caractersticas bioqumicas
Indol
Rojo de metilo
Voqes Proskauer
Citrato (Simmons)
Hidrogeno sulfurado
(TSI)
Hidrlisis de urea
Lisina descarboxilasa
Arginina
descarboxilasa
Ornitina
Motilidad
Hidrlisis gelatina
(22C)
Acidez O-glucosa
Gas O-Glucosa
Lactosa
(fermentacin)
ONPG

Fuente: Farmer 111 J. Enterobacteriaceae: Introduction and identification. En: Murray PR, Barn EJ, Pfaller MA, Tenover FC.
Identificada la colonia sospechosa. Realizar las siguientes pruebas:
Yolken RH. Manual of Clinical Microbiology. 7a ed. Washington OC: American Society for Microbiology; 1999. pp 447- 458.

d Utilizacin de lactosa
e
Utilizacin de
glucosa e) Prueba de
oxidasa
o0 Crecimiento a 42 C
o1 Utilizacin
Reduccin de
de citrato
nitrato

Hidrlisis de la gelatina
g)
6.3.4.3 Procedimiento
0 Identificar la colonia sospechosa que se encuentra en la placa de agar Mc Conkey.
0
Esterilizar al rojo vivo el asa de siembra recta en un mechero de
Fofo
Prueba
de Voges proskauer.
Bunsen. e)N16:
Enfriar
el asa.
N17: Prieba
de movilidad.
%Fofo
la Obtener
la colonia
seleccionada con el asa recta, tratando de no tocar el fondo del medio de
Fofo
N18:
Prueba
de vecina.
indol.
cultivo
ni otra
colonia
%lb Sembrar por estra en los medios diferenciales empezando por el agar citrato (en la superficie),
TSI, LlA (introduciendo el asa por el centro hasta tocar el fondo del tubo, retirar por el mismo trazo y
sembrar en estra la parte inclinada), caldo para la prueba de indol y caldo nitrato.
D Sembrar por puntura en el centro del agar gelatina (hasta una profundidad de 1,5 cm - 2,5 cm) y
agar movilidad hasta una profundidad aproximada de 1.5 cm.

%lb Quemar el asa y dejar enfriar.


%lc Con el asa recta obtener la misma colonia trabajada y cogerla tratando de no tocar el fondo del
medio de cultivo ni otra colonia vecina y sembrar haciendo pequeos trazos en el extremo de dos
placas de TSA o Mueller Hinton (sembrar solo una placa de TSA o Mueller Hinton si no se dispone
de incubadora a 42 C).
%ld Utilizando un asa de siembra en aro estril y tomando como referencia central el inoculo de la
colonia, realizar la siembra por dispersin agotamiento en los cuadrantes de la placa.
%le Incubar a 35 - 3r C de 18 a 24 horas a excepcin de una placa de TSA que debe ser incubada
a 42 C.
NOTA: De no disponer de estufa a 42 C, una alternativa es utilizar un bao mara graduado a 42
C y sembrar el cultivo en estudio en TSB o BHI e incubarlo de 18 a 24 horas.
6.3.4.4 Lecturas
a)

Agar TSI

Seguir los pasos descritos en el Procedimiento IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM


NEGATIVOS FERMENTADORES: Eschercha coH, Enterobacter y K. pneumonae.
P. aerugnosa da una reaccin: K/K o N/N y no hay produccin de sulfuro de hidrgeno.
(Foto N 20)
b)

Prueba de utilizacin de citrato

Procedimiento
Seguir los pasos descritos en el Procedimiento IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM
NEGATIVOS FERMENTADORES: Eschercha coH, Enterobacter spp y K. pneumonae.
NOTA: 95% de cepas de P. aerugnosa son positivos.
c)

Prueba de hidrlisis de la gelatina

Determina la capacidad de un microorganismo de producir gelatinasas (enzimas de tipo


proteoltico) que lican la gelatina.
Medio
Gelatina nutritiva pH 6,8
Procedimiento
Utilizando una asa de siembra en punta y a partir de un cultivo puro de 18 a 24 horas coger un
inculo abundante y hacer una puncin en el centro y en forma vertical en el medio de gelatina
hasta una profundidad de 1.5 a 2.5 cm.
Utilizar un tubo con medio de gelatina sin inocular como control de la prueba.
Incubar los cultivos en estudio y de control a 22 - 25 C por 24 - 48 horas y hacer la lectura.
Evaluar diariamente el cultivo durante 14 das.

Al trmino de cada perodo de 24 horas colocar el tubo control y el de estudio en el refrigerador o en


un recipiente con hielo durante 2 horas aproximadamente para determinar si se ha producido o no
la digestin de la gelatina (licuefaccin).
Realizar las lecturas observando si hay crecimiento (turbidez) y licuefaccin.
Controles
Positivo : Serrata marcescens
Negativo: E.col
Resultados
Positivo : medio de cultivo semilquido.
Negativo: medio de cultivo slido.
Recomendaciones

En todos los ensayos debe prepararse un tubo control (sin inoculacin del microorganismo). Pasar
los tubos de la incubadora al refrigerador sin agitarlos para evitar resultados falsos negativos
(Foto W 21).
d)

Prueba de reduccin de nitrato a nitritos

Se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de reducir el nitrato a nitritos o en


nitrgeno libre.
Medios y reactivos
Caldo con nitrato: pH 7
Reactivo A (Ver anexo C)
Reactivo B (Ver anexo C)
Polvo de zinc
Procedimiento
Incubar a 35 - 3r C por 12 a 24 horas. Puede requerir una incubacin hasta 5 das pero no es
frecuente.
Agregar directamente al caldo de cultivo, 1 gota del reactivo A y 1 gota del reactivo B.
Resultados
%ld Primera prueba:
Positivo: cambia a un color rojo dentro de 30 - 60 segundos (prueba completa).
Negativo: no cambia de color.
%lg Segunda prueba:
Agregar aproximadamente 20 mg de polvo de zinc, y observar el color en el trmino de 5 - 10
minutos.
Positivo: no hay desarrollo de color. El nitrato ha sido reducido a nitrgeno libre. (ausencia de
nitrito en el medio).
Negativo: color rosado a rojo intenso, el nitrato no fue reducido por el organismo (el zinc
redujo el nitrato en nitrito).

Controles
Un medio sin inocular (para determinar si hay nitrito en el medio) y un control positivo, ambos
tratados en las mismas condiciones que para el tubo con la muestra problema.
Control positivo: Eschercha col
Control negativo: Acnetobacter calcoacetcus (Foto N 22).
e)

Prueba de la oxidasa

La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la


oxidacin del citocromo reducido por el oxgeno molecular, el que a su vez acta como aceptor de
electrones en la etapa terminal del sistema de transferencia de electrones. Con esta prueba se
determina la presencia de la enzima oxidasa.
Reactivos
N,N,N,N, tetrametil-p fenilenediamina o
N,N, dimetil-p fenilenediamina Solucin acuosa al1 %
Procedimiento
Se trabaja a partir del crecimiento bacteriano en TSA o Mueller Hinton. Humedecer
un trozo de papel de filtro con el reactivo dentro de una placa petri.
Con la ayuda de un mondadiente o un asa de platino o aluminio (el nicrn u otro material de las
asas que contienen fierro pueden causar reacciones falsas positivas) se coge la colonia a probar
y se coloca extendindola sobre el papel filtro.
Controles
Positivo : P. aerugnosa
Negativo: E. col
Resultados
Positivo: Viraje de color hacia el azul -violeta (con el reactivo N, N, N, N, tetrametil-p fenilenediamina) o prpura (con el reactivo N, N, dimetil-p fenilenediamina) despus de 10 - 15
segundos.
Negativo: No hay viraje de color (Foto N 23)
Alternativamente una solucin de reactivo al 0.5% puede ser goteado directamente sobre la
colonia.
NOTA: De no ser posible preparar los reactivos, se debe adquirir las tiras comerciales. El 99% de
cepas de P. aerugnosa son oxidasas positivas.

f)

Crecimiento a 420 C

Luego del perodo de incubacin observar si hay desarrollo del cultivo en estudio.

Resultados
Todas las cepas de P. aerugnosa crecen a 42 C.
g)

Produccin de pigmentos

Despus del perodo de incubacin, realizar la lectura verificando la produccin de algn pigmento
en el TSA o agar Mueller Hinton.
P. aerugnosa produce pigmentos: verdoso o azul verdoso brillante, rojo o marrn. Ocasionalmente
algunas cepas de P. aerugnosa solo producen pioverdina siendo difcil su diferenciacin de otras
P. seudomonas como P. fIIuorescens o P. putda, sin embargo se puede diferenciar de las otras
especies por la temperatura de crecimiento (42 C) (7).
Lectura:
Si no se observara pigmento dejar la placa incubando a temperatura ambiente y realizar la lectura
a las 48 horas
(Foto
Foto N
19 N 24).
6.3.4.5 Resultados
Realizar la lectura e identificar la especie de acuerdo a la Tabla 7.
NOTA: Si se dispone de estufa a 42 C o bao mara graduado a 42 C para la identificacin de P.
aerugnosa, es suficiente realizar las pruebas de: oxidasa, cultivo en TSI, crecimiento a 42 C y
demos-tracin de produccin de pigmento verde-azulado, rojo o marrn en el agar TSA o Mueller
Hinton (7)

Tabla 9. Caractersticas de P. aeruginosa y otras Pseudomonas que producen pigmento,


encontradas en muestras clnicas

Prueba
Oxidasa
Crecimiento en:
Agar Mc Conkey
42C
Reduccin de nitrato
Pioverdina
Indol
Hidrlisis de la
Gelatina
Citrato de Simmons

P.aeruginosa
99

P. fluorescens
97

P. putida
100

100
100
98
65
O
82

100
O
19
96
O
100

100
O
O
93
O
O

95

93

94(6)

Porcentaje de cepas positivas


Porcentajes en parntesis representan cepas con reacciones retrasadas
Fuente: Kiska O, Gilligan P. Pseudomonas. En: Murray PR, Barn EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH. Manual
of Clinical Microbiology. 7a ed. Washington OC: American Society for Microbiology; 1999. pp 517 - 525.

c5C!J
POSITIVO

Foto N 22

Foto N 23

Foto N 21

Fofo N19: Colonias de Pseudomonas aeruginosa en agar Mac conkey.


Fofo N20: Reaccin bioqumica de P. aeruginosa en el agar TSI.
Fofo N21: Hidrolisis de la gelatina

Referencias:

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

Lauderdale T, Chapin K, Murray P. Reagents. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH.
Manual of Clnical Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for Microbiology; 1999. pp 1665
-1673.
Kloos W, Bannerman T. Staphylococcus. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH.
Manual of Clnical Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for Microbiology; 1999. pp 264 -282.

Koneman E, Allen S, Dowell V, Sommers H. Diagnstico microbiolgico. Editorial Mdica Panamericana. 3a


ed. 1992, Buenos Aires.
Mc Faddin J. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. Mxico
DF:Editorial Mdica Panamericana .. 1991
Facklam R, Sahm D, Martins L. Enterococcus. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH.
Manual of Clnical Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for Microbiology; 1999. pp 297 305
Lauderdale T, Chapin K, Murray P. Reagents. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH.
Manual of Clnical Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for Microbiology; 1999. pp 1665
-1673.
Kiska D, Gilligan P. Pseudomonas. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH.
Manual of Clnical Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for Microbiology; 1999. pp 517 -525.

Foto N 24

Fofo N22: Prueba de reduccin del Nitrato.


Fofo N23: Prueba de la oxidasa.
Fofo N24: Produccin de pigmento en P. aeruginosa.

PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA POR EL METODO DE DISCO DIFUSION


Las diferentes especies y cepas de un microorganismo tienen grados variables de susceptibilidad a los
antimicrobianos, adems esta susceptibilidad puede cambiar especialmente durante el tratamiento. Es por eso
que en un proceso infeccioso es importante que el clnico conozca adems de la identidad del microorganismo,
los antimicrobianos a los cuales es sensible para brindar un eficaz tratamiento. Esta informacin la debe dar el
microbilogo haciendo un diagnstico preciso y determinando la susceptibilidad del microorganismo a varios
antimicrobianos .
Para determinar la susceptibilidad a los antimicrobianos de las diferentes especies y cepas de un
microorganismo se aplica el mtodo de disco difusin el mismo que se describe en el documento M2-A7.17 (1)
2000 NCCLS Performance standard for antimicrobial disk Susceptibility Test: Approved Standard ro Ed.,
complementada con las Tablas descritas en el documento M100-S11 (M2) 2001 NCCLS Disk Diffuson
Supplemental Tables.
Nota: Solicitar al proveedor de los discos de susceptibilidad un certificado de calidad expedido por el Centro de
Control de Calidad delINS.

CONTROL DE CALIDAD
El propsito de llevar a cabo el control de calidad en el laboratorio de microbiologa es asegurar al mdico y al
paciente un diagnstico confiable y oportuno mediante el monitoreo de la exactitud, precisin, calidad de los
reactivos y pruebas realizadas, as como el desempeo laboral del personal de laboratorio.
Control interno de la calidad
Los colorantes y reactivos usados para la identificacin bacteriana deben probarse inmediatamente
despus de la preparacin y peridicamente para evaluar las caractersticas de tincin esperadas y la
correcta reactividad de los medios apropiados con cepas referenciales o de reactividad conocida.
Debe llevarse un registro del control de calidad de los medios de cultivo, colorantes y reactivos en el
que se incluya: fecha, nmero de controlo lote, control positivo y negativo utilizado, resultados de la
prueba y nombre de la persona que realiz la prueba. Los registros deben estar a disposicin de todo el
personal del laboratorio.
Es necesario llevar registros de temperatura y de mantenimiento de los equipos para documentar el
correcto funcionamiento de los mismos y demostrar que los hallazgos de laboratorio constituyeron
realmente determinaciones vlidas.
Para asegurar la confiabilidad del diagnstico microbiolgico de las infecciones intrahospitalarias se
realiza la verificacin del cumplimiento de las especificaciones contenidas en el presente Manual de
Procedimientos.
Se verifica el cumplimiento de la frecuencia programada para controlar el estado de calibracin de los
equipos y los medios de medicin.

En caso de identificarse disconformidades en la aplicacin de las especificaciones, se informa al personal


responsable del laboratorio, quien decide la adopcin de medidas correctivas necesarias y la
identificacin de las causas.

REGISTROS
La aplicacin de las disposiciones contenidas en el presente Manual exige la generacin, uso y
conservacin de registros necesarios para demostrar el cumplimiento de las especificaciones y
requisitos que aseguran la confiabilidad y garanta de los diagnsticos de las infecciones
intrahospitalarias.

El personal directivo del establecimiento de salud determina el periodo de conservacin de los


diferentes registros. Este periodo es definido por las disposiciones contenidas en la reglamentacin
aplicable al establecimiento de salud.
Los principales registros generados en la aplicacin del presente manual son los siguientes:
Formulario de solicitud de examen.
Rotulado de la muestra.
Registro de la muestra en el laboratorio.
Datos de las lecturas de las pruebas realizadas y reporte del diagnstico.
Lectura de los halos de inhibicin (mm) de las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana.
Registros de los controles de calidad.
Registros del control de operacin de los equipos.
Registros de calibracin y mantenimiento de equipos y medios de medicin.

Formulario de solicitud de examen


El formulario de sol icitud de examen, debe ser llenado con letra clara y es firmado por la persona que
tom la muestra e incluye los siguientes datos:
%la Fecha de solicitud.
%le Nombre, edad y sexo del
paciente. e) Nmero de cama (cuarto o
sala).
%ld Tipo de muestra.
%la Examen
solicitado. Sospecha
clnica.
%le Enfermedad de base.
%lf Informacin sobre uso de
antimicrobianos.
%lg Hora de la obtencin de la muestra(*).
%lh Mdico solicitante.
%li Responsable de la obtencin de la
muestra.

%ld Para infecciones del torrente sanguneo se registra la temperatura del paciente al
momento de la obtencin de muestra. En caso de muestra seriadas, indicar si es primera,
segunda o tercera muestra. (Ej. Hemocultivo, urocultivo y otros.)
(*) Es un dato bastante importante en el control de la calidad y anlisis de la viabilidad de la
muestra.
9.5

Rotulado de la muestra
El personal responsable de la obtencin de muestra se asegura de identificar las muestras con los
datos de los pacientes. Cada muestra se rotula con la siguiente informacin:
%la
%lb

Cdigo de identificacin del paciente


Tipo de muestra
e) Fecha y hora
d) En infecciones del torrente sanguneo anotar el nmero de
hemocultivo tomado.

BIBLlOGRAFIA

%lb Chapin K, Murray P. Stains. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH. Manua/of
Clinical Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for Microbiology; 1999. pp 1674 -1686
%ld Chapin K, Murray P. Media. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH. Manua/of
Clinical Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for Microbiology; 1999. pp 1687- 1707
%lg Facklam R, Sahm D, Martins L. Enterococcus. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC.
Yolken RH. Manual of Clnical Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for Microbiology;
1999. pp 297 - 305
%la Farmer 111 J. Enterobacteriaceae: Introduction and identification. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA,
Tenover FC. Yolken RH. Manual of Clnical Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for
Microbiology; 1999. pp 447- 458
5.

Finegold S, Ellen Baron. Diagnostic Microbiology. The C.V. Mosby Company 1986. USA

%le Holt JG, Krieg NR, Sneath PH, Staley JY, Williams ST. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.
9a ed. Baltimore: Library of Congress Cataloging.in Publicatiion Data; 1994
%ld Instituto Nacional de Salud - Centro Nacional de Laboratorios de Salud Publica. Manual de normas de
bioseguridad. Serie de Normas Tcnicas W18. Lima. 1997
%la Instituto Nacional de Salud - Centro Nacional de Laboratorios de Salud Publica. Manual de
Procedimientos Laboratorios para la obtenGn y envo de muestra (1). Serie de Normas Tcnicas
W15.Lima.1997
%le Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnstico de infecciones
respiratorias agudas. Curso Terico Prctico. En: Diagnstico de laboratorio de infecciones respiratorias
agudas y entero virus. Lima. 1999
%ld Isenberg HD. Vol 1: Clnical Microbiology Procedures handbook. Washington DC: American Society for
Microbiology; 1992
o0 Jorgensen J, Turnidge J, Washington J. Antimicrobial Susceptibility testing: Dilution and disk diffusion
methods. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH. Manual of Clnical Microbiology. 7a
ed. Washington DC: American Society for Microbiology; 1999. pp 1526 -1543
gl

Kloos W, Bannerman T. Staphylococcus. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH.
Manual of Clnical Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for Microbiology; 1999. pp 264 282

al

Kiska D, Gilligan P. Pseudomonas. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH.
Manual of Clnical Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for Microbiology; 1999. pp 517 525

el

Koneman E, Allen S, Dowell V, Sommers H. Diagnstico microbiolgico. Editorial Mdica Panamericana. 3a


ed. 1992, Buenos Aires

dl

Lauderdale T, Chapin K, Murray P. Reagents. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC.
Yolken RH. Manual of Clnical Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for Microbiology;
1999. pp 1665 -1673

el

Mc Faddin J. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. Mxico


DF:Editorial Mdica Panamericana 1991

o0 Miller J. Michael, Holmes H. Specimen collection, transport and storage. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller
MA, Tenover FC. Yolken RH. Manual of Clnical Microbiology. 7a ed. Washington DC: American Society for
M icrobiology; 1999. pp 33 - 63
gl

Ministerio de salud. Protocolo: Estudio de prevalencia de infecciones intrahospita/arias. Documento tcnico


(OGE - RENACE / VIG. HOSP. DT 001-99V.1 )1999/ Lima Per

al

Ministerio de Sade. Vigilncia Epidemiolgica por componentes NNIS. Ttulo original: National
Nosocomiallnfection Surveillance System (NNIS) Information packet. 1994. Brazil

el

NCCLS. Performance standards for antimicrobial disk Susceptiblty Test: Approved Standard. yo Ed M2- A7.
17(1) 2000

21. NCCLS Disk Diffusion Supplemental tables M1 00-S11. 21 (1) 2001


dl

OPS. Vol IV Manual de prevencin y control de infecciones hospitalarias. Serie HSP/ Manuales Operativos
Paltex. W 13, USA. 1996

el

Reisner B, Woods G, Thomson R, Danse L, Garca L , Shimizu R. Specimen processing. En: Murray PR,
Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH. Manual of Clnical Microbiology. 7a ed. Washington DC:
American Society for Microbiology; 1999. pp 64 - 104

SCIHSCSP, 1997 En: Miller J.M. A guide for specimen management in clnical microbiology. American
Society for Microbiology: USA. 1996

25. Tenover F, Mc Gowan J. Antibacterial resistance. Inf Dis Clin N Am.1997, Vol 11 (4): 757 - 887

ANEXO A
PRUEBAS BIOQUIMICAS: RECOMENDACIONES
A.1

PRUEBA DE CATALASA

A .. 1.1 Reactivo
Perxido de hidrgeno 3%
A .. 1.2 Recomendaciones
0
1

A.2

Conservar el frasco de perxido en frasco color caramelo y evitar exponerlo innecesariamente a


la luz. De preferencia mantenerlo refrigerado.
Peridicamente el perxido de hidrgeno debe ser controlado con cultivos positivos y negativos
conocidos, antes de su uso.

PRUEBA DE COAGULASA:

A .. 2.1 Reactivo: Plasma de conejo deshidratado


A .. 2.2 Recomendaciones:
0

Guardar las ampollas, bien cerradas y refrigeradas para mantener su estabilidad. Es


recomendable no conservar el plasma reconstituido pasado el da de su uso, pero cuando sea
necesario es preferible congelarlo (-20 C) durante algunos das pero siempre se tienen que
hacer pruebas de control de calidad antes de su empleo.

A.3

PRUEBA DE OXIDASA

A.3.1

Reactivos
N,N,N,N, tetrametil-p fenilenediamina, o
N,N, dimetil-p fenilenediamina

A.3.2

Solucin acuosa a11%

Recomendaciones
El reactivo puede crear sensibilidad en la piel e inclusive ser carcinognico.

A.4

AGAR BILIS ESCULlNA

A.4.1

Preparar el medio de acuerdo a las indicaciones del fabricante, calentando suavemente la solucin.
al
bl
cl
dl

MPR-CNLSP-004

Colocar 5 mL aproximadamente en un tubo con tapa de rosca (16 mm x 125 mm).


Autoclavar a 121 C, 15 libras / pulg2, 15 minutos.
Enfriar manteniendo el tubo inclinado de tal manera que se obtenga una buena superficie en pico
de ftauta).
Conservar refrigerado (4 - 10 C).

6
9

Instituto Nacional de Salud

ANEXO 8
METODO DE COLORACION DE GRAM
8.1

FIJACION DE LA MUESTRA:
Los frotis pueden ser fijados al calor o con metanol.

8.1.1

Al calor
Dejar secar el frotis en una superficie plana.
Un vez seco pasarlo dos o tres veces por la llama del mechero. No sobrecalentar. Dejar
enfriar la lmina antes de colorear.

8.1.2

Metanol:
La fijacin por metanol previene la lisis de los glbulos rojos brindando una visualizacin mas clara del
campo. Tambin previene el arrastre de las muestras de orina.
Dejar secar el frotis en una superficie plana.
Colocar unas cuantas gotas de metanol y dejar un minuto. Eliminar el restante y secar la lamina al aire.
No usar calor antes de colorear.

8.2

PREPARACION DE COLORANTES

8.2.1

COLORACiN GRAM DE HUCKER

8.2.1.1 Cristal violeta

Cristal violeta: solucin stock

Cristal violeta (90 a 95% contenido del colorante)


Etanol 95%

40 g
400 mL

Disolver y mezclar
Almacenar en un frasco oscuro
Rotular con fecha de un ao de expiracin
Almacenar a temperatura ambiente

Solucin de oxalato de amonio (1%)

Oxalato de amonio (grado reactivo)


Agua destilada

16 g
1600 mL

Disolver y mezclar en una frasco oscuro


Rotular con fecha de un ao de expiracin
Almacenar a temperatura ambiente

Cristal violeta: Solucin de trabajo

Solucin stock de cristal violeta


Solucin de oxalato de amonio (1 %)

MPR-CNLSP-004

40 mL
160 mL

7
0

Instituto Nacional de Salud

Filtrar la solucin stock de cristal violeta en una botella de vidrio. Una vez que ha filtrado
completamente, filtrar a continuacin la solucin de oxalato de amonio.
Rotular con la fecha de expiracin mas prxima de cualquiera de la soluciones stock.
8.2.1.2 Lugol de Gram
1 gr 2 gr
300 mL

Cristal de yodo
Yoduro de potasio
Agua destilada

Mezclar los cristales de yodo con el yoduro de potasio en un mortero.


Agregar el agua destilada en pequeas cantidades.
Depositarlo en un frasco de vidrio oscuro.
Rotular con fecha de 6 meses de expiracin.
Almacenar a temperatura ambiente
Precaucin:
El yodo y yoduro de potasio son corrosivos. Evitar la inhalacin, ingestin o contacto con la piel.
8.2.1.3 Decolorante: alcohol- acetona (1 :1)
500 mL
500 mL

Etanol 95%
Acetona
Mezclar el Etanol con la acetona Depositarlo
en un frasco de vidrio oscuro. Rotular con
fecha de un ao de expiracin. Almacenar a
temperatura ambiente
8.2.1.4. Colorante de contraste: Safranina
Safranina (certificada)
Etanol (95%)

2.5 gr
100 mL

En un mortero disolver 0,25 g de la safranina (certificada) en 10 mL de etanol (95%), seguidamente


agregarle 90 mL de agua destilada.
Almacenar la solucin preparada en un frasco oscuro.
8.2.1.5. Decolorante: alcohol- acetona (1:1)
500 mL
500 mL

Etanol 95%
Acetona
Mezclar el Etanol con la acetona Depositarlo
en un frasco de vidrio oscuro. Rotular con
fecha de un ao de expiracin. Almacenar a
temperatura ambiente
8.2.1.6 Procedimiento

Preparar un extendido fino del material en estudio y dejarlo secar al aire.

MPR-CNLSP-004

71

Instituto Nacional de Salud

Fijar el material al portaobjeto de modo que no sea arrastrado durante el proceso de tincin, pasando
rpidamente el portaobjeto 3 o 4 veces por la llama del mechero o con metanol y dejar secar.
Colocar el preparado sobre un soporte de tincin y cubrir la superficie con solucin de cristal violeta ..
Colorear un minuto y lavar con agua de cao.
Cubrir la lmina con lugol de Gram durante un minuto. Lavar nuevamente con agua.
Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el ndice y baar la superficie con unas gotas de alcohol
acetona hasta no arrastrar ms colorante violeta. Generalmente requiere de unos diez segundos o
menos.
Lavar con agua de cao y colocar nuevamente el portaobjeto sobre el soporte.
Cubrir la superficie con safranina durante un minuto. Lavar con agua de cao.
Dejar secar la lmina.
Examinar la lmina coloreada al microscopio con objetivo 100 x de inmersin (aceite).

B.2.2

COLORACION GRAM - MODIFICACiN DE KOPELOFF

B.2.2.1. Cristal violeta alcalino


(1) Solucin A
Cristal Violeta
Agua destilada

10 g
1000 mL

Disolver el colorante en el agua destilada.


Almacenar en un frasco color mbar. Rotular con fecha de un ao de expiracin.
Almacenar a temperatura ambiente.
(2) Solucin B: Bicarbonato de sodio

50 g
1000 mL

Bicarbonato de sodio
Agua destilada

Disolver el bicarbonato en el agua. Rotular con fecha de un ao de expiracin.


Almacenar a temperatura ambiente.
B.2.2.2. Solucin de Lugol
4g
25 mL
20 g
1g
925 mL

Hidrxido de sodio
Agua destilada
Cristales de yodo
Yoduro de potasio
Agua destilada

Disolver el hidrxido de sodio en 25 mi de agua destilada en un frasco oscuro.


Agregar el yodo, yoduro de potasio y disolverlos bien.
Gradualmente agregar 975 mi de agua destilada, mezclando bien despus de cada adicin.
Precaucin:
El yodo y yoduro de potasio son corrosivos. Evitar la inhalacin, ingestin o contacto con la piel.

7
2

8.2.2.3. Decolorante
Etanol 95%
Acetona

700 mL
300 mL

Combinar y mezclar en un frasco color mbar. Rotular con fecha de un ao de expiracin.


Almacenar a temperatura ambiente.
Precaucin:
El etanol y la acetona son inftamables.
8.2.2.4. Colorante de Contraste: Safranina
Safranina 0, certificada
Etanol 95%
Agua destilada

20 gr
100 mL
1000 mL

En un frasco de un litro agregar solo suficiente etanol para disolver la safranina (aproximadamente 50 mL).
Agregar agua destilada a la solucin de safranina,
Rotular con fecha de un ao de expiracin.
Almacenar a temperatura ambiente.
8.2.2.5. Procedimiento de la coloracin:
Cubrir el frotis con la solucin A. Agregar aproximadamente 5 gotas de la solucin B.
Colorear 2 - 3 minutos cuidando que no se seque.
Enjuagar completamente con la solucin de lugol y descartar.
Agregar mas solucin de lugol para que cubra la lmina y dejarlo por 2 minutos.
Manteniendo la lmina en posicin inclinada agregar el decolorante y enjuagar inmediatamente.
Colorear con safranina al menos 30 segundos.
Enjuagar con abundante agua de cao.
Dejar secar.

ANEXOC
MEDIOS: PREPARACION y RECOMENDACIONES
AGAR CITRATO DE SIMMONS
dl
el
fl
gl
hl
il

Preparar de acuerdo a las indicaciones del fabricante.


Calentar suavemente hasta su disolucin.
Colocar aproximadamente 4 a 5 mL en cada tubo.
Autoclavar a 121 C, 15 libras / pulg2 por 15 minutos.
Dejar que el medio solidifique en posicin inclinada, con poca profundidad en pico de flauta.
Refrigerar para su conservacin (4 - 10 C).

AGAR KLlGLER Y AGAR HIERRO TRIPLE AZUCAR


al
bl
cl
dl

Preparar ambos medios de acuerdo a las indicaciones del fabricante.


Distribuir aproximadamente 5 mL en tubos de 13 x 100 preferentemente.
Autoclavar a 121 C, 15 libras / pulg2 por 15 minutos.
Enfriar en posicin inclinada (pico de ftauta) con una capa basal profunda.

AGAR LlSINA HIERRO


dl Preparar de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
el Autoclavar a 121C, 15 libras / pulg2 por 15 minutos
fl Distribuir aproximadamente 5 mL en tubos de 13 x 100. Dejar enfriar en posicin inclinada, para
producir una columna de aproximadamente 3 cm de altura y sobre ella, una superficie inclinada de
por lo menos la misma longitud.
AGAR UREA DE CHRISTENSEN: Produccin de ureasa
Medio: Agar urea de Christensen
Preparar de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
Autoclavar a 121 C, 15 libras / pulg2 por 15 minutos. Enfriar hasta 50 C.
Aspticamente agregar al agar 100 mL de urea estril.
Distribuir el medio aspticamente en tubos estriles, aproximadamente 4 mL por tubo. Solidificar
en posicin inclinada formando un pico de ftauta largo, con la capa profunda reducida.
Conservar en refrigeracin (4 - 10 C).

0 Urea:
- Pesar 20 g en 100 mL de agua destilada o desmineralizada.
- No calentar la solucin. Esterilizar por filtracin (utilizar filtro de membrana Millipore,
dimetro del poro 0.45Ilm).
- De no contar con los filtros se puede esterilizar la urea por tindalizacin.
CALDO DESCARBOXILASAS: Caldo descarboxilasa de Moeller
0 Preparar el medio de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
1 Para determinar la actividad descarboxilasa de un determinado aminocido, se agrega al caldo base
en concentracin de 1%. (L(+) lisina, o L(+) ornitina, o L(+) arginina).

0
1
2

Generalmente no es necesario ajustar el pH cuando se emplea L arginina o L lisina, pero con la L


ornitina hay que hacer el ajuste antes de la esterilizacin. El ph final debe ser de 6.8 0.2.
Repartir en tubos de 4 mL a 5 mL en tubos de tapa rosca y autoclavar.
Conservar refrigerado (4 - 10 C).

CALDO MR VP
Prueba de rojo de metilo
Reactivos

Indicador de pH rojo de metilo:


Rojo de metilo
Alcohol etlico 95
Agua destilada
Disolver el rojo de metilo en el alcohol. Agregar el
agua destilada a la mezcla anterior. Guardar el
reactivo refrigerado.

0.1 g
300 mL
200 mL

Medio MRVP
Preparar el medio de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
Calentar suavemente hasta su disolucin
Distribuir aproximadamente 5 mL en tubos (13 x 100 de preferencia).
Autoclavar a 12 C, 15 libras / pulg2, 15 minutos.
Conservar refrigerado 4 a 10 C.
Recomendaciones
La peptona del medio puede afectar los resultados de la prueba, por eso es importante realizar el control de
calidad utilizando las cepas de control.
Prueba de Voges-Proskauer
Medios y reactivos
Medio MRVP
Preparar el medio de acuerdo a las indicaciones del fabricante. Distribuir
aproximadamente 5 mL en tubos (13 x 100 de preferencia). Autoclavar a
121 C, 15 libras / pulg2, 15 minutos.
Conservar refrigerado 4 C a 10 C.
a naftol al 5 %
KOH al 40%.
MEDIO DE GELATINA NUTRITIVA: Prueba de licuefaccin de la gelatina
al
bl
cl
dl
el

Preparar siguiendo las indicaciones del fabricante.


Distribuir aproximadamente de 4 mL a 5 mL por tubo.
Autoclavar a 121 C, 15 libras / pulg2, 15 minutos.
Enfriar en posicin vertical, ajustar las tapas y refrigerar a 4 - 10 C.
Conservar los tubos con gelatina refrigerados hasta el momento de su inoculacin.

PRUEBA DE INDOL
Medios y reactivos:
Caldo de triptfano o de peptona o caldo de triptona.
Preparar de acuerdo a las indicaciones del fabricante.
Distribuir en tubos, aproximadamente 4 mL por tubo.
Autoclavar a 121 C, 15 libras / pulg2, 15 minutos.
Conservar refrigerado.
Reactivo de indol de Kovacs
Alcohol amlico o isoamlico (puede sustituirse por alcohol butlico) 150 mL
p-dimetilamino-benzaldehido
g
HCI concentrado
mL
Procedimiento

10
50

dl
el
fl
gl
hl

Disolver el aldehido en el alcohol.


Agregar el cido lentamente a la mezcla aldehido - alcohol.
Guardar en frascos oscuros y en refrigeracin.
Si el cultivo de 24 horas es negativo, deber incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba.
Antes del empleo de los reactivos, deben ser controlados con cultivos positivos y negativos
conocidos, por ejemplo Eschercha col y Klebsella.
il Conservar refrigerados los reactivos y hacer un control de calidad semanal
Recomendaciones
El reactivo de Kovacs debe mantenerse refrigerado a 4 - 10 C en un frasco mbar con tapa de
vidrio. Si se deja a temperatura ambiente durante un tiempo, cambiar de color y se har menos
sensible.
PRUEBA DE MOTILlDAD:
Medio
Se emplea medios semislidos que se obtienen comercialmente (Agar movilidad, SIM, MIO).
Procedimiento
al
bl
cl
dl

Preparar el medio de acuerdo a las indicaciones del fabricante.


Autoclavar a 121 C, 15 libras / pulg2, 15 minutos.
Distribuir aproximadamente 5 mL por tubo.
Solidificar el medio en posicin vertical y conservar refrigerado (4 - 10 C)

PRUEBA DE REDUCCION DE NITRATO


Medios y Reactivos
Caldo Nitrato
- Preparar de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
- Repartir 1 mL por tubo.

- Autoclavar a 121 C, 15 libras / pulg2, 15 minutos.


- Conservar los medios refrigerados a 4 -10 C
Reactivo A:
- a -naftilamina
- Dimetil-a naftilamina
- Acido actico (5N), 30%

5g 6g
1000 mL

Procedimiento
- Disolver cualquiera de las sustancias en menos de 1000 mL de cido actico 5 N por medio de un
suave calentamiento.
- Pasar la solucin a un frasco volumtrico de 1 litro y completar a 1000 mL con el cido actico 5
N.
- Filtrar la solucin.
- Guardar refrigerado (4 C) en un frasco mbar.
Reactivo B:
- Acido sulfanlico (cido para aminobencenosulfnico)
- Acido actico (5N), 30%

8g
1000 mL

Procedimiento
- Disolver el cido sulfanlico en menos de 1000 mL de cido actico 5 N.
- Traspasar la solucin a un frasco volumtrico de un litro y agregar cido actico 5 N
c.s.p 1000 mL y guardar refrigerado (4 C) en un frasco mbar.
- Ambos reactivos se mantienen estables por lo menos tres meses.
AGAR BILIS ESCULlNA
Se prepara el medio de acuerdo a las indicaciones del fabricante, calentando suavemente la
solucin.
dl Colocar 5 mL aproximadamente en un tubo con tapa de rosca (16 mm x 125 mm).
el Autoclavar a 121 C, 15 libras / pulg2, 15 minutos.
fl Enfriar manteniendo el tubo inclinado de tal manera que se obtenga una buena superficie en
pico de flauta).
gl Conservar refrigerado (4 - 10 C).

C.12

CALDO PARA LAS PRUEBAS DE CARBOHIDRATOS


Medios y reactivos
0
Caldo infusin corazn
90 mL
1
10% de carbohidrato en agua
10 mL
2
Prpura de bromocresol, (1,6% en etanol 95%),
0,1 mL
0 Repartir 3 mL en cada tubo de 12 mm x 75 mm con tapa de rosca y autoclavar a 121 C x 10
minutos.
1 Conservar los medios en refrigeracin (4 - 10 C).

C.13

MEDIOS PARA HEMOCULTIVOS


C.13.1 MEDIO MONOFASICO:
Materiales y medios:
Caldo Tripticase Soya o Infusin cerebro corazn
Polyanetol sulfonato de sodio (SPS)
Gelatina
Frascos de vidrio de 150mL 125mL
Tapones de jebe
Precintos
Preparacin:
al
bl
cl
dl
el
bl
cl
dl
el

Preparar el caldo de acuerdo a las indicaciones del fabricante.


Agregar gelatina a una concentracin final de 1,2 %.
Agregar polianetol sulfonato de sodio (SPS) a una concentracin de 0.025 - 0.05 %, mezclar.
Distribuir 90mL en frascos de 150 mL y 45 mL en frascos de 125 mL.
Colocar el tapn de jebe yasegurarlo con cinta maskintape para evitar que debido a la presin
los tapones se salgan.
Se esteriliza por autoclave a 1210 C a 15 lb de presin x 15 minutos.
Una vez fro retirar la cinta masking tape.
Asegurar los tapones de jebe y colocar precintos de seguridad. Realizar este procedimiento en una
cabina de flujo laminar o cerca de un mechero de bunsen.
Se realiza el control de esterilidad: Incubar los medios a 35 - 3r C por 24 - 48 horas.

C.13.2. MEDIO BIFASICO:


dl Materiales:
Frascos de vidrio
Tapones de jebe
Precintos
al Fase Slida
Agar BHI o TSA
Agar agar:
Preparar de acuerdo a las instrucciones del fabricante agregando agar agar en una
concentracin final de 1 %
el Fase Lquida:
Caldo Tripticase Soya o Infusin cerebro corazn
Polyanetol sulfonato de sodio
Gelatina
dl
el
fl
gl

MPR-CNLSP-004

Preparar el caldo de acuerdo a las indicaciones del fabricante.


Agregar gelatina a una concentracin final de 1,2 % .
Agregar polianetol sulfonato de sodio (SPS) a una concentracin final de 0.025 - 0.05 %
Distribuir 45 mL en frascos de 150 mL y 20 mL en frascos de 125 mL.

78

Instituto Nacional de Salud

Preparacin

Se reparte 25 mL de agar en los frascos y se esteriliza.


Se deja solidificar en posicin inclinada.
- Agregar el caldo aspticamente, al medio solidificado.
Colocar los tapones de jebe y los precintos de metal.
Se controla la esterilidad del medio por una semana a 35 - 3r C.

RESULTADO DE SU ANTIBIOGRAMA
ANTIBIOTICO

Concentracin del
disco

FECHA DE AISLAMIENTO:
FECHA DE SIEMBRA EN EL MEDIO:
FECHA DE ENVIO DE CULTIVO BACTERIANO
F1-MPR-CNLSP-004

Lectura (mm)

Interpretacin