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PRACTICA Nº 1

GLICOLISIS
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS
1.- Glicólisis anaeróbica en un preparado de músculo esquelético de conejo
GLUCOSA

a) Determinación de glucosa basal y después de Fosforilasa
1 hora

Glucógeno

ATP
Fructosa
HEXOQUINASA
Glucosa
1–P
b)
Determinación
de
ácido
láctico
basal
de 1 hora.
Galactosa
ADP y después
Manosa
Fosfofructomutasa
Glucosa – 6 P
INTRODUCCIÓN
Fosforilación

La glicólisis es unaFOSFOGLUCO
vía metabólica que consiste en una secuencia de reacciones
ISOMERASA

citoplasmáticas a través de las cuales 1 mol de glucosa se convierte en 2 moles de piruvato
Fructosa
6P
con la concomitante producción de ATP
y la –reducción
del NAD+ a NADH + H+ si es que

ocurre en presencia de oxígeno.
En condiciones de
anaerobiosis, es decir en ausencia de
ATP
FOSFOFRUCTO
QUINASA
oxígeno, éstos 2 moles de piruvato
se reducen a 2 ADP
moles de Lactato a expensas del NADH
+ H+. En presencia de oxígeno los tejidos pueden posteriormente oxidar el piruvato
Fructosa 1, 6 Bis P
totalmente hasta CO2 y H2O a nivel mitocondrial.
ALDOLASA

La glicólisis es una vía que ocurre en todas las células del organismo, con la finalidad
de hacer posible que la glucosa TRIOSA
pueda FOSFATO
degradarse, proporcionando la energía química
ISOMERASA
Gliceraldehido 3-fosfato
Dihidroxiacetona fosfato
necesaria para la actividad celular en forma de compuestos fosfóricos ricos en(2)
energía
(ATP). Así, por molécula de glucosa que se convierte en 2 de ácido Pi
láctico, se produce
+
una síntesis neta de 2 moléculas de ATP, de tal modo
el proceso global que ocurre en
NADque
(2)
GLICERALDEHIDO
3P
las células, podría resumirse como:
NADH2

Ac. LACTICO

Glucosa + 2ADP + 2Pi

DESHIDROGENASA

2 Lactato + 2 ATP + 2 H2O
Acido 1,3 difosfoglicérico (2)

+

NAD

Tanto las reacciones así como las enzimas que catalizan las diversas etapas de la
NADH2

glicólisis se encuentran en el citoplasma, no obstanteADP
existe una estrecha
asociación con las
FOSFOGLICERO
(2)
Ac. Piruvico
mitocondrias
en donde se lleva a cabo la descarboxilación
oxidativaKINASA
del Piruvato, las
ATP
reacciones del ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa.
Acido 3-fosfoglicérico
(2
ATP
PIRUVATO
En la presente práctica se evaluará a la glicólisis a través del consumo de glucosa
y la
)
KINASA

FOSFOGLICERO
producción de ácidoADP
láctico en un sistema de ensayo que contiene
homogenizado de
MUTASA

músculo esquelético mantenido en condiciones de anaerobiosis a 37 ºC durante una hora.
Ac. Fosfoenol piruvico
(2)

ENOLASA

Acido 2-fosfoglicérico

H2O
1

FIGURA Nº 1 .- Vía Glicolítica

(2)

EXPERIMENTO 1
2

Glicólisis anaeróbica en un sistema preparado con músculo esquelético de cobayo
Objetivos
1. Demostrar como la glucosa en ausencia de oxígeno se transforma en ácido láctico,
utilizando como fuente enzimática un homogeneizado de músculo de cobayo o en
caso contrario de rata.
2. Comprobar el consumo de glucosa durante el proceso
3. Comprobar la producción de ácido láctico en condiciones de anaerobiosis
Procedimiento:
a) Degradación de la glucosa:
1. En un Erlenmeyer de 125 ml. limpio y seco, medir 10 ml de una solución de
glucosa al 1%, disuelta en una solución Krebs Ringer Fosfato (*) conteniendo
Nicotinamida 0.03 M, NAD+ 0.2 % y ATP 0.2 %.
2. Incubar la solución en baño maría a 37 ºC por 10 minutos.
3. Agregar al Erlenmeyer 50 ml de homogenizado de músculo al 10 % (P/V),
8,1016,18,20,22preparado previamente en solución Krebs Ringer Fosfato.
4. Mezclar y rápidamente tomar un volumen de aproximadamente 20 ml en una
probeta y colocarlo inmediatamente en hielo. Esta muestra constituye la muestra
basal a tiempo cero.
5. Después de haber extraído la muestra basal, añadir al Erlenmeyer con la muestra
sobrante, un volumen adecuado de parafina líquida, para crear las condiciones
de anaerobiosis. Proseguir entonces con la incubación a 37 ºC durante 60
minutos. Esta será la muestra incubada en donde se habrá de producir la
glicólisis.
6. Realizar las determinaciones de glucosa y ácido láctico, tanto en la muestra
basal a tiempo cero, así como en la muestra incubada por 60 minutos a 37ºC,
siguiendo la metodología para cada una de ellas.
b) Determinación de glucosa. ( Método de Nelson-Somogy ).
La de terminación de glucosa por este método, recomienda que la muestra a
analizar esté libre de proteínas, ya que de no ser así, éstas podrían reaccionar con el
reactivo de cobre utilizado dando interferencia en la coloración obtenida.
Desproteínización:
3

Procedimiento: 4 . 6. Preparar 4 tubos de Folin. medir en un tubo de ensayo 4 ml de agua destilada y agregar 2 ml. 7. Procedimiento para cuantificar glucosa: 1. El filtrado libre de proteínas deber ser incoloro y transparente. 4. de muestra respectiva. 3.154 D. de acuerdo a la siguiente tabla: REACTIVOS 1 2 3 4 1 ml --- --- -- Filtrado muestra incubada --- 1 ml --- --- Solución Estandar (**) --- --- 1 ml --- Agua destilada --- --- --- 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Filtrado de la muestra basal Reactivo Cúprico-alcalino (**) Solución estándar de glucosa conteniendo 50 ug/ml.02 N. (ó 67 UK).a) Para cada muestra. c) Determinación de Acido Láctico (Método Volumétrico). 1 ml del reactivo arsenomolibdato. Hacer los cálculos respectivos y expresar la concentración de glucosa en mg %. disolviendo con suave agitación el Cu2O producido. utilizando al rojo de fenol como indicador. de Ba(OH)2 0. La determinación de glucosa se hará en este filtrado. Dejar en reposo 5 minutos. 2. de ZnSO4 al 5 %. Colocar los tubos en baño maría hirviente por 15 minutos. 5. La absorbancia leída del sistema estándar fue de 0. d) Transcurrido el tiempo. c) Añadir 2 ml.3 N. Añadir a cada tubo. b) Agregar 2 ml. Enfriar los tubos en agua corriente.O. agitar y dejar en reposo por 5 minutos. Completar con agua destilada a 25 ml y mezclar. proceder a centrifugar o filtrar dichas muestras. El ácido láctico se determinará por titulación con una solución de KOH 0. Leer en el fotocolorímetro con filtro verde y anotar. Agitar y dejar en reposo por 5 minutos.

agregando 1 gota del indicador rojo de fenol.1. hasta obtener un color naranja-rosa. Proceder a la titulación de 3 ml de cada muestra con KOH 0. la glucosa es degradada anaeróbicamente. Defina a la glicólisis anaeróbica y glicólisis aeróbica 2. Resultados Anote sus resultados en la siguiente tabla : MUESTRA BASAL MUESTRA INCUBADA Glucosa en mg % Acido láctico en mEq/L En el siguiente espacio discuta los resultados obtenidos _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ __________________________________________________________ INTERROGANTES 1. En que células o tejidos. Escriba las reacciones de la glicólisis que requieren de ATP y las que producen ATP a) 5 . En cada uno de dos beakers medir aproximadamente 15 ml de las muestras basal e incubada respectivamente y hacerlas hervir por 2 minutos teniendo cuidado de que no se proyecten 2. Anotar el volumen de soda gastado y calcular la normalidad del ácido láctico. Enfriar y filtrar a través de una gasa y luego a través de papel filtro. 4.02 N. 3. y en cuales aeróbicamente 3.

Cuál es la producción neta de ATP en la oxidación anaeróbica de un mol de glucosa. Describa de manera general las etapas en donde se forma ATP. Haga los cálculos respectivos. Por qué no aparecen NADH y NAD+ en la reacción neta? 9. Cuál es la producción neta de ATP por la oxidación aeróbica de 1 mol de glucosa hasta CO2 y H2O.b) c) d) 4. Mediante un esquema demuestre la función del NAD + en la glicólisis. 5. A qué se llama enlaces fosfóricos ricos en energía. Cuál es la importancia de la glicólisis para los eritrocitos y las neuronas 8. Qué enzimas de la glicólisis catalizan estas reacciones? 6. Qué intermediarios de la glicólisis lo presentan? 6 . 7. Como se define la fosforilación a nivel de sustrato.

Escriba las reacciones irreversibles de la glicólisis. Si se añadiese CN y/o dicumarol en el experimento de la presente práctica. se afectaría la síntesis de ATP de la glicólisis? 7 . calcule la eficiencia en porcentaje del proceso. 14. Cómo se regula la glicólisis? 12.10. Qué inhibidores de la glicólisis conoce Ud. 13.? Indique el lugar y el mecanismo de acción de estas sustancias. A partir del Gº’ de la glicólisis y del número neto de ATPs producidos. indicando las enzimas que las catalizan 11.

8 .

Determinación del consumo de oxígeno (Manometría) 2. A partir del succinato se regenera oxalacetato a través de reacciones en las que ocurren dos oxidaciones. ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo del ácido cítrico el cual funciona en estrecha relación con la cadena respiratoria mitocondrial.. son captados por los transportadores de la cadena respiratoria para llevarlos hasta el oxígeno molecular que se reduce y forma agua.. se condensa con el acetato (acetil CoA) para dar lugar a un ácido tricarboxílico de 6 átomos de carbono (citrato). En condiciones aeróbicas. Un isómero de éste el isocitrato es descarboxilado y oxidado para dar un cetoácido de 5 carbonos (alfa ceto glutarato). y se demostrará el requerimiento de varios cofactores para un buen funcionamiento 9 . él cual a su vez es descarboxilado oxidativamente para formar un ácido dicarboxílico de 4 carbonos (succinato). la etapa siguiente en la degradación de la glucosa.PRACTICA Nº 2 CICLO DE KREBS RELACION DE EXPERIMENTOS 1. para formar acetil CoA.Determinación del consumo de piruvato (Colorimetría) INTRODUCCION Cuando la glucosa se degrada por la vía glicolítica se obtiene como producto final piruvato o lactato. Es necesario remarcar que el acetil CoA no sólo proviene del metabolismo de los carbohidratos. Como consecuencia se produce 2 ó 3 moléculas de ATP por cada proceso oxidativo. En esta práctica se utilizará un homogenizado de hígado como fuente de enzimas. este hecho tiene importancia metabólica por que los hidrógenos provenientes de las oxidaciones producidas en el ciclo de Krebs. Durante el ciclo de Krebs ocurre esencialmente lo siguiente: Un compuesto de 4 átomos de carbono (oxalacetato). el cual puede oxidarse hasta CO2 y H2O en una vía metabólica llamada ciclo de Krebs. es la descarboxilación oxidativa del piruvato a nivel mitocondrial. sino que también se forma durante la beta oxidación de los ácidos grasos o en la oxidación de algunos aminoácidos. El ciclo de Krebs se realiza en las mitocondrias y está íntimamente ligado a la cadena respiratoria.

c H2O 2H+ FIGURA Nº 2.cetoglutarato HSCoA CO2 FAD NAD+ Succinil .ceto Glutarato Deshidrogenasa NADH2 Succinil CoA Sinteasa HSCoA ATP NAD FMN ATP Coenzima Q Cit.AMINOACIDOS GLUCOSA ACIDO PIRUVICO HSCoA NAD+ CO2 NADH2 Complejo de la Piruvato Deshidrogenasa ÁCIDOS GRASOS Acetil . b ATP Cit. Oxalacético H2O NADH2 NAD Acido.SCoA HSCoA Citrato Sinteasa Acido. c1 Cit..SCoA NAD+ Complejo  .(a + a3) 1/2 - O2- . Cítrico Aconitasa Deshidrogenasa Málica + Acido Isocítrico Acido Málico Fumarasa Isocitrato Deshidrogenasa H2O CO2 Acido Fumárico FADH2 H2O ADP + Pi ATP Succinato Deshidrogenasa Acido Succínico GTP GDP + Pi NADH2 Acido  .Ciclo de Krebs 10 Cit.

el consumo de oxígeno determinará una disminución de la presión del sistema. 2. Fundamento del respirómetro de Warburg. Como en este proceso de oxidación de Piruvato. ( el funcionamiento del respirómetro de Warburg así como los cálculos respectivos ya fueron indicados en la practica de Fotosíntesis: Bioquímica I ) . Midiendo el consumo de oxígeno mediante el empleo de un método manométrico. lo cual se evidencia por un desnivel del líquido manométrico presentes en las columnas. el ciclo de Krebs será estudiado: 1.. 11 Brazo lateral .del ciclo.1. Midiendo los micromoles de Piruvato consumidos. mediante un método colorimétrico Experimento 1 Determinación del consumo de oxígeno. El frasco de Warburg que contiene el sustrato. La integración del ciclo de Krebs y la cadena respiratoria mitocondrial va a originar que el oxígeno sea reducido y convertido en agua. Estando cerrado el frasco y en comunicación con el manómetro. en cuyo medio se quiere medir el consumo de oxígeno. el oxígeno es reducido hasta agua. Manómetro Warburg Compartimiento principal Frasco Warburg Baño maría Warburg Nave central Frasco Warburg Reservorio de líquido manométrico Figura Nº 10. cofactores y el homogenizado de hígado. es colocado en baño de agua a temperatura constante.Respirómetro de Warburg Procedimiento. produciéndose un consumo neto de este gas. consumo que puede ser medido mediante el uso del respirómetro de Warburg.

01M.6 ml 0.5 ml 0. ** El homogenizado de hígado se obtuvo al homogenizar en frio durante 2 minutos.6 ml 0. - Convertir las lecturas obtenidas en l de oxígeno consumido en una hora para cada uno de los sistemas. Luego en el compartimiento principal de cada frasco medir los siguientes reactivos: ATP 0. Equilibrar los sistemas por 10 minutos sin cerrar la llave de los manómetros.1 ml ---0.Se preparan 6 frascos de Warburg.0 ml * El sustrato contiene 5 volúmenes de piruvato de sodio 0.4 ml 0.1 ml 2.5 ml ---2.0 ml 0.1 M pH 7.3 H2O Fluoroacetato Homogenizado de hígado ** 1 2 3 4 5 6 0.2 ml ---2. Cerrar luego la llave de los manómetros y la llave lateral de los frascos de Warburg y hacer la lectura cada 15 minutos.4 ml 0.6 ml 0.02 M NAD Sustrato * Buffer fosfato 0.3 ml 0.3 ml 0.4 ml ---0.6 ml 0.1 ml 0. Sistema 1: _____________________________________________________________ ________________________________________________________________ Sistema 2: ________________________________________________________ 12 .4.1 ml 0.4 ml 0.6 ml 0.3 ml ---0.3 ml 0.01 M MgSO4 0. Expresión de resultados - Confeccionar una Tabla o Cuadro y anotar las lecturas obtenidas cada 15 minutos para cada sistema.4 ml ---2.25 M de buffer tris 0.4 ml de KOH al 20 % y colocar un fragmento de papel filtro plegado en “acordeón”.5 ml 0.5 ml 0.7 ml ---2.1 ml ---2. en la copa central de cada uno de ellos medir 0.5 ml 0.3 ml ----0.1 ml 0.5 ml 0.0 ml 0.0 ml 0.0 ml 0. hígado de rata en ayunas con 9 volúmenes de sacarosa 0.02 M pH 7. permitiendo el libre intercambio gaseoso con el medio ambiente.1M y un volumen de fumarato de sodio 0.4 ml 0. - Interpretar los resultados para cada sistema. Preparar además un frasco termobarómetro( TB) que debe contener 4 ml de agua destilada para corregir o compensar los cambios de presión y temperatura durante el experimento.0 ml ---0.5 ml ---0.

03 3 KO2=0. Tiemp TB 1 KO2=0.94 4 KO2=1.96 2 KO2=1.88 0’ 183 295 297 289 278 274 275 10’ 184 234 205 250 230 220 250 20’ 186 211 120 220 185 170 229 30’ 185 182 40 299 190 135 130 200 40’ 188 136 206 173 100 100 185 50’ 188 113 135 155 65 292 80 165 60’ 186 92 48 50 275 65 145 Consumo de oxígeno en l / 60’ Consumo de Piruvato en Moles Sistema 3: ___________________________________________________________ ___________________________________________________________________ Sistema 4: _____________________________________________________________ ___________________________________________________________________ Sistema 5: ___________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 13 .89 6 KO2=0. realizando los cálculos respectivos ).CUADRO DE RESULTADOS: ( Completar el siguiente cuadro.00 5 KO2=0.

y los sistemas basales 1.612 Tubo 6 : 0. los tubos 2 y 6 sirven de estándares. 2 y 6 ) se procede de la siguiente manera: - Medir en tubos de prueba 2 ml del contenido de cada tubo - Añadir 18 ml de ATCA al 5 % .038 2: 0.4 ml de cada filtrado - 0.Determinación de los micromoles de piruvato consumidos.589 . A parte preparar en tubos de prueba los sistemas 1. Luego se trasvasa el contenido del compartimento principal de cada frasco a tubos de prueba numerados del 1al 6. Al finalizar el experimento de la medición del consumo de oxígeno se abren todas las llaves de los manómetros y frascos Warburg.605 Absorbancia de los tubos del 1 al 6 : 1: 0.471 4: 0. dejar 20 minutos en reposo. - Añadir 10 ml de NaOH al 10 %.. El piruvato reacciona con la 2. Procedimiento.6 ml de agua destilada - 1. Dejar en reposo por 5 minutos y filtrar.Sistema 6: ___________________________________________________________ ___________________________________________________________________ 2.4-dinitro fenil hidrazina. cuya absorbancia se mide en el fotocolorímetro.4-dinitrofenil hidrazina.467 Calcular el Factor de calibración: 14 5: 0. Mezclar. Luego con los 8 tubos ( 1 – 6 después de haber medido el consumo de oxígeno.0 ml de 2. 2 y 6 (que están marcados con º ) donde el tubo 1 sirve de blanco. dando lugar a la formación de una hidrazona que en medio alcalino toma una coloración pardo oscura.458 6: 0. En otros tubos medir respectivamente: - 0. Fundamento.038 Tubo 2 : 0.088 3: 0. Dejar en reposo por 5 minutos - Leer con filtro verde Tubo 1 : 0.

.. Dónde actúan? 15 ...... qué importancia tiene y en qué lugar de la célula ocurre? 2.Cuál es la razón de que el sustrato contenga fumarato? 7............? ....Explicar la relación que existe entre el consumo de oxígeno y el funcionamiento del ciclo de Krebs....... 4: ...Qué es el KO2 5... 6: .. 3: ....Haga el balance energético del Ciclo de Krebs asociado a la cadena respiratoria mitocondrial para un mol de acetil CoA.. 5: ......... INTERROGANTES: 1.......Qué es el ciclo de Krebs.......... 6.Factor de calibración: . el empleo de KOH en el compartimiento central de cada frasco Warburg ? 4. Calcular los micromoles de piruvato consumidos en cada sistema: 1: ....... 2: ........... 3....................Qué inhibidores del ciclo de Krebs conoce Ud...Qué finalidad tiene en la presente práctica..........Qué finalidad tiene la preparación del sistema termobarómetro? 3..

Qué enzimas regulatorias intervienen en este proceso y como son reguladas? 10.8. Qué otro ácido relacionado con el metabolismo de la glucosa sufre igual transformación. Cuál sería el cambio de energía libre ( Gº’ ) total? 16 .Cómo se regula el flujo metabólico del ciclo de Krebs. 9. cuando 1 mol de Piruvato es oxidado hasta CO 2 y H2O ?...Cuál es el rendimiento neto de ATPs.-Indique qué vitaminas o derivados de vitaminas se necesitan para la descarboxilación oxidativa del alfa ceto glutarato.

es catalizada por la Piruvato Descarboxilasa. Las células de levadura son esenciales para producir las enzimas necesarias que participar en el proceso fermentativo. La reacción de descarboxilación del Piruvato. parte de la cual se emplea en la fosforilación de las hexosas. en acetaldehido y dioxido de carbono. enzima que requiere de Pirofosfato de Tiamina (PPT) como coenzima. donde intervienen la Piruvato Descarboxilasa y la Alcohol Deshidrogenasa. y las etapas enzimáticas son idénticas a las de la fermentación láctica o glicólisis. intermediario que luego se descompone en PPT acetaldehido. pero una vez que éstas estén presentes ya no serán tan indispensables para que la fermentación se produzca en forma normal. Como producto intermediario se forma “ácido pirúvico activo” que por liberación del CO 2 se convierte en “acetaldehido activo” (PPT–Acetaldehido). 1 mol glucosa es convertida anaeróbicamente en 2 moles de etanol. la glucosa anaeróbicamente es convertida en etanol y dióxido de carbono.PRACTICA Nº 3 FERMENTACION ALCOHOLICA DE LA GLUCOSA RELACION DE EXPERIMENTOS 1. Formación de Acetaldehido y Etanol a partir de glucosa en presencia de Saccharomyces cerevisiae. además de iones Mg2+. La fermentación alcohólica es un proceso bioquímico que por acción de las levaduras. a) Identificación de acetaldehido b) Cuantificación de etanol 2. La energía producida en los procesos de fermentación y que las células aprovechan para las reacciones endergónicas. se acumula en forma de ATP. a excepción de la etapa terminal catalizada por la Deshidrogenasa láctica. Cuantificación del contenido alcohólico en diversas bebidas INTRODUCCION. Las fermentaciones son procesos anaeróbicos que liberan energía para la formación de ATP en un proceso conocido como “fosforilación a nivel de sustrato”. éste 17 . la cual es reemplazada por dos etapas enzimáticas adicionales. En levaduras.

(Acetoína).3 difosfoglicérico (2) ETANOL ALCOHOL DESHIDROGENASA FOSFOGLICERO KINASA (2) (2) ADP ATP + NAD Acido 3-fosfoglicérico NADH2 (2) FOSFOGLICERO MUTASA (2) Acetaldehido Acido 2-fosfoglicérico PIRUVATO DESCARBOXILASA PPT ATP ADP Ac.último se reducirá a etanol en la reacción siguiente .. GLUCOSA ATP ADP HEXOQUINASA Glucosa – 6 P FOSFOGLUCO ISOMERASA Fructosa – 6 P ATP FOSFOFRUCTO QUINASA ADP Fructosa 1. Fosfoenol pirúvico PIRUVATO KINASA FIGURA Nº 3 . Pirúvico (2) (2) CO2 ENOLASA H2O Ac.Fermentación alcohólica de la glucosa 18 (2) . una parte del acetaldehido activo se condensa a acetaldehido libre para formar acetil-metil-carbinol. 6 Bis P ALDOLASA TRIOSA FOSFATO ISOMERASA Dihidroxiacetona fosfato Gliceraldehido 3-fosfato Pi GLICERALDEHIDO 3 P DESHIDROGENASA NAD+ NADH2 Acido 1. no obstante.

En la fermentación alcohólica...La conversión de acetaldehido en etanol es llevada a cabo por la alcohol deshidrogenasa. no sólo actúan las levaduras de Saccharomyces cerevisiae.. EXPERIMENTO 1. además del etanol y dioxido de carbono se originan productos secundarios como glicerina. Incubar en baño de agua a 37 ºC durante 60 minutos 5. ácido acético y ácido succínico. Como inductores de la fermentación alcohólica.. recién preparada y a pH 8. recién preparada y a pH 5. sino también las bacterias: pseudomonas.5 10. agregar lo siguiente: M-1 M–2 1.Levadura de panificación fresca 1.. xantomonas y aeromonas.Centrifugar a 3. 19 .0 ml ------ 3. la cual es una enzima que requiere de NADH + H + y que cataliza la reacción de izquierda a derecha cuando esta se lleva a cabo en un medio ligeramente ácido ( pH de 5 a 6 ).0 ml cubra la superficie.0 g 2. 10 min.Mezclar y agregar rápidamente parafina líquida hasta que 5. el cual puede observarse por el color azul que se produce al reaccionar con el nitroprusiato de sodio y la piperidina. por el contrario en medio ligeramente alcalino (pH 8) esta se realiza de derecha a izquierda. Obtener los sobrenadantes por separado para las determinaciones del acetaldehido y etanol Identificación del acetaldehido.. FERMENTACION DE LA GLUCOSA POR Saccharomyces cerevisiae HASTA ACETALDEHIDO Y ETANOL En 2 matraces ( M-1 y M-2 ) de 50 ml. Fundamento: En el sobrenadante de la muestra de incubación el sulfito de calcio atrapa al acetaldehido.000 rpm.0 ml 6..0 ml 4.0 g 1.Solución de glucosa al 5 %.Mezclar bien y agregar el reactivo sulfito de calcio ------ 500 mg 5.Solución de glucosa al 5 %. 10 min.0 ------ 10.

Agua destilada ----1. 8. 20 . agregar lo siguiente: T-1 T –2 T–3 1.524 g.5 ml de la mezcla sulfocrómica en un frasco de 30 ml. Reactivos: a) Dicromato de potasio. susceptible a ser medido por fotocolorimetría. Solución de Nitroprusiato de Sodio 0. Colocar 0. Sobrenadante de M – 1 1.Observar.5 ml 0. Fundamento.2 ml.0 ml --3. 1000 ml c) Mezcla sulfocrómica: Verter lentamente el ácido sulfúrico a la solución de bicromato (Reacción exotérmica). a la vez que se forma sulfato cromoso con una coloración que varía del amarillo al verde. Colocar exactamente 0. La mezcla oxidante Dicromato-ácido sulfúrico actúa sobre el alcohol etílico transformándolo en ácido acético. 1000 ml.5 ml Mezclar y colocar los tubos en baño de agua hirviente por 5 minutos. Sobrenadante de M – 2 --1. Finalmente colocar herméticamente en el frasco que contiene la solución sulfocrómica.0 ml 4. cuidando que la tira de papel filtro no toque las paredes del frasco ni el reactivo. de la muestra a analizar en una tira doblada de papel filtro adherida a un tapón de jebe con un alfiler.0 ml ----2. en forma proporcional a la concentración de etanol existente en la muestra.5 ml 0. Procedimiento: 1. 5. aproximadamente.P. 2. Anotar el color y olor característico del acetaldehido CUANTIFICACION DEL ETANOL (Método de Shefftel modificado). Agua destilada b) Acido sulfúrico Q. En 3 tubos de ensayo ( T) debidamente rotulados.Procedimiento. 3.

en el siguiente Cuadro: T–1 T–2 T–3 Identificación de acetaldehido Coloración obtenida Cantidad de etanol (mg % ) Anotar los resultados obtenidos en el experimento 2.O ) 0.005 0. sólo que en su lugar medir 0.2 ml de agua destilada en la tira de papel filtro. RESULTADOS. Calcular los Factores de calibración respectivos en base a los datos indicados: Absorbancia Blanco Estandar 1 ( 0.0 mg/ml ) Estándar 3 ( 2. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 578 nm. 5. Retirar el tapón con la tira de papel que contiene a la muestra.018 Fc Promedio Calibración. sólo que en lugar de esta última medir 0. º 8.0 mg/ml ) Factor de Absorbancia ( D. procediendo exactamente de la misma manera que para la muestra problema.5 ml de agua destilada. 1. Colocar las tapas rosca y llevarlos a Baño María hirviente o a estufa a 100 ºC por 10 minutos.001 21 . 7. Bebida alcohólica Blanco Anizado Cerveza Chicha Absorbancia Concentración en la Concentración en cantidad de muestra mg % 0.001 0. 6. Preparar sistemas estándar del mismo modo que para las muestras problema.5 mg/ml.5 mg/ml ) Estándar 2 ( 1. De igual modo preparar un blanco.009 0. Enfriar y agregar 12.2 ml del estándar respectivo ( 0.0 mg/ml y 2 mg/ml ) en la tira de papel filtro. neta ------ ------ ----- Anotar los resultados obtenidos del experimento 1 (fermentación alcohólica de la glucosa ).4.

Indique para qué se utilizan los siguientes compuestos o sustancias. 7. 1...Comente o explique los resultados obtenidos en la cuantificación de etanol del experimento 1. 3. 5.Esquematice la secuencia de reacciones de la fermentación alcohólica de la fructosa 4..De qué otras maneras se puede estudiar la fermentación alcohólica? 22 ...Mencione las diferencias entre la fermentación láctica y fermentación alcohólica.Pisco INTERROGANTES Y COMENTARIOS. en la presente práctica:  Sulfito de calcio:  Solución sulfocrómica diluida: 6..Comente o explique los resultados obtenidos en la identificación del acetaldehido. 2..Escriba las coenzimas y/o cofactores que necesita la piruvato descarboxilasa y la alcohol deshidrogenasa.

Qué otros compuestos se pueden formar durante la fermentación alcohólica? 23 ..8.

PRACTICA Nº 4 OXIDACION DE ACIDOS GRASOS Y FORMACION DE CUERPOS CETONICOS INTRODUCCION: Como se sabe. la oxidación de los ácidos grasos comprende una serie de reacciones enzimáticas que al final conducen a la formación de Acetil CoA y un acil CoA de 2 átomos 24 .

de carbono menos. OH Acil la oxidación del butirato y la formación de cuerpos cetónicos. b ATP Cit. Así por ejemplo.ceto Glutarato Deshidrogenasa Preparar 4 frascos de Warburg en la siguiente forma: 2 FAD NADH2 Acido Succínico GTP GDP + Pi Succinil . AMP + PPi ACIDOS GRASOS colesterol. Acetil CoA NAD el aparato manométrico de Warburg para medir el consumo de oxígeno. al Hunirse al oxalacetato 3 2 n ATP HSCoA ACTIVACION DE en interviene también la síntesis de ácidos grasos. Demostrar la necesidad del NAD. FADH2 Procedimiento: ADP + Pi ATP Succinato Deshidrogenasa Acido  . 1. c1 Cit.cetoglutarato HSCoA CO NAD+ Complejo  .. Las moléculas Acido Graso de”n” átomos de carbono de Acetil CoA serán ampliamente utilizadas por el organismo y así de primera importancia C – (CH ) – COOH y seguir las reacciones es el empleo en la producción de energía.(a + a3) 1/2 H2O 25 TRANSPORTE DE ELECTRONES EN LA CADENA RESPIRATORIA MITOCONDRIAL FIGURA Nº 4 . en procesos de acetilación. de tal manera que el ácido graso queda convertido finalmente en varios Acetil CoA dependiendo del número de carbonos del ácido graso. c Cit. oxidación dará lugar a 8 Acetil CoA y tratándose del ácido butírico originará 2 Acetil CoA. NADH2 Ceto Acil CoA HSCoA OBJETIVOS: HSCoA etc. SeLempleará paraCoA este efecto. para el caso del ácido palmítico. Oxalacético Acido.Oxidación Completa de un ácido graso O2-- . Determinar cualitativamente la formación de cuerpos cetónicos en los diferentes Acido Málico Isocitrato CICLO NAD+ sistemas de estudio. este último compuesto reingresa al ciclo. Estudiar la oxidación del ácido butírico a través del consumo de oxígeno utilizando un Citrato Sinteasa homogenizado de hígado como fuente enzimática. NAD+ H2O Acido Isocítrico 3. Cítrico 2. iones magnesio y ATPH en O la oxidación de los ácidos NADH2 2 Aconitasa Deshidrogenasa Málica grasos. Interpretar losH2Oresultados sobre el consumo de CO oxígeno 2 y formación Acido Fumárico cetónicos. Trans – Enoil CoA En esta práctica se utilizará un homogenizado de hígado como fuente de enzimas para Acil CoA . Deshidrogenasa DE Fumarasa NADH2 de cuerpos KREBS 4. OXIDACION DE ÁCIDOS GRASOS beta hidroxibutírico y a la acetona. del acetil CoA en la formaciónAcil de cuerpos que ocurre 3 FAD hígado. Acido. Se conocen bajo la nominación de cuerpos cetónicos a los ácidos: FADH2 Aceto acético. síntesis de del ciclo de Krebs. Aquí estudiaremos también de forma particular el rol C – (CH2)nlo– CO CoA especialmente en el CoA Hcetónicos.SCoA Succinil CoA Sinteasa HSCoA ATP NAD FMN ATP Coenzima Q 2H+ Cit.

4 ml.4 ml.01M Mg SO4 0.3 ml. 0. Colocar 0.6 ml.4 1 0.3 ml.5 ml.3 ml. ------0.3 ml. pH 7.4 ml de KOH 20% en la copa central de cada frasco y un pedazo apropiado de papel filtro plegado en “acordeon”. 0. y luego en el compartimiento principal de cada frasco medir lo siguiente: ATP 0. 0.1 ml. ------0.6 ml. 26 2 0.5 ml.02 M NAD · Sustrato ·· Buffer Fosfato 0. 0. 0.1 M.1.1 ml. . 4 0.5 ml 3 ------0.4 ml. 0. 0. 0.5 ml.6 ml. 0. 0. 0.1 ml.

Preparar además. 7. 2.02 M ( pH 7. Filtrar después de decantar los cristales de la sal. 0.1 ml. (Cuadro de Resultados ) 5.7 ml. 2. un frasco termobarómetro conteniendo 4 ml. Colocar cada frasco en su correspondiente manómetro.1 M y 1 volumen de Fumarato de sodio 0.Interprete y comente los resultados obtenidos en : Sistema Nº 1 : 27 . cuya intensidad de color será considerada de 0 a ++++. Identificación de cuerpos cetónicos: 6. La concentración relativa de cuerpos cetónicos (aceto acetato) en cada tubo será apreciada por la presencia de un color violeta..25 M en buffer Tris 0. cerrar la llave de los manómetros y proceder a la lectura basal. de agua destilada para compensar los cambios de presión y temperatura durante el experimento. .4 ).0 ml. 2.0 ml. 3. Agitar lateralmente y dejar ambos tubos en reposo durante 5 minutos. 0. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: 1. Después de esta fase inicial. 2. . calcular el consumo de oxígeno total de cada frasco y trasvasar el contenido de cada compartimiento principal de los frascos a tubos de ensayo enumerados en forma similar. (Cuadro de Resultados ) 4.01 M. equilibrar durante 10 minutos a 37 ºC en el aparato de Warburg con agitación constante. Enzimas : Homogenizado de hígado de rata en ayunas con 9 volúmenes de sacarosa 0.. Continuar las lecturas cada 10 minutos.. Saturar el contenido de cada frasco con sulfato de amonio sólido y dejar en reposo durante 5 minutos. agregar 3 gotas de NH4OH concentrado y 2 gotas de nitroprusiato de sodio al 5 %..0 ml. Al final del experimento.0 ml. · NAD 3.5 ml. Sustrato ( 5 volúmenes de butirato de sodio 0. ). A un volumen igual de cada filtrado ( por ejemplo 1.0 ml.Agua destilada Enzimas ··· 0.2 ml. 0. sin cerrar la llave de los manómetros. 2.0 mg y 43 mg de nicotinamida. haciendo las correcciones necesarias de acuerdo a los cambios observados en el termobarómetro.

Donde ocurrirá la activación de este ácido graso? ..Sistema Nº 2 : Sistema Nº 3 : Sistema Nº 4 : INTERROGANTES: 1.... por que? 6. por qué? 28 . 5..A través de un diagrama describa la beta oxidación del ácido butírico 2..Cuál es la razón de que se use fumarato junto al sustrato butirato? 3.Calcule cuantos ATPs netos se obtienen cuando el butirato se degrada completamente hasta CO2 y H2O y calcule su eficiencia energética (%).Hay necesidad de carnitina para la oxidación de butirato? .De qué otros modos se podría evaluar la oxidación de los ácidos grasos? 4.

Explicar la relación existente entre consumo de oxígeno y oxidación de ácidos grasos.Qué hormonas intervienen en la movilización de ácidos grasos desde los depósitos? 29 ..... En qué condiciones se acumulan en el organismo 14.Qué hormonas estimulan la capacidad de transformar la glucosa en ácidos grasos? 15.7..Qué finalidad tiene en la presente práctica el empleo de KOH en el compartimiento central del frasco Warburg? 11.Escriba la reacción de síntesis de cada uno de los cuerpos cetónicos 12..Como los cuerpos cetónicos pueden cumplir un rol energético? 13.Qué entiende por cetosis.Cuál es el fundamento de la determinación cualitativa de los cuerpos cetónicos? 10...Un desacoplador de la fosforilación oxidativa tendría algún efecto sobre la oxidación de los ácidos grasos en la presente práctica? 9. Cuáles son los llamados cuerpos cetónicos. 8..

Cual es la principal razón de utilizar acido butírico y no otro acido graso en la presente practica? Cuadro de Resultados.94 298 300 295 280 TB 180 182 260 231 30 270 258 .16.98 KO2 = 1.95 KO2 = 0. Complete los datos del siguiente cuadro TIEMPO ( Minutos) 0’ 10’ 1 2 3 4 KO2 = 0.12 KO2 = 0..

20’ 181 30’ 179 40’ 181 50’ 180 60’ 180 229 175 250 230 220 114 233 221 197 42 215 208 168 298 ----214 198 191 149 140 162 153 Consumo de Oxígeno en l. Cuerpos Cetónicos + +++ 31 + ++++ .

PRACTICA No 5 DEGRADACIÓN DE AMINOÁCIDOS: TRANSAMINACIÓN RELACION DE EXPERIMENTOS 1. Transaminación utilizando un extracto enzimático de hígado de paloma INTRODUCCION La transaminación es el proceso que consiste en la transferencia reversible del grupo amino desde un aminoácido hasta un cetoácido . dando como resultado conversión del primero en un cetoácido y el segundo en un nuevo aminoácido Esta reacción es de gran 32 .

Estas enzima tienen una acción eminentemente intracelular.importancia en el metabolismo de los aminoácidos y es catalizada por enzimas llamadas TRANSAMINASAS o Aminotransferasas. Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un marcado aumento de la actividad de TGO.ceto Glutarato - Enzima O R-C-COO- H NH3 H . pancreatitis aguda. TRANSAMINACION EN PRESENCIA DE UN PREPARADO DE HIGADO DE PALOMA 33 . El cofactor de estas enzimas es el piridoxal fosfato y para casi todas las transaminasas el alfacetoglutarato es el aceptor del grupo amino. incluso antes de la aparición de síntomas clínicos como la ictericia. Un aumento de actividad será evidencia de un deterioro de los tejidos en que se encuentran de los cuales resultan particularmente importantes corazón e hígado. En este caso TGP será la enzima predominante debido a su gran concentración en el tejido hepático. habrá también un incremento considerable de la actividad sérica de transaminasas. presentes en la mayoría de tejidos animales. por lo que la actividad sérica en condiciones normales es baja o nula. En este caso no existirá aumento e la actividad sérica de TGP o será mínimo. En hepatitis vírales u otras formas de enfermedad hepática que involucren necrosis de tejido. NH3 R-CH-COO- O H C=O OOC-CH2-CH2-C-COO  . debido a la liberación al torrente sanguíneo de esta enzima tan abundante en el miocardio. distrofias musculares. etc. Una elevada actividad de transaminasas puede detectarse también en otras condiciones como : traumas accidentales o quirúrgicos. formándose por tanto ácido glutámico.C -NH2 OOC-CH2-CH2-CH-COO- Enzima L-aminoácido + alfa-cetoglutarato Glutamato alfa-cetoácido + L-glutámico El interés clínico está centrado especialmente en dos transaminasas: L-alanina: alfacetoglutarato aminotransferasa (Transaminasa glutámico Pirúvica o TGP) y L-aspartato: alfa-cetoglutarato aminotransferasa (Transaminasa Glutámico Oxalacética o TGO).

2 ml 0. el residuo obtenido es secado a temperatura ambiente obteniéndose así polvos secos.2 ml 0.05 M alfa-cetoglutarato 0. En esta forma la acetona reduce la desnaturalización de las (enzimas) proteínas y concomitantemente produce la desintegración de las estructuras celulares y la disrupción de los enlaces lipoproteicos. fáciles de conservar.2 ml 0.p. por 10 minutos. Preparación del experimento de la transaminación.2 ml - 0.Objetivo: Aplicación de la técnica de cromatografía en capa fina para estudiar la transaminación en presencia de un preparado de hígado de paloma como fuente enzimática.m.05 M Glutamato 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0. Se decanta el sobrenadante y se completa el volumen a 35 ml con agua destilada. La acetona por su acción deshidratante facilita la extracción de enzimas de los tejidos. medir lo siguiente : REACTIVOS Alanina 0. En cuatro tubos de prueba (13 x 100 mm).1 M Piruvato 0.2 ml 0. luego de filtrar y lavar varias veces.2 ml - 0.2 ml - IV 0. El día de la práctica se muelen en un mortero 700 mg de polvos acetónicos con 7 ml de agua destilada y luego se centrifuga el preparado a 2000 r.05 M Aspartato 0.1 M Extracto enzimático Extracto enzimático hervido SISTEMAS II III I 0.2 ml Mezclar el contenido de cada sistema y luego incubar en baño maría a 37 oC durante una hora 34 . previamente lavados con HNO 3 concentrado. utilizando alanina y aspartato como substratos. Procedimientos: Preparación de la fuente enzimática (Polvos acetónicos): Los hígados recientemente extraídos de 4 pichones son homogeneizados en 10 volúmenes de acetona fría durante un minuto.2 ml 0.

10 ul de cada sistema incubado y 2 ul de las soluciones estándar de aminoácidos en alícuotas de no más de 1 ul cada vez...... Mancha Nº 5 . La cromatografía termina cuando el solvente alcanza la línea marcada a 10 cm de los puntos de origen..... Mancha Nº 6 .. en la que se han marcado los puntos de origen a 15 mm del borde inferior... Al final......8 ml de agua..Identificación de los productos de la reacción por cromatografía en capa fina : Cada grupo dispondrá de una placa de vidrio con Silica Gel..2 ml del Aminoácido (Alanina.... Expresión de Resultados: Calcular los Rf x 100 de cada mancha....... Estos sistemas estándares deberán ser preparados de la siguiente manera: Medir 0. Glutamato y Aspartato....... Haga un comentario de cada uno de los sistemas preparados: Rf Rf Mancha Nº 1 .. Mancha Nº 2 ..................... Mancha Nº 4 . colocar la placa en la cámara cromatográfica conteniendo como solvente 75 volúmenes de fenol y 25 de agua.. completar la tabla anterior e interpretar el cromatograma con los resultados obtenidos.05 M y agregar 0... 35 . Glutamato o Aspartato) que previamente se encuentra a concentración 0............... y revelar el cromatograma rociando una solución de ninhidrina al 0.. dejando secar cada área después de cada aplicación. con una distancia entre ellos de 25 mm y en el siguiente orden: Uno para cada uno de los cuatro tubos de experimento y tres para los tres estándares de : Alanina...1% en n-butanol saturado con agua y luego dejarla secar.. Aspártico 3 4 Aplicar utilizando tubos capilares de vidrio y en el punto de origen que les corresponde.. Mancha Nº 7 ...... secarla en la estufa a 110 ºC por 3 minutos........... de 200 x 200 mm. Muesta o Sistema No Rf x 100 1 2 PUNTOS DE ORIGEN Estandar Estandar Estándar Alanina Glutámic. Entonces sacar la placa............ Mancha Nº 3 ... La representación esquemática de los resultados obtenidos luego de revelar el cromatograma se muestra en la página siguiente.

INTERROGANTES BIOQUIMICAS 1... Aminoácido Aminoácido Mancha Nº 1 .......... Mancha Nº 4 .. para el solvente usado en la presente cromatografía............ glutámico y ac...... Tenga en cuenta que los valores de Rf para los aminoácidos: Alanina..................Haga la identificación de cada una de las manchas señalando a qué aminoácido corresponde en base a sus valores de Rf......2 respectivamente.... Mancha Nº 3 .......... 26 y 11. Mancha Nº 6 .. Mancha Nº 2 ... Mancha Nº 7 . Mancha Nº 5 ... ac... Que es Rf Frente del solvente Interpretación de los resultados Obtenidos........... 2 Sistema1 ___________________________ ___________________________ ___________________________ ___________________________ 4 Sistema 2 ___________________________ ___________________________ ___________________________ ___________________________ 1 3 6 5 I II Sistema 3 ___________________________ ___________________________ ___________________________ ___________________________ III 7 IV 36 Sistema 4 ___________________________ ___________________________ ___________________________ ___________________________ ..... Aspártico son de 58.......................

Cuál será la distribución celular de la TGO y TGP ? 37 . Fundamente su respuesta 7. Se desprende amoniaco libre en el medio durante una reacción de transaminación ?.Figura Nº 6.1. Explique el mecanismo que permite la separación de sustancias por cromatografía en capa fina 6.. Cuál es el grupo funcional del cofactor ?. 8. Pronostique el efecto de una deficiencia de vitamina B6 sobre la degradación de los aminoácidos. Explique su mecanismo 4.Cromatograma de la transaminación 2. Que papel desempeña el piridoxal fosfato en las reacciones de transaminación ?. La degradación de los 20 aminoácidos sería afectada ?. Cuales son las reacciones catalizadas por TGO y TGP 3. Cuál es el objeto del sistema 2 5.

Fundamente. 13. alfa-cetoglutarato. Que idearía para determinar la actividad de TGP por un método similar ?.9. Participan las reacciones de transaminación en la biosíntesis de aminoácidos ? 12. 11. Es factible la identificación de cetoácidos mediante cromatografía?. Si en el experimento de transaminación que Ud. De qué manera? 38 . NADH y un exceso de malato deshidrogenasa ?. Señale algunas secuencias de reacciones que permitan explicar este fenómeno. los carbonos marcados se incorporaran en una proteína. Qué aminoácidos espera encontrar marcados preferentemente ?. Que pensaría de un ensayo en el cual una muestra biológica como el suero se mezclara con aspartato. Qué nombre propondría para la enzima involucrada? 14. qué productos se podría identificar?. realiza colocará ácido pirúvico uniformemente marcado con C14. Si se administra glucosa con C14 a un animal. Si se utilizara leucina y -ceto glutarato para estudiar la transaminación. 10.

5 ml 2.25 ml 0. Construcción de la curva de calibración.25 ml Colocar en Baño maría a 37 ºC por 2 minutos y aluego agregar: Suero sanguineo -----50 l Agua destilada -----50 l Mezclar por agitación suave. Después de 2 minutos leer en el fotocolorímetro con filtro verde (500-550 nm). Dejar durante 10 minutos a 37 ºC.O. Métodos. colocar: REACTIVOS B D Sustrato TGP (Alanina y ceto glutarato en Tampon Fosfato pH 7.4) 0. Incubar exactamente por 30 minutos y luego agregar: Reactivo 2.EXPERIMENTO 2 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE ALANINA AMINO TRANSFERASA (TGP) EN SUERO SANGUINEO Objetivos  Estudio de la transaminación en sueros normales y patológicos  Aplicación del método colorimétrico de Reitman y Frankel para la determinación de la actividad de la TGP sérica.25 ml 0. Determinar la cantidad de piruvato formado luego de reaccionar Alanina y  .ceto Glutarato en presencia de la TGP del suero utilizando la reacción con la 2.25 ml Mezclar. Luego agregar: NaOH 0.5 ml Mezclar por inversión y retirar del baño.4 M 2. Para poder convertir la absorbancia de la muestra en unidades de actividad enzimática es necesario construir la curva de calibración respectiva.4 DNFH ( 2. llevando previamente el aparato a cero D. 39 .4 Dinito fenilhidrazina) 0.4 dinitro fenilhidrazina en medio alcalino. Procedimiento: En dos tubos de ensayo rotulados como B (Blanco) y D (Desconocido). con agua destilada.

..Así.Se desprende amoniaco libre en el medio durante las reacciones de transaminación? Fundamente su respuesta.360 0. Coloque en el eje vertical (Y) las absorbancias netas y en el eje horizontal (X) las actividades en unidades/litro de suero. haga en papel milimetrado la curva correspondiente y péguela en el espacio señalado. 3.Complete la siguiente Tabla: SISTEMAS Absorbancia bruta Absorbancia neta Actividad de TGP (U/L) B D 2.300 0.Haga un breve comentario del experimento realizado y del valor de actividad transaminásica obtenida. Interrogantes Bioquímicas.Escriba las reacciones catalizadas por la TGP y TGO. 40 .165 0. Explique su mecanismo de acción..455 Valores Normales. 2.. 1..410 0.Qué papel desempeña el piridoxal fosfato en las reacciones de transaminación. usando los datos de la siguiente Tabla.240 0. Actividad TGP sérica : 6 – 30 U/L Actividad TGO sérica : 8 – 40 U/L Expresión de Resultados: 1. Actividad TGP en U/L Absorbancia (DO) 0 13 28 46 66 90 0.

es suficiente este dato para diagnosticarlo como deficiente en piridoxina?. además del que se usó en esta práctica. 7. 9. podría emplear para detectar los productos de la reacción de transaminación.Se hace referencia de que en el hepatocito TGP es una enzima..Si se administra glucosa C-14 a un animal de laboratorio. Por qué? 5. ¿Qué aminoácidos esperaría encontrar marcados preferentemente? Fundamente su respuesta. 8..De qué manera es de utilidad la determinación de la actividad TGP en el diagnóstico de la deficiencia de piridoxina? Si en un paciente se encuentra disminuida la actividad TGP del suero. 41 .Si en el experimento de transaminación que Ud.Qué otro método. colocara ácido pirúvico uniformemente marcado con C-14...Participan las reacciones transaminación en la biosíntesis de aminoácidos? Cite algunos ejemplos. exclusivamente citosólica.. Está Ud. ha realizado. los carbonos marcados se incorporarán en una proteína? Señale la secuencia de reacciones que permita explicar este proceso. 6..4. de acuerdo con esta afirmación? ¿Cuál sería la distribución intracelular de la TGO? Fundamente su respuesta.

. constituido por unidades de D-glucosa unidas mediante enlaces alfa (1-4) . Aparece en las células como partículas discretas. pero abunda especialmente en el hígado y en el músculo. Determinación de glucógeno hepático en animal tratado con aloxano INTRODUCCION El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa fácilmente movilizable.Qué pensaría de un ensayo en el cual una muestra de suero es mezclada con aspartato. La cantidad de glucógeno varia ampliamente. NADH y un exceso de malato deshidrogenasa? Cuál sería su fundamento? La actividad de qué enzima se estaría midiendo? PRACTICA N° 6 GLUCOGENO HEPATICO RELACION DE EXPERIMENTOS 1. no solamente 42 . Las ramificaciones están separadas unas de otras por lo menos cuatro residuos en las porciones más centrales de la molécula haciéndola más compacta. Determinación de glucógeno hepático en animal alimentado 2. se encuentra en los tejidos animales. es un polisacárido ramificado. polisacárido de reserva.10. las cuales evidentemente son agregados de moléculas con un peso molecular que varia alrededor de 2 X 107. alfa ceto glutarato. El glucógeno. Al igual que la amilopectina del almidón. y ramificaciones ligadas por enlaces alfa (1-6). Determinación de glucógeno hepático en animal tratado con adrenalina 4. Determinación de glucógeno hepático en animal en ayunas 3.

entre diferentes tejidos, sino también dentro de un mismo tejido, dependiendo del
suministro de glucosa y de la demanda metabólica de energía. El hígado y el músculo
contienen los más grandes depósitos de glucógeno, por lo que nosotros nos ocuparemos de
su metabolismo en estos órganos.
En general la dieta afectará más el contenido de glucógeno del hígado que el del
músculo, mientras que el ejercicio físico afectará más el contenido de glucógeno muscular
que el del hígado. Además los depósitos de glucógeno hepático y muscular tendrán
diferentes roles. El glucógeno muscular esta presente para servir como una reserva de
combustible para la síntesis de ATP dentro del músculo, mientras que el glucógeno
hepático funcionará como una reserva de glucosa para el mantenimiento de la
concentración de glucosa en sangre (glicemia).
Un valor típico para el contenido de glucógeno hepático en una persona bien alimentada
es alrededor de 6,5g/100g de tejido; hay mucho menos después del ayuno y mucho más
después de una dieta rica en carbohidratos. El músculo esquelético típicamente tiene
1,4g/100g de tejido, el cual no cambia mucho después del ayuno nocturno o con una dieta
rica en carbohidratos.
El glucógeno hepático puede formarse a expensas de glucosa y otros monosacáridos
(glucogénesis), como también de residuos provenientes del metabolismo intermediario de
los hidratos de carbono, proteínas y lípidos (gluconeogénesis). Las vías de síntesis de
glucógeno (glucogénesis) y de degradación hasta glucosa (glucogenolisis), son
independientes, lo que determina que los mecanismos regulatorios del metabolismo del
glucógeno actúen independientemente.
La glucógeno sinteasa y la glucógeno fosforilasa son las enzimas regulatorias de
síntesis y degradación de glucógeno respectivamente. Ellas son reguladas recíprocamente;
cuando una es estimulada, la otra es inhibida, nunca están completamente activas
simultáneamente.
GLUCOGENO SINTEASA A ACTIVA

OH

Síntesis de glucógeno favorecida
GLUCOGENO FOSFORILASA B INACTIVA

OH

Pi
H2O

ATP
ADP
GLUCOGENO FOSFORILASA A ACTIVA

O-P

43
GLUCOGENO SINTEASA B INACTIVA

O-P

Degradación de glucógeno favorecida
Regulación recíproca de la glucógeno sinteasa y la glucógeno fosforilasa por fosforilación
y defosforilación. Los grupos seril fosforilados se muestran como -O-P
OBJETIVOS:
1. Realizar la determinación de glucógeno hepático
2. Cuantificar los niveles de glucógeno hepático en diferentes estados nutricionales y
hormonales:
-

Animal alimentado normalmente (ad libitum)

-

Animal en ayunas

-

Animal tratado con adrenalina

-

Animal Diabético (tratado con aloxano)

PROCEDIMIENTO:
1. PREPARACION DE LOS ANIMALES EXPERIEMNTALES
a) Rata A: Que recibirá su alimentación habitual sin restricción alguna.
b) Rata B: Que permanecerá en ayunas por lo menos 24 horas antes del
experimento.
c) Rata C : Estando el animal bien alimentado, pesarlo y proceder a inyectarle 0,025
mg de adrenalina por cada 100 g de peso, con dos horas de anticipación a la
práctica. Utilizar una solución de adrenalina que contenga 0,25 mg / ml.
d) Rata D: 24 horas antes del experimento se inyectará por vía subcutánea una
solución de aloxano ( 50 mg / ml ) a razón de 200 mg / Kg de peso.
2. EXTRACCIÓN DEL GLUCÓGENO
Método: Método de krisman
Fundamento:
44

Se trata un trozo de tejido hepático con una base fuerte (KOH) en caliente, siendo
degradadas las proteínas y otros constituyentes; quedando preservado el glucógeno, el cual
es precipitado con etanol y se le hace reaccionar con el yodo para hacer su determinación
colorimétrica. Se aumenta la sensibilidad de esta reacción con la presencia del cloruro de
calcio.
Reactivos:
1. Solución iodo-iodurada: Pesar 0,26 g de yodo y 2,6 g de yoduro de potasio.
Disolver en 10 ml de agua destilada
2. Cloruro de calcio saturado a temperatura ambiente. Pesar 97,7 g de cloruro de
calcio, disolver en 100 ml de agua. Filtrar antes de usar
3. Reactivo de yodo: Mezclar 130 ml de la solución de cloruro de calcio con 0,5 ml
de la solución iodo-iodurada. Guardar en frasco oscuro a 0 °C, durante siete días
máximo.
Procedimiento:
1. En un tubo de centrífuga medir 0,9 ml de KOH al 33 % y colocarlo en un baño
maría hirviente
2. Sacrificar los animales por decapitación y tan rápido como sea posible extraer el
hígado y pesar 100 mg de él. Colocar inmediatamente el trozo de hígado en la
solución de KOH que se encuentra en el baño hirviente y dejarlo allí por 20
minutos, agitando de vez en cuando para permitir la disgregación del tejido.
3. Retirar el tubo del baño y enfriar. Añadir 1,3 ml de etanol al 96% mezclar y
calentar la solución hasta la ebullición teniendo cuidado que no se proyecte.
Enfriar inmediatamente en baño de hielo por 5 minutos, para permitir la
precipitación del glucógeno
4. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos y decantar el sobrenadante. Colocar el
tubo boca abajo sobre un papel filtro
5. Neutralizar el exceso de álcali añadiendo 0,2 ml de cloruro de amonio saturado y
mezclar cuidadosamente con una varilla de vidrio permitiendo que la solución
añadida entre en contacto con toda la pared interna del tubo

45

Preparar un blanco para lo cual se mide 0.... hacer en esta etapa una dilución apropiada. proceder enseguida igual que las muestras problema.192 0....24 mg de glucógeno....6 del reactivo de yodo.... Absorbancia bruta BLANCO ESTANDAR 1 ESTANDAR 2 Absorbancia Concentración neta de Glucógeno (mg) 0.. Para preparar las soluciones estándar se pueden medir 0....... 1. añadir 2... A cada una de estas tres soluciones estándar.338 46 Factor de calibración ..........................18 mg 0..........................6..... Anotar el aspecto y tamaño del hígado de los animales de experimentación Rata A: ...06 mg.......................... Rata C: .... Rata B: .118 0...... 2. Colocar el tubo en baño maría hirviente durante 15 minutos y enfriar.. mezclar y proceder de la misma forma que la señalada para la muestra de hígado.......... 0.6 ml del reactivo de iodo ....... Medir la absorbancia utilizando filtro verde 9... Resultados.........6 ml del reactivo de yodo.... 7............... Observar la cantidad de precipitado después de centrifugar...4 ml de agua destilada y 2.. Añadir 0.............2 ml de agua destilada y 2... 8..4 ml de soluciones que contengan 0. Si la cantidad de glucógeno precipitado es grande..... Rata D: .....

50 0.38 (trat.... Calcular el factor de calibración: . con adrenalina) Rata D 3.98 0. Calcular la concentración de glucógeno en cada una de las muestras Expresar los resultados en mg de glucógeno por 100 mg....35 1..20 (Alimentado ) Rata B 4.. Calcular el porcentaje de disminución del glucógeno en 100 mg de hígado con relación al animal alimentado mg de glucógeno/ 100 mg de hígado RATA A RATA B RATA C 47 Porcentaje de disminución en relación al animal alimentado ..... 200 mg y en el peso total del tejido hepático Peso del hígado (mg) Ab Ab Bruta Neta CONCENTRACION en mg / 200 mg / 100 mg / Hígado Hígado Hígado Total Rata A 5. Graficar la curva de calibración con los datos anteriores...... Utilizando papel milimetrado 5...44 (trat.416 3.ESTANDAR 3 0. con aloxano) 6.50 (ayunas) Rata C 4...32 0.. 4....

Si se administra leucina marcada con C-14 será factible ala identificación posterior de glucógeno marcado con C-14.RATA D 7. Haga la interpretación de los resultados para cada rata: Rata A: Rata B: Rata C: Rata D INTEROGANTES 1. ¿Cómo se explica que el animal diabético tenga menores niveles de glucógeno hepático que su contraparte normal. 3. ¿Qué ventaja tiene la fosforólisis del glucógeno en comparación con la hidrólisis. ¿Qué diferencia hay entre la acción glucogenolílitica de la adrenalina y glucagon en el hígado y en el músculo. Represente esquemáticamente el mecanismo de acción de la adrenalina sobre la regulación en el metabolismo del glucógeno. 4. 2. 3. 48 .

Represente esquemáticamente el mecanismo de acción de la insulina sobre el metabolismo del glucógeno. 49 .5.

PRACTICA No 7 METABOLISMO DE LIPIDOS: HIGADO GRASO EXPERIMENTAL RELACION DE EXPERIMENTOS 1. En este sentido podemos decir que los siguientes procesos se realizan en la: - Oxidación de los ácidos grasos - Síntesis de ácidos grasos y colesterol 50 . Determinación de ácidos grasos en el hígado de una: - Rata control - Rata a la cual se ha administrado Etionina - Rata a la cual se ha administrado Etionina + Metionina INTRODUCCION El rol que cumple el hígado en el metabolismo lipídico es sumamente importante. Producción de un hígado graso en rata 2.

Abajo: Como la etionina afecta la síntesis de lipoproteinas. lo que En ocasiones puede ocurrir ATP alteraciones determina un anormal aumento en su contenido graso. . Esta entidad merece una especial atención del médico ya que Metionil-tRNA Sinteasa tRNA resulta ser con frecuencia el antesala de la cirrosis hepática. lipoproteinas de alta densidad (HDL) - Síntesis de ácidos biliares - Se encarga casi exclusivamente de la síntesis de cuerpos cetónicos PPi de estos procesos en el hígado.- Síntesis de lipoproteinas plasmáticas :Lipoproteinas de muy baja densidad (VLDL). Rol de la Metionina y efecto de Etionina sobre el metabolismo lipídico 51 Arriba: Mecanismo por el cual la metionina participa en la síntesis de lipoproteinas. esta situación se denomina hígado METIONINA METIONIL .AMP tRNA ATP Metionina Adenosil Transferasa Estrógeno S-Adenosiletionina Fosfatidil etanolamina Fosfatidil etilcolina S-adenosilhomocisteina Síntesis Proteica LIPOPROTEINAS FIGURA Nº 7. ATP ATP Metionina Adenosil Transferasa AMP PPi +Desde Pi un punto de vista general podemos considerar hasta cuatro situaciones Estrógeno Met-tRNA importantes que pueden ocasionar hígado graso.. ATP ETIONINA ATP PPi + Pi PPi Metionil-tRNA Sinteasa ETIONIL . S-Adenosilmetionina - Fosfatidil Aumento en laetanolamina cantidad de ácidos grasos que llegan al hígado. sea procedentes de la alimentación o de otros tejidos Fosfatidil Síntesis Proteica Menor oxidación colina de los ácidos grasos en el hígado - Mayor síntesis de ácidos grasos en el hígado - .AMP graso o esteatosis hepática.Disminución en la salida lipídica del hígado generalmente debido a un defecto S-adenosilhomocisteina LIPOPROTEINAS en la síntesis de lipoproteinas plasmáticas.

COOH COOH CH – CH2 – CH2 – S – CH3 NH2 CH – CH2 – CH2 – S – CH2 – CH3 NH2 Metionina Etionina Objetivos: 1. puromicina. de esta manera bloquea la síntesis de lipoproteinas y finalmente la salida de lípidos del hígado. etc. En esta práctica estudiaremos el hígado graso inducido por la etionina. como el tetracloruro de carbono.Nota: Las líneas discontinuas indican que el evento no se está realizando. tomando como parámetro el contenido de ácidos grasos del hígado. en la síntesis de proteínas y de fosfatidil colina. Experimentalmente se puede inducir el hígado graso mediante la administración de diversos agentes. etionina. es común denominador el aumento de triglicéridos Etionina es un compuesto estructuralmente relacionado al aminoácido esencial metionina y por lo tanto tiene un comportamiento de antagonista competitivo..Conocer el mecanismo bioquímico por el cual etionina induce esteatosis hepática 52 . ya que a pesar que el hígado graso puede ser inducid de diversas formas. ácido orótico.

4%. 5 horas y 7 horas después de la primera inyección.Rata tratada con Etionina: Se inyectará intraperitonealmente 3 ml de una solución de DL-Etionina (16. En este experimento se usarán ratas hembras. . DETERMINACION DE LOS ACIDOS GRASOS ..Conocer el fundamento de la determinación de los ácidos grasos en el hígado 3.5 g. Dejar en reposo por 10 minutos para conseguir una adecuada separación de las fases éter de petróleo y etanol-ácido.. 3.Rata tratada con Etionina + Metionina: Recibe el mismo tratamiento que la rata con etionina.5 horas.2. con la ventaja de mirar mejor la separación de las dos fases.Tapar cuidadosamente el recipiente y agitar fuertemente durante un minuto. mezclar y dejar en reposo algunos minutos .Estudiar el efecto de la metionina sobre el hígado graso producido por metionina 4. el que se fragmenta con la ayuda de tijeras y se deposita en un Erlenmeyer de 250 ml. 5 horas y 7 horas después de la primera inyección. Inyectar la misma cantidad a las 2:30. Inyectar la misma cantidad alas 2. . 2.Se calienta la preparación en baño maría hirviente durante 20 minutos.Indicar algunas alternativas de tratamiento en pacientes que sufren esteatosis hepática Metodología.Rata control: Solución salina isotónica 3 ml.Transcurridas 24 horas de iniciado el tratamiento de los animales se les sacrifica y se les retira rápidamente del hígado un trozo de 2.. teniendo cuidado que no se proyecte el contenido.Se le añade luego 10 ml de hidróxido de potasio al 33% y 40 ml de etanol al 96% con alcohol isoamílico al 0. .Añadir 17 ml de HCl al 25%. Para esta última etapa se puede utilizar una probeta en lugar del Erlenmeyer. las siguientes soluciones: 1. pero además se le inyecta 3 ml de L-metionina ( 20 mg/ml ) una hora antes de la primera inyección de etionina y una hora después de cada inyección de etionina.. . 53 .Añadir luego con pipeta volumétrica 25 ml de éter de petróleo..7 mg/ml). El día anterior a la práctica se inyecta vía intraperitoneal a un lote de tres ratas hembras. debido a que el incremento de grasa hepática es mucho más pronunciada en hembras que en machos..

0 INTERROGANTES 1.1 N ml gastados Rata Control 1.Retirar 5 ml de la capa etérea (superior).2 gr Anote el contenido de ácidos grasos en miliequivalentes en el volumen de titulación y en miligramos por gramo de tejido hepático húmedo.Finalmente titular con NaOH 0.. NaOH 0.G. y colocarlos en un Erlenmeyer y añadir 1 ml de solución de etanol-alcohol isoamílico y dos gotas de azul de timol.8 gr 7.3 gr 7.Cite por lo menos cinco alteraciones bioquímicas que se producen en los animales tratados con etionina 54 .Haga una interpretación adecuada de los esquemas mostrados 2.3 Rata con etionina (E) Rata con E + Metionina 3. .. Complete la siguiente tabla: Rata control Rata con etionina Rata con Etionina + Metionina Características del hígado Peso total Color Consistencia 6.6 Contenido de ácidos grasos mEq / 5 ml mEq / 25 ml mg de A.Porque la administración de adenina revierte en cierta forma los efectos de la etionina 3.1 N hasta obtener un color azul verdoso que debe permanecer estable por lo menos 3 minutos. por gramo de hígado 2.. Para efecto de los cálculos asuma que el PM promedio de los ácidos grasos que se están titulando es de 284..

.Qué conocimientos tiene. en relación al hígado graso inducido por etanol 55 ..4.Porqué la deficiencia de ácido pantoténico puede determinar hígado graso 5.

Este aumento puede ser a predominio de la bilirrubina directa (conjugada).Hiperbilirrubinemias por alteración en la conjugación hepática de la bilirrubina IV.Determinación de la bilirrubina directa e indirecta en el suero sanguíneo 2..Hiperbilirrubinemias por sobreproducción de bilirrubina II...PRACTICA N° 8 HIPERBILIRRUBINEMIAS RELACION DE EXPERIMENTOS 1.. en cuyo caso se hablara de hiperbilirrubinemias a predominio indirecto o a predominio directo..Hiperbilirrubinemias por menor captación hepática de bilirrubina III..Identificación de pigmentos biliares en la orina (Reacción de Gmelin) INTRODUCCION Se denominan hiperbilirrubinemias a las enfermedades que cursan con aumento en la concentración de bilirrubina en el suero sanguíneo. Sin embargo resulta más apropiado agrupar las hiperbilirrubinemias en atención al mecanismo de su producción y desde este punto de vista.Hiperbilirrubinemias por alteraciones en la excreción de bilirrubina 56 . se describen cuatro categorías: I.

M HO V M N C H Acido Sulfanílico Diazotizado HSO3 M HO V N N P CH2 M N H H B I L I R R U B I N A M V OH N C H N = NCl M C H P P N CH2Cl P HSO3 N=N M N M C H V N COMPLEJO DE COLOR ROJO Figura Nº 8. EXPERIMENTO 1 DETERMINACION DE LA BILIRRUBINA DIRECTA E INDIRECTA EN EL SUERO (Método: Malloy Evelyn..Para la tipificación de las hiperbilirrubinemias se han descrito diversos análisis de laboratorio.) Fundamento del método. Entre estos podemos destacar : a) Determinación de bilirrubina directa e indirecta en el suero sanguíneo b) Identificación de pigmentos biliares (bilirrubina) en la orina c) Excreción urinaria de urobilinógeno d) Medida de la actividad transaminásica (TGP y TGO) en suero e) Medida de la actividad glucoronil transferásica del hígado f) Medida de la actividad fosfatásica alcalina del suero g) Prueba de la bromosulfotaleina De todas estas determinaciones sólo se practicarán las dos primeras en la presente práctica y se usarán como muestra el suero sanguíneo y la orina de un paciente ictérico y de una persona aparentemente normal.Diazo reacción de Ehrlich 57 OH .

.... 5..0 --2.5 3..Estimar el factor de calibración porcentual Absorbancia del Estándar : .Determinar las bilirrubinas en el suero de un sujeto aparentemente normal 3. BILIRRUBINAS IV Suero Normal Suero A Suero B 0.. II....5 2.Comparar el resultado obtenido en ambas determinaciones Procedimiento 1.Leer en el fotocolorímetro utilizando filtro verde 4...5 Metanol ----Reactivo de Erhlich 0..0 2.004 mg/ml)....5 --0...... 2..Mezclar y dejar en reposo por 20 minutos III 2..Utilizar el procedimiento descrito tanto para el suero del paciente ictérico y el suero normal Expresión de los resultados 1.. Factor de calibración : ...5 ml del reactivo de Erhlich...0 Agua destilada 2... midiendo 2.........5 ml de una solución de bilirrubina (0..Objetivos: 1.... Se midió la absorbancia en las condiciones señaladas para el suero (2 y 3) y se obtuvo una lectura de 0.En 4 tubos de prueba rotularlos como I...224..5 ml de metanol y 0.034 0.5 --- IV 2..052 0.430 0.. Factor de calibración porcentual : ....5 2... 2..Completar la siguiente tabla: ABSORBANCIAS I II III CONC.... III y IV.......5 --Reactivo blanco --0.5 0.0 --2.... medir lo siguiente: I II Suero diluido (1/10) 2..Determinar las bilirrubinas en el suero de un paciente con ictericia..046 58 BT BD BI .Con anterioridad a la practica se preparó un sistema estándar.. se añadió luego 2.. Concentración del Estándar : .....

Suero C 0.Hacer la reacción utilizando la orina patológica y una orina normal Expresión de los resultados Anote sus resultados en el espacio en blanco 1. Procedimiento 1.058 0.. normales (N) o disminuidos (D)..Orina normal 2.194 0.052 3.En un tubo de prueba medir 2 ml de orina 2..Realizar la reacción de Gmelin en una orina normal y comparar el resultado obtenido con el correspondiente a la orina colúrica Método Identificar la presencia de bilirrubina en la orina utilizando la acción oxidante del ácido conteniendo trazas de ácido nitroso (reacción de Gmelin)..Con una pipeta hacer llegar hasta el fondo del tubo.292 0...Realizar la reacción de Gmelin en una orina colúrica 2.Completar la siguiente tabla indicando si los valores de la concentración de bilirrubina directa (BD) y de la bilirrubina indirecta (BI). tratando que se formen dos capas 3.. están aumentados (A).. Bilirrubina directa Bilirrubina indirecta (BD) (BI) MUESTRA A MUESTRA B MUESTRA C EXPERIMENTO 2 IDENTIFICACIÓN DE PIGMENTOS BILIARES EN LA ORINA Objetivos 1.Orina patológica INTERROGANTES 59 .Observar los cambios de coloración que ocurren entre ambas capas 4.. 2 ml de ácido nítrico-nitroso.

.1.. Fundamente su respuesta.Qué tipo de bilirrubina es la que se encuentra en la orina en cantidades trazas en una persona normal? 7.El urobilinógeno da positiva la reacción de Gmelin? 6..Dan positiva los bilatrienos (biliverdina) la reacción de Gmelin...Señale las causas más comunes de un aumento de bilirrubina tipo directa.Qué Contiene el reactivo de Erhlich 2.Porqué no se prepara un tubo blanco para la determinación de bilirrubinas por el método de Malloy Evelyn.A qué se llama ictericia? 8. Tenga en cuenta que los tubos 2 y 4 no corresponden a los blancos que Ud.. esta acostumbrado a preparar.. 5. 3.Cumplen rol fisiológico los pigmentos biliares? 9..Qué bilirrubina es la que se determina en el tubo Nº 3 y por qué? 4.. 60 .

61 .

Los exámenes de laboratorio resultaron normales.N. No había sufrido ningún trauma en ese dedo. El Paciente no podía flexionar ni extender las articulaciones de dicho dedo y el movimiento pasivo de las mismas le causaba un intenso dolor.64 mmoles / L. quejándose de un dolor muy intenso en el primer dedo del pié derecho y que había comenzado 6 horas antes de la consulta. Este material fue informado como cristales de urato de sodio. Se obtuvo mediante aspiración con una aguja. se le indicó para su tratamiento Alopurinol por vía oral a la dosis de 150 mg dos veces al día. pero al examen clínico aparecía rojo e hinchado. A los pocos días de iniciado el tratamiento el ácido úrico 62 . 0.6 g / 24 hrs.es un empleado de 47 años de edad que asistió al servicio de emergencia de un hospital. con excepción de una excreción urinaria de ácido úrico de 1.21 g / 24 hrs (V.3 a 0. una muestra de líquido de la articulación comprometida y la observación bajo microscopía de luz polarizada reveló la presencia de cristales semejantes a agujas y que se encontraban también fagocitados por leucocitos.T. El resto del examen clínico fue completamente normal. Estaba con mayor temperatura y extremadamente doloroso a cualquier presión.PRACTICA-TALLER Nº 9 ALTERACIONES EN EL METABOLISMO DE LOS NUCLEOTIDOS Caso Clínico 1 N. En Vista de lo anterior.) y una concentración de ácido úrico en el suero de 0.S. nuestro paciente fue diagnosticado como gotoso y una vez mejorado el cuadro agudo.

Caso Clínico 2 Nuestro paciente es ahora una niña de 22 meses de edad.. que se manifestó por infecciones respiratorias frecuentes. no volviendo a presentar un episodio similar de artritis gotosa e igualmente no se constató manifestaciones sugerentes de la presencia de cálculos renales de ácido úrico.Representación esquemática del aspecto del electroforetograma de las isoenzimas de ADA. Los resultados se muestran en la figura adjunta y corresponden a la separación electroforética de las dos isoenzimas más importante de la ADA y su tinción para determinar su actividad.Niña afectada 3. tos convulsiva y tétano produjo una mínima respuesta en la niña.. La administración de vacuna contra la difteria.. Se considera linfopenia en niños cuando el número de linfocitos es menor a 3000 por microlitro de sangre. menos de 500 linfocitos por microlitro de sangre. Desde su nacimiento presentó una severa deficiencia de linfocitos T.. El Paciente fue controlado durante los meses siguientes.Control norma (b)l Figura.Control normal (a) 2. La determinación espectrofotométrica de la actividad total de la ADA demostró ausencia de actividad en los hematíe de la niña .sérico comenzó a bajar y luego de varias semanas dichos valores ya estaban muy cerca de lo normal. luego de su tinción para medir su actividad 63 2 3 4 5 .. Canaletas: 1 1. candidiasis y marcada linfopenia. única hija de un matrimonio entre primos hermanos.Madre 4... haciéndose el mismo estudio en ambos padres y en dos controles normales. en tanto que el padre y la madre tenían actividades de ADA que correspondían al 50 % y 60 % de lo normal respectivamente.Padre 5. Se practicó la determinación de la actividad de las isoenzimas de Adenosina Desaminasa (ADA) en un lisado de hematíes de la paciente. normalmente los linfocitos T son cerca del 50 % del número total de linfocitos.

Las células fagocíticas intentan digerir este material.ENFERMEDADES ASOCIADAS A ALTERACIONES EN EL METABOLISMO DE LOS NUCLEOTIDOS PURICOS Y PIRIMIDINICOS..ALTERACIONES EN EL CATABOLISMO DE LAS PIRIMIDINAS Aciduria Orótica Tipo I Orotatofosforribosiltransferasa y OMP Descarboxilasa Aciduria Orática Tipo II OMP Descarboxilasa Aciduria Orótica Moderada sin el Ornitina carbamil transferasa (enzima del componente hematológico Ciclo de la úrea). GOTA. Es el transtorno más frecuente del metabolismo de los nucleótidos y se caracteriza por una excesiva producción de ácido úrico. se detrminaron los niveles de desoxinucleótidos de adenina en los eritrocitos...Niveles de desoxinucleótidos de Adenina en los eritrocitos de la niña afectada (nmoles/ml de paquete de hematies PACIENTE NORMAL NSD: No se detecto dATP ( nmoles/ml) 904 NSD dADP (nmoles/ml) 98 NSD dAMP (nmoles/ml) 5 NSD Bases Moleculares y Correlato Clínico-Bioquímico. Muestra las diferentes enfermedades asociadas a alteraciones en el metabolismo de nucleótidos púricos y pirimidínicos TABLA Nº 2 . TABLA 1. que a causa de su escasa solubilidad en el agua tiende a precipitar como cristales de urato de sodio. PRPP Amidotransferasa HGPRT (parcialmente) Síndrome de Lesch-Nyhan HGPRT (completamente) Inmunodeficiencia Severa Combinada Adenosina Desaminasa ADA (SCID) Xantinuria Xantino Oxidada Inmunodeficiencia Purinonucleósido Fosforilasa (PNP) Enfermedad de Von Gierke Glucosa 6 Fosfatasa 2. de manera especial en el líquido sinovial de las articulaciones.En la niña deficiente de ADA. pero su 64 .ALTERACIONES EN EL CATABOLISMO DE LAS PURINAS Enfermedad Enzima afectada Gota PRPP Sinteasa. obteniéndose los resultados que se muestran en la tabla siguiente.. Si bien se ha descrito varias enfermedades asociadas a alteraciones en el metabolismo de los nucleótidos púricos y pirimidínicos. las alteraciones que predominan en humanos son aquellas que resultan de un alterado catabolismo de los nucleótidos púricos. La Tabla 2. 1.

La incidencia familiar es del 70 al 80% y es mucho más frecuente en varones que en mujeres (proporción 3 a 1). La excreción urinaria varía normalmente entre 0. Al cambiar la estructura de la enzima su afinidad por el sustrato aumenta (menor KM) y por lo tanto aumenta la síntesis de PRPP. La manifestación bioquímica característica de la gota es el aumento de ácido úrico en sangre (hiperuricemia) y casi siempre esta acompañada con aumento en su excreción urinaria (uricosuria). etc. por algún cambio en la estructura de la misma. La primera corresponde al transtorno producido por alteración genética.  Resistencia de la PRPP sinteasa a su inhibición por retoalimentación. cerca del 3% en los EEUU y en otros países parece ser muy similar. la policitemia.0 mg % en mujeres y debe tenerse en cuenta que estos valores aumentan con la altitud. 65 . Se acostumbra clasificar a la gota en primaria y secundaria.6 a 6.  Aumento en la afinidad de la enzima por la Ribosa 5P.3 a 0.5 a 7. La frecuencia con la que se presenta al gota es relativamente alta. la secundaria es consecuencia de otras alteraciones. el uso de antimetabolitos para disminuir la síntesis de ácidos nucleicos. Sería el caso en que sus metabolitos reguladores. Se han descrito diversas situaciones que pueden explicar la mayor producción de ácido úrico en un paciente gotoso.6 g/día. Destaquemos las siguientes:  Aumento en la actividad de la fosforribosil Pirofosfato Sinteasa (PRPP sinteasa). AMP e IMP que normalmente se unen a la enzima y la inactivan. como el GMP. Los valores normales para el ácido úrico en sangre son de 3. no se pueden unir y por lo tanto sigue aumentando la síntesis de nucleótidos púricos. Estas enzimas a su vez determina una reacción inflamatoria aguda de la capsula articular (sinovitis) determinando las típicas manifestaciones de la artritis gotosa.  Aumento en la afinidad de la PRPP amidotransferasa por el PRPP motivado por una alteración en la estructura de la enzima. como la leucemia.tamaño y la indigestibilidad de los cristales causa más bien la destrucción de estas células y la liberación de sus enzimas lisosomales al espacio articular.0 mg % en varones y de 2.

GDP y GTP) no pueden hacerlo. Sindrome de Lesch-Nyhan. ATP.O N N H N H Xantina Hipoxantina Figura Nº X. En el tratamiento de la gota se usa un análogo de hipoxantina que es el Alopurinol. Recordemos que la Xantino Oxidasa cataliza la conversión de hipoxantina en xantina y posteriormente de la xantina en ácido úrico (ver figura). Este compuesto permanece unido al complejo Mo-S de la enzima y lo inhibe. Estando en el medio el alopurinol. El síndrome de Lesch-Nyhan resulta de una alteración a nivel del gen que codifica para la enzimahipoxantina-guanina fosforribosil transferasa. O O HN N N X. Los nucleótidos que normalmente la inhiben (AMP. que está localizado a nivel del cromosoma X (Xq26-q27.O HN N O N H Alopurinol Aloxantina O O N HN N H N H O N HN X.  Deficiencia pacial en la actividad de la enzima Hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa ( HGPRT) que impide la reutilización de hipoxantina y guanina determinando su destino hacia la mayor formación de ácido úrico. ADP. no permitiendo la formación de más ácido úrico.2) determinando una enfermedad que se transmite bajo la 66 .O O N H HN H N O O N H N H Acido Urico Efecto inhibitorio del Alopurinol sobre la Xantino Oxidasa También se ha descrito que el alopurinol puede reaccionar con el PRPP formando el nucleótido correspondiente y utilizando PRPP y determinando que bajen sus niveles y disminuya la síntesis de purinas. GMP. la xantino oxidasa lo hidroxila y lo convierte en aloxantina (oxipurinol). Perdida de la inhibición por retroalimentación de la PRPP amidotransferasa.

(2004) Gout. Mosby. COWAY T.BBRC 272:311-315. Lippincott-Raven. El pronóstico es malo y generalmente estos pacientes mueren antes de alcanzar los 20 años de edad. A case-oriented approach.. and HARVER R. ALDRICH M. Biochemistry. (2000). frecuentemente se muerden las extremidades distales de los dedos y los labios. durante el catabolismo de las purinas. II ed. The importance of adenosine deaminase for lymphocyte function. hay una marcada deficiencia de la enzima Adenosina Desaminasa que normalmente cataliza la remoción del grupo amino de la desoxiadenosina y de la adenosina. CHAMPE P. los pacientes muestran movimientos involuntarios y retardo mental. St Louis.. Como los linfocitos tienen que proliferar en respuesta a los invasores que llegan al organismo. USA. SPECTOR A. La alta concentración de éste nucleótido inhibe a la Ribonucleótidoreductasa evitando la formación de otros dNTP y por lo tanto inhibiendo la síntesis de ADN. Current Opinion in Rheumatology 16: 282-286 67 . VI Ed. En esta enfermedad también denominada Inmunodeficiencia Severa Combinada8SCID). Deficiencia de Adenosina Desaminasa.modalidad ligada al sexo. MONTGOMERY R. Los pacientes tiene severas manifestaciones de gota. BIBLIOGRAFIA. la respuesta inmune fracasa y los niños portadores de esta enfermedad no pueden superar el menor proceso infeccioso y frecuentemente mueren antes de los 2 años de edad. (1996) Biochemistry. and PEDRZ T. PASCUAL E. La severidad de esta alteración hace ver la importancia de la vía de síntesis de nucleótidos púricos por la vía de recuperación y parece ser que ésta síntesis a nivel extrahepático es sumamente importante y se vería completamente afectada en estos pacientes. Estas células acumulan grandes cantidades de desoxiadenosina que al ser fosforilada rinde grandes cantidades ( 50 veces más de lo normal) de dATP. and CHAPELL D. and BLACKBURN M. and KELLENS R. Las células que más sufren la deficiencia de esta enzima son los linfocitos T y también los linfocitos B. contribuyendo a explicar la severidad de su cuadro. Crystal deposition diseases. (1996). USA. Philadelhia. Junto a lo anterior. ya que hay un gran aumento en la formación de ácido úrico y además desarrollan conductas sumamente agresivas que los lleva a su propia automutilación.

. JAMA 289: 2857-2860 CUESTIONARIO 1.. Gout.Explicar la hiperuricemia de los pacientes con el síndrome de Lesch-Nyhan. and AGUDELO C. (2003).ROTT K. Qué aminoácido sería el más apropiado y como se procesaría dicha prueba? 4..Qué alimentos por su alto contenido en purinas deben ser excluidos de la dieta del paciente gotoso? Es suficiente este tipo de tratamiento para normalizar los valores séricos de ácido úrico en los pacientes gotosos? 5. 68 .Expresar la concentración del ácido úrico del paciente del caso clínico 1. en mg% (PM del ácido: 168). 2.. Proponga alguna explicación sobre la causa de las alteraciones neurológicas que estos pacientes presentan. en comparación con un control normal cuyo valor resultó 3 x 10-4 M.Para determinar si una persona con gota ha desarrollado su enfermedad por una sobreproducción de ácido úrico o a causa de una disminución en su capacidad de excretarlo. Utilizando estos datos proponga el mecanismo que explicaría la hiperuricemia del paciente.La concentración intracelular del PRPP es normalmente es de 10 -5 a 10-6 mol/L. 3.. se hace con frecuencia la prueba de la administración oral de un aminoácido radioactivo. La determinación de la KM de la fosforribosil pirofosfato amidotransferasa para PRPP en un paciente gotoso dio un valor de 2 x 10-5 M.

Explicar la hiperuricemia que se encuentra frecuentemente asociada: a) A la deficiencia de glucosa 6 fosfatasa (Enfermedad de Von Gierke) y b) A la hiperactividad de la glutatión reductasa. cristales de urato disódico en algún lugar del organismo? 10..Cómo se explica que los cristales de ácido úrico en el líquido articular de los gotosos corresponda a urato monosódico.detectar solamente las dos isoenzimas más importantes de la Adenosina Desaminasa? 69 . Podría encontrarse en estos pacientes. cómo se puede mediante la técnica utilizada.. Teniendo en cuente que en los hematíes hay una gran cantidad de proteínas. Por qué mecanismo (s) el alcoholismo puede determinar hiperuricemia? 11..Cuál es el mecanismo de acción de la colchicina en el tratamiento de la gota? En que momento se le usa? 9. en cambio en la orina de los mismos pacientes los cristales sean frecuentemente de ácido úrico solamente.Que explicación puede dar a los resultados mostrados en el electroforetograma de las isoenzimas de ADA en el caso clínico 2?. 7.6...Como actúa el alopurinol en el tratamiento de la gota? Por qué se señala que el alopurinol es un inhibidor suicida? 8..

.Que evidencia (s) existe (n) que los altos niveles de dATP en los pacientes con deficiencia de ADA sean los que inhiban a la Ribonucleótidoreductasa y determinen menor síntesis de ADN y con ello el daño a los linfocitos? 15. METIONINA S..De qué manera se ven afectadas las reacciones de metilación en que interviene SAdenosil Metionina (SAM).. en los pacientes con deficiencia de ADA. Utilice en su explicación el siguiente esquema.Como se explica la linfopenia del paciente del caso clínico 2 y los continuos cuadros de infección respiratoria que presentó? 13.12.ADENOSILMETIONINA (SAM) Metil Transferasa X X – CH3 S-ADENOSILHOMOCISTEINA (SAH) Hidrolasa HOMOCISTEINA 70 ADENOSINA .

71 .

Determinación de cuerpos cetónicos en orina INTRODUCCION. Determinación de glucosa en sangre 3. El metabolismo intermediario de cada clase de sustrato por lo general es considerado por separado. Un aspecto muy interesante en la regulación del metabolismo celular corresponde a la participación de las hormonas que son sintetizadas en tejidos específicos (Glándulas) secretadas a al sangre y luego transportadas hasta alcanzar sus células “blanco”. sin embargo. caso contrario sobrevendrá una enfermedad. donde las diferentes vías metabólicas se hallan enlazadas. Esta integración exquisitamente regulado. Producción de Diabetes Experimental 2. de esta intima y armoniosa organización dependerá la función integrada de todas las células que conforman un organismo. es la que permite a cada célula llevar a cabo sus funciones bioquímicas y sin duda. estos procesos ocurren en nuestro organismo en forma concertada. donde previa interacción con sus receptores ejercerán sus efectos regulatorios fundamentalmente a través de : - Activación o desactivación de enzimas ya existentes en las células “blanco”.PRACTICA Nº 10 INTEGRACION Y REGULACION DEL METABOLISMO RELACION DE EXPERIMENTOS 1. formando una verdadera red metabólica controlada rigurosamente por diferentes mecanismos regulatorios. a través de segundos mensajeros 72 . Determinación de glucosa en orina 4.

lípidos y proteínas diferencias en cuanto a la etiología y alteraciones metabólicas entre los dos tipos mencionados. Grasos Piruvato Colesterol Acetil CoA Albúmina Ac. productores de insulina. 3 PG Glicina  Ceto ácidos Alanina A. En esta práctica centraremos nuestra atención en algunas acciones metabólicas de la insulina usando como modelo experimental el estado diabético. Grasos GA 3 P Di OH A P Albúmina NH4 Serina VLDL Ac.. aquí el paciente alivia sus síntomas por administración de antidiabéticos que 73 . Grasos Acetil CoA Acetil CoA Oxalacetato Aspartato TG Ac. La diabetes Mellitus es una enfermedad producida por la carencia absoluta o relativa de insulina en el organismo. En tanto que en la diabetes tipo II la causa primaria es un defecto en la respuesta a la insulina.. se conoce dos tipos de esta enfermedad: La diabetes tipo I o insulino dependiente y la diabetes tipo II o insulino no dependiente. pero lo que caracteriza a cada uno de ellas y les da el nombre es el hecho de que en la diabetes tipo I. la causa primaria es un defecto o destrucción de las células beta del páncreas. Grasos Albúmina Cuerpos Cetónicos CK Acetil CoA Acetil CoA Asparragina CADENA RESPIRATORIA Figura Nº 9.- Inducción de la síntesis de enzimas o alguna otra proteína.Integración de las vías metabólicas de carbohidratos. y el paciente solo se alivia con la administración de insulina. Hay varias PROTEINAS GLUCOSA Glucosa 6 P NADPH2 Aminoácidos Ribosa 5 P TRIGLICERIDOS Glucógeno Glicerol Ac.

5.0. Esta sustancia también es tóxica y hepatotóxica pero a dosis mayores.estimulan la secreción de insulina por las células beta del páncreas y raramente hacen cetosis. En cambio en la Diabetes tipo I La cetosis es común y aparece en etapas tempranas de la vida niñez o juventud.3% 2-4% Presencia de anticuerpos contra SI NO islotes Complicaciones Frecuentes Frecuentes Secreción de insulina Casi nula o nula Normal o casi normal Tratamiento con insulina Siempre necesaria No es necesario Resistencia a la insulina Ocasional Usual Hay muchas sustancias que pueden producir los síntomas diabéticos cuando son administrados al organismo debido a que pueden producir un deterioro o destrucción de las células beta del páncreas. Características distintivas entre la diabetes mellitus insulino dependiente (Tipo I) y la diabetes mellitus no dependiente de insulina (Tipo II). CARACTERÌSTICAS TIPO I TIPO II Edad de inicio Menos de 30 años Mas de 40 años Cetosis Común Raro Peso corporal No obeso Obeso (80%) Prevalencia 0. Causa un daño permanente de las células beta de los islotes de Langerhans.6 tetraoxipirimidina o pirimina tetrona). produciéndose un cuadro de diabetes mellitus humana. TABLA I.4. con la consiguiente ausencia parcial o total de insulina. La tabla I resume las características más importantes de ambos tipos de diabetes. O HN es un antibiótico de amplio espectro obtenido de Streptomyces achromogenes produce necrosis de las O células beta y su acción es más selectiva sobre dichas NH 74 Aloxano . Una de las sustancias que produce diabetes es el aloxano (2. O La estreptozotocina es otra sustancia que causa diabetes. Además la diabetes tipo II aparece en épocas tardías de la vida (Después de lo cuarenta años ) y la herencia juega un rol importante.2.

células que el aloxano razón por la cual ahora se el usa mas en diabetes experimental. la 8-hidroxiquimolina.3% Mezclar bien y dejar en reposo por 5 minutos.0 ml de NaCl 0. Otras sustancias con capacidad de producir diabetes por afectar a las células beta de los islotes de Langerhans son el ácido dehidroascórbico.2 ml de sangre 0. luego filtrar o centrifugar para recuperar el filtrado libre de proteínas - Determinación de glucosa : En tubo de Folin Wo medir lo siguiente : 1 ml de filtrado libre de proteínas 1 ml de reactivo cúprico alcalino mezclar y calentar en baño maría hirviente por 15 minutos Enfriar en agua corriente y luego añadir: 1 ml de reactivo arseno-molibdato 75 . NOTA: EL uso de este método requiere la desproteinización de la muestra sanguínea a fin de evitar interferencia en las reacciones que deben depender únicamente de la glucosa) Fundamento: El filtrado libre de proteínas se calienta en presencia de una solución cúprico-alcalino (Cu++) obteniéndose la reducción del cobre a CuO. utilizando el método colorimétrico ( Nelson y Somogy).4 ml de hidróxido de Bario al 0.9 % 0. el cual actúa luego sobre el arsenomolibdato produciéndose un complejo de molibdeno reducido de color azul.4 ml de Sulfato de Zinc al 5% 0. la ditizona y otras quimolinas. cuya intensidad se mide en el fotocolorímetro Procedimiento: - Desproteinizado: En un tubo de ensayo medir : 3. pero su acción diabetogénica es menos pronunciada y menos específica que el aloxano y estreptozotocina. EXPERIEMNTO 1 DETERMINACIÒN DE LA GLICEMIA Objetivo : Determinar la concentración de glucosa en sangre de un paciente .

Completar los espacios en blanco Lectura Bruta Lectura Neta Tubo blanco ____________ ____________ Tubo Muestra (N) ____________ ____________ Tubo Muestra (P) ____________ ____________ Concentración de Glucosa en la muestra (N) es de ___________mg/100 ml Escriba en el espacio en blanco si el valor obtenido es Normal. Alto o Bajo _________ EXPERIMENTO 2 DETERMINACION DE GLUCOSA EN ORINA Objetivo : Determinar la concentración de glucosa en orina utilizando la prueba de Benedict Fundamento : Esta reacción redox ocurre más rápidamente en medio alcalino. dejar en reposo por 5 minutos y leer en el fotocolorímetro con filtro verde.Mezclar suavemente. Estimar el Factor de calibración porcentual Absorbancia blanco __________________ Absorbancia bruta del estándar __________________ Absorbancia neta del estándar __________________ Concentración del estándar __________________ Factor de calibración __________________ Factor de calibración % __________________ 2. así cuando se calienta una suspensión de hidróxido cúprico en medio alcalino y en presencia de una sustancia 76 . mezclar por inversión. La lectura en el fotocolorímetro fue de 67 UK (D. Alto o Bajo _________ Concentración de Glucosa en la muestra (P) es de ___________mg/100 ml Escriba en el espacio en blanco si el valor obtenido es Normal. Medir 1 ml de ésta solución y colocarla en un tubo de Folin Wo y proceder como para el caso de la muestra. O : 0. Preparar un blanco usando 1 ml de agua destilada en lugar del filtrado. Resultados 1.134). añadir agua destilada hasta la marca de 25 ml. Preparar un estándar de glucosa que contenga 50 g/ml.

ORINA N _______________ DIAGNOSTICO: ___________________ ORINA P _______________ DIAGNOSTICO: ___________________ EXPERIMENTO 3 DETERMINACIÒN CUALITATIVA DE CUERPOS CETÒNICOS EN ORINA Objetivo: Identificar la presencia de cuerpos cetónicos en orina utilizando la reacción del nitroprusiato en medio alcalino Fundamento: El método se basa en que al acetona y el acetoacetato al reaccionar con el nitroprusiato de sodio en medio alcalino forman un complejo de color violeta indicando la positividad de dicha reacción. explicando lo observado _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _____________________________________________________________ 77 . Mezclar bien - Hervir durante 3 minutos - Anotar el resultado explicando lo observado Resultados : Llene el espacio en blanco escribiendo (+) cuando hay precipitado o coloración rojo ladrillo y (-) cuando no lo hay.reductora. como algunos carbohidratos (glucosa) . Procedimiento: - Colocar unas gotas de orina sobre el reactivo nitroprusiato de sodio en medio alcalino - Mezclar bien y esperar unos minutos para observar la aparición de color Resultados: Anotar el resultado. el hidróxido cúprico se reduce a oxido cuproso (precipitado de color rojo ladrillo) Procedimiento : - Colocar 5 ml de l reactivo de Benedict en un tubo de ensayo - Añadir 8 gotas de muestra de orina.

Cuál es la razón de emplear fluor en la mezcla anticoagulante para la sangre cuando se va a determinar glucosa en la muestra 78 ..Por qué razón se produce cetonuria en el estado diabético 2.. a un diabético insulino no dependiente? 3.Cómo se encontraran los ciclos alanina – glucosa y Cori en un diabético no tratado 6.Cómo se explica la hiperglicemia y glucosuria que presentan los diabéticos de tipo II 5.....Qué tipo de dieta le daría Ud.INTERROGANTES 1.Mediante un esquema señale las principales rutas de señalización para el mecanismo de acción de la insulina.. 4.En qué casos se indica la prueba de tolerancia a la glucosa? 7.

.Qué es la hemoglobina glicasada.Por que en un paciente diabético insulino dependiente...8. a cuál de ellos se asemeja. la diabetes causado por aloxano.Considerando los tipos de diabetes i y II.Cómo se encontrará la gluconeogénesis en una persona con Diabetes tipo I no tratada? Por qué? 11. uno de los problemas que se le presenta es la hipoglicemia? 79 . y que importancia tiene en el estudio de la diabetes 10.. Por qué? 9.

lípidos)..PRACTICA Nº 11 PEROXIDACION LIPIDICA RELACION DE EXPERIMENTOS 1. que presentan un electrón desapareado en su orbital externa. el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo libre (OH·).Inducción y evaluación de la peroxidación lipídica INTRODUCCION. De estos intermediarios en la reducción del oxígeno hacia agua. los peróxidos lipídicos así formados. colapsando las gradientes de iones. pues está involucrado en reacciones tales como la peroxidación lipídica y generación de otros radicales tóxicos. prevalentes en las células. ácidos nucléicos. causan daño a la mayoría de macromoléculas de las células (proteínas. tales como el malondialdehido y el hidroxinonenal. el radical hidroxilo se ha descrito que extrae átomos de hidrógeno de los lípidos (fosfolípidos) de membranas (ácidos grasos poliinsaturados) e inician las llamadas reacciones de peroxidación lipídica. se descomponen a especies carbonilo reactivas. pero éste es convertido en radical hidroxilo a través de las reacciones de Fenton o Harver-Weiss en presencia de Fe2+ o Cu+. El peróxido de hidrógeno. Los radicales libres son definidos como moléculas o sustancias altamente reactivas. y 80 . los cuales a su vez reaccionan con proteínas. dañando la integridad de la membrana celular y la integridad de proteínas transportadoras. por si sólo no es un radical libre. La transferencia de electrones hacía el oxígeno resulta en la formación de los siguientes intermediarios como son el anión superóxido (O 2-). lo cual puede iniciar una cadena de reacciones al remover un electrón de otra molécula para completar la suya. el radical hidroxilo es indudablemente el radical libre de oxígeno más dañino. Los radicales libres de oxígeno (o Especies Reactivas de Oxígeno). Así.

injurias.Complejo Acido TiobarbituricoMalondialdehido N OH HO N 81 CH – CH = CH OH SH N OH . EXPERIMENTO Nº 1 Determinación de Malondialdehido como medida de peroxidación lipídica. infecciones.. glutation peroxidasa. Objetivos: 1.). Preparar los sistemas biológicos de estudio. Fundamento: El Malondialdehido (MDA) forma un aducto 1:2 con el ácido tiobarbitúrico produciendo el siguiente compuesto (complejo Acido Tiobarbitúrico–Malondialdehido): N S Figura Nº 10 . No obstante. Como se puede entender. ingesta de drogas. sin embargo. cumplen un rol importante en las células fagocíticas para hacer frente a infecciones bacterianas. Determinar la concentración de malondialdehido en los sistemas de estudio.. Sin embargo. igualmente existen mecanismos de defensa. sino también para poder evaluar las bondades antioxidantes de muchos productos naturales. generados por algún agente causal. la generación de radicales libres es un hecho natural que ocurre normalmente en las células.). Interpretar los resultados y discutir los alcances del uso de esta técnica en trabajos de investigación. vitamina E. a partir de hígado de rata para la inducción de peroxidación lipídica. etc. La evaluación de la peroxidación lipídica a través de la determinación de Malondialdehido. etc.conduciendo así hacia la muerte celular. sin embargo. se constituye en una prueba muy útil no sólo para conocer la presencia de radicales libres. lo que explica el peligro que entraña la sobreproducción de estos radicales. conocidos como antioxidantes (superóxido dismutasa. 3. estas especies reactivas de oxígeno inclusive. etc. 2. carotenos. un organismo puede responder con una sobreproducción de estos radicales. que permiten contrarrestar la presencia de estos agentes dañinos. Estos procesos fueron muy bien documentados por estudios en hematíes. flavonoides. por lo que se hace imprescindible potenciar las defensas antioxidantes ya sea endógenas o a través de la dieta con la ingesta de alimentos con alto potencial antioxidante ( vitamina C. hoy se sabe que similares procesos también ocurre en células nucleadas. bajo ciertas condiciones tales como radiaciones. glutation reductasa.

En la presente práctica. aunque esta reacción tiene mucha más alta sensibilidad cuando se mide por fluorometría. incluyendo aldehídos e hidroperóxidos lipídicos. Estas sustancias retornan a sus niveles normales con el tiempo. lo que se indica el siguiente cuadro: Nº de Concentración de Volumen de MDA Volumen del Estándar MDA (nmol/ml) Estándar (l) diluyente (l) 1 2 3 4 Blanco 12. (Absorbancia (DO) vs Concentración de Malondialdehido (nmoles/ml). 82 . contienen una mixtura de Sustancias Reactivas al Acido Tiobarbitúrico (TBARS). construya la curva de calibración para el malondialdehido. dependiendo de la presencia de antioxidantes. En la práctica. pueden emplearse cualquiera de los dos.de color rojo-naranja. sin embargo. En el presente ensayo. las TBARS son expresados en términos de malondialdehido (MDA) equivalentes. se usa un estándar de malondialdehido para construir la curva estándar respectiva. Muchas muestras biológicas. Preparación de la Curva de Calibración: Rotular 9 tubos de ensayo y proceder a medir en cada uno de ellos. los cuales se incrementan como resultado del stress oxidativo. el cual puede ser medido por fluorometría o espectrofotometría.5 25 50 100 0 125 250 500 1000 0 875 750 500 0 1000 Absorbancia (DO) Con los datos obtenidos. por razones técnicas se la hará por espectrofotometría (colorimetría).

El proceso de triturado no debe demorar más de 10 minutos. Transcurrido el tiempo de incubación. de homogenizado de hígado al 10 %e iniciar la peroxidación lipídica añadiendo 100 l de sulfato ferroso (FeSO4) 15 mM. Preparar un sistema sin FeSO 4.5 gramos de hígado y mantenerlo siempre sobre hielo. Tamizar el tejido utilizando una malla metálica. Acido tricloroacético ( Cl3CCOOH ) 5 %. para lavar la sangre.67 % en ácido acético al 50 %. hasta obtener un homogenizado homogéneo. 6. 5. Separar y guardar el filtrado a 0 ºC. 83 .. Pesar 2. 1. Recuperar las membranas (tejido parenquimal) que queda sobre la malla 4. Incubar los sistemas por 1 hora a temperatura ambiente. Centrifugar a 15. para hacer los ensayos de peroxidación lipídica. 2. Se recomienda utilizar el filtrado fresco para cada ensayo. 4. Filtrar el homogenizado con la ayuda de una gaza. 3. Colocar las membranas en un mortero frío (sobre hielo) y triturar con 25 ml de KCl 0. 1.000 rpm durante 5 minutos. b) Inducción y determinación de la peroxidación lipídica. Procedimiento: a) Preparación del homogenizado de hígado de rata al 10%. 2. tomar 200 l de cada sistema y mezclar por agitación con 200 l de ácido tricloroacético al 5 %. que servirá como control. presionando el tejido contra la malla y agregando KCl 0. Medir 3.15 M FeSO4 15 mM Acido Tiobarbitúrico ( C4H4N2O2S ) 0.15 M frío.0 ml. 3.Reactivos: KCl 0.15 M frío.

6. 4 40 0.036 Estand.003 Sistemas de estudio Muestra 1 Muestra 2 Concentración de MDA (Moles / L) . a partir de la curva de calibración.0 ml de Acido tiobarbitúrico 0.153 Estand.094 Estand. 8 200 0. 6 100 0. Determinar la cantidad de Malondialdehido (MDA) formado. durante 1 hora. 5 50 0.250 Estand.67 % en ácido acético 50%. 1 10 0.061 Estand. 8.101 Estand. Tomar 100 l de sobrenadante y mezclar con 1. 2 20 0. Transcurrido este tiempo.. 84 . Qué otros daños provocan los radicales libres? Descríbalos. Incubar las muestras en baño de agua hirviente.5. 7 150 0.429 Blanco 0 0. Expresión de Resultados: Concentración Absorbancia Absorban- Factor de Factor de MDA (M) (DO) cia neta Calibración Promedio Estand. 3 30 0.354 Estand. una interpretación e los resultados: INTERROGANTES BIOQUIMICAS: 1. 9.Haga Ud. 7. Realizar las lecturas en un espectrofotómetro a 535 nm. retirar los sistemas del baño hirviente y enfriar en hielo por 15 minutos.

3. 5. Cómo se generan las especies reactivas de oxígeno (ROS) en nuestro organismo? 7. Cuáles son los sistemas antioxidantes con que cuenta nuestro organismo? y como funcionan? 6.2. A qué se denomina antioxidante. Qué otros métodos conoce Ud. para evaluar la producción de radicales libres de Oxígeno? 4. y de que maneras podrían actuar? 85 . Escriba la reacción del Malondialdehido con el ácido Tiobarbitúrico. Describa el proceso de peroxidación lipídica.

con el uso del tiempo de protrombina. ya que ella estaba en estrecho contacto con su esposo. el cual exigió tratamiento con warfarina ( un anticoagulante ). habiéndole retirado la fenilbutazona e indicado que siga con el tratamiento de warfarina por diez días. hacía algunos años que se le había diagnosticado que padecía de gota. siendo tratado únicamente con una dieta adecuada y fenilbutazona ( una droga antiinflamatoria y que secundariamente es uricosúrica). De improviso se le declaró un cuadro de tromboflebitis. 86 . a pesar de haber seguido con el uso de los anticonceptivos orales. El médico le recetó a la señora. estaba consumiendo anticonceptivos orales con el objeto de evitar el embarazo. señalar el probable mecanismo. pero en el momento actual estaba en fase de remisión. Un paciente de 45 años de edad. teniendo en cuenta el metabolismo de un xenobiótico. Hacer un repaso de algunas vías importantes en el metabolismo de los Xenobióticos. sin descuidarse. Luego de la mejoría del paciente.PRACTICA-TALLER Nº 12 METABOLISMO DE XENOBIOTICOS Objetivos: 1. le dio de alta. 3. Una señora de 28 años de edad. rifampicina por precaución. El control de la dosificación de la warfarina se hizo en forma rigurosa. el cual fue tratado adecuadamente en forma ambulatoria. Después de un tiempo a su esposo se le diagnosticó un cuadro de tuberculosis pulmonar. 2. Se notó que la dosis de warfarina requerida para el paciente fue de tres veces mayor que lo habitual. CASO 1. A propósito de un caso de intoxicación alcohólica aguda. A los pocos meses. CASO 2. la señora resultó embarazada. A propósito de algunas interacciones medicamentosas. hacer un repaso del metabolismo del etanol en el organismo humano y discutir algunos de los efectos del etanol. el médico tratante.

Luego de transcurrido dicho tiempo. empezó a sentir quemazón y picor en la cara. la no acelerada tasa de hidroxilación. En otros casos. pero también otros compuestos que son 87 . por lo que decidió comer bastante y beber simultáneamente. y habiendo bebido y comido bastante. es que un xenobiótico puede inducir la actividad del Citocromo P450 particular que lo metaboliza. aumento del pulso. Empezó a sentir somnolencia. fue invitado a una recepción en donde. puede producir una alterada eficacia terapéutica de fármacos. quedándose luego dormido. palpitaciones. pero después de dos o tres horas. pero en esta oportunidad tenía motivos especiales para estar alegre y beber. Si un compuesto induce un determinado Citocromo P450. Una de las características de los sistemas de Citocromo P450. ya que. debido a una incrementada formación de metabolitos que pueden acusar injuria celular. al inicio no sintió el malestar que antes había tenido al ingerir bebidas alcohólicas. Sin embargo. CASO 3. dolor de cabeza. pero empezó a tener aquellos síntomas y signos de la llamada resaca (“hangover”). Anteriormente el había ingerido alcohol muy pocas veces y en pequeñas cantidades. la inducción del sistema de Citocromo P450 puede producir efectos colaterales inesperados e indeseables de agentes terapéuticos. la cual no pudo ser controlada. como es habitual. La inducción del sistema Citocromo P450. BASES MOLECULARES. Efectivamente. puede incrementar la inactivación o acrecentar la tasa de excreción de los fármacos. todos los signos y síntomas compatibles con el fenómeno de “flushing” (rubor o bochorno).con el encargo de volver para su control. comenzó a comer y beber en abundante cantidad. el paciente retornó a los siete días en estado de shock y con hemorragia gastrointestinal masiva. Las bebidas que ingirió fueron a base de vodka con cocacola y había comido bastantes bocaditos endulzados. por que al beber un poco de cualquier bebida alcohólica. Prácticamente cada especie de Citocromo P450 puede ser inducido por uno o un grupo de compuestos en particular. sintiéndose mucho mejor después de habérsele puesto por vía endovenosa glucosa al 10 %. enrojecimiento de los ojos. inmediatamente dicho compuesto se metabolizará más rápido. A la mañana siguiente se levantó ya sin los síntomas anteriores. si son producidos en concentraciones suficientes. Un japonés de 26 años de edad. falleciendo el paciente dos días después. notaba un cierto disconfort.

aminopirina. La administración crónica de etanol a ratas causa una proliferación del retículo endoplasmático del intestino delgado superior y del hígado. rifampicina y testosterona. también se metabolizará más rápido. Es bastante conocido que el metabolismo del etanol en el organismo humano. La consecuencia de ese metabolismo acelerado. una eliminación acelerada de una droga en el organismo. un efecto bien estudiado ahora. pentobarbital. 88 . Aunque el etanol puede producir varios efectos sobre otros xenobióticos.metabolizados por dicho Citocromo P450. puede seguir diversas vías. Esto explica varias de las interacciones medicamentosas o de otro tipo que se conocen. siendo las más importantes las siguientes: 1. según el siguiente esquema: Supresores: Dietéticos Fonetil Isotiocianato P450 2EL Inductores: Uso crónico de Etanol Ayuno Sustrtos: Alcoholes AcetonaAnilina Piridina Benzeno Fenol Tetracloruro de carbono Dihaloetanos Tricloroetileno N-Nitrosodietilamina Eteres Acetominofen Halotano etc. etc. supresores y sustratos. Esto es. la inducción de un citocromo P450 por una droga puede estimular por si mismo el metabolismo de ella o de otras drogas que son sustratos del Citocromo P450 inducido. es que induce un Citocromo P450 particular. La Administración crónica de etanol incrementa la tasa de eliminación de varios fármacos. mejor llamada aldehído deshidrogenasa. el P450 2EL Este citocromo tiene las siguientes características en cuanto a inductores. tolbutamida. es en general. Vía de la actividad de las enzimas alcohol deshidrogenasa y la acetaldehido deshidrogenasa. tales como meprovamato. propanolol.

Después del consumo de etanol puede producirse una hipoglicemia. por lo que no tenemos datos. el cual es dependiente del citocromo P450 2MI y que produce acetaldehido. Parece que el aumento del acetaldehído produce un aumento en la liberación de las catecolaminas adrenalina y noradrenalina de la médula suprarrenal y terminaciones nerviosas simpáticas. Explique en que consiste la Fase II del metabolismo de los xenobióticos. pero también por una mayor sensibilidad a la insulina. 2. que la hace inactiva. pero también . Qué es el itocromo P450? 89 . la ALDH2. En razas blancas esto es raro. cuando se consume grandes cantidades de etanol. cuyas características ya se han descrito. La más importante es la primera. responsable del fenómeno de “flushing”. Por el sistema llamado MEOS. El 50 % de orientales carecen de actividades de la ALDH 2 en el hígado. sistema microsomal oxidante del etanol. la cual en parte se explica por disminución de la gluconeogénesis. si se ingiere muchos dulces o comidas endulzadas con mucho azúcar. la hipoglicemia es mayor. Por la catalaza. Cuando se consume alcohol y no se come mucho. Explique en qué consiste la Fase I del metabolismo de los xenobióticos. 3. INTERROGANTES: 1. por que los azúcares estimulan la producción de insulina y la presencia de etanol potencia los efectos de la insulina. pero la segunda también interviene y cobra importancia. se acentúa el efecto hipoglicémico.2. 3. Esto no se ha investigado en nuestro país. lo cual explica una elevación del acetaldehído. que en ciertas circunstancias puede comportarse como una peroxidasa y produce también acetaldehído. El disulfiram y la cianamida son inhibidores de la aldehído deshidrogenasa. En algunas razas indígenas de Chile y Ecuador la carencia es del 40 % de la población. En las razas orientales se ha descrito que tienen una frecuencia elevada de mutación de una isoenzima de la aldehído deshidrogenasa.

En el caso 2. al retirar la fenilbutazona el efecto de la warfarina se hace más manifiesto. por qué? 8. En el caso 2 . Por qué? 90 . de por que en el caso 1. por la acción combinada de las enzimas: Deshidrogenasa alcohólica y aldehido deshidrogenasa. Intente dar una explicación.4. 6. la señora resultó embarazada. 10. Haga un esquema de la vía de metabolización del etanol. aun habiendo estado consumiendo anticonceptivos orales. Qué fase de matabolización del etanol es el sistema MEOS? . Que es el sistema MEOS de metabolización del etanol? 11. Por qué el etanol es considerado como un xenobiótico? 9. Qué significan que los citocromos P450 sean autoinducibles? 5. cuál sería la explicación de que el paciente requiere de tres veces mayor dosis de warfarina para que ejerza un buen efecto anticoagulante? 7.

por lo que lo felicitamos). Hay un dicho popular que dice “borracho que come miel pobre de él”.12. En la intoxicación alcohólica aguda. 91 . de que la persona que estaba ingiriendo alcohol. describa lo que sintió. De una explicación bioquímica para esto. A qué se debe el fenómeno de “flushing” en personas que ingieren bebidas alcohólicas? 14. En personas diabéticas. Cuál es la explicación bioquímica para esto? 18. De una explicación bioquímica para esto. En la intoxicación alcohólica aguda puede presentarse acidosis láctica. parte de la hipoglicemia que se presenta puede ser debida a una disminución de la gluconeogénesis. Intente dar una explicación. se desencadena un fenómeno de “flushing”. al ingerir alcohol. Si Ud. sea Japonés? Por qué? 13. averigue en otra persona en que consisten los síntomas de la resaca. Tiene importancia el dato. alguna vez ha ingerido bebidas alcohólicas en exceso ( que esperamos no lo haga siempre) y a la mañana siguiente ha tenido el fenómeno de la resaca. que ingieren antidiabéticos orales del tipo de la clorpropamida. 16. 15. 17. Si nunca ha experimentado este fenómeno ( lo cual es plausible que así sea.

19. Explique los síntomas de la resaca. 92 .

PRACTICA Nº 13 93 .

NUTRICION
OBJETIVOS
1) Aprender a hacer cálculos de los requerimientos diarios energéticos de una
persona.
2) Distribuir los requerimientos energéticas en cantidades de hidratos de
carbono, lípidos y proteínas que debe ingerir una persona en su dieta diaria,
para satisfacer dichos requerimientos
3) Manejar tablas de composición de alimentos.
INTRODUCCION:
Como ya se ha visto en la parte teórica existen 2 métodos para calcular los requerimientos
energéticos diarios de una persona. En la presente práctica se emplearán los dos métodos
para dicho cálculo y luego, empleando las tablas de composición de alimentos, proponer
una dieta que satisfaga los requerimientos calculados. Para esto se debe proceder de la
siguiente manera:
PRIMER METODO:
1. Calcular las necesidades energéticas para satisfacer los requerimientos para el
metabolismo basal. Para esto cada persona debe saber su peso y talla. Luego calculará
su superficie corporal en metros cuadrados empleando la fórmula correspondiente,
Usando la tabla que se adjunta calcular las kilocalorías necesarias para satisfacer su
metabolismo basal, según su superficie corporal.
2. Calcular las Kilocalorías necesarias para satisfacer los requerimientos correspondientes
a la actividad física que se desarrolla, de acuerdo con lo siguiente:
Actividad ligera: 30 % del metabolismo basal
Actividad moderada: 40 % del metabolismo basal
Actividad pesada : 50 % del metabolismo basal
3. Calcular las necesidades para la Acción Dinámica Específica de los alimentos
(ADEA).
Por este método, sus necesidades energéticas diarias para Ud., fueron: _____________
SEGUNDO METODO:
1. Usando la tabla correspondiente para gasto según actividades, calcular las Kcal. que se
requieren diariamente; para esto hay que hacer un cómputo de que actividades se
realizan en un día y según la tabla calcular las Kcal que se necesitan por día. Además,
94

hay que tener en cuenta que los datos de dicha tabla ya involucran en cada actividad
las calorías correspondientes al metabolismo basal.
2. Como la tabla da lo que requiere una persona de 65 Kg hay que hacer una corrección
para el peso de cada persona en particular.
Por este método sus necesidades energéticas fueron: _______________
Cálculo de la dieta diaria que habrá de consumir una persona para satisfacer sus
necesidades energéticas.
Para esto se puede usar cualquiera de los dos datos que se calcularon en el acápite
anterior; sin embargo, se recomienda usar el obtenido en el segundo método.
Las necesidades energéticas diarias habrá que repartirlas en cantidades de hidratos de
carbono, lípidos y proteínas, que se deben consumir diariamente. Se recomienda usar los
siguientes datos:
Hidratos de carbono:

60 % de las necesidades energéticas diarias

Lípidos:

25 % de las necesidades energéticas diarias

Proteínas:

15 % de las necesidades energéticas diarias

Con los equivalentes calóricos correspondientes convertir las Kcal en gramos de
carbohidratos, lípidos y proteínas que se deben consumir diariamente; por lo tanto, Ud.,
deberá de consumir:
Hidratos de carbono:

---------------------g

Lipidos:

---------------------g

Proteínas:

---------------------g

Luego con las tablas de composición de alimentos, hacer una dieta que satisfaga los
requerimientos calculados. Distribuir las necesidades alimenticias en el desayuno,
almuerzo y comida ( cena ).
Desayuno:_____________________________________________________________
______________________________________________________________________
Almuerzo: _____________________________________________________________
______________________________________________________________________
Comida: _______________________________________________________________
______________________________________________________________________
Nota: Puede Ud. usar hojas adicionales si desea.
FORMULA PARA CALCULAR LA SUPERFICIE CORPORAL
95

S = P 0.425 x H 0.725 x 0.007184
En donde:

S: Superficie corporal en metros cuadrados
P: Peso corporal en Kg.
H: Talla en centímetros

Nota: Con esta fórmula se puede calcular la superficie corporal con un error no mayor del 5 %.

CUADRO 1.- Valores normales del metabolismo basal, en Kcal / m3 / h, referidos a la
edad del último cumpleaños.
Años

Hombre

Mujer

Años

Hombre

Mujer

6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

53.05
52.4
51.5
49.9
48.0
47.2
46.8
46.5
46.4
46.1
45.5
44.4
42.9
42.2
41.6

50.5
48.05
46.7
46.1
45.7
45.1
43.9
42.5
41.1
39.7
36.6
37.6
37.0
36.6
36.3

21
22
23
24
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75

41.2
40.9
40.7
40.5
40.3
39.6
38.9
38.3
37.6
37.0
36.3
35,7
35.1
34.5
33.4

36.2
36.1
36.1
36.0
36.0
35.8
35.7
35.5
35.3
34.4
33.4
32.8
32.4
32.2
32.0

CUADRO Nº 2 .- Consumo de energía total en kilocalorías por día de personas
que efectúan diversos trabajos, durante ocho horas.
Oficio
Sastre
Encuadernador
Zapatero
Obrero metalúrgico
Pintor
Carpintero
Albañil
Aserrador de madera
Costurera de mano
Costurera de máquína
Encuadernadora
Servicio doméstico
Lavandera
Metabolismo basal nedio (24 horas)
SEGUNDO METODO:
96

Hombre

Mujer

2600 – 2800
3000
3100
3400 – 3500
3500 – 3600
3500 – 3600
4700 – 5200
5500 - 6000
-------------------------

------------------------------------------------------------------------------------------------2000
2100 – 2300
2100 – 2300
2500 – 3200
2900 – 3700

1700

1350

5 Manejar auto en ciudad 3.0 Leer en voz alta parado 1.0 1.1 Leer en voz alta sentado 1.0 Bailar rápido 6.4 Afeitarse 2.0 a 9.0 Confeccionar ropa 2..6 Echado viendo TV o leer 1.0 Caminar despacio 3.5 Tender la cama 3.0 a 8.8 Sentado.0 Vestirse 1.3 Lavar platos 2. 97 .5 Picapedrero 12 Tomar alimentos 1.2 Bailar suave 4.9 Planchar ropa 2.9 Lavarse los dientes 1.0 a 4.2 Montar a caballo 5.2 Pintar un techo 4.5 Coser a máquina de pedal 3. Corresponde a una persona de 65 Kg de peso.5 Lavar ropa a mano 4.8 Atender una clase 1.5 Recoger y guardar las cosas 1. Esta tabla ya incluye el gasto de metabolismo basal y la acción dinámica específica de los alimentos. por lo que habrá que hacer la corrección para el peso de cada persona ( regla de tres ).8 Trapear 6. verduras 10 Bañarse 2.0 Cargador de frutas. quieto mirando TV 1.8 NOTA.9 Trabajo intelectual (no modifica) Lavarse 2. sentado 3.0 Aspirar el piso 3.0 Manejar auto en carretera 2.5 Subir escaleras 4.4 Gimnasia rítmica Escribir a mano.0 Pintar una pared 2.0 Viajar en colectivo sentado 1.1 Montar bicicleta rápido 7.0 Tocar piano 2.2 Pintar un mueble 3.7 Viajar en ómnibus de pié 2.2 Nadar 9.8 Estar echado sin dormir 1.TABLA 1.VALORES DE GASTO DE ENERGIA SEGÚN ACTIVIDADES (Kcal / minuto ) Dormir 0.0 Coser a máquina eléctrica 1.3 Barrer 4.9 Jugar futbol 10 Correr 8.8 Manejar automóvil 2.0 Caminar rápido 4.8 Albañil común 4.4 Estar de pié descansando 1.1 Bajar escaleras 2.2 Escribir a máquina rápido 2.2 Jugar ping pomg o paleta 5.8 Viajar en ómnibus sentado 1.9 Gimnasia deportiva 7.9 Coser a mano 1.

8 Carne cerdo 5 62.0 9.6 20.8 Fibra g 0.3 Grasa g 3.0 0.8 Total g 5.7 2.7 22.0 14. Edad y Peso Talla Necesidades energéticas Sexo Infantes 0.5 0.0 Niños 1–3 4–6 7 – 10 Varones 11 – 14 15 – 18 19 – 22 23 – 50 51 – 75 76 o más Mujeres 11 – 14 15 – 18 19 – 22 23 – 50 51 – 75 76 o más Embarazo Lactancia Kcal en 24 hrs.1 Corazón de cerdo 9 76.RECOMENDACIONES DIETETICAS PARA INGESTION DE ENERGIA.8 14.6 Camarones 4 78.5 – 1.0 19.0 0.2 Carne pollo o gallina 7 62.2 2.5 11.7 16.2 13.3 Carne de res 6 75.2 17.9 1.1 0.0 0.8 4.4 18.0 0.0) (0.4 75.0 288 86 270 113 246 278 115 191 90 99 24.7 1.1 3.4 (0.7 ( Por 100 g.0 0.2 23.4 18.5 (0.5 0.1 21.3 13.1 Pescado fresco de agua dulce 12 75.0) 1.3 0.0 0.0 98 CARBOHIDRATOS .0 0.1 Chorizos 8 56.7 --2. 6 9 60 71 Kg x 115 Kg x 105 13 20 20 90 112 132 1300 1700 2400 45 66 70 70 70 70 157 176 177 178 178 178 2700 2800 2900 2700 2400 2050 46 55 55 55 55 55 157 163 163 163 163 163 2200 2100 2100 2000 1800 1600 más 300 más 500 COMPOSICION DE ALIMENTOS COMUNMENTE USADOS EN AMERICA LATINA * ( por 100 g de porción comestible ) ALIMENTO Nº Agua g 87.0 – 0.1 Panza de res 11 81..7 0.TABLA Nº 2 . de porción comestible ) Calorías 61 148 Proteínas g 3.0) (0.5 9.1 15.3 Leche fresca de vaca 1 Huevos de gallina 2 Carnes Atún enlatado 3 52.0 0.4 Lengua de res 10 69.0) 0.

8 0.8 16.0 0.8 0.3 1.5 Cebolla ( cabeza ) 30 88.7 0.9 Lima limón 53 91.1 0.0 9.9 2.8 Lima dulce 52 89.7 1.1 2.4 3.2 0.6 8.0 0.5 8.3 2.2 4.6 1.1 4.8 Hojas de rábano 22 85.ALIMENTO Nº Agua g 76.4 Rábano 36 93.3 3.4 5.7 0.8 0.0 2.9 17.3 4.2 0.4 0.2 Zanahoria 27 89.1 Guayaba 51 80.2 0.5 0.8 1.0 0.2 Remolacha 37 87.0 0.9 0.7 Ciruela 44 87.6 57 97 40 47 122 52 49 36 94 60 69 30 32 47 43 59 0.8 0.4 0.2 9.6 0.6 Berenjena 29 94.0 .8 2.1 0.9 15.2 0.5 10.0) (0.9 0.1 0.8 10.8 2.2 Espinaca 20 89.3 Guanábana 50 83.8 13.4 2.2 Verdolaga 26 91.3 8.2 Cidra 43 88.5 0.9 6.7 5.6 Hojas de remolacha 23 86.2 0.3 Melocotón 47 85.2 2.0 0.0 0.2 0.8 27 38 32 30 31 52 45 20 26 286 41 1.9 16.8 Mandarina 55 87.2 0.1 Coliflor 31 89.8 Ají 18 88.4 2.7 1.8 Berro 19 92.9 4.6 0.6 0.0 9.8 19 17 45 33 22 27 154 115 23 44 28 14 21 0.2 11.7 0.5 6.8 1.2 1.4 0.0 5.3 1.9 0.7 0.4 5.8 1.5 ( Por 100 g.1 Tallos de cebolla 25 92.8 0.1 0.6 0.6 Tomate 40 93.9 Fresa 48 90.4 1.7 0.8 Mango 56 83.0 Mamey 54 86.8 1.8 Repollo 38 91.0 0.4 0.8 0.3 4.3 12.8 0.6 1.4 0.8 Hojas de nabo 21 9.7 1.4 0.8 2.1 0.7 1.4 5.9 0.4 Lechuga escarola 24 93.4 Espárragos 32 92.2 0.6 0.6 1.7 0.8 Pescado fresco de agua salada 13 Pulmón de res 14 Riñón de res 15 Sesos de res 16 Vegetales verdes y amarillos Acelga 17 90.0 1.0 0.7 4.1 Otros vegetales Apio 28 93.4 0.8 3.8 0.5 4.2 1.0 9.7 80.4 7.4 Repollo chino 39 95.1 0.6 Total g (0.0 Pepino 35 95.4 0.4 0.1 0.4 1.2 11.9 1.8 2.8 Frutas Albaricoque fresco 41 84.7 0.0 Coco tierno 45 81.1 0.2 1.0 3.7 6.2 0.8 0.8 2.8 99 CARBOHIDRATOS Fibra g 0.0 1.3 77.5 17.0 12.9 0.2 0.1 0.0 8.5 Palta 34 77.2 15.4 0.6 0.4 0.2 Plátano 42 72.4 0.1 4.6 0.5 4.7 0.8 25.2 13.0) 1.9 0.4 Grasa g 1.0 8.8 0.9 1.4 Durazno blanco 46 85.4 0.6 1.5 0.4 0.0 Granadilla 49 76.0 1.3 14.9 8.8 1. de porción comestible ) Calorías 100 90 124 134 Proteínas g 20.7 0.4 0.1 0.1 10.8 1.3 4.1 5.1 75.7 Nabo 33 92.

8 0.3 14.4 12.2 79.2 Calorías 100 CARBOHIDRATOS Fibra g 0.8 61.4 1.7 0.3 0.7 21.8 0.4 68.9 76.2 10.7 73.4 60.2 60.6 23.0 24.1 12.0 0.0 12.4 69.3 2.2 0.6 10.3 0.1 58.7 29.4 4.0 23.2 1.0 0.7 5.3 1.5 0.1 1.9 12.6 89.7 25.9 10.8 0.2 32.6 9.3 26.3 6.5 22.3 10.6 60.7 1.0 11.2 0. tubérculos y plátano.5 12.3 0.1 0.2 6.2 57.2 0.3 24.4 1.0 60.6 6.5 74.6 12.3 0.8 0.0 0.7 57.5 0.3 37.3 9.2 0.8 1.2 1.0 10.4 28.9 65.3 4.8 65.8 87.6 0.8 13.3 0.2 11.6 6.2 10.0 61.2 0.2 1.7 9.2 4.5 1.2 2.4 8.ALIMENTO Nº Manzana 57 Melón 58 Naranja 59 Papaya 60 Pepino 61 Pera 62 Piña 63 Sandía 64 Toronja 65 Leguminosas Arvejas 66 Frijoles 67 Garbanzo 68 Habas 69 Lentejas 70 Maní 71 Cereales y derivados Arroz 72 Avena 73 Cebada 74 Galletas de soda 75 Galletas dulces 76 Harina de trigo enriquecida 77 Macarrones 78 Maíz 79 Pan de rodaja 80 Pan dulce 81 Pan francés 82 Pan integral 83 Tallarines 84 Pastel simple 85 Raíces.4 0.0 8.8 9.4 0.6 6.6 3.6 0.6 3.6 10.5 3.0 18.8 75.1 12.5 2.2 0.4 0.5 0.4 85.9 343 337 364 339 340 543 22.0 10.6 12.6 102 116 79 122 148 0.2 1.5 9.2 Total g 15.4 0.5 0.3 12.4 5.0 1.2 9.5 8.8 364 370 348 435 406 364 377 361 311 438 298 286 381 327 7.5 5. Arracacha blanca 86 Camote o batata 87 Papas 88 Plátano 89 Yuca 90 * De ICNND INCAP 58 25 42 32 32 56 52 22 38 Proteínas g 0.6 6.2 .9 13.1 17.4 0.0 0.4 93.0 92.6 18.8 1.0 Agua g 84.1 0.7 4.2 0.1 76.2 50.3 44.0 84.6 26.8 3.9 77.4 1.5 0.9 3.7 74.1 1.6 Grasa g 0.0 0.5 6.6 3.3 9.4 0.9 0.7 90.9 0.7 92.3 0.5 73.1 73.5 0.0 1.6 0.

J. Universidad de Chile.. C. Muriel O. Devlin T. Zegarra F.C. Pacheco. Biochemistry. y Tymoczko J.. Bernabé. Zegarra F... Guía de Practicas de Bioquímica UNSA. Muriel O. John Wiley .Paz B. 11. Universitaria Sao Paulo-Brasil 2001 3. UCSM. Stryer L.& sons. 5. Universidad de Manitota. 5º Ed. Bioquimica. 2005 10. C. 1969 8. Guia de Prácticas de Bioquímica. 2004 4. Arequipa-Perú. Practicas del Curso de Bioquímica Médica II.. Nelson D y Cox M. Fitzpatrick D. Lippiincott-Raven. 101 . Gutierrez Correa. Principles in Biochemistry of Lehninger.A. 2002. 3º Ed. Biochemiostry: With clinical correlation. 2006.A BarcelonaEspaña. Champe P. Noriega P. 2. B.. Campbell M. Harvey R. IV Ed. Amazon 2004 9. Universidad Católica de Santa María... Curso de Bioquímica. S. 1965 7. y Paz I. Noriega P. y Arenas. Bioquímica 3° Ed. Zegarra F. Guía de Prácticas para Agronomía UNSA. y Paz I.. Bernal O. J. Universidad Nacional de Trujillo.. Berg J. Practicas del Curso de Bioquímica Médica I. Bernal O.M. 2000. Editorial Reverté. Manual de prácticas de Biología Molecular. II Edición. 13. Cárdenas L. 2005 12.BIBLIOGRAFIA 1.L.K. Prácticas de Laboratorio. 1991 6. Lab Manual. Paz. Juárez R. Biochemistry. 2008. 1976.Paz. J... UCSM.

a capítulos de mayor relevancia y en otros casos. que en algunos experimentos. sin embargo. se proporcionan directamente los resultados. Igualmente se podrá observar.PRESENTACION Ponemos a disposición de nuestros alumnos de Ingeniería Biotecnológica de la Universidad Católica de Santa María. esto en razón a las limitaciones de ciertos reactivos y equipo. interpretaciones y respuestas en la misma Guía de Prácticas para que no tenga que perder tiempo copiando en un cuaderno aparte el protocolo de la misma. hemos tenido que seleccionar un grupo de prácticas en razón a que corresponden en algunos casos. a que por su propia naturaleza deben ser incluidos para alumnos de Biotecnología. Todas las prácticas incluyen un cuestionario. de allí que los autores seremos muy receptivos a las sugerencias de los usuarios a quienes desde ya les estaremos muy agradecidos. que consideramos será de ayuda para apoyar el proceso enseñanza – aprendizaje de nuestro curso de bioquímica y que aprovecha la experiencia acumulada por un grupo de Profesores de Bioquímica que venimos enseñando el Curso teórico y a la vez realizamos las prácticas respectivas durante muchos años. No dudamos que esta Guía de Prácticas tenga muchos aspectos que puedan ser mejorados en las próximas ediciones. Los Autores 102 . También hemos tratado que el alumno anote sus resultados. Conscientes del creditaje y naturaleza del Curso de Bioquímica en las diferentes carreras. esta Guía de Prácticas de BIOQUIMICA II. donde se pregunta al alumno sobre aspectos que trata el tema . donde el alumno puede aplicar o aportar otros datos a fin de deducir explicaciones y resolver las interrogantes planteadas. en muchos casos la idea es que es mucho más importante que el alumno comente sus resultados y sobre todo haga la interpretación correcta y adecuada de los mismos.

NOMBRE DEL CURSO: ___________________________________ GRUPO Nº ____________________________________________ APELLIDOS: ____________________________________________ NOMBRES: ____________________________________________ DIA/HORA: _____________________________________________ LABORATORIO: __________________________________________ NOMBRE DEL PROFESOR: ________________________________ 103 .

CH2 CH2 CH2 C C C + CH2 H3N+ A 3 NH4+ M M P P Hidroximetilbilano Sintasa CH P NH H3N A C P C C CH CH2 P NH A C P C A C P C A C Uroporfirinógeno III Cosintasa p P A A p P C CH C CH C CH C CH2 NH CH2 NH CH2 NH US P A UROPORFIRINOGENO I UC A P M COPROPORFIRINOGENO III 4 CO2 FREDY ZEGARRA A.COOCH2 COO CH2 (2) CH2 CH2 ALA .Sintasa COSCoA SUCCINIL SCoA (2)  AMINO  CETO ADIPICO CH – COO NH3+ ALA . A P CESAR CACERES Z. A JULITZA PAREDES F.Sintasa GLICINA (2) 5 ANINO LEVULINATO CH2 (ALA) (2) CO CH2 CO CH2 NH3+ NH3+ N P V 6H M P V PROTOPORFIRINOGENO III CO2 M PROTOPORFIRINA III M P M P M P M Protoporfiriógeno Oxidasa M V M V Fe N M COOCOO .CH2 CH2 CH2 N Ferroquelatasa HEMO Sintasa M V CH – COONH3+ HSCoA N M P Fe2+ CO V M GRUPO HEMO - H2O OH O2 Coproporfirinogenasa 2 H2O ALA – Deshidrasa Porfobilinógeno Sintasa M COOPORFOBILINOGENO COO . P A Arequipa – Perú 104 UROPORFIRINOGENO III 2014 P .

105 .

........................................... 1 PRACTICA Nº 2 : Ciclo de Krebs : .......... 17 PRACTICA Nº 4 : Oxidación de ácidos grasos : ................... 9 PRACTICA Nº 3 : Fermentación alcohólica : ..................................................:........ 91 BIBLIOGRAFIA: ......INDICE Pag PRACTICA Nº 1 : Glicólisis :...........................................................................................…………………................................................................................................ 73 PRACTICA N° 11: Peroxidación lipídica:……........................................... 43 PRACTICA Nº 7 : Metabolismo de lípidos: Hígado graso experimental: .........…............. 25 PRACTICA Nº 5 : Degradación de aminoácidos : Transaminación : ...... 102 106 ....... 81 PRACTICA-TALLER Nº 12: Metabolismo de xenobióticos ..................................……………………………………………………............................…..............................…... 33 PRACTICA Nº 6 : Glucógeno hepático : .........................................87 PRACTICA Nº 13: Nutrición................ 51 PRACTICA Nº 8 : Pigmentos biliares: Hiperbilirrubinemias: .............................................................................. 63 PRACTICA Nº 10 : Integración y regulación del metabolismo : .... 57 PRACTICA-TALLER Nº 9: Metabolismo de nucleótidos: .....................................................