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Facultad

de Ciencias Biologicas
Universidad Andres Bello

BIOLOGIA CELULAR BIO-034

METODOS EN BIOLOGIA CELULAR



Lorena Varela-Nallar, PhD
lorena.varela@unab.cl

Tipos de experimentos
In vivo (en el organismo viviente): Experimentos que se llevan a cabo en organismos
completos.
In vitro (en vidrio): Experimentos que se realizan en cultivos celulares,
1. Clulas de cultivo primario
2. Lneas clulares
3. Hibridomas
4. Clulas madres (stem cells)
Fibroblastos

Mioblastos

Figure 8-4 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Celulas nerviosas

Celulas tabaco

1. Cul@vo primario (extraccin de clulas)

Diseccin
Manual
1. Mecnico
Lser

Microdiseccin por captura laser desde corte histolgico

1. Cul@vo primario (extraccin de clulas)

Diseccin
1. Mecnico
2. Enzimtico
Enzimas
proteolcas
- Tripsina
- Colagenasa

Figure 8-3 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Degradan de matriz extracelular

1. Cul@vo primario (neuronas hipocampales)

1. Cul@vo primario
Separacin de los dis5ntos 5pos celulares
Se pueden u7lizar varios mtodos para separar los diferentes @pos celulares de la
suspensin celular, segn sus propiedades:

1. La diferencia de tamao de las clulas permite separarlas por centrifugacin.


2. La capacidad que 7enen algunos 7pos celulares de adherirse al vidrio o al pls@co, permite
separarlos de otras clulas que se adhieren dbilmente.

3. Algunos an@cuerpos se unen especcamente a sustancias presentes en determinadas clulas. Luego,
se emplea diferentes matrices (como colgeno, bolitas de polisacridos, pls7co) a la cuales slo las
clulas reconocidas por los an7cuerpos podrn adherirse.

4. Se emplean an@cuerpos acoplados a colorantes uorescentes para marcar clulas especcas
adheridas a ellos. Las clulas marcadas por interaccin con el an7cuerpo pueden ser separadas de las
no marcadas en un separador de clulas ac7vado por uorescencia o cell sorter

1. Cul@vo primario
Separador de clulas ac5vado por uorescencia

Las clulas individuales viajan a travs de un


conducto muy delgado y son iluminadas por un lser.
Una boquilla vibratoria forma diminutas gotas (que
con7enen 1 o ninguna clula)
La go7ta recibe carga posi7va o nega7va
dependiendo de si la clula es uorescente (el
equipo detecta qu clulas emiten uorescencia por
el an7cuerpo adherido).
Luego, las gotas son separadas por un campo
elctrico hacia los recipientes colectores segn su
carga.

2. Lneas celulares

Tabla 8-1 Biologa molecular de la clula, quinta edicin ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

2. Lneas celulares (lnea celular HeLa)


Lnea de clulas epiteliales humanas procedentes de un carcinoma cervical, y las primeras clulas
humanas de las cuales se estableci una lnea celular permanente.
En 1951 se prac7c una operacin quirrgica a la paciente HenrieQa Lacks (de ah el nombre), una
mujer afroamericana de 31 aos, en la cual se extrajeron clulas de un carcinoma en el tero con
la intencin de evaluar su malignidad. La paciente falleci 8 meses despus a causa de su tumor.
Las clulas extradas estaban invadidas por el virus del papiloma humano 18 (HPV18),
transformndose en clulas tumorales.

Hoescht
- Replicacin indefinidamente: immortal
- Hasta hoy >80.000 publicaciones con HeLa
-10-20% otras lneas clulares estan contaminados con HeLA

3. Hibridomas
Secretan an@cuerpos monoclonales contra un anOgeno en par@cular.

An@cuerpos

Los an7cuerpos son fabricados por


linfocitos B
Cada linfocito B en reposo lleva un
an@cuerpo especco (que reconoce un
anZgeno especco) ligado a su
membrana
Cuando el anZgeno se une se es7mula la
divisin de los linfocitos B y la produccin y
secrecin de an@cuerpos solubles

Produccin de An@cuerpos

Produccin de
hibridomas

4. Clulas Madre (Stem Cells)


Subgrupo de clulas que 7enen la habilidad de
reponerse a s mismas a travs de auto-renovacin y
7enen el potencial de diferenciar a diferentes 7pos de
clulas.
Los dos 7pos principales son:
- Clulas madre embrionarias (ESCs), 7enen la
capacidad de generar las tres capas germinales
embrionarias ectodermo, endodermo y mesodermo,
de los que derivarn todos los tejidos y rganos
- Clulas madre adultas

Las clulas madre pueden producir uno o ms


tejidos maduros, funcionales y plenamente
diferenciados en funcin de su grado de
mul@potencialidad.

4. Clulas Madre (Stem Cells)


Totipotente, puede crecer y formar un
organismo completo, tanto los
componentes embrionarios como los
extra-embrionarios (placenta).
Pluripotente, puede formar cualquiera
otro tipo de clula proveniente de los tres
linajes embrionarios (endodermo,
ectodermo y mesodermo), as como el
germinal y el saco vitelino.
Multipotentes, solo pueden generar
clulas de su propia capa o linaje
embrionario de origen
Unipotentes pueden formar nicamente
un tipo de clula particular.

4. Clulas Madre
Clulas madre embrionarias

Fuente inagotable de material que a futuro podra se usada para terapia celular
Aun no son del todo seguras (tumores)
Rechazo si son de otra persona (terapias personalizadas)

4. Clulas Madre
Transplante de ncleo de clula som5ca

ES personalizada

Figura 8-6 Biologa molecular de la clula, quinta edicin ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

4. Clulas Madre
Mtodos para inducir reprogramacin

4. Clulas Madre
Proyecciones cul5vo de clulas madre

Cmo se cul@van las clulas?


Incubadora con condiciones controladas:
5% CO2 -95% O2
95% Humedad
Clula eucariote
37C

Composicin de medios de cul7vo para clulas eucariotas animales:


Los medios de crecimiento pueden variar en pH, concentracin de glucosa,
factores de crecimiento y la presencia de otros componentes nutri7vos.
Los factores de crecimiento usados para suplementar a los medios derivan a menudo de sangre
animal, como el suero bovino.

Ventajas de los cul@vos celulares


- Permiten un control preciso y no del medio ambiente. En un cul7vo se pueden
controlar todos los factores dle medio: Fsico-qumicos (pH, temperatura, presin
osm7ca, niveles de O2, CO2, tensin supercial...), y siolgicos (hormonas, factores de
crecimiento, densidad celular,...)

- Caracterizacin y homogeneidad de la muestra. Las clulas en cul7vo de una lnea
celular, o de una lnea con7nua son homogneas, con morfologa y composicin
uniformes. Se pueden obtener con facilidad un nmero elevado de rplicas idn7cas, con
lo que se supera el grave problema de heterogeneidad de las muestras inherente
asociado al uso de animales de experimentacin.
- Economa. Suponen una economa en el uso de reac7vos o drogas a estudiar pues al
realizarse en volmenes reducidos, y con un acceso directo de las clulas a la droga las
concentraciones requeridas son mucho ms bajas que en el animal completo.

- Mo@vaciones @cas. La inves7gacin biomdica supone el sacricio cada ao de
muchos miles de animales de experimentacin. El cul7vo celular no puede reemplazar
siempre el ensayo "in vivo" pero es una alterna7va vlida en muchas situaciones.

Desventajas de los cultivos celulares


- No reproduce la situacin en vivo (3-D) con mltiples interacciones entre distintos tipos de
clulas
- Tcnica sensible. El crecimiento de las clulas animales es mucho ms lento que el de los
contaminantes ms habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas...) y adems dado
que proceden de organismos pluricelulares son incapaces de crecer en ausencia de una
compleja mezcla de nutrientes que simula el plasma o el fluido intersticial. Esto supone la
necesidad de mantener las condiciones de asepsia en todo momento, lo cual es limitante a
nivel tanto del instrumental requerido como del personal cualificado para su manipulacin.
- Cantidad y costo. El costo de produccin de 1 gramo de tejido desde cultivo es ms de 10
veces superior al obtenido en el animal. Asimismo existe una limitacin de produccin, que es
del orden de 10 g de clulas en un laboratorio normal, y que para ser superior a 100 g requiere
instalaciones de tipo industrial.
- Inestabilidad. Muchas de las lneas celulares continuas son inestables, como consecuencia
de la dotacin cromosmica aneuploide. La poblacin celular puede variar su composicin si
alguna de las subpoblaciones celulares es capaz de crecer con una tasa ligeramente superior,
es decir podemos encontrar diferencias significativas en la lnea celular de una generacin a la
siguiente. La nica manera de evitarlo es emplear lneas estables que se resiembran a partir
de un stock congelado cada determinado tiempo, o despus de un determinado nmero de
generaciones.

Fraccionamiento subcelular

Rotura de clulas y tejidos

Rotura de clulas y tejidos

Centrfuga

Centrfuga

Centrifugacin diferencial
Centrifugaciones repetidas a velocidades cada vez ms elevadas fraccionan los
homogenizados celulares en sus componentes
Separan los componentes en base a su tamao y su densidad:
mayor tamao mayor fuerza centrfuga, forman precipitado mientras
componentes mas pequeos y menos densos se mantienen en suspensin
(sobrenadante).

Sedimentacin por velocidad

Los componentes subcelulares sedimentan en base a su forma y tamao

Gradiente de sacarosa

Equilibrio de sedimentacin

Como comprobar pureza de las fracciones?

Separacin de Protenas

Cromatogra^a
Mtodo mediante el cual se separan molculas basado en las diferencias existentes
entre su estructura y/o composicin.

Generalmente, los compuestos a separar (protenas) se 7enen en solucin y se
hacen pasar por un soporte estacionario (columna que con7ene matriz slida porosa).

Los dis7ntos niveles de interaccin entre el soporte estacionario y las molculas
permi7rn a estas ul7mas migrar lenta o rpidamente a travs del soporte.

Separaciones cromatogrcas se pueden realizar u7lizando una variedad de
soportes: silica inmovilizada en placas de vidrio (cromatograca de capa na), gases
vol7les (cromatograca de gases), papel (cromatograca de papel), lquidos
(cromatograca liquida).
Las protenas se pueden separar en base a su carga (c. de intercambio inico),
hidrofobicidad (c. hidrofbica), de su tamao (c. de ltracin), capacidad de unin a
determinados grupos qumicos (c. de anidad)

Cromatogra^a en columna

Dependiendo de la matriz que se


u 7 l i c e s e p u e d e n s e p a r a r
protenas segn su carga, tamao,
carcter hidrofbico, etc

Biologa molecular de la clula, quinta edicin ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

Tipos de matrices
Cromatogra^a de intercambio inico

Figure 8-13 and 8-14 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Tipos de matrices
Cromatogra^a de ltracin en gel

Figure 8-13 and 8-14 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Tipos de matrices
Cromatogra^a de anidad

Figure 8-13 and 8-14 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Electroforesis

Las protenas suelen tener carga neta posi7va o nega7va debido a los aminocidos cargados
Si se aplica un campo elctrico la protena migrar a una velocidad que depende de su carga neta, su tamao
y su forma
Se u7liza un detergente cargado nega7vamente (dodecil sufato sdico, SDS) que permite la disociacin de
las protenas de otros componentes proteicos o lipdicos y enmascara la carga intrnseca de la protena
hacindola migrar hacia el electrodo posi7vo
Se utliza un agente reductor para romper puentes disulfuro para separar los polipp7dos cons7tu7vos de
molculas de varias subunidades

Electroforesis

Figura 8-18 Biologa molecular de la clula, quinta edicin ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

Anlisis de muestra proteica mediante


electroforesis

Sucesivos estados de purificacin de una enzima


(se carg igual cantidad (g) de protena)

Usos de los anticuerpos

Usos de los anticuerpos

Usos de los anticuerpos

Usos de los anticuerpos


Western Blotting

Figura 8-20 Biologa molecular de la clula, quinta edicin ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

Anlisis del DNA


Nucleasas de restriccin:
Secuencias especficas de 6 pb palindrmicas (identicas en ambas hebras si se gran
en 180)
Puede generar extremos romos o cohesivos.
Se generan fragmentos de DNA que se pueden unir (ingeniera gentica, que permite
manipular DNA in vitro)

Biologa molecular de la clula, quinta edicin ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

Anlisis del DNA


Nucleasas de restriccin generan
fragmentos que se pueden unir

Insercin de un fragmento de DNA


en un plsmido bacteriano utilizando
DNA ligasa.
Plsmido y DNA a ligar estn
digeridos con la misma enzima de
restriccin
Se aparean extremos cohesivos y
se sellan los cortes en la cadena de
DNA (DNA ligasa + ATP)

Figura 8-39 Biologa molecular de la clula, quinta edicin ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

Electroforesis en gel de agarosa

DNA est cargado nega7vamente por el grupo fosfato


Gel de agarosa
Se usa bromuro de e7dio que se une al DNA y emite uorescencia al ser observado con luz UV

Electroforesis en gel de agarosa

Southern o Northern bloang


Northern blofng: RNA con sonda de DNA
Southern blofng: DNA con sonda de DNA

Figura 8-38 Biologa molecular de la clula, quinta edicin ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

Amplificacin de DNA mediante PCR

Uso de PCR en medicina forense

VNTR: variable number of tandem repeat


Secuencias cortas repe7das (nmero variable de veces, entre 4 y 40 veces en
dis7ntos individuos)
Se encuentran en varias posiciones (loci) del genoma)
Biologa molecular de la clula, quinta edicin ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

Uso de PCR en medicina forense