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Ttulo: Principios y prctica de la Microscopa Electrnica. 1ra. Edicin.

Autores:
Sorrivas de Lozano, Viviana.
Alfonsina Morales.
Mara Julia Yaez
Baha Blanca: Viviana Sorrivas de Lozano, 2014. E-book.

ISBN:978-987-43-4752-7
1. Microscopa.
2. Manual.
1RA EDICIN
Fecha: 2/10/2014

Prohibida la reproduccin total o parcial de este libro , salvo con autorizacin escrita de los autores.

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Queda hecho el depsito que establece la ley 11723.

Principios y prctica de la Microscopa Electrnica


autores
Autores: Prof. Viviana Sorrivas de Lozano
Dra. Alfonsina Morales.
Ing. Mara Julia Yaez.

Colaboradores
Mg. Cecilia Gutierrez Ayesta.
Tc. Carlos Alberto Jones.

Editado y diseado por:


Viviana Sorrivas de Lozano
Diseo de tapa y grficos del captulo fundamentos: Carlos Alberto Jones.

ISBN:978-987-43-4752-7

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1ra.edicin: 2014

Agradecimientos

En la elaboracin de este libro participaron muchas personas que en mayor o menor medida contribuyeron a su realizacin y a
quienes queremos tener presentes en este agradecimiento:
Al Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET) por posibilitarnos los recursos necesarios para crecer en la
especialidad. Un recuerdo especial para el Ing. Martn Urbicain que siempre nos apoy y estimul en nuestra tarea.
A nuestros colegas microscopistas con los cuales hemos intercambiado experiencias y conocimientos.
A Carina Cano, nuestra mano derecha en el laboratorio de preparacin de muestras. A Carlos Jones por el procesamiento de
imgenes que es una parte muy importante de nuestro trabajo y por brindar su conocimiento en fotografa en el captulo XI de ste
libro, por los grficos y el diseo de la tapa. AMg. Cecilia Gutierrez Ayesta por su aporte en seguridad en laboratorio , un tema tan
importante a tener en cuenta en la labor diaria.
Al Ing. Francisco Spinella por la asistencia y ayuda brindada en el mantenimiento y reparacin de los equipos con los cuales
trabajamos.
A nuestros compaeros de las distintas reas de servicios : electrnica, taller, administracin, computacin, vitroplasta y
tranferencia.
A la comunidad cientfico tecnolgica del pas por depositar en nosotros la confianza en la asistencia de trabajos de microscopa
electrnica.

Y por supuesto con mucho cario a nuestras familias.


Las autoras.

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A los usuarios que durante ms de 30 aos compartieron con nosotros su conocimiento y nos permitieron publicar las imgenes
de sus muestras en este libro.

PREFACIO

En las ltimas dcadas, el avance tecnolgico ha posibilitado grandes adelantos en microscopa electrnica favoreciendo su aplicacin en las
diversas reas de la ciencia. La ampliacin de las capacidades de los microscopios y el desarrollo de nuevas metodologas han sido de significativa
importancia en estudios relacionados con la salud, produccin, medio ambiente y nanotecnologa.
A partir de la experiencia recogida en ms de 30 aos de trayectoria en la especialidad, se han observado algunas problemticas relacionadas con
la capacitacin de recursos humanos. La formacin integral en microscopa electrnica, con temticas multidisciplinarias, ha demostrado brindar un
plus de conocimientos que han ampliado los criterios para la realizacin de muchos trabajos. Por ejemplo, un Ingeniero que investiga polmeros
biodegradables necesita conocer cmo se procesan las bacterias y a su vez el bilogo comprender las caractersticas estructurales y morfolgicas del
polmero. Un Ingeniero en alimentos requiere reconocer la ultraestructura del material que procesa para comprender los cambios en las propiedades
que afectan al producto. Estos son slo algunos ejemplos que muestran nuestro parecer.
Muchos de los libros disponibles tienen un alto contenido terico y escasos protocolos de preparacin de muestras, mientras otros, son netamente
prcticos. Asimismo, abunda bibliografa dedicada a un tpico en particular. Se ha notado que quienes se inician en Microscopa Electrnica,
encuentran problemas que parecen insalvables a la hora de procesar sus muestras e interpretar resultados. El aporte de los protocolos de
laboratorio, tiene por objeto ayudar a resolver estos inconvenientes.
Este manual de distribucin gratuita; ha sido realizado gracias a la permanente interaccin con los integrantes del sistema cientfico y tecnolgico,
a experiencias adquiridas, bibliografa disponible y el equipamiento mayor y auxiliar con el que trabajamos perteneciente al CONICET.
Estn a disposicin los saberes que se consideran fundamentales para facilitar al lector la concrecin de sus objetivos.

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Los autores

INDICE
INTRODUCCION
I.1-Breve resea histrica de la microscopa electrnica.
I.1.1-El rol de la mecnica de onda.
I.1.2- Los comienzos.
I.2-Estado del arte.

I.2.1-Nuevas tecnologas en microscopios de transmisin.


I.2.1.1-Atomic resolution Jeol Jem-arm200f tem.
I.2.1.2-Low-voltage transmission-electron-microscopy.
I.2.1.3- Dynamic transmission electron microscope.
I.2.1.4- Nuevo detector de electrones directo fei company (nasdaq: feic).
I.2.1.5- Liquid scanning transmission electron microscope (stem).
I.2.1.6-Los microscopios electrnicos de transmisin (TEM) actuales.
I.3- Aplicaciones de la tcnica que coadyuvaron al desarrollo de nuevos microscopios electrnicos de transmisin .
I.3.1-Caractersticas notables que poseen los microscopios actuales con ms capacidades.
I.4- Avances en la tecnologa de microscopa electrnica de barrido.

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I.4.1-fib: (focused ion beam).


I.5- Conclusiones.

Captulo I : Fundamentos de la Microscopa Electrnica


I.1
Concepto de Resolucin.
I.2
Naturaleza de las ondas electrnicas.
I.3
Componentes de un microscopio electrnico.
1.3.1 Emisin termoinica.
1.3.2 Emisin de campo.
I.4
Lentes electromagnticas.
I.5
Aberraciones: cromtica, esfrica, astigmatismo.
I.6
Descripcin del Microscopio Electrnico de Transmisin.
I.7
Interaccin haz de electrones muestra.
1.7.1- Scattering elstico e inelstico.
I.8 Comparacin entre el microscopio ptico y el electrnico.
I.9 Descripcin del Microscopio Electrnico de Transmisin.
1.9.1-Tipos de contraste.
1.9.2- Teora del contraste.
1.10 Interaccin haz incidente muestra en el SEM.
1.11 Profundidad de campo y profundidad de foco en el MEB.
1.12 Tipos de contraste en MEB.

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2-Fijacin.
2.1 PH del buffer.
2.2 Osmolaridad.
2.2.1 Cmo ajustar la osmolaridad?.
2.3 Composicin inica de la solucin fijadora:
Agregado de electrolitos.
Agregado de sustancias no-electrolticas: como glucosa o sacarosa al 5%.

Captulo II: Preparacin de muestras biolgicas y de materiales para su observacin por Microscopa Electrnica de
transmisin.

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2.7.1- Aldehdos: formaldehdo, glutaraldehdo, acrolena.


2.7.1.1 Glutaraldehdo (GA).
2.7.1.2 Formaldehdo.
2.7.1.3 Acrolena:
2.7.2- Oxidantes: tetrxido de osmio, de rutenio, permanganato de potasio.
2.7.2.1 Tetrxido de osmio: (OsO4).
2.7.2.2 Tetrxido de Rutenio: RuO4 .
2.7.2.3 Permanganatos.
2.7.3Sales de uranilo.
2.8
Tipos de fijacin.
2.8.1
Por inmersin.
2.8.2
De un cultivo en monocapa.
2.8.3
Clulas aisladas en suspensin .
2.8.4
Criosustitucin (TEM).
2.8.5
Material particulado.
2.8.6
Fracciones Subcelulares.
2.8.7
Vegetales.
2.9
Aditivos.
2.9.1
Tanino al 1 %.

2.4
Constitucin inica.
2.5
Factores que afectan una fijacin.
2.5.1 Temperatura.
2.5.2 Duracin de la fijacin.
2.5.3 PH del fijador:
2.6 Vehculos.
2.6.1 Los vehculos ms utilizados.
2.6.1.1
Tampn fosfato.
2.6.1.2
Tampn cacodilato: Na(CH3)2 AsO4.3 H2O .
2.6.1.3
Tampn Veronal-acetato.
2.6.1.4
Tampn colidina: (2,4,6 trimetil piridina).
2.7 Fijadores.

2.9.2
2.9.3

Ferrocianuro de potasio 0.05 M.


Hidrxido de lantano al 2%.

2-10
2.11

Fijacin de carbohidratos.
Algunos protocolos.
2.11.1 - Fijacin de muestras vegetales (TEM).
2.11.1.1 - Semillas.
2.11.1.2 - Semillas (otra opcin TEM).
2.11.1.3 - Semillas secas (TEM).
2.11.1.4 - Hojas.
2.11.1.5 - Tejidos blandos vegetales.
2.11.1.6 - Granos de polen.
2.11.1.7 - Races
2.12- Preparacin de muestras de materiales para su observacin por Microscopa electrnica de Transmisin.
2.12.1-Contraste de polmeros (ver captulo 6).
2.12.2-Caracterizacin de catalizadores soportados por TEM.
2.12.3- Interaccin haz electrnico con el catalizador.
2.12.4-Contraste de la imagen.
2.12.5-Determinacin de tamaos.
2.12.6-Efecto de la forma de las partculas.

Captulo III. Deshidratacin.

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3.1 - Objeto de la deshidratacin.


3.1.1- Mtodos.
3.1.2- Mtodo de diluciones infinitas.

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4. El medio de infiltracin ideal.


4.1 Tipos de resina.
4.1.1 Resinas Polister.
4.1.1.1 Ej. Vestopal y 4.1.1.2 Rigolac.
4.1.2 Resinas Epoxi.
4.1.2.1
Epn .
4.1.2.2
Mezcla de Araldita: (araldita + DDSA + DMP 30).
4.1.2.3 Medcast (Epn).
4.1.2.4 Spurr.
4.1.3 Resinas Metacrilato.
4.1.3.1
Lowilcryl.
4.1.3.2
Unicryl.
4.1.3.3
London Resin: LR.
4.2
Seguridad en el uso de resinas.
4.3
Pre-infiltracin.
4.3.1
Agar o agarosa.
4.3.1.1 Gelatina.
4.3.1.2 Otros soportes.
4.3.2 Tipos de moldes de inclusin.
4.4
Errores en la infiltracin y la polimerizacin.
4.5
Protocolos tipo.
4.5.1
Lowilcryl K4M.
4.5.2
Embebido plano para monocapas celulares con LR White.
4.5.3
Monocapas de clulas en resina epoxi.
4.6
Tincin de cortes 1 m para microscopa ptica.
4.6.1
Para cortes de resina epoxi.
4.6.2
Para cortes de resina metacrilato.

10

Captulo IV: Infiltracin con resinas

Captulo V: Ultramicrotoma
5.1 Introduccin a la ultramicrotoma.
5.2 Las cuchillas.
5.3 Herramientas necesarias para ultramicrotoma.
5.3.1 Tipos de pinzas o bruselas.
5.3.2 Las grillas:
5.4 Sintetizando el proceso.
5.5 Cmo extraer el taco de su molde
5.6
Tallado del taco.
5.6.1
Tallado en mesa.
5.6.2
Alineacin de la cuchilla.
5.7
Eleccin del ngulo libre.
5.8
Cortes semifinos (1 m).
5.9
Tincin de cortes de resina de 1 m para microscopa ptica.
5.9.1

Azul de toluidina para cortes de resina epoxi.

5.9.2

Colorante policromo (azul y rojo).

5.10 Re tallado del taco manualmente.


5.10.1 Corte y recogida de secciones en una grilla.
5.11 Cmo se sabe el grosor del corte?
5.11.1 Referencias de colores.
5.12 Preparacin de grillas con film soporte
5.12.1 Film de Parlodion o Colodion.
5.12.2 Film de Formvar.
5.13-Problemas en el corte con el ultramicrtomo.

11

Azul de toluidina para cortes de resina metacrilato.

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5.9.3

Captulo VI: Contraste.


6.1 Objetivo del contrastado de secciones.
6.1.1 Cmo se logra el contraste?
6.1.2 Condiciones que debe tener un medio de contraste.
6.1.3 Clasificacin de medios de contraste:
6.1.3.1
6.1.3.2
6.1.3.3
6.1.3.4
6.1.4

Contraste intravital.
En bloque.
Contraste de cortes finos montados en grillas.
Contraste negativo.
Materiales difciles de contrastar: tcnica.

6.1.5
Medios de contraste para Microscopa Electrnica de Transmisin (TEM).
6.1.5.1
Acetato de Uranilo: U: PM=238.
6.1.5.2
Soluciones de plomo: (Pb=PM 207).
6.1.5.3
cido fosfotngstico (PTA) (H 3 PO4.12 WO3.24H2O).
6.1.5.4
Permanganato de potasio: KMnO4 : (Mn=55).
6.1.5.5
Rojo de Rutenio.
6.1.5.6
Contraste de polmeros.
6.1.5.7
Tetrxido de Osmio.
6.1.5.8
Tetrxido de Rutenio.
6.1.5.9
cido clorosulfnico.

6.2.2
6.2.3
6.2.4
6.2.5

Contraste de la imagen.
Factores que afectan el contraste.
Tiempo de accin y penetracin del agente contrastante
Especificidad del contrastante
Factores que afectan al acetato de uranilo.
Contaminacin de las secciones

12

6.2
6.2.1

cido Fosfotngstico.

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6.1.5.10

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7. Inmunolocalizacin.
7.1
La reaccin a se puede realizar:
7.1.1
Antes de la fijacin.
7.1.2
Luego de la fijacin y antes de la infiltracin en resina.
7.1.3
Luego de la fijacin y polimerizacin en una resina epoxi.
7.1.4
Luego de la fijacin y polimerizacin en una resina hidroflica.
7.1.5
Sobre crio cortes.
7.2
Cundo utilizar lowilcryl y cundo criocortes?
7.2.1
Usamos CUM (crio-ultramicrotoma).
7.2.1.1 Como patrn de ultraestructura.
7.2.1.2 Cuando tengo disponibilidad de nueva muestra.
7.2.1.3 Porque es ms rpida (sin 2 fijacin, sin deshidratacin ni polimerizacin).
7.2.1.4 Para detectar antgenos muy lbiles o en baja cantidad.
7.2.1.5 Para hibridizacin in situ.
7.2.2
Fijacin suave.
7.2.3
Preinfiltracin.
7.2.4
Resinas metacrilato: Inmunolocalizacin luego de la fijacin y polimerizacin.
7.2.5
Los criocortes.
7.2.5.1 Qu ocurre cuando se congela una solucin acuosa a distintas velocidades?.
7.2.5.2 Qu ocurre cuando las clulas estn en una solucin acuosa?
7.2.6
Fijacin.
7.2.7
Crioproteccin.
7.2.8
Corte.
7.2.8.1 Problemas de corte.
7.2.8.2 Las cuchillas de diamante.
7.2.8.3 La cuchilla de vidrio.
7.3
Artefactos del corte.
7.4
Protocolo para obtener secciones por CUM.
7.5
Pasos del protocolo de inmunomarcacin sobre secciones montadas en grillas.
7.5. 1
(CUM o Lowilcryl).
7.6
Tipos de contraste.

13

Captulo VII: Inmunolocalizacin

7.7

Ventajas y desventajas de la tcnica.

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8. Introduccin.
8.1
Tipos de muestras y mtodo de preparacin (SEM).
8.2
Preparacin de superficies.
8.3
Mtodos para remover materiales extraos de la superficie de la muestra.
8.3.1 Desmineralizacin.
8.3.2 Para remover cilios o flagelos.
8.4
Fijacin.
8.4.1 Fijacin qumica.
8.4.1.1Coagulantes.
8.4.1.2No coagulantes.
8.4.2
Formas de utilizacin de los fijadores.
8.4.3
El vehculo ideal.
8.5
Deshidratacin.
8.5.1
Objetivo de la deshidratacin.
8.5.2
Mtodos de deshidratacin.
8.5.2.1Un esquema tpico de deshidratacin es el siguiente.
8.5.2.2Mtodo de diluciones infinitas.
8.6
Secado.
8.6.1
Secado por congelamiento.
8.6.2
Secado al aire desde solventes orgnicos.
8.6.3
Secado por punto crtico.
8.6.3.1Fluidos intermediarios y de transicin.
8.6.3.2Portamuestras para secado por punto crtico.
8.7
Montaje de especmenes para microscopa electrnica de barrido.
8.7.1
Adhesivos para sostener la muestra.
8.7.2
Montaje de la muestra.
8.7.2.1 Orientacin de la muestra.

14

Captulo VIII: Preparacin de muestras para microscopa electrnica de barrido

8.8
8.9
8.10
8.11
8.11.1
8.11.2
8.12

Materiales para depositar.


Constantes fsicas de varios elementos empleados en la formacin de films conductores.
Cuidados para con la muestra despus que ha sido montada.
Evaporador de metales en alto vaco.
Produccin de films conductores delgados.
Evaporadora de metales en plasma de argn.
Comparacin entre evaporador en vaco y evaporadora en plasma de argn.

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9 gua para la preparacin de muestras para Microscopa Electrnica de Barrido.


9.1
Tejidos blandos animales.
9.2
Clulas libres.
9.3
Microorganismos en suspensin.
9.4
Microorganismos en agar.
9.5
Bacterias.
9.6
Organismos acuticos.
9.7
Plancton (Lab. de microscopa Electrnica de la UAT).
9.7.1 Protocolo para fijar zooplankton. (Laboratorio de Microscopa Electrnica UAT)
9.8
Vegetales.
9.8.1 Semillas.
9.8.2 Frutos.
9.8.3 Almidn.
9.9
Notas de inters.
9.10.
Polvos particulados.
9.10.1 Polvos secos.
9.10.1.1Mtodo 1: Espolvoreo.
9.10.1.2 Mtodo 2.: Por corriente de aire.
9.10.1.3 Mtodo 3. : Flujo en recipiente semi-cerrado.
9.10.2 Partculas en suspensin lquida.
9.11
Muestras filtradas.
9.12
Fractura (materiales polimricos).

15

Captulo IX. Protocolos ejemplo para SEM.

9.13

Alimentos. Masas.

Captulo X: Artefactos

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10.2.1 Tiempo de agona.


10.2.2 Prdida de sustancias.
10.2.3 Falsa localizacin.
10.2.4 Prdida de la actividad biolgica (enzimtica o la antigenicidad).
10.2.5 Reacciones inespecficas.
10.2.6 Alteracin del volumen de las estructuras.
10.3
Artefactos causados por deshidratacin e inclusin en TEM.
10.4
Resinas epoxi.
10.5
Artefactos en seccionamiento ultra fino.
10.6
Artefactos relacionados con la ultramicrotoma.
10.6.1 Parmetros para tener en cuenta.
10.6.1
Ambientales.
10.6.2
Chatter.
10.6.3
Compresin.
10.6.4
Marcas de cuchilla.
10.6.5
Arrugas al recoger la seccin.
10.6.6
Secciones irregulares.
10. 7
No se logran cortes en serie.
10.8
Contaminacin de las secciones debido a ultramicrotoma.
10.9
Artefactos debidos a la performance de los instrumentos utilizados.
10.9.1 Distorsin en las imgenes.
10.9.1.1
Problemas mecnicos.
10.9.1.2
Penetracin del haz.

16

10 Artefactos. Definicin.
10.1 Artefactos causados por la fijacin en Microscopa Electrnica de Transmisin.
10.2 Artefactos de fijacin en TEM.

10.9.1.3
Contaminacin.
10.9.1.4
Deriva de la imagen e inestabilidades mecnicas.
10.9.1.5
Desviacin trmica.
10.9.1.6
Vibracin Mecnica.
10.9.1.7
Inestabilidades elctricas y magnticas.
10.10
Artefactos propios de la microscopa electrnica de barrido (SEM).
10.10.1
Artefactos ms comunes durante la observacin en el microscopio.
10.10. 2 Daos producidos en la muestra durante la preparacin.

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11-La Micrografa Electrnica.


11.1 El cuarto oscuro electrnico: Imgenes digitales.
11.2 Importancia del tamao del pixel.
11.3 Cmo se puede saber si todos los pixeles en una cmara CCD, contribuyen a mejorar la resolucin ?
11.4 Publicacin de las micrografas.
11. 5
Imagen digital.
11.5.1 Formacin de la imagen digital.
11.5.2 El sistema binario y su funcionamiento.
11.5.3 Pixeles: Los puntos de una imagen.
11.5.4 La resolucin, cantidad de pixeles.
11.5.5 La resolucin de la impresin: Puntos por pulgada (ppp) Pixeles por pulgada (ppi).
11.5. 6 Pixelacin.
11.5.7 Cmo guarda el color el pixel: El Bit y el color.
11.6
Formatos de archivos.
11.6.1 Imgenes Vectoriales.
11.6.2 Mapa de bits.
11.6.3 Compresin de los archivos digitales.
11.6.4 Formatos con prdida de calidad.
11.6.5 Formato de archivo Tiff.
11.6.6 Formato de archivo BMP.

17

Captulo XI. Aplicacin de la fotografa digital a la Microscopa Electrnica.

11.6.7 Eps: Encapsulated Postscript.


11.6.8 Psd, formato de archivo de photoshop.
11.6.9 PDF, portable document format.
11.6.10 JPEG y la fotografa digital.
11.6.11 Formato de archivo GIF.
11.6.11.1
Normas a seguir antes de editar una imgen JPEG
11.6.12 Formato de archivo GIF
11.6.13 Formato PNG.
11.7
Procesos de mejora de las imgenes.
11.7.1 Procesos de modificacin del brillo y contraste por transformacin del histograma.
11.8
Filtros de convolucin.
11.8.1 Teora y definiciones.

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12-1.1.
Reactivos
12.1.1.1.
-Acetato de uranilo
12.1.1.2.
-Acetona
12.1.1.3.
-Alcohol etlico
12.1.1.4.
-Azul de toluidina
12.1.1.5.
-Buffer (fosfato y cacodilato)
12.1.1.6.
-Citrato de plomo
12.1.1.7.
-F.A.A.
12.1.1.8.
-Glutaraldehdo
12.1.1.9.
-Permanganato de potasio.
12.1.1.10. -Resina Spurr (epoxi)
12. 1.1.11.
-Solucin Formvar (resina de polivinil formal-dicloruro de etileno)
12.1.1.12. -Tetrxido de osmio
12.1.1.13. -Tetrxido de rutenio
12-1.2.
Gases comprimidos y licuados
12.1.2.1.
- A argn

18

Captulo XII: Seguridad en el laboratorio de Microscopa Electrnica..

12.1.2.2.
- Nitrgeno gaseoso
12.1.2.3.
-Dixido de carbono lquido
12.1.2.4.
-Nitrgeno lquido
12.1.3: Equipos
12.1.3.1
- Micro centrfuga
12.1.3.2
- Bao ultrasnico
12.1.3.3
- Horno y plato agitador/calefactor)
12.1.3.4
- Secador por punto critico
12.1.3.5
- Ultramicrtomo
12.1.3.6Evaporacin de metales
12.1.4: Microscopios electrnicos
12.1.5: Manipulacin, transporte y envo de muestras y productos qumicos
12.1.6: Gestin de residuos
12.1.7: Emergencia
12.1.8: Marco legal

Tincin para observar secciones gruesas en el microscopio ptico.


Para contraste de secciones ultrafinas.
Fijadores.
Para formaldehido.
Glutaraldehdo en buffer Sorensen 4 % (pH 7.25).
Formalina cido actico Alcohol (FAA).
Tetrxido de osmio 2%.
Soluciones Tampn.
Sorensen.
Cacodilato de sodio 0.4 M.
Soluciones para contraste.
Acetato de uranilo.

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A1).
A2).
A3).
A3.a)
A3.b)
A3.c)
A3.d)
A4).
A4. a)
A4. b)
A5).
A5.a)

19

Apndice I : Soluciones de trabajo y reactivos necesarios.

A5.b)
A5.c)
A5.d)
A.6)
A.7)
A.8)
A.9)
A9.a)
A9.b)
A9.c)
A.10)
A.11)
A.12)
A.13)

Citrato de plomo.
Solucin de K2MnO4..Solucin de rojo de rutenio para contraste en bloque.
Colorantes para cortes semifinos para microscopa ptica.
Formacin y remocin de precipitados formados por soluciones de contraste en cortes ultra finos.
Pre-infiltracin con agar.
Resinas.
De baja viscosidad. Spurr. (1969).
Metacrilatos para estudios citoqumicos.
Epon, Araldite.
Cmo quitar la resina epoxi de los cortes.
Cmo quitar la resina epoxi de los tacos mal infiltrados.
Tcnica de desparafinizacin.
Ejemplo de protocolo.

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AII
Mantenimiento y operacin.
AII.1
Condiciones de operacin.
AII.2
Seleccin del tamao del haz ( spot size)en TEM
AII.3
Limpieza del can.
AII.4
Qu potencial utilizar en su muestra?.
AII.5
Recambio de aperturas.
AII.5.1
- Eleccin de aperturas.
AII.6
Alineacin del haz.
AII.7
Correccin de astigmatismo.
AII.8
Enfoque.
AII.9
Adquisicin de imgenes.
AII.10
Con respecto al portamuestras.
AII.11
Seleccin de la magnificacin.
AII.12
Foco.
AII.12.1 Enfoque a baja magnificacin.

20

Apndice II: Condiciones de operacin

AII.12.2
AII.12.3
AII.12.4
AII.13
AII.13.1
AII.14
AII.15
AII.16
AII.17
AII.18
AII.19
AII.20
AII.20.1
AII.20.2
AII.21
AII.21.1
AII.21.2

Enfoque a alta magnificacin.


Correccin de astigmatismo.
Correccin de astigmatismo en el SEM.
Alineacin (TEM).
-Alineacin SEM.
Alineacin del can de electrones.
Alineacin de la lente condensadora en TEM.
Sistema formador de imagen (TEM).
Alineacin de la apertura de objetivo (TEM).
Campo oscuro.
Difraccin de rea selecta.
Mantenimiento de equipos accesorios.
-Mantenimiento de la evaporadora de metales en plasma de Argn.
-El aparato de secado por punto crtico.
Calibracin.
-Calibracin de la magnificacin (TEM).
-Calibracin de la magnificacin (SEM).

Tp2.1
TP2.2
TP2.2.1

Contraste con acetato de uranilo y citrato de plomo. (Biologa).


Contraste de polmeros. (Materiales).
Tetrxido de Osmio. (Materiales).

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Instrumentacin necesaria. (Materiales)


Microscopa Electrnica de Transmisin.(TEM).
TP1
Fijacin, deshidratacin e inclusin. (Biologa)
TP1.1 Fijacin: Esquema tipo. (Biologa)
TP1.2 Deshidratacin: Esquema tipo .(Biologa)
Tp1.3 Inclusin en resina y polimerizacin.(Biologa)
TP1.4 Inclusin en resina. (Materiales).
TP2.
Contraste. (Biologa y Materiales)

21

Gua de trabajos prcticos. (Biologa y Materiales)

TP2.2.2
Tetrxido de Rutenio. (Materiales). (Para polmeros seccionados previamente).
TP3
Film Soporte.
TP3.1 Preparacin de grillas con soporte. (Biologa y materiales).
TP3.2 Cast films. (Materiales).
TP4.
Tallado del taco de resina. (Biologa y materiales).
TP5.
Preparacin de polvos TEM. (Materiales).
Tp5.1 Molienda y Suspensin. (Materiales) .
Microscopa de Barrido. (SEM)

TP6.1
TP6.2
TP6.3
TP6.4
TP6.5
TP7
TP8

Secado por punto crtico. (Biologa).


Operacin del Desecador Modelo Polaron. (Modelo manual)(Biologa).
Montaje de especmenes para su observacin por microscopa electrnica de barrido (SEM) (Biologa y Materiales).
Evaporacin de metales en alto vaco. Evaporadora marca JEOL (Biologa y Materiales).
Evaporacin de metales en plasma de Argn. (Biologa y Materiales).
Seccin morfometra.
Interpretacin de imgenes.

Glosario

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22

BIbliografia general

INTRODUCCION

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23

Prof. Viviana Sorrivas de Lozano

I.1-Breve resea histrica de la microscopa electrnica


Desde el ao 1660 hasta la actualidad el microscopio ptico ha sido fundamental en el conocimiento de lo
invisible a nuestros ojos. Aunque su poder de resolucin aument a travs del tiempo con la mejora en la calidad
de las lentes, su factor limitante fue la longitud de onda de la luz. En 1873, Ernst Abbe predijo: Quiz en el futuro
se conozca algn principio que permita a travs de diferentes caminos sobrepasar los lmites que ahora nos
parecen insalvables. Creo que los instrumentos que nos asistirn algn da, ms suficientes que los
microscopios actuales para explorar los elementos del mundo fsico, no tendrn nada en comn con ellos, salvo
sus nombres (3) Realmente su prediccin se cumpli ya que los instrumentos actuales permiten acceder al
mundo molecular y atmico tan lejano para los investigadores de aquellos tiempos.
Fue gracias al descubrimiento de los principios fsicos que llegaron a ser la base terica de la microscopa
electrnica, que se avanz a pasos de gigante en el conocimiento de lo muy pequeo.
I.1.1-El rol de la mecnica de onda

El trabajo realizado por Busch en 1927, permiti desarrollar la ptica electrnica. Demostr que: Un campo
esttico o magntico, que tenga simetra de revolucin alrededor de un eje, ejerce una accin de enfoque real

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Knoll y Ruska crean que el aumento del poder de resolucin se deba a la pequea dimensin del
corpsculo electrn. Pensaban que la resolucin ptima deba ser menor que la distancia entre dos molculas
o tomos adyacentes en lquidos o slidos.

24

Cuando en 1924 De Broglie public su teora de longitud de onda asociada al movimiento del electrn, Ruska
se sinti frustrado porque una vez ms el lmite del poder de resolucin era gobernado por un fenmeno de
ondas. Pero, aplicando la frmula de De Broglie revel que la longitud de onda asociada con el electrn era
cinco rdenes de magnitud ms pequea que la onda de la luz, lo que implicaba de todas maneras un gran
avance, al aumentar el poder de resolucin.

sobre el haz de electrones paraxiales y constituye una lente electrnica constructora de imgenes .
Por los aos 1930, las investigaciones llevadas a cabo para desarrollar la ptica electrnica siguieron dos
caminos: El grupo que tuvo resultados exitosos fue el de Gaston Dupouy (3) y colaboradores, que en base a los
trabajos de Busch construy la primera lente electromagntica, pieza elemental de los futuros microscopios.
I.1.2- Los comienzos

En un trabajo traducido por Thomas Mulvey, Ernst Ruska (3), describi los esfuerzos que realiz con sus
colaboradores para concebir y disear el Microscopio Electrnico. La construccin del Microscopio Electrnico
fue el resultado de trabajos realizados sobre el oscilador catdico (osciloscopio)(2). Para lograr una densidad de
electrones adecuada, el punto clave fue determinar el dimetro del spot y la concentracin del haz. Este trabajo
se llev a cabo en el Instituto de Electrotecnia de la Universidad de Berln. Varios jvenes investigadores como
D.Gabor, A.Mathias, Max Knoll y Bodo Von Borries, estudiaron el tema durante los aos 1924-1929. La
concentracin del haz por un campo magntico se adopt como el mtodo ms conveniente.

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Con los fundamentos tericos para el desarrollo de la microscopa electrnica ya establecidos, se sucedieron
acontecimientos, que llevaron a optimizar los instrumentos. Paralelamente se implementaron tcnicas para
preparacin de muestras. El Dr. Bill Marton (Bruselas) ocup un rol importantsimo, ya que ide tcnicas en las
cuales las muestras no eran perjudicadas por el haz de electrones. Al observar las imgenes descubri que haba
aumentado el contraste. Interpret que era debido a la dispersin y no a la absorcin en la interaccin
electrn-muestra. (7).

25

El 7 de Abril de 1931 Ernst Ruska, asombrado y feliz, (imagnense!) obtuvo la primera imagen de una grilla
metlica con electrones. El modo de magnificacin fue M= l6x. Basndose en el trabajo de Busch (1927),
implement las lentes electromagnticas. En Diciembre de 1933 obtuvo imgenes de fibras de algodn M=
8.OOOx y una hoja de aluminio M= l2.000x (10).

El desarrollo del microscopio de barrido comenz en 1933, cuando Manfred Von Ardenne, vio la posibilidad
de construir un instrumento electrnico de Barrido que permitiera la observacin de superficies sin los
problemas que traa la preparacin de muestras para transmisin (secciones ultrafinas).
Los Trabajos de Von Ardenne fueron truncados debido a la destruccin del microscopio durante un ataque
areo en la Segunda Guerra Mundial. Por eso fue que recin en 1965 se produjo en Inglaterra el primer SEM
comercial.

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Fig.I.1- 1er. microscopio

26

Segn los Holandeses, el microscopio fue inventado por Zacharias Jansen, su invencin fue en 1590 1595 (WIKIPEDIA), cuando
trataba de encontrar un camino para magnificar las imgenes y ayudar a resolver el problema de la disminucin de visin. Aunque el
origen del microscopio tambin se lo atribuyen al italiano Galileo Galilei. La palabra microscopio se utiliz por primera vez en la
Academia dei Licei una sociedad cientfica a la que perteneca Galileo.

Fig.2- Galileo Galilei.

Fig.3- Zacharias Jansen

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27

En la tabla que contina figuran los hechos ms importantes en la historia de la Microscopia Electrnica.

Antonie Philips van Leeuwenhoek

(Octubre 24, 1632 Agosto 26, 1723)

Comerciante y cientfico Holands. Se lo conoce


como the Father of Microbiology, y es considerado
el primer microbilogo.
Alcanz una magnificacin con microscopio ptico
de 250X observ:
Protozoos, clulas sanguneas, espermatozoides.

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28

1660

Marcello Malpighi
(March 10, 1628 November 29, 1694)

Malpighi: Anatomista italiano. Mdico del


papa Inocencio 12, fue uno de los primeros en
aplicar el microscopio al estudio de los tejidos,
lo que le permiti descubrir nuevas
formaciones histolgicas (corpsculos de
Malpighi, del rin). Estudi tambin los
rganos respiratorios de los insectos y diversos
aspectos del desarrollo embriolgico. Dio a
conocer los resultados de su trabajo en varios
tratados.

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29

1665

Public dibujos
de insectos, cristales, plumas en Micrographia.

30

1665

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Robert Hooke
( 28 July 1635 3 March 1703)

Ernst Karl Abbe


(Enero 23, 1840 Enero 14, 1905)

Defini los lmites de resolucin de la microscopia


ptica. Fue un fsico alemn, optometrista y
reformista. Junto con Otto Schott y Carl Zeiss fundaron
la ptica moderna.

1873

Sir Joseph John Thomson,


(18 Diciembre 1856 30 Agosto 1940)

Fue un fsico Ingls. Describi a los electrones como


partculas que tienen carga elctrica negativa. O sea
que descubri las partculas subatmicas. Gan el

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31

premio Novel en 1906.

1897

Teora de la longitud de onda de los electrones.


th

Louis-Victor-Pierre-Raymond, 7 Duc de Broglie,

(15 August 1892 19 March 1987) ( 5)

Fsico francs que contribuy a definir la teora


cuntica, en 1924 en su tesis doctoral postul la
naturaleza de onda de los electrones y sugiri que la
materia tiene propiedades ondulatorias. Premio Novel
en 1929.
.

1924

Primera lente magntica.

32

1926

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H.Busch (5 )

Dos aos despus de la


publicacin de la tesis doctoral de De Broglie, en 1926,
H. Bush, el padre de la ptica electrnica present el
diseo de una lente electromagntica. Mediante este
tipo de lente sera posible enfocar un haz de electrones
de la misma forma que las lentes pticas enfocan los
rayos luminosos. Esta aportacin abri el camino al
diseo por parte de Ruska y Knoll del primer
microscopio electrnico, el TEM o microscopio
electrnico de transmisin en 1932, consiguiendo en
1934 superar el poder resolutivo del microscopio ptico.

1927

Davidson y Germer

Difraccin de electrones.

1924-1929

Gabor-Mathias M.Knoll-Von Borries-Vodo ( 3)

Desarrollo del oscilador catdico para determinar


el dimetro del spot y la concentracin del haz
ptimas.

1929

M. Stintzing

Dupouy y Coltou.

Desarrollo de lentes electromagnticas.

33

( 3) (2)

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1930

Descripcin terica del SEM.

Primer TEM. d =2000 de resolucin

Helmut Philipp Georg Ruska (1908-1973) y

Escrito por Ernst RUSKA: My first completed


scientific work (1928-9) was concerned with the
mathematical and experimental proof of Buschs theory
of the effect of the magnetic field of a coil of wire through
which an electric current is passed and which is then
used as an electron lens. During the course of this work I
recognised that the focal length of the waves could be
shortened by use of an iron cap. From this discovery the
polschuh lens was developed, a lens which has been
used since then in all magnetic high-resolution electron
microscopes. Further work, conducted together with Dr
Knoll, led to the first construction of an electron
microscope in 1931. With this instrument two of the most
important processes for image reproduction were
introduced-the principles of emission and radiation. In
1933 I was able to put into use an electron microscope,
built by myself, that for the first time gave better
definition than a light microscope.

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34

1932

Max Knoll (17 de julio de 1897 - 6 de


noviembre de 1969)

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35

1932

Marton (3)(7) (Bruselas)

1932

Ruska y Von Borries (3)

Uso Os04 para fijar especmenes.

Avances en las lentes electromagnticas. (Reduccin de aberraciones).

Primeros trabajos en SEM .

Manfred von Ardenne (20 January 1907 26 May

36

1997) (9).

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1933

1936

Krausse (3)

Morton
1936

1936

Demostracin de la teora de SEM. Introdujo mejoras. 3000 ev- 0,1 rnm-a 1mm de resolucin.

Primera imagen de Diatomeas y paredes de clulas epiteliales.

Observacin de Chromobacterium al SEM .


Difundi la Microscopa Electrnica

37

Knoll, Max

Primer microscopio comercial: Siemens (11).

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1935

Primer ultramicrtomo.
1937

Manfred von Ardenne (20 January 1907 26 May


1997) (9

1938

Primer SEM profundidad de foco= 100 nm.


Primer STEM de = 40 nm.
Reduccin de vibraciones.

Von Borries y Ruska

Primer TEM comercial.

38

1939

Primer microscopio de barrido (V.Ardenne vio en


el SEM una va para la observacin de especmenes
grandes).

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1938

Manfred von Ardenne (20 January 1907 26 May


1997) (9 )

1940

Manfred von Ardenne (20 January 1907 26 May


1997) (9)

1942

Worykin, J.Hillier, RL.Synder

1942-1943

Manfred von Ardenne (20 January 1907 26 May


1997)

Ernst Ruska (9 )

Introdujo el mtodo de estereografas.

Introduccin del detector de electrones secundarios con post-aceleracin (9 Kev), pantalla


fluorescente y fotomultiplicador.

Mejoran la resolucin en el TEM d res=


20 .

Segunda Guerra Mundial, finaliza el trabajo de


Von Ardenne. Un ataque areo destruye las
instalaciones de microscopa.
1944

Porter (P.N. Fisiologia y Medicina 1972), Claude (P.N.


Fisiologia y Medicina 1974) y Fullam utilizaron
el microscopio electrnico para examinar
clulas en cultivo de tejidos luego de fijarlas y

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1945

39

William and Wyckoff introducen la


tcnica de sombreado metlico.

teirlas con tetrxido de osmio.

1946
Philips introduce su primer prototipo de microscopio
electrnico comercial en Oxford.
Introduccin del corrector de astigmatismo. dres=
0,6 nm.

1948
Hillier Ramberg (9)
1950

Pease y Baker preparan confiablemente secciones


biolgico.

H. Latta y J. F. Hartman introducen la cuchilla de


vidrio para ultramicrotoma.

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1956

Palade (P. N. Fisiologa y Medicina 1975) , Porter


(P.N. Fisiologa y Medicina 1972), y Sjstrand
desarrollan mtodos de fijacin y seccionamiento fino
que permitieron ver por vez primera muchas
estructuras intracelulares. En una de las primeras
aplicaciones de estas tcnicas, H. E. Huxley demostr
que los msculos esquelticos contienen un arreglo

40

1952

solapado de filamentos protenicos, apoyando la


hiptesis de los filamentos deslizantes de la
contraccin muscular.

Observ la doble hlice del ADN en TEM.


Hall

1956

Smith K.C.A

Produccin de lentes electromagnticas SEM.


Glauert y asociados demuestran que la resina
epxica Araldita era un agente efectivo para incluir
muestras para microscopa electrnica.

Singer utiliza anticuerpos acoplados a


ferritina para detectar molculas en
las clulas utilizando el microscopio
electrnico.

41

1956

Microanlisis con rayos x.

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V.E.Cosslell y P.Duncomb

d res =12 (TEM).

Singer utiliza anticuerpos acoplados a ferritina para


detectar molculas en las clulas utilizando el
microscopio electrnico.
1959

1960

Brenner y Horne ampliaron la tcnica de tincin


negativa, inventada cuatro aos antes por
Hall, a una tcnica de uso general para la
visualizacin de virus, bacterias y filamentos
protenicos.

Everhart Thornley (9)

Introduce el centellador. SEM (disminuye el ruido


en la pantalla).

Primer microscopio electrnico de alto voltaje (3)1 MV (Tou1ousse). Se observaron bacterias vivas.

1965

Oatley (6)

Primer stereoscan. Resolucin: 20 nm. Primer


SEM comercial
( Cambridge Instrument Company).

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42

1960

1970

Crewe-Wall (9)

1976

Demuestra que la crio-fractura permite


visualizar el interior de las membranas.

Introduce el campo de emisin para el haz (SEM)


dres = 0,5 nm.

Microscopio Electrnico Analitico. SEM-TEM.

43

Branton

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1966

STEM- Rayos X.(Instrumento hibrido).(10).

1980

Procesamiento de imagenes digitalizadas.

1987---a
------1993

60 microscopios de alto voltaje en todo el mundo.


Se logra la resolucin de 1 en un Philips CM200/300 en la Universidad de Tbingen

I.2-Estado del arte

I.2.1.1-Atomic resolution JEOL jem-arm200f tem:


En febrero de 2010 se instal, en la Universidad de Texas, el primer microscopio electrnico de transmisin de resolucin atmica. El
atomic resolution JEOL JEM-ARM200F permite tanto la resolucin de imgenes tomo por tomo y el mapeo espacial de materiales

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Desde la comercializacin del primer microscopio electrnico de transmisin, en la dcada del 30, la tecnologa y aplicaciones de estos
instrumentos han ido modificndose de acuerdo con los interrogantes plantados por los cientficos. Es as que el Microscopio Electrnico
de Transmisin (TEM) fue perfeccionndose a lo largo de dcadas conforme a los descubrimientos y avances en el campo de la fsica y la
electrnica.
Se muestran aqu solo algunas de las novedades y futuros desarrollos en el campo de Microscopa Electrnica de Transmisin (TEM).

44

I.2.1-Nuevas tecnologas en microscopios de transmisin

qumicos a nivel atmico. Posee un diseo completamente nuevo de columna de electrones que integra SEM / TEM.

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La construccin de un microscopio electrnico de transmisin de bajo voltaje es un proyecto Carl Zeiss SMT en conjunto con la
Universidad de Ulm y CEOS (Heidelberg) iniciado en febrero de 2009 y con perodo estimado de realizacin de 5 aos. El proyecto
microscopios de transmisin (TEM) que produzcan imgenes con resolucin atmica utilizando relativamente bajo voltaje de aceleracin.
Para el Profesor Harald Rose, encargado de disear los instrumentos de correccin de ste nuevo microscopio, SALVE significa un sueo
hecho realidad para poder seleccionar el voltaje de aceleracin basado en los requisitos de la muestra y el objetivo sin sacrificar
resolucin. Segn comentarios del director del proyecto, en comparacin con los TEM actuales de media tensin que destruyen las
muestras sensibles a la radiacin antes de que las imgenes puedan ser registradas, este nuevo microscopio de alto rendimiento
permitir por primera vez obtener imgenes electrnicas de muestras sensibles al haz de electrones y el seguimiento de los procesos
moleculares que contribuyen a la decodificacin de conversiones qumicas. El conocimiento de estos procesos es fundamental para
muchas reas de aplicacin en ciencias de los materiales, la investigacin biomdica y en la tecnologa de semiconductores.

45

I.2.1.2-Low-voltage transmission-electron-microscopy:

I.2.1.3-Dynamic transmission electron microscope:

Un equipo de cientficos de la UC Davis propone desarrollar el primer microscopio electrnico del mundo capaz de filmar en vivo los
procesos biolgicos. Su plan es trabajar sobre el dynamic transmission electron microscope o DTEM para expandir sus capacidades.
Los DTEMs son versiones avanzadas de los microscopios electrnicos de transmisin (TEM), que en lugar de tomar fotos estticas
capturan procesos en tiempo real mediante el uso de un lser pulstil que produce rfagas muy cortas de electrones para iluminar las
muestras. El DTEM puede captar de 10 a 100 imgenes por millonsima de segundo, mientras que captura detalles tan pequeos como
10 nanmetros.
La finalidad del proyecto es adaptar los DTEMs a clulas vivas y sistemas en movimiento, esto permitira aumentar 100 veces la
resolucin actual, permitiendo a los cientficos observar y registrar los procesos biolgicos a nivel molecular.

I.2.1.4- Nuevo detector de electrones directo Fei company

I.2.1.5- Liquid scanning transmission electron microscope (stem).

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46

En julio de 2009 se anunci el nuevo Falcon Direct Electron Detector para microscopios electrnicos de transmisin (TEM). Su
funcionamiento se basa en la deteccin directa de electrones, lo que permite la adquisicin de imgenes con poco ruido de muestras
biolgicas delicadas y otros materiales sensibles que requieren bajas dosis de electrones para prevenir del material.

Esta nueva tcnica utiliza dispositivos que contienen fluidos, con una ventana transparente a los electrones (silicon nitrate) que permite
obtener imgenes de clulas en un medio lquido.
Para demostrar su funcionamiento los investigadores utilizaron STEM para obtener la imagen de una molcula del factor de crecimiento
epidrmico unido a un receptor de superficie celular, logrando una resolucin de 4 nanmetros.

I.2.1.6-Los microscopios electrnicos de transmisin (TEM) actuales

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47

Son capaces de resolver detalles de estructuras biolgicas y no-biolgicas a escalas micromtricas, nanomtricas e incluso subnanomtricas. Estos microscopios, emplean muestras muy finas (500 o menores), las cuales son atravesadas por un haz de electrones
que pasa por un sistema de lentes electromagnticas. La imagen generada puede ser visualizada en una pantalla fluorescente, una placa
fotogrfica o una cmara digital, con altas magnificaciones y alcanzando ultra-altas resoluciones. Adicionalmente, esta capacidad puede
ser mejorada con sistemas analticos capaces de brindar informacin precisa sobre la composicin y estructura de la muestra, el grosor, la
composicin qumica y elemental, la estructura electrnica y los niveles de energa, e incluso la distribucin elemental-especfica de los
tomos de los especmenes.

I.3- Aplicaciones de la tcnica que coadyuvaron al desarrollo de nuevos microscopios electrnicos de transmisin

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48

1. Determinacin de estructura cristalina en minerales, metales, etc.


2. Estudio de catalizadores.
3. Determinacin de impurezas, precipitados, etc.
4. Identificacin de bordes de grano e interfaces en metales.
5. Estudio de fases y zonas cristalinas en polmeros.
6. Determinacin de tamao de partculas en catalizadores, minerales, etc.
7. Identificacin de planos cristalinos.
8. Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos trmicos.
9. Realizacin de estudios de histoqumica para identificar compuestos especficos.
10. Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales y animales.
11. Reconocimiento de virus.
12. Estudios de cito qumica.
13. Estudios de estructuras moleculares.
14. Anlisis elemental a nivel nanomtrico.
16. Determinacin de estructura cristalina a nivel nanomtrico.
17. Estudios de interfases en recubrimientos, uniones de materiales semiconductores.
18. Estudios a nivel nanomtrico de tratamientos trmicos In-Situ al interior del microscopio electrnico.

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Ultra alta resolucin (0.08 nm)


Alta magnificacin (1.500.000x)
Gran aceleracin de voltaje (hasta 300 kV)
Calentador de filamento automtico
Alineacin y saturacin automtica del haz
Gran contraste y brillo
ptimo balance contraste/resolucin
Modificacin de la iluminacin, el foco y la minimizacin del astigmatismo fcilmente
Corrector de aberraciones esfricas
Fcil manejo de controles
Operacin automtica
Anlisis de alta sensibilidad
Gran cantidad de muestras a analizar
Mnimo dao de las muestras por el haz de electrones
Mltiples opciones de operacin (inclinacin, rotacin, calentamiento, enfriamiento, crio muestras, etc.)
Aptos para aplicaciones de materiales biolgicos y no biolgicos
Exposicin fotogrfica automtica
Adaptacin de cmaras digitales que proveen imgenes instantneas y de alta calidad con slo apretar un botn
Informacin 2D y 3D y 3D-tomografa. Reconstruccin y visualizacin de imgenes
Almacenamiento de datos
Rpida adquisicin de datos
Software con contenido de tutoriales, guas de manejo y operacin remota
Gonimetro de alta estabilidad
Estabilidad elctrica y mecnica

49

I.3.1-Caractersticas notables que poseen los microscopios actuales con ms capacidades.

Estabilidad ante fluctuaciones magnticas y trmicas


Versatilidad de detectores
Adaptacin a bajas temperaturas (crio TEM) para muestras que pueden ser daadas al ser tratadas con el protocolo tradicional (secado,
fijado y tincin), adems
de la posible introduccin de artefactos.
Observacin de muestras no contrastadas.
Permite la adicin de accesorios como binoculares, programas especficos, portamuestras especiales (eliminan el background),
detectores ultra-sensibles, sistemas de crio-transferencia de temperatura, control de lentes individuales, scanning de las grillas para
determinar una posicin exacta, calibracin semiautomtica de la magnificacin, programas de fotomontaje, operacin remota, etc.
Se puede combinar con un equipo de barrido (STEM)
Obtencin de resultados repetitivos y de alta calidad
Diseo ergonmico para el confort del operador
El Microscopio Electrnico de Transmisin - TEM - se ha utilizado en todos los mbitos de las investigaciones biolgicas y biomdicas, por
su capacidad para observar las estructuras ms finas de la clula. Tambin se utiliza como herramienta de diagnstico en los laboratorios
de patologa de los hospitales.
Los cristalgrafos, metalrgicos y cientficos que realizan investigacin de semiconductores, usan preferentemente TEM de alto voltaje /
de alta resolucin, utilizando un voltaje de aceleracin que va de 200 keV a 1 MeV. Se ha conseguido la proyeccin de imgenes de
tomos, permitiendo a los investigadores supervisar los materiales y su diseo con propiedades a medida.

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50

Con la incorporacin de anlisis de energa dispersiva de rayos X (EDX) o espectrometra de prdida de energa (EELS), el TEM tambin se
puede utilizar como una herramienta de anlisis elemental, capaz de identificar los elementos desde boro hasta Uranio.

I.4 -Avances en la tecnologa de microscopa electrnica de barrido:

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EL FIB o haz de iones enfocados es una tcnica utilizada particularmente en la industria de los semiconductores, ciencia de los
materiales y se est incrementando en el campo de la biologa para realizar anlisis de deposiciones y ablacin de materiales. Es similar
al microscopio electrnico de barrido. Lo que ocurre es que mientras el SEM usa un haz de electrones para obtener la imagen, un FIB usa
un haz de iones por lo que debera denominarse Microscopio inico.
Un uso tpico es en la fabricacin de semiconductores y se desarrollaron a partir de la necesidad creada por la industria de los
microchips. La tcnica utiliza una mscara para exponer una capa foto resistente sobre un sustrato hecho de un material semiconductor
tal como dixido de silicio o un arseniuro de galio Este sello se revela para tener un positivo foto resistente. Las porciones expuestas
son removidas con un proceso qumico. El resultado es un patrn dejado sobre la superficie del sello que ha sido enmascarado para
exponerlo. El sello se coloca en la cmara de vaco y se expone al haz de iones. El impacto de los iones erosiona la plantilla quitando
reas no cubiertas por el material foto resistente. Otra utilidad de estos instrumentos es realizar anlisis de falla de semiconductores.
Esta verificacin combina el remover material o agregar material conductor, dielctrico o aislante.
El instrumento posee un can de iones, un can de electrones y un micro manipulador. Con el de electrones se va observando la
muestra, con el de iones se va horadando o calando la superficie. El micro manipulador se utiliza en el caso de que se desee obtener
secciones finas o ultrafinas para Microscopia Electrnica de Transmisin. Los iones ms utilizados son de Galio porque su punto de fusin
es de 31 C pero puede depositarse, C, Pt, W, SiO2, etc.
Para idear este instrumento se basaron en la concepcin de Gilbert (1600), y luego Taylor (1969). El principio de Gilbert deca que un
fluido sometido a alta tensin formaba un cono, aun un fino hilo poda dispersarse en forma de jet. Taylor realiz la experimentacin.
Entonces el cono de Gilbert pas a llamarse Gilbert-Taylor. El haz de Galio, que se forma en la punta del cono de Gilbert-Taylor logra una

51

I.4.1-FIB: ( Focused ion beam)

Pgina

Figs. I. 2 e I.3
Los instrumentos modernos cuentan con un micro manipulador cuya funcin es extraer lamelas o secciones para TEM, realizar
mediciones elctricas , manipular nano objetos, agregar o quitar otros, rotar, aplicar fuerzas , etc.
Tambin se pueden tallar muestras para observar su interior, grabar la superficie para realizar complejos patrones o agregar
materiales.
Con respecto al Microscopio Electrnico de transmisin lo que sera importante mejorar es la resolucin, sabemos que la resolucin
depende de la longitud de onda de los electrones y la calidad de las lentes. La Long. de onda se achica aumentando el voltaje de
aceleracin o mejorando la correccin de la aberracin esfrica de la lente objetiva. El elemento clave del TEM ultra- alta resolucin
(UHRTEM) incluye tres nuevos componentes ptico electrnicos. El corrector Cs de aberracin esfrica de acuerdo al concepto de Rosew,
que consiste de dos hexapolos y dos lentes dobles que proveen la completa compensacin para la aberracin esfrica en las lentes
objetiva. El segundo componente es un monocromador y se encuentra integrado en un sistema de emisin de campo. El monocromador
reduce la dispersin del haz de electrones desde 0.7 eV a valores menores a 0.2 eV. La combinacin del monocromador FE con el
corrector Cs de la lente objetiva rompe la barrera de la resolucin sub Angstrom. Finalmente el UHRTEM contiene en la columna un

52

coherencia espacial transformndolo en un haz de iones. Tambin puede hacerse el molido del material para grabar la superficie. Se
utilizan Xe2 F, para Silicio y aislantes, I2, para metales, H2 O en el caso de C, polmeros.
Otras experiencias que pueden realizarse son: contactar estructuras microscpicas por deposicin de metales, secciones no
perpendiculares, repetir secciones para hacer imgenes 3 D, EDX en una lnea de un rea y EBSD: mapeo de una seccin.

filtro de energa que dispersa los electrones de acuerdo a su energa. (Como un prisma dispersa los colores de la luz visible) y provee un
espectro de energas perdidas (EELS).
Una imagen libre de artefactos. La habilidad de reducir los defectos de las lentes, la aberracin esfrica en tres rdenes de magnitud
a un valor cercano a 0 no slo incrementa la resolucin sino que mejora la calidad de la imagen. (ref. reporte de Zeiss).
Los avances en preparacin de muestras, instrumentacin y metodologa han llevado a ampliar las aplicaciones desde la escala sub
nanomtrica a la micromtrica. La tomografa electrnica (ET) por rayos X, la microscopa correlativa, difraccin y holografa.

Pgina

De acuerdo a la informacin recabada, se observ que el fundamento por el cual funcionan los microscopios electrnicos de transmisin
actuales es el mismo que el empleado por Ernst Ruska. No obstante estos equipos han evolucionado, y lo seguirn haciendo si se
contina mejorando la calidad de las lentes y se sigue multiplicando la versatilidad de aplicaciones que pueden alcanzar cuando trabajan
combinados a otras tcnicas y a otros avances tecnolgicos de automatizacin, los cuales deben ir acompaados del perfeccionamiento
en la adquisicin de datos.
Los principales proveedores de microscopios de transmisin electrnica en Argentina al momento de esta publicacin son: JEOL, FEI
Company (fusionada con Philips Electron Optics), Carl Zeiss y Hitachi. La mayora de los actuales microscopios son multifuncionales y con
controles computacionales, algunos ofrecen en un mismo equipo, TEM, STEM y EDX, otros ofrecen STEM, EDX, EELS y ADF, otros
permiten STEM, EDX, EELS y ESI (electron spectroscopic imaging: imagen espectroscpica electrnica). El STEM es una modificacin del
microscopio de electrnico de transmisin, en el cual los electrones pasan por la muestra, pero, como en un SEM (microscopa
electrnica de barrido), las lentes focalizan el haz de electrones un punto estrecho que es barrido sobre la muestra con un patrn o
trama de barrido. La diferencia es que la accin de focalizacin del haz electrnico (y correccin de sus aberraciones) ocurre antes que
ste impacte sobre el espcimen, a diferencia del TEM que ocurre despus. El barrido del haz de electrones con una trama a travs de la
muestra, hace que estos microscopios sean convenientes para tcnicas de anlisis como el mapeo de la energa de los rayos-X
dispersados (EDX), de la prdida de energa de electrones (EELS) y la representacin campo oscuro anular (ADF). ste ltimo es un
detector de forma de disco con un agujero con el centro donde est instalado el detector convencional (bright field detector), y capta los
electrones dispersados por la muestra en ngulos bajos, obtenindose una imagen de contraste. Tambin algunos equipos ofrecen como
complemento un detector HAADF, que es similar al anterior, pero el dimetro y el agujero central son mucho mayores, de forma de
detectar los electrones dispersados a altos ngulos, as, casi slo la dispersin incoherente contribuye a la formacin de la imagen. Estas
seales (STEM, EDX, EELS, etc.) pueden ser obtenidas simultneamente, permitiendo la correlacin directa de imagen y datos
cuantitativos.

53

I.5- CONCLUSIONES

Tambin muchos equipos TEM dan opcin a cryoholders para analizar muestras a muy bajas temperaturas (< 100 K).
Las resoluciones logradas, especialmente en STEM son de 1 o subangstroms para muestras ultra delgadas. Esto se logra con:
potenciales de 100 a 300 KeV, con fuente de electrones del tipo emisin de campo (field emission gun), el cual fue desarrollado por
Albert Crewe (dcada del 70) y crea un haz de electrones de mucho mayor brillo que la fuente tradicional termoinica. Uso de
monocromadores para evitar prdidas de energa del haz de electrones. Correctores de aberraciones (esfrica, cromtica) que aumentan
la densidad de corriente de la sonda de electrones mejorando la relacin seal/ruido y aumentando la sensibilidad. Estos correctores
fueron mejorados en los ltimos 20 aos por investigadores como Zach, Rose y Haider e incorporados a los TEM comerciales a partir de
2004. Tambin los nuevos equipos cuentan con mecanismos para mejorar la estabilidad elctrica y evitar fluctuaciones de temperatura y
campo magntico en la columna del microscopio, reduciendo el tiempo empleado en el anlisis de la muestra y aumentando la calidad
del anlisis. Las imgenes son obtenidas a travs de detectores CCD (sistema para la captura de imgenes digitales). Tambin hay que
destacar que algunos microscopios pueden complementarse con un equipo FIB (haz de iones focalizado) usado en muestras grandes,
logrndose lminas muy delgadas (algunos cientos de nanmetros) de un rea de inters en una muestra como un semiconductor o
metal.

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Edition Jones and Bartlett Publishers. Canad.

Captulo I

Fundamentos de la microscopa electrnica

Pgina

57

Ing. Mara Julia Yaez

1.1-RESOLUCION

El concepto de resolucin est relacionado con la capacidad de distinguir detalles finos en una imagen. Se puede definir como la mnima distancia
medible entre dos objetos para ser distinguidos separadamente. Cuando rayos de luz emanan de un punto y pasan a travs de una lente con apertura
semiangular , forman la imagen de un punto, con una intensidad difusa alrededor de l, llamada disco de Airy (Fig. 1). Este fenmeno es debido al
efecto de difraccin producido por las imperfecciones de la lente. Si se grafica la distribucin de intensidades a su alrededor, se puede asumir que
toda la intensidad est concentrada en una regin de dimetro d1, siendo

d1

1
( di metro apertura )

Pgina

La mnima distancia
medible entre dos objetos
para ser distinguidos
separadamente.

58

(i)

De la teora de difraccin de Rayleigh , podemos derivar la relacin (ii):

59
Pgina

Fig. 1.1
Si en lugar de un objeto tenemos dos objetos puntuales separados una distancia d. Segn el criterio propuesto por Rayleigh, estos dos puntos
podrn distinguirse cuando el mximo de intensidad de un disco de Airy coincide con el primer mnimo del segundo disco. De acuerdo con esto, es
fcil ver que la distancia d deber ser mayor que d1/2 para reconocer los puntos como entidades individuales. El valor d1/2 se denomina lmite de
resolucin. Para distancias menores que d1/2, los puntos aparecern como una mancha difusa y ser imposible discriminarlos.

r1

d1/ 2

0.61
sen

(ii)
donde es la longitud de onda de la luz y es el ndice de refraccin del medio entre el objeto y la lente. El denominador de la expresin anterior
se denomina apertura numrica (NA). Es importante notar, que la separacin entre puntos no depende de alguna propiedad de la lente excepto de su
apertura semiangular.
En un microscopio de luz usando aceite de inmersin para aumentar , empleando luz verde con una longitud de onda de 400 nm y una apertura
numrica de 1.4, el lmite de resolucin es de 2000 aproximadamente.
En un microscopio electrnico, las lentes generan campos magnticos y no hay cambio apreciable en el ndice de refraccin cuando los electrones
pasan a travs de ellos. Por esta razn, se asume un valor de =1. Adems, los ngulos en los que se desvan los rayos al ser desviados por la lente son
pequeos y puede hacerse la aproximacin sen( ) tag( )
con cierto grado de precisin. Con lo asumido anteriormente, la resolucin terica
del microscopio electrnico es:
Para valores de = 0.037 y
La resolucin nominal es 0.2 .

= 0.1 radianes,

r1

0. 61

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La teora cuntica de Max Planck y la teora de la relatividad de Albert Einstein fueron dos grandes principios que permitieron asociar a
electrones en rpido movimiento con una radiacin de corta longitud de onda. Combinando ambos principios, De Broglie mostr que una partcula
movindose a una velocidad cercana a la de la luz tena una forma de radiacin asociada con ella.
Esta relacin est expresada por:

60

1.2-NATURALEZA DE LAS ONDAS ELECTRONICAS

h
m v
(iii)
donde es la longitud de onda, h la constante de Planck, m la masa de la partcula y v su velocidad.
Si la partcula es un electrn y su velocidad 1/3 de la velocidad de la luz, = 0.05 A, la resolucin de un microscopio que emplee este tipo de
radiacin ser mucho mejor que la de un microscopio de luz.
La naturaleza precisa de estas ondas de electrones es difcil de entender en trminos de la fsica clsica y su descripcin se hace mediante la
mecnica cuntica. Las ondas de electrones no deben confundirse con radiacin electromagntica se pueden pensar como un quantum o paquete de
radiacin que acompaa a cada electrn en su trayectoria, es parte de l y permanece con l. Las caractersticas de estas ondas dependen de la
posicin exacta de un dado electrn en el espacio y en el tiempo; puede expresarse como la probabilidad de encontrar al electrn en esa posicin.
En el microscopio electrnico, la longitud de onda ( ), est relacionada con el voltaje de aceleracin (Vr ) segn:

12. 26
Vr

(iv) donde esta expresado en A y Vr en eV.

1.3- Componentes fundamentales de un microscopio electrnico

Un microscopio electrnico (ya sea de barrido o de transmisin) est constituido, bsicamente, por:

Pgina

El can de electrones de un microscopio electrnico es la responsable de la generacin del haz de electrones. Debe reunir ciertos
requerimientos, entre ellos que produzca un alto brillo y tenga alta estabilidad.
Las fuentes de electrones pueden ser termoinicas o de emisin de campo.

61

Can de electrones.
Lentes electromagnticas.
Pantalla.

El tipo de generador electrnico ms comn es el de emisin termoinica. Este est constituido por un filamento (F) (ctodo), un cilindro con una
apertura central, llamado cilindro de Wehnelt (G) que rodea al filamento y tiene un potencial ligeramente ms negativo que ste. El nodo (A) se
encuentra por debajo del cilindro de Wehnelt.

fig. 1.2

Pgina

En un emisor trmico, los electrones se emiten a partir de un material incandescente (termoinica). La funcin de la corriente incandescente del
filamento es dar a los electrones suficiente energa trmica para sobrepasar la barrera energtica que evita que los electrones sean liberados. Todos
los metales liberan electrones cuando se calientan a la temperatura adecuada, y cuanta mayor temperatura se aplica, mayor cantidad de electrones
se emiten. Sin embargo, la mayora de los materiales no sobreviven largo tiempo a las temperaturas requeridas para que sometidos a estos procesos,
liberen una cantidad significativa de electrones. El Tungsteno (W) tiene una temperatura de fusin suficientemente alta (3650 Kelvin), lo que permite
que el material soporte temperaturas elevadas por mayor tiempo (~ 2600- 3000K) y por tanto, es el material elegido para un emisor termoinico
tpico.
El filamento es calentado por el pasaje de corriente. Los electrones emitidos termoinicamente por el ctodo son acelerados hacia el nodo,
pasan por la apertura circular central de ste y un haz de alta energa es emitido hacia la columna del microscopio. El cilindro de Wehnelt tiene como
funcin controlar el dimetro del rea en la punta del filamento donde se emiten los electrones. Estos son concentrados en un plano de mnima
seccin transversal, en el cul la densidad de electrones por unidad de rea es la ms alta, llamado punto de entrecruzamiento. Este es considerado
la fuente efectiva de electrones.

62

1.3.1 La emisin termoinica:

El dimetro del haz en el entrecruzamiento depende del rea del filamento desde donde se emiten los electrones y puede controlarse por la
diferencia de potencial (bias) entre la punta del filamento y el cilindro de Wehnelt.
Otra manera de obtener emisin es reducir la barrera energtica de trabajo, la cual limita la emisin. Materiales con bajas funciones de trabajo
emiten a menores temperaturas (LaB6 por ejemplo). A estos materiales suele referrselos frecuentemente como emisores de campo parcial, ya que se
explota el concepto de que su baja funcin de trabajo permite la operacin a menores temperaturas que el tungsteno (~1400-2000 K). El uso del
trmino emisor de campo parcial no es rigurosamente cierto, ya que el mecanismo primario de excitacin sigue siendo activacin trmica.

1.3.2 Emisin de campo

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Para el caso de los caones termoinicos y de hexaboruro de lantano (LaB6), se forma un sistema de trodo con el filamento, cpsula de
Wehnelt y nodo. Mediante el diseo de la fuente de poder, la cpsula de Wehnelt es ligeramente negativa con el filamento y resulta un
campo electrosttico que funciona como una pequea lente produciendo un enfoque de los electrones que son emitidos solamente
desde una regin limitada de punta caliente de la fuente de Tungsteno. Esta diferencia de voltaje es normalmente conocida como voltaje
desviado del can. En los emisores de campo un sistema mltiple de nodos es utilizado en lugar de la configuracin de trodo. En
este caso se aplica un voltaje de extraccin. Los voltajes de desviacin son generalmente de unos cientos de volts, mientras que en el
voltaje de extraccin en un FEG (field emission gun) es generalmente en el rango de 3-5 kV.

63

Las fuentes de emisin de campo operan mediante una reduccin de la barrera de energa por un campo aplicado que permite la
formacin de tneles cunticos de electrones a travs de la barrera reducida hacia el vaco. Este es un proceso distinto a la emisin
termoinica. Existen dos tipos de emisores de campo: los asistidos trmicamente (tambin denominados Schottky) y los Emisores de
campo fro, como lo implican sus nombres, los emisores asistidos trmicamente requieren calor, mientras que los de campo fro no.
Ambos necesitan la aplicacin de un campo externo para extraer el haz de electrones de una punta o extremo muy pequeo.

El filamento y la cpsula de Wehnelt (o ltimo nodo para un FEG) se conectan tambin a la terminal negativa de la fuente de alto
voltaje. Por lo tanto, el haz de electrones que abandona el Wehnelt se acelera por el alto voltaje hacia el nodo, que se coloca en la base
del can. Esta aceleracin proporciona a los electrones su velocidad axial (Z).
Algunos de estos electrones logran pasar por una pequea apertura en el nodo que es la entrada a la columna de electrones. Una vez
que pasa el electrodo del can (con potencial de tierra) la aceleracin Z de los electrones es esencialmente cero y viajan a velocidad
constante (determinado por el alto voltaje) hasta que golpean la muestra.
La funcin de las lentes remanentes y los deflectores en el cuerpo de un microscopio sirven para provocar la desviacin y enfoque
posterior del haz hacia el espcimen, de la forma en que el analista lo requiera.
Finalmente, puede notar que los electrones son emitidos a partir de un filamento termoinico de una manera muy similar a como ocurre
en un foco. En el caso del foco, la falla del filamento se debe a la transferencia de masa y a la fusin. Esto involucra el movimiento de
tomos metlicos alejndose del punto de la falla (aun cuando se est abajo del punto de fusin). El sobrecalentamiento de los
filamentos genera que este fenmeno se produzca con mayor rapidez, reduciendo por tanto, la vida til del filamento.

1.4 -LENTES ELECTROMAGNETICAS

La longitud focal de la lente est determinada por el voltaje de aceleracin aplicado y por la intensidad de campo magntico en la lente,
el cul es una funcin inversa del producto de la corriente (I) en la bobina y el nmero de vueltas de la misma (N).

Pgina

64

Una lente electromagntica est constituida, por un cilindro anular de hierro blando (pieza polar), rodeado por una bobina de cobre. Al
circular una corriente por los enrollamientos de la bobina, se genera un campo magntico en el espacio anular de la pieza polar.

Vr

(v)
2
( NI )
donde K es una constante,
La distancia focal puede cambiarse variando la corriente que circula por los enrollamientos de la bobina. A medida que incrementamos la
corriente que pasa por la bobina, se incrementa el campo magntico, las lentes se hacen ms potentes y la longitud focal decrece.
Los electrones al llegar a la lente, son influenciados por el campo magntico y siguen una trayectoria helicoidal. Este movimiento, no afecta las
condiciones de focalizacin y pueden aplicarse las mismas leyes pticas que rigen los diagramas de rayos de microscopa de luz.

Vr Vo 1 0.978.10 6 .Vo

(vi)

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Los electrones viajan en el haz a una fraccin apreciable de la velocidad de la luz y es necesario hacer una correccin relativstica. La misma
puede ser expresada como:

65

Fig.1. 3

1.5- ABERRACIONES

Las lentes que se emplean en un microscopio, ya sea de luz o electrnico, no son perfectas sino que tienen defectos que deterioran la
resolucin.
* Aberracin esfrica: Este tipo de defecto es la incapacidad de una lente para focalizar todos los haces incidentes en un punto.

fig.1. 4

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66

Los rayos que pasan por la porcin de la lente ms alejada del eje ptico son focalizados ms cerca de la lente que aquellos rayos que la
atraviesan cercanos al eje (paraxiales).

En la actualidad se ha logrado corregir en dos rdenes de magnitud la aberracin esfrica, mediante el uso de monocromadores. Hay un
disco de dimetro mnimo, entre estos dos focos, en el que convergen los rayos, conocido como disco de mnima confusin. El dimetro
del mismo est dado por la expresin:

ds

Cs

(vii)

donde Cs es el coeficiente de aberracin esfrica que est relacionado con la energa del haz y la longitud focal f; y la apertura semiangular de la
lente. Como vemos, la aberracin esfrica puede ser minimizada, pero nunca eliminada. Se puede minimizar disminuyendo pero si se hace
demasiado pequea, la resolucin limitada por la difraccin se hace importante. Hay un tamao ptimo de apertura en la cual la aberracin esfrica
es minimizada sin afectar la resolucin.
opt

0. 67

1/ 4

Cs 1/ 4
(viii)

ropt

3/ 4

Cs1/ 4

siendo B una constante.

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Al decir diferencia de energas estamos significando diferencia de longitudes de onda, que a su vez est asociada con diferencias en la velocidad
de los electrones. Electrones ms rpidos, de corta longitud de onda son menos desviados por la lentes que los electrones ms lentos, de mayor
longitud de onda. Hay por lo tanto, distintos puntos de focalizacin. Este efecto se traduce en una imagen borrosa, similar a la que est fuera de foco.
Si diferenciamos la expresin de la longitud focal obtenemos:

67

* Aberracin cromtica: Esta aberracin es causada por la diferencia de energas que tienen los electrones del haz.

f
f

Vr
Vr

I
I

(ix)

Se demuestra que: cualquier cambio en el voltaje de aceleracin o en la corriente de las lentes, causar un cambio en la longitud focal de las
mismas (f: Long focal; V voltaje, I: intensidad de corriente). Estas variaciones afectan la resolucin en mayor o menor medida segn la sensibilidad
que tenga la lente a tales cambios. El parmetro que representa esa cualidad es el coeficiente de aberracin cromtica (Cc). La resolucin dc limitada
por los defectos cromticos est dada por:

dc

Cc

Vr
Vr

2 I
I

(x)

Este tipo de efecto puede ser eliminado logrando una muy buena estabilidad en el voltaje de aceleracin. El Cc puede reducirse incrementando la
intensidad de campo magntico en la lente.

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Puede deberse a diversas causas, como por ejemplo baja precisin en el maquinado de la lente, falta de homogeneidad en el material de la pieza
polar, contaminacin, incorrecta alineacin del eje ptico. La imagen aparecer borrosa y deformada y ser imposible alcanzar un foco ptimo.

68

* Astigmatismo: se produce por la asimetra del campo magntico de la lente. Dicha asimetra hace que la longitud focal en una
direccin sea distinta a la longitud focal en la direccin perpendicular a la anterior.

Fig. 1.5
La cantidad de astigmatismo est definida como la distancia entre las lneas focales.
Para corregir este defecto, suele colocarse, cercano a la lente, una serie de enrollamientos (corrector de astigmatismo), que aplican un dbil campo
magntico sobre el haz electrnico para alcanzar la simetra deseada. El corrector de astigmatismo corrige la asimetra tanto en magnitud como en
direccin.

Entre las caractersticas principales que tiene un microscopio electrnico se encuentran la gran profundidad de campo y profundidad de foco que
posee.

a) Profundidad de campo

Pgina

69

1.6- PROFUNDIDAD DE CAMPO Y PROFUNDIDAD DE FOCO

El rango de posiciones que puede tomar un objeto, sin que se perciban cambios en
la nitidez de la imagen, se denomina profundidad de campo.

Fig.1.6

Por simple geometra se tiene:

donde

r1

(xi)

es la apertura semiangular.

70

D0

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Una imagen aparecer en foco cuando el objeto se encuentre


en un plano apropiado. Si parte del objeto se ubica por encima
o por debajo de dicho plano, habr partes de la imagen que
estarn fuera de foco.
En la figura 6, se pueden ver dos rayos paralelos O1 y O2,
separados por una distancia lmite de resolucin (r1).
La distancia Do se denomina profundidad de campo.

b) Profundidad de foco

Un trmino que suele confundirse con la profundidad de campo es la profundidad de foco (Df). Esta es anloga a la anterior pero para el rango
de posiciones en que puede ubicarse la imagen sin aparecer fuera de foco, para una posicin fija del objeto. La profundidad de foco (Df ) se
relaciona con la magnificacin (M) y con la profundidad de campo, (Do )
Segn:

Df

r1

D0 M

(12)

Tanto la profundidad de campo como la de foco son funciones inversas de la apertura semi-angular y directa de la resolucin.
Como se observa en la figura 6
Debido a las cortas longitudes de onda y las pequeas aperturas que se utilizan en microscopa electrnica, tanto la profundidad de campo
como la profundidad de foco son grandes comparadas con las de microscopa de luz. Esta es una de las razones por las cuales el microscopio
electrnico de barrido es usado para estudios topogrficos de un material.

Pgina

Cuando el haz de electrones incide sobre un material, hay interacciones entre los electrones incidentes y los tomos que componen la muestra.
Es importante, conocer y entender la naturaleza de dichas interacciones para interpretar correctamente la imagen observada.
Se adoptar el trmino scattering para significar la dispersin de electrones producida por las interacciones electrn tomos de la muestra.
La probabilidad de que un electrn sufra scattering est descripta en trminos de la seccin transversal ( ) o bien, como el camino libre medio
( ). La primera est expresada como el rea en la que una partcula se presenta al electrn incidente para ser dispersada. Si hay N partculas
por unidad de volumen y ( ) es la seccin transversal para un evento de scattering. La probabilidad de que un electrn sufra scattering en su
pasaje a travs de un espesor dx, ser: N. .dx, de manera anloga se define el camino libre medio, que es la distancia que viajar el electrn
antes que ocurra un evento de scattering.

71

1.7- INTERACCION HAZ DE ELECTRONES - MUESTRA

1
N

(12i)

En microscopa electrnica de transmisin, donde las muestras deben ser delgadas (espesor < 800 ) para poder observarlas, el camino libre
medio para scattering es similar al espesor de la muestra y los electrones sufrirn como mximo un slo evento de scattering.
En SEM, las muestras son gruesas y los electrones incidentes sern dispersados (scattering) ms de una vez.
La probabilidad que un electrn incidente sufra (n) eventos de scattering mientras viaja una distancia x est dada por la ecuacin de Poisson:

p ( n)

1
n!

. exp

x/
(xiv)

Cuanto mayor sea el nmero atmico de los tomos que componen la muestra, mayor ser la densidad atmica y por lo tanto, mayor la
probabilidad que se produzca un evento de scattering.
Para scattering mltiple donde los electrones se asumen dispersados varias veces por diferentes mecanismos, una descripcin ms adecuada es la
simulacin de Monte-Carlo.

1.7.1- SCATTERING

a). Scattering elstico: Es un proceso en el cul un electrn incidente,


puede cambiar su direccin, sin prdida apreciable de energa.

Este tipo de proceso es causado, principalmente, por las interacciones de tipo Coulmbicas entre un electrn incidente, el ncleo y los electrones
del tomo.
Si la energa del electrn incidente es Eo, la probabilidad p( ) que sufra scattering elstico en un ngulo est dada por:

Pgina

a) Scattering elstico.
b) Scattering inelstico.

72

Existen dos tipos de eventos de scattering:

p( )

1
E0 sen4 ( )

(xv)

b) Scattering inelstico: En este tipo de proceso, un electrn incidente sobre un tomo, pierde parte de su energa
pero no sufre cambios significativos en su direccin.
Si la interaccin inelstica tiene lugar entre el ncleo y un electrn incidente, de alta energa, ste perder parte de su energa cintica debido al
efecto de frenado que ejerce el campo coulmbico del ncleo atmico.
Si el electrn incidente, interacta con un electrn del tomo las energas de ambos se distribuyen. El electrn incidente sufre una prdida de
energa, que provoca una disminucin de su velocidad desviando su trayectoria en un pequeo ngulo.

73

Fig.1.8

Pgina

Fig.1.7

Hay muchos tipos de interacciones con prdida de energa, la cual se transfiere a los electrones o tomos de la muestra. Este tipo de scattering es
el responsable del frenado de electrones observado en un slido. Parte de la energa cintica del electrn incidente se transferir como calor a la
muestra. Una pequea porcin de la energa escapar como rayos x o como electrones secundarios.
Un electrn interacciona con la materia de diversas formas. Los electrones incidentes, chocan con la superficie de la muestra e interaccionan
elstica e inelsticamente con los tomos que la componen. Como consecuencia de esto, se producen rayos x, luz visible, electrones Auger, electrones
retrodifundidos, electrones secundarios y si la muestra es delgada, electrones difractados, electrones transmitidos y electrones no dispersados. Cada
uno de estos fenmenos se conoce como seal, es portador de una informacin caracterstica de la muestra y es captado por detectores especficos.
De acuerdo al tipo de informacin que deseemos obtener, seleccionaremos los detectores y equipos adecuados para ello.
En la figura, se presentan las principales seales que tienen lugar en un slido cuando es bombardeado por un haz de electrones.

Pgina

74

Fig.1.9

Evento

Seal

Informacin

Elstico

E- retrodifundidos

Contraste por Z

Elstico transmitidos

E- secundarios

Topografa superficial

Rayos x caractersticos

Composicin elemental

E- Auger

Composicin superficial

Catodoluminiscencia

Concentracin impurezas

E- transmitidos

Ultraestructura interna

E- difractados

cristalografa

Pgina

Inelstico

75

Contraste topogrfico

1.8- COMPARACION ENTRE MICROSCOPIOS PTICO Y ELECTRONICO

MICROSCOPIO
PTICO

MICROSCOPIO
ELECTRONICO

Iluminacin

Haz de luz

Haz de electrones

Longitud de onda

2000 - 7500

0.037 - 0.086

Lentes

Vidrio

Electromagnticas

Medio

Atmsfera

Vaco

Resolucin

2000

1nm Auriga por ej

Magnificacin

10 x - 2000 x

Focalizacin

Mecnica
Absorcin Reflexin

Scattering

76

Elctrica

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Contraste

100 x - 1.000.000 x

Fig.1.10

Pgina

77

la fig.10 se muestra un esquema comparativo entre los tres microscopios

1.9 MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISION

El sistema ptico-electrnico del microscopio electrnico

de transmisin est constituido por las siguientes partes:


Estos componentes estn ensamblados en una columna vertical la cual se encuentra en alto vaco.

Cpsula de Whenelt:
focaliza y concentra el
haz

Can de electrones

Lente condensadora: enfoca el haz de e-

- Can de electrones.
-Sistema de lentes.
-Pantalla fluorescente.
-Sistema de adquisicin
de imgenes
- Portamuestras.

Lente objetivo : forma la imagen

Lente intermedia: magnificacin final

Lente proyectora: proyeccin final

imagen final.

El can de electrones, es la fuente emisora del haz de electrones. Se encuentra ubicado en la parte superior de la columna.

Pgina

Pantalla: imagen final

78

Fig. 1.11

El sistema de lentes est formado por lentes denominadas por su funcin cmo: condensadoras, objetivas, intermedias y proyectoras. La primera
de las condensadoras, proyecta la imagen del punto de entrecruzamiento demagnificada (tamao del haz), mientras que la segunda controla su
dimetro y el ngulo de convergencia en que incide sobre la muestra. Cuanto mayor sea la magnificacin, menor ser el spot de iluminacin y por
lo tanto, menor el rea de la muestra que se podr examinar. La segunda lente condensadora est equipada con una apertura fsica que limita al
haz que incide sobre la muestra.
La lente objetivo forma la primera imagen, localizada debajo del espcimen. De sta lente depende, en gran medida la resolucin final. Esta lente,
tiene dos componentes importantes: la apertura fsica (apertura de objetivo), localizada en el plano focal posterior de la lente, y un corrector de
astigmatismo. Los diferentes tamaos de la apertura de objetivo, permiten variar la proporcin de electrones que son detenidos por esta
apertura, lo que modifica el contraste de la imagen.
Las lentes intermedia y proyectora son las encargadas de amplificar la imagen dada por la lente objetivo y proyectarla sobre la pantalla de
observacin.

1.9.1- TIPOS DE CONTRASTE

El haz de electrones est formado por electrones que tienen una onda caracterstica, determinada por una fase y una amplitud. En la interaccin
entre el haz de electrones y la muestra, los electrones emergentes sufren un cambio en amplitud y en fase, generando distintos tipos de contraste.

Pgina

Si la muestra es suficientemente delgada, se puede asumir que la mayora de los electrones que llegan a la misma emergen desde el fondo de
sta. La dispersin de energa y el rango angular, estn asociadas a los eventos elsticos e inelsticos que se producen a medida que los electrones
atraviesan el material.
El efecto de colocar una apertura en el plano focal imagen de la lente objetivo ser detener los electrones que son dispersados en un ngulo
mayor que la apertura semiangular . Si la apertura est centrada sobre el eje ptico, se obtiene una imagen de campo claro.
Zonas con igual nmero atmico promedio, con regiones de la muestra ms gruesas o con mayor densidad de partculas provocarn mayor
dispersin de electrones.
Similarmente, para un mismo espesor, regiones de alto nmero atmico (Z) promedio, dispersaran mas electrones que regiones de bajos Z.
En ambos casos, las zonas de mayor dispersin aparecern ms oscuras, generando lo que se conoce como contraste masa-espesor.

79

1.9.1 A- CONTRASTE MASA ESPESOR (POR AMPLITUD).

Pgina

80

Fig.1. 12
Este tipo de contraste bsicamente es generado por materiales no cristalinos tales como muestras biolgicas y polmeros. Una manera de
mejorar el contraste masa-espesor en este tipo de muestras, es incorporar tomos pesados que reaccionan con grupos especficos de la estructura.
Estas reas aparecern ms oscuras que las dems regiones, facilitndose la identificacin de las mismas. Un detalle de los mtodos de preparacin
adecuados para distintos tipos de muestras se presenta en captulos posteriores.

1.9.1B - CONTRASTE POR DIFRACCION.


Si la muestra es cristalina un contraste adicional contribuye a la imagen debido a que las intensidades de la dispersin son reforzadas en ngulos
particulares. Este tipo de fenmeno es lo que se conoce como difraccin de Bragg, que se explica, muy someramente, a continuacin. Si se considera
un haz de electrones coherente, es decir que las ondas individuales estn en fase, incidiendo sobre un cristal, las ondas dispersadas que estn en fase
unas con otras se combinarn constructivamente y se reforzarn. Aquellas ondas que no estn en fase, interactuarn destructivamente y formarn un
haz menos intenso.

Fig. 1.13
Las ondas dispersadas estarn en fase si difieren en un nmero entero de longitudes de onda.

Esta condicin de interferencia constructiva se conoce como Ley de Bragg de la difraccin.


d: espaciado interplanar.
n: orden de difraccin, por convencin se toma n=1.
: ngulo de Bragg. Es el ngulo entre el haz incidente y el haz difractado.
En el caso de microscopa electrnica, la relacin anterior se expresa como:

81

(xvi)

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2 d sen( ) n

r .d

.L

(xvii)

L es conocida como la longitud de cmara, es la distancia efectiva recorrida por los electrones desde el lugar de difraccin hasta la pantalla del
microscopio. y L son independientes de la muestra. El producto .L es llamada constante de cmara y debe ser calibrada para cada
microscopio. Conociendo .L y midiendo r podemos determinar el espaciado interplanar d.
En resumen: un haz de electrones ser fuertemente difractado por los planos cristalinos si stos se encuentran casi paralelos al haz incidente. Las
zonas de la muestra que difractan fuertemente, aparecern como regiones ms oscuras en la imagen.
La importancia principal del contraste por difraccin es la capacidad de hacer visibles y resaltar defectos cristalinos tales como dislocaciones, fallas
de apilamiento y precipitados.
En muestras amorfas, cuyos tomos estn distribuidos al azar, el diagrama de difraccin consistir en una dispersin de intensidades alrededor del
punto central.
En materiales cristalinos podemos encontrar dos clases:
a) Cristales simples: los cuales tienen una estructura peridica de tomos, generarn patrones de difraccin formado por un arreglo de puntos.
b) Poli cristales: los cuales tienen un conjunto de reas discretas, cada una de ellas con un determinado arreglo atmico y una orientacin
particular.
En este caso, el difractograma ser una serie de anillos concntricos.
Tambin pueden existir diagramas de difraccin con una orientacin preferencial. Estos son caractersticos de materiales poli cristalinos cuyos
granos estn parcialmente orientados al azar, pero donde es posible se ubican en una orientacin particular. El modelo de difraccin consistir de
anillos concntricos con ciertas zonas de los mismos ms brillantes que otras.

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Este tipo de contraste se produce debido a las diferencias en fase de las ondas de electrones dispersadas por una muestra delgada. El mecanismo
de contraste de fase es muy sensible a pequeos cambios en el espesor de la muestra, orientacin de la misma, variaciones en el foco o
astigmatismo de la lente objetivo. La mayora de los mecanismos de scattering involucran un cambio de fase por lo tanto, algo de contraste de fase
est presente en toda la imagen; pero es ms visible a altas magnificaciones y es muy til en la observacin de detalles de muestras de bajos Z.
Este contraste est asociado microscopa electrnica de transmisin de alta resolucin con (HREM).

82

1.9.2-CONTRASTE DE FASE

1.10-MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO (SEM).

Fig. 1.14

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83

El microscopio electrnico de barrido (MEB) tiene componentes comunes con el Microscopio electrnico de Transmisin (MET) tales como el
can de electrones, sistema de vaco, lentes condensadora y objetivo. La diferencia principal entre ellos es la manera en que forman y magnifican
la imagen. Esto hace que la informacin que se obtiene de cada uno sea distinta. Mientras el MET permite el estudio de la ultraestructura de
muestras delgadas, el MEB posibilita conocer la morfologa superficial. En el microscopio electrnico de barrido (MEB), el haz electrnico,
atraviesa la columna y llega a la muestra. Un generador de barrido es el responsable de producir el movimiento del haz, de manera que barra la
muestra punto a punto. De la interaccin entre los electrones incidentes con los tomos que componen la muestra se generan seales, las cuales
pueden ser captadas con detectores especficos para cada una de ellas. El detector capta una seal y las convierte en una seal electrnica que es
proyectada en una pantalla (CRT).
El barrido del haz est sincronizado con el barrido del CRT y produce una relacin uno a uno entre puntos de la muestra y puntos en el CRT.

El mecanismo por el cual la imagen es magnificada es simple. La zona barrida por el haz de electrones sobre la muestra es menor que la regin
mostrada en la pantalla. La magnificacin lineal est dada por la relacin entre la longitud barrida sobre la muestra (l) y la longitud del barrido sobre el
tubo de rayos catdicos.( TRC)(L):

l
Por ejemplo, si l= 10

L
y L = 180 mm la magnificacin ser de 18000 X.

Fig.1.15

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84

1- INTERACCION HAZ INCIDENTE - MUESTRA EN EL SEM.

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Naturaleza de la interaccin: En el volumen de excitacin primaria, ocurren interacciones que generan seales tales como: electrones
secundarios, electrones retrodifundidos, rayos x caractersticos, electrones Auger, catodoluminiscencia.
Electrones secundarios: son emitidos desde la muestra como consecuencia de las ionizaciones surgidas de las interacciones inelsticas. Poseen
baja energa ( 50 ev). Brindan una imagen de la morfologa superficial de la muestra.
Electrones retrodifundidos: provienen de las interacciones elsticas y por lo tanto, tienen alta energa. Estos electrones tienen energas
cercanas a la del haz incidente. Pueden interactuar con tomos de la muestra para generar electrones secundarios y los otros tipos de seales
nombradas anteriormente.
Son empleados para obtener imgenes de contraste por nmero atmico y contraste topogrfico.
Rayos x caractersticos: Este tipo de seal; se produce cuando un electrn de un orbital interno de un tomo es desalojado por un electrn del
haz incidente. La vacancia es llenada con un electrn de un orbital ms externo. En este salto el exceso de energa es liberado en forma de
radiacin electromagntica (rayos x).
Se sabe que cada orbital tiene una cantidad discreta de energa que es caracterstica para cada elemento. Por lo tanto, la diferencia de energa
entre orbitales es tambin una cantidad discreta y caracterstica de un tomo en particular.
La espectroscopa de rayos x dispersiva en energa (EDX), brinda informacin sobre la composicin elemental de la muestra.

85

La interaccin haz incidente-muestra produce una variedad de seales, las cuales brindan distinta informacin sobre la superficie de la muestra.
Dichas seales pueden ser captadas por sus correspondientes detectores.
Volumen de excitacin primaria: Cuando un haz de electrones choca contra una muestra, los electrones incidentes penetran en el material una
distancia que es directamente dependiente de la energa del haz e inversamente dependiente del nmero atmico de los tomos que componen
la muestra. La regin en la cual los electrones penetran la muestra se conoce como volumen de excitacin primaria.
En la figura, se aprecian las variaciones de dispersin electrnica cuando se utilizan bajos y altos voltajes de aceleracin en materiales de bajo y
alto nmero atmico.
La profundidad de penetracin y el volumen de excitacin aumentan con el incremento de la energa del haz incidente y decrece con el
incremento del nmero atmico. Una muestra compuesta por tomos de alto nmero atmico tendr ms partculas disponibles para detener la
penetracin del haz, que un material compuesto de elementos de bajo nmero atmico.
Con el incremento de la energa del haz los electrones pueden penetrar ms profundamente en la muestra por lo tanto, el volumen de excitacin
aumenta su dimetro y profundidad. Esto provocar una prdida del detalle de la estructura superficial en la imagen debido al incremento de la
generacin de seales adicionales (ruido). Esta es una de las razones por las cuales el voltaje de aceleracin es uno de los elementos limitantes de
la resolucin en el MEB.

Electrones Auger: Cuando un electrn de una capa externa llena una vacancia de una capa ms interna, el exceso de energa puede inducir la
eyeccin de un electrn de una rbita externa; convirtiendo esta energa en
energa cintica. Este electrn es llamado electrn Auger.
La energa de este electrn es aproximadamente igual a la diferencia de
energa entre los orbitales involucrados en la transicin.
Esta tcnica es ms adecuada que la espectroscopa de rayos x para los
estudios de muestras de bajo nmero atmico. Por poseer baja energa los
electrones Auger pueden dar informacin precisa de las monocapas cercanas a
la superficie.
La emisin Auger es ms alta en elementos de bajo nmero atmico debido a
que los electrones estn dbilmente ligados al ncleo.
Catodoluminiscencia: Es la emisin de fotones en longitudes de onda en
los rangos del ultravioleta, visible o infrarrojo, para disipar el exceso de energa
que se genera en la transicin electrnica entre orbitales.
Esta tcnica permite realizar estudios de concentracin de impurezas en un
material.
Adems de las seales anteriores, las cuales dan una informacin til sobre la
muestra, tambin se presenta un fenmeno no deseado cuando
se realizan estudios con rayos x. Esto ocurre cuando un electrn incidente
interacta inelsticamente con el ncleo atmico, como
consecuencia de esto se desacelera y provoca la emisin de rayos x, que no
son caractersticos de ningn elemento. Se denomina: radiacin blanca
(Bremsstrhlung) o rayos x del continuo.

En la siguiente tabla se resumen las principales seales y su aplicacin:

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86

fig.1.16

INTERACCION
e- .incid / emuestra
-

e . incid / ncleo

SEAL
- e- secundarios

APLICACION
-

morfologa

superficial

contraste por nmero atmico


contraste topogrfico

e retrodifundidos

catodoluminiscencia

concentracin de impurezas

rayos x caractersticos.

composicin elemental

electrones Auger

compos superficial

rayos x continuo

e- .incid / vacancias

DISTANCIA DE TRABAJO Y PROFUNDIDAD DE CAMPO EN MEB

La lente objetivo, demagnifica la imagen del filamento produciendo un haz de dimetro d sobre la muestra. La distancia entre la parte inferior de
la lente objetivo y la superficie de la muestra es llamada distancia de trabajo (wd).

87

seal no til

Pgina

e- incid. o retrodif /
ncleo atmico

88
Pgina

Fig. 1.17

Pgina

89

Fig 1.18

90
Pgina

Fig 1.19

91
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Fig. 1.20

La gran profundidad de campo, que est dada en funcin de la distancia de trabajo como:

0. 2 wd
A. M

(xviii)

siendo A la apertura de objetivo y M la magnificacin. Para valores tpicos de wd = 20 mm, A=100 y M=1000 x , la profundidad de campo es 40
.; mientras que en un microscopio ptico a la misma magnificacin, h es de 1 .

1-12-Tipos de contraste en MEB: CONTRASTE TOPOGRAFICO

El contraste obtenido en el MEB con la seal de electrones secundarios, est relacionado con la topografa de la muestra y se conoce
como contraste topogrfico. La emisin de electrones secundarios desde la superficie depende del ngulo de incidencia. Cuando la
muestra se inclina un cierto ngulo , la distancia x recorrida por los electrones desde una profundidad xo = 100 , hasta la superficie se
incrementa segn la relacin:

Al aumentar el ngulo disminuye la distancia x cos( ) para que los electrones secundarios alcancen y salgan de la superficie, aumentando la
cantidad de electrones emitidos desde la misma. El efecto de la topografa sobre la imagen est relacionado con la posicin del detector. Podemos
entender el mecanismo de contraste en trminos del ngulo de incidencia y la difusin electrnica.

92

( xix)

Pgina

x = xo sec( )

93
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Figs 1.21.a y 1.21b

94
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Fig. 1.22

FIG.1.23. ( Microscopio Electrnico de Barrido )

Pgina

95

Los electrones emitidos a la izquierda del pico que se muestra en la figura,


quedarn bloqueados por este ltimo, en su camino hacia el detector Aquellos electrones emitidos desde la superficie de la muestra que miran al
detector, a la derecha del pico, no sern detenidos en el camino hacia aquel. El efecto total en la imagen ser una zona ms iluminada a la derecha
que a la izquierda del pico. Por su parte, el pico emite electrones ms eficientemente que el resto de la muestra. La estructura ms delgada aparece
ms iluminada. Por lo visto anteriormente, la imagen producida en el MEB depende de muchas variables: el contraste, el brillo, la emisin
electrnica, la corriente de las lentes electromagnticas, aperturas, y est afectado por los cambios en la composicin de la muestra, la topografa y la
inclinacin.}

96
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fig.1.24

97
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fig.1.25

98
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fig 1.26

Pgina

99

Captulo II

Pgina

Dra. Alfonsina Morales, Prof. Viviana Sorrivas, Ing. Mara Julia Yaez

100

Preparacin de muestras biolgicas y de materiales


para su observacin por Microscopa Electrnica de
Transmisin.

Un fijador ideal debe mantener el medio


ambiente similar al que tena el tejido en su
estado vivo, respetando su pH, osmolaridad y
constitucin inica. Para cubrir estos aspectos, al
agente fijador se le agrega un vehculo que tiene
por funcin mantener:

2. Fijacin

El pH, ya que los cambios metablicos


producen acidez, que altera las
protenas. El vehculo es una solucin
tampn.
La osmolaridad dado que el medio
isotnico previene que las clulas se
expandan o se contraigan.

La fuerza o constitucin inica,


previniendo las extracciones de
molculas y precipitados.

Debe tener adems mxima solubilidad


en el agua y mnima en membranas
biolgicas, lo que aumenta su poder de
penetracin. Es aconsejable utilizar un
vehculo que no sea txico, dado que entra
en la muestra antes que el fijador y podra
daar el tejido que an no est fijado.

101

La fijacin del tejido tiene por objeto preservar la estructura fina celular, las
relaciones entre las clulas y la arquitectura de las organelas. En la fijacin se reemplazan
las uniones lbiles de las molculas dentro de la clula por otras ms estables y con ello se evita
el colapso del citoesqueleto y la desorganizacin de las organelas.
En el procesamiento para microscopa electrnica de Transmisin, no debera hacerse una
fijacin por coagulacin como se utiliza para microscopa ptica, con metanol o por
calentamiento, porque se desnaturalizaran las protenas y se alterara la ultraestructura. Por
ello se aconsejan los fijadores no-coagulantes, que mantienen la estructura terciaria de las
molculas y producen ligamentos cruzados entre ellas. En Microscopa Electrnica de barrido se
utiliza frecuentemente FAA (formol, cido actico, alcohol) ya que se realizan observaciones de
la topografa externa.

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Dijo Marlene Benchimol, microscopista brasilera :


Esto tiene ms de brujera que de ciencia

2.1 pH del buffer

Los fijadores en general se ajustan a un pH cercano a la neutralidad (6,5 -8) salvo el tetrxido de osmio que se recomienda usar a pH 6
para la preservacin de material nuclear.
El punto isoelctrico de las protenas es menor que el pH neutro del fijador y quedan cargadas negativamente. Para evitar que las protenas se
repelan, se agregan cationes que permiten su acercamiento como para poder establecer las uniones transversales en la fijacin.

Siempre se mide el pH final del fijador a


temperatura ambiente
El trmino osmolaridad: Se refiere a
los moles por litro de solucin, que
tendr una solucin ideal de

solucin control .

2.2 Osmolaridad

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misma presin osmtica que una

102

sustancia no disociada, para poseer la

2.2.1 Cmo ajustar la osmolaridad?

Se pueden agregar electrolitos o no electrolitos al tampn. Los ms


comunes son: sacarosa, glucosa, polivinil pirrolidona (PVP) y electrolitos
como cloruro de sodio y cloruro de magnesio. Los electrolitos pueden
cambiar el pH as que habr que medirlo y ajustarlo en la solucin final. Las
sustancias mencionadas se agregan en la primera fijacin con
Glutaraldehdo o la segunda con tetrxido de osmio. Pero NO, si la primera
es con tetrxido de osmio, porque pueden ocasionar la prdida de
materiales solubles del tejido durante la fijacin. Si se agregan iones como
Mg++ y CA++, se prefiere Mg++ porque no precipita las protenas.
Cada tipo de clula requiere una osmolaridad diferente. Se determina
por prueba y error. Excepto para tejidos en que ya se ha determinado con un
osmmetro.
Cmo seleccionar la mejor osmolaridad?

Osmosis: Es el movimiento neto del agua a travs de una


membrana semipermeable en respuesta a un gradiente de
concentracin del soluto (el agua se desplaza para diluir la
solucin ms concentrada). Slo se produce smosis cuando
tenemos una solucin hiperosmolar y una hiposmolar separadas
por una membrana semipermeable.
Osmolaridad: La concentracin del agua depende de la
concentracin de partculas del soluto (en relacin) y no de
molculas de soluto, ya que algunas molculas se disocian en
iones.
Su unidad es Os, osmol, o nmero de partculas (iones o
molculas intactas) por litro de solucin. La concentracin del
agua es igual en una solucin con 1 mol de glucosa y 1 mol de
NaCl; 3 moles de glucosa; o 1,5 moles de NaCl. O sea son 3 Os de
soluto /lt.
La osmolaridad es una propiedad coligativa de las soluciones,
depende estrictamente del nmero de partculas /l de solucin.
La medida de osmolaridad sola no predice qu le ocurrir a la
clula en la solucin, porque depende tambin de la cantidad de
solutos no-penetrantes propios de la clula.
Tonicidad o estiramiento, en cambio, describe el volumen
celular cuando la clula ha alcanzado el equilibrio con la solucin.
La tonicidad no tiene unidades, solo es un trmino comparativo.
Por ejemplo, si la clula pierde agua y se encoge cuando es
puesta en una solucin, se dice que la solucin en hipertnica. Si
no cambia su volumen es una solucin isotnica.

103

La osmolaridad del tampn juega un rol fundamental en la


determinacin de la presin osmtica y el glutaraldehdo utilizado para la
primera fijacin, contribuye a esta presin.
La osmolaridad de las soluciones se determina midiendo la depresin del
punto de congelamiento. El punto de congelamiento a presin ambiental es
la temperatura a la cual las fases lquida y slida permanecen en equilibrio.
La osmolaridad del tampn juega un rol fundamental en la determinacin
de la presin osmtica, el glutaraldehdo contribuye a esta presin.

Recordamos:

Pgina

El trmino osmolaridad se utiliza en microscopa electrnica asociado


al comportamiento del tejido sumergido en una solucin. En general se
selecciona el fijador segn trabajos realizados con tejidos similares y
luego se ajusta su osmolaridad si se observan signos de contraccin o
hinchamiento.

Para tejidos que poseen diferentes tipos de clulas, habr que pensar cules son las que se necesitan preservar y ajustar la osmolaridad a
sas clulas solamente.

Ejemplo: si hablamos de los tejidos animales para fijar mdula de rin, necesitaremos osmolaridad diferente segn el nivel que necesitemos
estudiar. En vegetales, por ejemplo, si se desea fijar una hoja, tendremos: epidermis, parnquima en empalizada, esponjoso, xilema y floema. Cada
uno de esos tejidos posee una osmolaridad diferente.
En la tabla II-1 se detallan valores de osmolaridades tipo para tomar como base. (Principles and Techniques of Electron Microscopy. Biological
applications. Fourth edition : MA Hayat. Pg:13 y 14).

Tabla 2.1- Osmolaridades aproximadas de vehculos

Tabla 2.2-Osmolaridades aproximadas (mOsm) de soluciones tampn y fijadores de glutaraldehdo (Ga) (pH 6.85)
Tampn
0.1M fosfato
0.1M cacodilato
Fosfato isotnico

slo tampon
212
220
310

tampn +1%Ga
345
340
441

tampn +2%Ga
472
470
575

tampn +4%Ga
710
720
800

104

osmolaridad en mOsm.
250
300
350
400
350
300
350
400
400

Pgina

Vehculo
0.1M cacodilato de sodio +0 05%Ca2Cl +0.07M sacarosa
0.1M cacodilato de sodio +0 05%Ca2Cl +0.1 sacarosa
0.1M cacodilato de sodio +0 05%Ca2Cl +0.18M sacarosa
0.1M cacodilato de sodio +0 05%Ca2Cl +0.23M sacarosa
0.2M cacodilato de sodio
0.15M Srensen
0.19M Srensen
0.2M Srensen
0.2M collidina+0.16M sacarosa

Caulfield
Dicromato de Dalton

280
345

390
503

504
630

730
895

Glutaraldehdo %

Vehculo

osmolaridad (mOsm)

1.5
1.8
1.8

0.07M Srensen+0.015% Cl Ca2


0.05M Srensen
0.05M Srensen + 0.05M sacarosa

300
250
300

1.8

0.05M Srensen + 0.1M sacarosa

350

1.7

0.1M Srensen

350

1.7

0.1M Srensen + 0.05M sacarosa

400

2.5

0.05M Srensen + 0.08M sacarosa

400

2.5

0.1M Srensen + 0.13M sacarosa

450

2.0

0.05% Srensen

300

1.8

0.1M Srensen

350

2.0

0.1M Srensen

400

1.8
2.2
1.8

0.08M Srensen+0.015% Cl Ca2


0.08M Srensen
0.1M cacodilato+0.05 Cl Ca2

350
400
350

105

2.0

0.1M cacodilato

400

1.5

0.1M colidina+0.05% Cl Ca2

350

Pgina

Tabla 2.3-Osmolaridades del fijador Glutaraldehdo en diferentes concentraciones y distintos vehculos

3.0

0.1M colidina+0.10 % Cl Ca2

400

2.5

0.1M colidina.

350

Tabla 2.4 -Osmolaridades promedio de soluciones tamponadas de glutaraldehdo a diferentes concentraciones:

Ga %

Miliosmoles

pH

Fosfato 0.1M

230

7.4

1.2% a

370

7.2-7.3

2.3%Ga

490

7.2-7.3

4.0% Ga

685

7.1-7.3

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El vehculo de la solucin fijadora es mejor que sea algo hipertnico, debido a que cambia la osmolaridad total por la penetracin del fijador
y por su dilucin.
Para tejidos vegetales maduros, vacuolados: 800 mOsM (mesfilo), 400 mOsM (tejidos meristemticos, ejemplo pice de raz).
Para mamferos, una Osmolaridad total de 500 a700 mOsM, donde la osmolaridad del vehculo sea aproximadamente 300 mOsM. Para
especmenes delicados: se prefiere 300-350 mOsm. El fijador de Karnovsky tiene una osmolaridad de 2010 mOsm.
Para microscopa electrnica de barrido la solucin debera ser isotnica.

106

Notas a tener en cuenta:

El volumen celular
depende de :
1) las bombas de iones
de la membrana (ATPasas)
2) presin osmtica
intracelular.

-Rin: 420 mOs


-Cerebro:800 mOs.

Fig.2.1 Bacterias y esporas. Barra 1

GA al 2%:

100,11 g---1 mol glutaraldehdo


20g---------- x= 0.2 mol/lt = 200 mOs

volumen de glbulos rojos cmo


se encuentran en los fluidos del
cuerpo.

0
Concentracin osmolar de Cl Na

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Fig.2.2 -En el cuerpo humano la solucin isotnica a la sangre tiene 300


mOs/l aproximados:
0.3OsM/l = 0.15 M NaCl = 0.3 M Sacarosa.

107

100 ml---2g
1000 ml20g

GA al 5 %:
100 ml-----5g
1000 ml50g
100,11 g---1 mol glutaraldehdo
50g----------0.5 mol/l = 500 mOs.
Si la muestra es un rin, por ejemplo, no
habra que agregarle nada al vehculo.

Buffer fosfato 0,1 M a pH 6,85 tiene una osmolaridad de 212 mOs


7,2
226 mOs.
Aporte del terico de la sacarosa:
Cuando la solucin resulta muy hipo osmtica, se le puede agregar sacarosa al 5%: cuyo aporte
es:
100 ml----5g

108

Aporte del terico del buffer fosfato:


En el caso del buffer no es tan sencillo porque al variar el pH, cambia el grado de ionizacin y,
por lo tanto la osmolaridad:

El osmio no contribuye a la
osmolaridad prcticamente. Durante
la fijacin con osmio se liberan
algunos lpidos de membrana y las
protenas empotradas a ellos. Por eso
aumenta la permeabilidad a los iones
y no hay cambios por osmolaridad. Se
pierde la propiedad de membrana
semipermeable. Es lo mismo usar un
vehculo de alta o baja osmolaridad,
aunque algunos autores sostienen
que esto no es del todo cierto e igual
conviene usar una solucin en buffer.

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Fig.2.3- As, si en un mol de Cl Na hay 58,443 gramos /litro, en 0.015 moles/l calculamos el % de la
solucin salina isosmtica e isotnica. Que es al 0.9 % .
Aporte terico del glutaraldehdo:
Por lo tanto contribuye poco a la osmolaridad, hay que controlar el vehculo agregndole
sacarosa o sales.
.

1000 ml50 g
342.3 g---1 mol
50 g----x= 0.14 mol/ lt = 0.14 Os = 140 mOs
En resumen, segn el aporte terico, la osmolaridad total de la solucin fijadora sera de 586 mOs:
*Buffer fosfato 0.1 M a pH 7,2....226 mOs
*Sacarosa 5%...140 mOs
*Glutaraldehdo 2%...........................200 mOs
586 mOs
Sin embargo, cuando se mezclan sustancias no se puede calcular la osmolaridad exactamente. Es por eso que es mejor medirla con un
osmmetro. As, la osmolaridad total real del GA en buffer fosfato resulta:

Concentracin del GA
1-2%
2-3%
4%

pH
7.4
7.2-7.3
7.1-7.3

osmolaridad
370 mOs
490 mOs
685 mOs

Este resultado difiere del calculado tericamente. Algunos autores calculan de este otro modo la osmolaridad:
Osmolaridad efectiva = mOs (GA) + mOs (vehculo)

En el caso de la 2 fijacin con osmio al 1%:


100 ml----1g
1000 ml10 g

Pgina

OJO: cuando la osmolaridad es alta, aparecen las clulas oscuras, que han sido descriptas en sistema nervioso central, epiddimo y epidermis,
pero son artefactos.

109

Y otros autores prefieren despreciar la osmolaridad del GA o FA y slo consideran la del vehculo para los clculos.

254,2 g--- 1 mol OsO4


2. ------- x= 0.04 mol/lt = 40 mOs.

2.3Composicin inica de la solucin fijadora: 2.3.1: Agregado de electrolitos

Para el normal funcionamiento de las clulas se requiere un balance inico perfecto. (Ca++, Mg++, K+, Na+). Hay poca informacin en la
literatura sobre los iones que deberan agregarse a la solucin fijadora y en qu concentracin, por lo que se realiza por prueba de acierto y error.
Puede suceder que si no hay un balance exacto se pierda material de las clulas o se deposite fijador como precipitado.
2.3.2

Agregado de sustancias no-electrolticas: como glucosa o sacarosa al 5%.

No deben ser usadas si se realiza una 1ra. fijacin con tetrxido de osmio ya que inhiben la fijacin de la albmina.

Cuando la composicin del fijador difiere del lquido extracelular normal del tejido puede haber extraccin del material

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2.4 Constitucin inica

110

Como se coment anteriormente, son mejores los fijadores algo hipertnicos, ya que al fijar la
clula se produce la prdida de la semipermeabilidad de la membrana. Al inactivarse la bomba de
sodio, este in se mantiene dentro de la clula y en un medio isotnico penetrara agua en ella.

celular o depsito del fijador. Esto ocurrira antes de que el tejido est adecuadamente fijado, especialmente con los fijadores
que penetran o reaccionan lentamente (OsO4 y FA).
Se pueden explicar algunos efectos de extraccin por la presencia de ciertos iones, como el in bicarbonato, que
destruye especficamente los microtbulos (Schultz y Case,1968).
En cambio, otros iones son beneficiosos, como los iones bivalentes Ca2+ y Mg2+ que son necesarios para mantener las
membranas lipdicas. Se prefiere usar el in magnesio al calcio porque es una molcula de menor tamao, y en
concentraciones adecuadas no precipita las protenas (Millonig y Marinozzi-1968).

En el caso de elegirse el calcio, se debe agregar 1-3 mM de CaCl2 al glutaraldehdo ya que a


mayor concentracin se forman precipitados. Adems, si se usa el buffer fosfato, el agregado de
CaCl2 puede dar lugar a la formacin de cristales de fosfato de calcio que no se solubilizan en
los lavados.
Por ltimo, en la seleccin del in que va a utilizarse se debera considerar que ste no produzca un efecto fisiolgico

osmolaridad fue la correcta observando las mitocondrias.

111

Cmo determinar si la eleccin la

secrecin glandular o la contraccin muscular.

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especfico en ese tejido, como la

Baja concentracin inica


Alta concentracin inica
Con Calcio
Con S-colidina
Osmio a pH 7
En agua destilada

Fig 2.4
2.5 Factores que afectan una fijacin
2.5.1 Temperatura:
Lo ms usual es trabajar de 4 a 10C y hasta 20 C. A mayor temperatura de fijacin ocurre un aumento de la velocidad de difusin
del fijador dentro del tejido pero tambin se produce mayor autlisis y extraccin de material. A bajas temperaturas pueden no
preservarse estructuras lbiles como los microtbulos.
En casos especiales, como en el estudio de algunos tipos de miosina, se aconseja trabajar a 37C. y no congelar el tejido. Para la
preservacin de enzimas muy lbiles, la fijacin debe llevarse a cabo en fro. En el caso de fijacin por perfusin el glutaraldehdo debe
utilizarse a temperatura corporal para que no se produzca vaso constriccin.

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Depende tanto de la velocidad de penetracin del fijador como de su rapidez de reaccin. Generalmente se utiliza una
primera fijacin de 1 a 4 horas a temperatura ambiente o a 4C.
El tiempo ptimo va a estar controlado por: el tipo de fijador, el tamao de la muestra, el tipo de espcimen, la
temperatura, el tampn, el mtodo de contraste y el objetivo del estudio. El microscopista experimentado podr aconsejar los

112

2.5.2 Duracin de la fijacin

tiempos de fijacin de acuerdo a los parmetros antes indicados.


2.5.3 PH del fijador:
Las protenas tienen carga elctrica positiva o negativa y el punto isoelctrico depende de los grupos cidos y bsicos presentes en las
molculas. En su punto isoelctrico las protenas son neutras, muestran menos solubilidad y viscosidad, menor presin osmtica y menos
hinchamiento.
Las protenas son capaces de combinarse con cationes en su fase alcalina y con aniones en su fase cida. Una desviacin del pH de su
punto isoelctrico resulta en un incremento de la ionizacin, la presin osmtica de la solucin aumenta.

El tetrxido de osmio disminuye el punto isoelctrico de las protenas, probablemente debido a la destruccin de aminocidos
bsicos. La red de cargas negativas de las protenas aumenta con la fijacin de tetrxido de osmio. Los fijadores como
glutaraldehdo, formaldehdo y dicromato de potasio bajan el punto isoelctrico de las protenas.

Las clulas vegetales que contienen una gran vacuola tienen una alta presin osmtica en su interior.
El pH de las clulas vara entre 5.0 y 6.0 mientras que el pH del citoplasma de las mismas clulas vara
entre 6.8 y 7.1.

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113

Un incremento del pH significa un aumento de la capacidad de entrecruzamiento del Glutaraldehdo.

Cmo aumentar el pH:


Los especmenes se fijan por inmersin del 3 al 6% de glutaraldehdo en tampn a pH 7.0
por una hora a temperatura ambiente.
Luego se lleva el pH del Glutaraldehdo a 8.0 en tres pasos, agregando a los 30 y a los 60
gotas de 0.1N de Na OH, mientras se agita la solucin. Los especmenes se dejan en esta

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Un pH de 8.0 parece ser ms efectivo en vegetales.

114

Pequeos cambios en el pH de los fijadores producen cambios en el interior de las clulas, incluyendo la
consistencia del protoplasma, la selectividad de la membrana y la actividad de las enzimas

aldehdos
osmio

Tabla

Carbohidrato
s
-

c.
Nucleico
s.
+
(histonas)
+
(histonas)

Protena
s

Fosfolpidos

Lpidos neutros

++

++

++

permanganat
o

S, destruye

destruye

destruye

destruye

destruye

uranio

S, destruye

++

2.5

Pgina

Fijador

115

Resumiendo:

2.6 Vehculos

Los mismos lquidos propios de la muestra a los que se les agrega directamente el fijador son los indicados. Por ejemplo el plasma sanguneo para
ver glbulos rojos o el agua de mar para estudiar algas marinas. En el caso de clulas en cultivo se aconseja utilizar el mismo medio, pero
considerando que contienen protenas que tambin sern fijadas y contrastadas y podran llegar a entorpecer la observacin. (SEM)

2.6.1 Los vehculos ms utilizados:

2.6.1.1

Tampn fosfato:

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. No se recomienda para estudios citoqumicos de enzimas.


. Se contamina fcil con microorganismos y ms con el agregado de sacarosa.
. Precipita con acetona.
. No permite la adicin de Ca++.

116

Se usa en general el de Srensen 0,067M. ( pH 7,2-7,4), de osmolaridad 226 a 230 mOs.


. El pH vara poco con la temperatura.
. No es txico (para clulas en cultivo).
. Econmico.
. Bueno para perfundir, ya que es semejante al medio fisiolgico.

2.6.1.2

Tampn cacodilato: Na(CH3)2 AsO4.3 H2O

. Se conserva largo tiempo porque no se contamina.


. Permite la adicin de Ca++.
. Tiene mayor osmolaridad que el buffer fosfato.
. Capacidad tampn mxima a pH 6.4-7.4.

. Es carcinognico y txico, contiene arsnico. Tiene aroma a ajo. Se absorbe por piel.
. Destruye las vesculas sinpticas si se lava por ms de 30 minutos.
2.6.1.3

Tampn Veronal-acetato:

. Cuando se usa uranilo en bloque, porque no produce precipitados.


. Tiene poco poder buffer entre pH 5-7.5.
. No se debe usar con aldehdos porque reacciona.
. Contiene barbitrico.
. Desarrolla microorganismos durante el almacenamiento.

2.6.1.4

Tampn colidina: (2,4,6 trimetil piridina)

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. Muy mal olor.


. Muy txico.
. Extrae material celular, lisa las membranas.

117

. Estable a temperatura ambiente.


. Permite mayor penetracin de fijador en grandes trozos de tejido.

2.7 Fijadores

En general se recomienda realizar una primera fijacin con un aldehdo, de mayor rapidez de reaccin, que fija protenas y entre ellas las
encargadas de iniciar la autolisis, y luego una fijacin con un oxidante, como el Tetrxido de osmio, que fija los lpidos de las membranas. Si se sigue
este esquema, entre las fijaciones con el aldehdo y el oxidante en necesario realizar un lavado para que no se reduzcan los fijadores oxidantes del
segundo paso.

Muy importante: En general se recomienda realizar una primera fijacin con un aldehdo, de mayor rapidez de
reaccin, que fija protenas y entre ellas las encargadas de iniciar la autolisis, y luego una fijacin con un oxidante,
como el Tetrxido de osmio, que fija los lpidos de las membranas.
Si se sigue este esquema, entre las fijaciones con el aldehdo y el oxidante en necesario realizar un lavado con
buffer para que no se reduzcan los fijadores oxidantes del segundo paso.

Glutaraldehdo (GA): Sus dos grupos aldehdos forman enlaces con los grupos amino de las protenas y cidos nucleicos.

118

2.7.1.1

Fijadores aldehdos:

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2.7.1

Reacciona con aminocidos (Lys, Tyr, Trp, Hys, Phe) dando bases de Schiff, amarillas. Esta reaccin permite chequear
la profundidad de la fijacin. Fija las protenas, el glucgeno, los cidos nucleicos y tambin algunos lpidos, como la
fosfatidil etanolamina.

Concentracin
1.2%
2.3%
4.0%

osmolaridad
370 mOs
490 mOs
685 mOs

pH
7.4
7.2-7.3
7.1-7.3

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La osmolaridad del GA en buffer fosfato 0.1 M (230 mOsm, pH 7.4):

119

Cmo se almacena? Se debe mantener a 4 C y descartar si el pH cae por debajo de 3.5, que es
debido a la formacin de cido glutrico o contaminacin con CO2. Se vuelve amarillo cuando est
polimerizado.

Admite el agregado de sacarosa, que no demora su reaccin, y tambin de Cl2Ca.


. Penetra 1,5 mm/ h. a temperatura ambiente. Es lento al entrar al tejido aunque luego reacciona muy rpido.
. Irrita la piel, los ojos, las vas respiratorias. Es mutagnico, alergnico y sensibilizante. Produce dermatitis.
. No es apto para las tcnicas de inmunolocalizacin porque tapa los epitopes, se utiliza en muy baja concentracin.
2.7.1.2 Formaldehdo:

H2C=O

CH2=O
R---NH2 + CH2=O
R---NH---CH2---OH
R---NH---CH2---NH---R
La formalina o formol comercial es una solucin al 38% de formaldehdo que contiene metanol (11-16 %). Por eso conviene usar su forma
polimrica, el paraformaldehdo (PFA). Igual que con el GA, la permeabilidad de la membrana ser parcialmente preservada y es conveniente
cuidar la osmolaridad del vehculo.
. Es 10 veces ms rpido como fijador que el GA. Se pueden tratar bloques mayores de tejido.
. Es bueno para las tcnicas de inmunolocalizacin.
. Da una reaccin reversible, por lo que no conviene prolongar el lavado.
. No fija los polisacridos.
. La preservacin de la ultraestructura celular es menor que con el uso de GA.

120

Acrolena:

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2.7.1.3

-Se prepara al 10% en buffer fosfato 0,025M. El producto comercial es lquido y puede ser purificado por destilacin para remover la hidroquinona
que se usa como estabilizante.
. Tiene muy buena penetracin (1mm/h hasta en bajas temperaturas),
. Sirve para trozos grandes, clulas vegetales y microorganismos de paredes gruesas.
. Es muy soluble en agua.
. Es hipertnica: no es necesario usar aditivos

. Es txica e inflamable.
. Solubiliza los lpidos (es extractiva ) y altera los microtbulos.
. Inhibe las enzimas: no se puede usar en histoqumica.
. Tambin requiere una 2 fijacin con osmio.

2.7.2 Fijadores oxidantes:

PM: 254.2
Fija las cadenas insaturadas de lpidos. Si se deja el tejido un tiempo prolongado, quiebra las uniones de las protenas. Se deposita en las regiones
polares, hidroflicas, de los fosfolpidos de membrana y se reduce a OsO2 de color negro. Lo que permite rastrear hasta dnde ha sido fijado el bloque
de tejido.
El osmio tambin reacciona con los sulfihidrilos de las protenas. No reacciona con los cidos nucleicos, pero s con las protenas asociadas a ellos
(histonas) y quedan atrapados.

Los primeros sitios de reaccin son las ligaduras dobles alifticas. Esta oxidacin produce un monoster del cido smico acclico, que
se hidroliza hasta un diol, otro monoster, que es inestable, reacciona con el diol dando un dister estable.

121

Tetrxido de osmio: (OsO4)

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2.7.2.1

Durante la fijacin con osmio se pierden algunos lpidos de membrana y las protenas empotradas a ellos. Por eso aumenta la permeabilidad a los
iones y no hay cambios por osmolaridad. Se destruye la propiedad de membrana semipermeable. Es lo mismo usar un vehculo de alta o baja
osmolaridad, aunque algunos autores sostienen que esto no es del todo cierto e igual conviene utilizar una solucin en tampn.
Si se us tampn de lavado con el agregado de sacarosa al 5 % conviene hacer un ltimo lavado sin sacarosa antes de fijar con osmio.

Es muy voltil y txico: produce dao pulmonar y renal, quemaduras en la piel. Es carcinognico.
. Penetra y reacciona muy lentamente (0.5 mm /h): hay que usar trozos de material muy pequeo, para que no se altere la
ultraestructura antes de producirse la fijacin.
. Produce la contraccin de los nervios mielnicos.
. NO se debe usar con buffer TRIS porque explota.
. Por dar un taco opaco no se puede usar antes de la inclusin con resinas que deben polimerizarse con UV.

Pgina

122

. Reacciona con los lpidos, protenas y cidos nucleicos.


. Da contraste.
. Facilita la ubicacin del trozo de tejido en el taco de resina en el ultramicrtomo

. Disminuye la extraccin de material celular con el agregado de CaCl2 o MgCl2, pero puede formar precipitados.

2.7.2.2

Tetrxido de Rutenio: RuO4

Es de penetracin lenta y se debe usar buffer veronal o cacodilato para mejorar este aspecto. Costoso. Reacciona con lpidos polares, protenas y
glucgeno.
2.7.2.3
Permanganatos:
Se reduce sobre los fosfolpidos y protenas de la membrana a MnO2. No reacciona con los lpidos no-polares.
Es de penetracin lenta. Se debe fijar el tejido a 5-10 C. para evitar necrosar el material, y slo por 15 min. a 2h, ya que el tejido se vuelve friable.
Los tejidos fijados con permanganatos y embebidos en parafina son luego duros de cortar.
Permanganato de potasio:
. Sirve como contraste negativo.
. Se conserva el ADN, aunque no la estructura de los cromosomas.
. Fija y contrasta el glucgeno.
. Se usa en botnica.

Permanganato de sodio:

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. Es mejor que el de potasio ya que preserva mejor las membranas.

123

. Extrae protenas, ribosomas, microtbulos y microfilamentos.


. Se pierden lpidos y ARN.
. Rompe las membranas.

. Forma grnulos sobre las membranas.

2.7.3

Fijacin y contraste en bloque con acetato de uranilo:

. Disminuye la extraccin de material.


. Se une a los grupos fosfato de los cidos nucleicos y fosfolpidos.
. Se une a los grupos carboxilos y aminos libres.
. Fija las protenas.
. Aumenta el contraste.
. Aumenta la extraccin de glucgeno citoplasmtico.
. Precipita con el buffer fosfato y cacodilato. Se lo usa al 0,5%- 5% en agua durante 2-24 h. luego de la post fijacin con OsO4 a 4C.
. Es foto lbil.
. Es radiactivo.

2.8 Tipos de fijacin

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2.8.2 De un cultivo en monocapa : Cuando se tiene un cultivo en monocapa de clulas sobre vidrio, plstico u otros soportes tales como
filtros millipore, son fcilmente fijadas sumergindolas en el fijador. Tambin se puede fijar con vapor por 10-15 min en glutaraldehdo y
luego con osmio.

124

2.8.1 Por inmersin: La fijacin por inmersin se realiza sumergiendo pequeos trozos de a muestra en un recipiente que contenga la
solucin fijadora (fijador + vehculo) en un volumen 10 veces mayor por lo menos.

Fig.2.5

2.8.3 Clulas aisladas en suspensin: Las clulas aisladas en suspensin se colocan en la solucin fijadora por slo 10 o 15 minutos. Luego
los pasos sucesivos se realizan centrifugando o embebiendo en agar las clulas (para microscopa electrnica de transmisin).

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Tratamiento de la muestras con anticongelantes: glicerol, etilenglicol, dimetil-sulfxido.


Inmersin en isopentano enfriado en nitrgeno lquido.
Sublimacin del agua al vaco.
Infiltracin con monmero plstico al vaco.
Polimerizacin.

125

2.8.4 Crio sustitucin (TEM): Tiene la ventaja que mantiene la actividad enzimtica. Si se usa una resina soluble en agua se pueden hacer
reacciones histoqumicas. Consiste en los siguientes pasos:

2.8.5 Material particulado: Se considera material particulado los virus, ribosomas, fragmentos de membranas obtenidos con tcnicas de
ultra centrifugacin, protenas fibrosas y enzimas. Y en lo que se refiere a materiales: arcillas, compuestos inorgnicos, catalizadores, etc.
consultar preparacin de muestras de materiales para TEM: captulo II (2.12). Para estudiar el material particulado se hace una
suspensin, y se coloca una gota directamente en una grilla con film en el caso de microscopa electrnica de transmisin o en un
cubreobjetos con poli-l lisina para microscopa electrnica de barrido. (ver captulo VIII, SEM). Para aumentar la dispersin de las
partculas se puede agregar albmina de suero bovino, glicerina o propilen-glicol. Cuando la grilla est seca, se sombrea con carbn o se
le hace un contraste negativo, que consiste en sumergirla en acetato de uranilo y luego se deja secar sin lavarla. Queda lista para su
observacin en el TEM. Slo se puede obtener informacin de la estructura de la superficie (ver contraste negativo).

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2.8.7 Vegetales: La muestras vegetales no sufren cambios post-mortem, pero s la desecacin rpida. Es preferible cortar trozos menores
de 1 mm3. Estas muestras contienen aire intercelular. Si flotan en el fijador, se deben colocar en vaco. Si son races, se pueden dejar a 1
atm por 1 min, y no ms porque se separara la membrana plasmtica de la pared celular. Para absorber el aire se puede utilizar tampn
hervido. Los tallos, hojas y flores estn recubiertos por cera, que es hidrofbica y pelos que producen burbujas de aire. Es por ello que no
penetran los fijadores y hay que tratarlos previamente con un detergente diluido. Si no funciona la tcnica convencional de fijacin con
GA y osmio de puede intentar fijar con KMnO4 0.6-5% en buffer veronal acetato por 1h 30 min. a 4-22 C. o acrolena. La pared celular y
la vacuola mantienen una alta presin osmtica, por eso tambin se puede usar el buffer cacodilato. Sin embargo no conviene usar el
buffer fosfato, porque en muestras vegetales extrae alrededor del 50% de fosfolpidos y protenas.

126

2.8.6 Fracciones Subcelulares: Para microscopa electrnica de transmisin, en muestras tales: microsomas, bacterias, mitocondrias, etc.
Se realiza igual que en materiales pequeos, slo que para centrifugar se utilizan mayores velocidades. La fraccin subcelular se fija
mezclando con igual volumen de fijador, el cul contiene la misma concentracin de sacarosa que el medio de suspensin.
Alternativamente se agrega glutaraldehdo a la suspensin para llegar a una concentracin final de 1%. La concentracin no parece ser
crtica en rangos de 0,5 a 3,0% en 0,1M de cacodilato de sodio con agregado de 2-3mM de Cloruro de Calcio. El pellet se fija de 30 min. a
1 hora. El tiempo depende de la medida del pellet, mientras que para suspensiones el tiempo es menor. Luego, para la segunda fijacin,
el pellet se achica cortando con una hoja de bistur limpia y nueva.

Al cortar las clulas se libera el contenido de la vacuola, de pH 5-6, al citoplasma, de pH 7. Por ello conviene hacer una primera fijacin en
buffer pH 8 y luego una segunda fijacin en buffer a pH 7.
En comparacin con tejidos animales, los vegetales pareciera que no son afectados al extraerlos de la planta pero se sabe que hay cambios
ultraestructurales debido a la prdida de agua que ocurre rpidamente. Trozos de hojas, tallos o races deben ser fijados inmediatamente al
sacarlos de la planta. Se coloca una gota de fijador sobre la muestra, la cual, es luego cortada con una hoja de afeitar en finas rodajas (0,2 a 1,0
mm) o pequeos cubos 1,0 mm3). Luego esas piezas se sumergen en fijador fresco lo ms rpido posible, teniendo cuidado de minimizar el dao
estructural en esta etapa. Si los tejidos flotan, colocarlos en vaco. El primer xito que se obtuvo en la fijacin de vegetales fue usando
permanganato de potasio (0,6-5,0%) con buffer veronal-acetato por 1 h y a 2-4C o a 22C.
Cuando el fijador no penetra fcilmente se sugiere:
l.

El uso de un fijador que contenga acroleina o permanganato.

2.

Ruptura mecnica del tejido antes de la fijacin.

Un ejemplo seria:
glutaraldehdo (2-6%) en
buffer fosfato o cacodilato
por 1 a 4 h. a temperatura
ambiente seguida por una
segunda fijacin con 0s04
(1-2%) en el mismo buffer
1 a 2 h.

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Adems de variar los tiempos y las temperaturas de fijacin se pueden agregar sales o sacarosa para incrementar la osmolaridad. El modo de fijacin depende
del tamao de la muestra. Si son algas unicelulares o cloroplastos aislados, se fijan en pellet por centrifugacin o en suspensin. Si la muestra es grande se fija por
inmersin. Para lograr el esquema de fijacin ptimo para determinada muestra, hay que realizar varias fijaciones e ir descartando por prueba y error.

127

La fijacin con permanganato da excelentes resultados en la visualizacin de membranas celulares, pero causa
tambin remocin progresiva de otros componentes celulares y debe usarse slo para propsitos especiales.
Desde la introduccin de los fijadores aldehdos se ha incrementado la preservacin de detalles citoplasmticos haciendo una post-fijacin con 0s04. Los
tiempos de fijacin varan segn el espcimen.

2.8.8 Fijacin de muestras grandes

2.9 Aditivos

Son soluciones que se utilizan junto a la fijacin persiguiendo un fin determinado.


Ya se han mencionado algunas sales, iones, usados para mantener la osmolaridad y
la fuerza inica. La adicin de iones debera controlarse, ya que, por ejemplo, el
CaCl2 con el buffer fosfato da cristales de fosfato de calcio que no se solubilizan en
los lavados y luego se observan precipitados en las preparaciones.

2.9.1
Tanino al 1 %:
Para TEM, aumenta el contraste de las membranas. Se usa luego de la post fijacin con osmio,
30 min. a temperatura ambiente. Luego se lava en sulfato de sodio 1% por 5 minutos.

2.9.2
Ferrocianuro de potasio 0.05 M: (TEM) Da mayor contraste a las membranas y al
glucgeno. Con ferrocianuro, Fe (CN)6 4, el osmio se vuelve marrn, y con ferricianuro, Fe
(CN)6 3, el osmio se vuelve amarillo.

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A veces es necesario fijar especmenes grandes. Se requiere un fijador que penetre rpidamente
por lo que se eligen fijadores que contengan paraformaldehido al 2% en 0,11-1 M de buffer cacodilato,
pH=7,4, con 0,2% de trinitrocresol y 2mM de cloruro de calcio.

Cuando se aplican distintas


fijaciones se hacen lavados para quitar el
resto del fijador que no reaccion, y con
ms razn si se us primero
glutaraldehdo y luego osmio porque
reaccionan entre ellos.
Para la mayora de los materiales, el
vehculo del primer fijador es adecuado
para el lavado, agregndole sacarosa 5%
si es necesario para ajustar la
osmolaridad, ya que se produjeron
cambios en la membrana durante la
fijacin.
Despus del tratamiento con
glutaraldehdo se puede dejar el material
en el lquido de lavado durante toda la
noche porque la reaccin es irreversible.
Cuando se deba guardar el tejido en
la solucin de lavado durante mucho
tiempo, se recomienda dejar al fro. En
algunos casos puede ser perjudicial, por
ejemplo, lavar con buffer cacodilato por
ms de 30 minutos puede destruir las
vesculas sinpticas.
Conviene volver a cortar el tejido antes de
la segunda fijacin en trozos menores.

128

Muy importante:

2.10

Fijacin de carbohidratos

Generalmente los carbohidratos se extraen durante la


fijacin, dan falsa localizacin o se colapsan, como los
glucosamino-glucanos. Se puede utilizar el rojo rutenio o el
cido tnico para mejorar la observacin del glucoclix. (TEM).
Para localizar carbohidratos conviene contrastar con plata,
que consiste en oxidar los azcares a aldehdos, y luego
revelarlos con Ag+ que se reduce a Ag.

129

El fijador es de alto costo, conviene usar viales pequeos. Se remover


slo el lquido del vial durante la fijacin, deshidratacin e infiltracin.
Se trasvasar el material a los moldes de resina para polimerizar en la
ltima etapa.
El volumen del fijador ser 10 veces mayor que el de la muestra, para
no diluirse el fijador con los componentes solubles del tejido. Para
trabajar en fro se ponen los viales con el fijador en la heladera
antes de comenzar.
Lavado en el mismo buffer durante 30 minutos.
Post fijacin en tetrxido de osmio 1% en el mismo buffer, con el
agregado de ferrocianuro de potasio al 1% en solucin final, como
agente auxiliar del contraste de membranas (Karnovsky, 1971),
durante 1-2 h. bajo campana.
El tejido se pondr negro.
Lavado en agua destilada o buffer (sin sacarosa) 3 veces, 5 minutos
cada lavado.

2.9.3
Hidrxido de lantano al 2%: (TEM) Para marcar
los espacios intercelulares se utiliza la sal nitrato de lantano al
4% y se enturbia con gotas de hidrxido de sodio 0.1N.

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2.11.1 Convencional. Luego de la diseccin rpida, el tejido se


corta en pequeos bloques de 1 mm 3, se sumerge en el primer
fijador, glutaraldehdo al 2, 5 % al 5 % en una solucin de tampn
cacodilato de sodio 0.1M o tampn fosfato de Sorensen 0,1 M a pH 7.2 a
7.4. Se dejan a 10C durante 2 a 10 hs. Se los coloca sobre una plancha
de cera dental y se los cubre con unas gotas de glutaraldehdo (bajo
campana). En el espacio de 1 minuto se corta el tejido con una hoja de
afeitar o de bistur, nueva, en cubos de aproximadamente 1 mm3.

Se utiliza junto con el osmio: 1 vol. tampn cacodilato


1 vol. ferrocianuro
1 vol. Osmio 2%

2.11- Algunos protocolos

El tamao del bloque de tejido no es tan crtico (hasta de


algunos milmetros cbicos) para la primera fijacin. Luego se
recortan trozos ms pequeos antes de la fijacin con osmio.

Aclaracin: La doble fijacin con GA +OsO4 tiene ciertas


ventajas sobre la fijacin con osmio slo.

El Glutaraldehdo reacciona con el glucgeno y luego de la doble fijacin su densidad es mucho mayor que la alcanzada con el
osmio solamente.

Los lpidos no son fijados con el GA de la 1 fijacin, pero s en la segunda fijacin con osmio. Si se demora la 2 fijacin, los
fosfolpidos no fijados pasan a la solucin, se reorganizan en membranas espontneamente y en la segunda fijacin con tetrxido de
osmio son inmovilizados fuera de su lugar de origen. A estos artefactos se los denomina figuras mielnicas, que se ven frecuentemente
en bloques grandes de tejidos. Se pueden evitar con la adicin de 1 a 3 mM de CI2Ca al GA.

Los materiales biolgicos se deben fijar rpido, antes de que se produzca su autlisis.
Generalmente los fijadores penetran lentamente en los tejidos y la regin central del bloque puede quedar sin fijar.
El vehculo del fijador penetra ms rpidamente y puede daar el tejido, que todava no est fijado.

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130

Se recomienda cortar el tejido en trozos pequeos y elegir bien el vehculo del fijador. Esto se debe a que

2.11.1 Fijacin de muestras vegetales (TEM)

2.11.1 .1 Semillas: Despus que el recubrimiento de la semilla es removido, piezas de tejido de 1mm3 de la parte perifrica de los
cotiledones se extraen y se colocan sobre un cubreobjetos. Para llevar a cabo la fijacin por vapor se lleva la pieza a un desecador y se
coloca una cpsula de Petri con el fijador. El desecador se sella y se deja durante 13 das.

2.11.1.2 Semillas (otra opcin TEM)


Glutaraldehdo al 25% 25ml
Formaldehdo( 8%).. 25ml
Tampn collidine(0.05M, pH7.3).. 100ml

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Los especmenes se fijan en esa solucin por 5 min. a temperatura ambiente y se transfieren a una solucin nueva a 4 C por otras 2 horas. Se
lavan en el mismo tampn por 1 o 2 horas, se post fijan con tetrxido de osmio 1% de 2 a 12 h. a 4 C.

131

Solucin fijadora:

2.11.1.3 Semillas secas (TEM)

Se fijan en 1% glutaraldehdo en 0.1M tampn cacodilato por 48 h.


Se separan los cotiledones y se cortan en trozos de 1mm3.
Se colocan en 5% glutaraldehdo en el mismo tampn con 2% sacarosa y bajo vaco por 1 hora y otra hora a presin atmosfrica.
Se lava toda la noche en el mismo tampn conteniendo sacarosa,
Se post fijan en tetrxido de osmio 2% en tampn por una hora.
Se lavan varias veces en agua destilada.

2.11.1.4 Hojas:

Solucin fijadora para TEM y SEM


Glutaraldehdo 25% ..15ml.
Formaldehdo............................25ml.
Tampn cacodilato (0.2M, pH 7,2) .18ml.

Procedimiento para fijar hojas: Un aro metlico de 3 mm de alto y 12 mm de dimetro se pega con lanolina en la superficie superior de la
hoja intacta, no debe haber lanolina en el interior del aro. Con el uso de una aguja hipodrmica se llena el espacio con la solucin
fijadora y se cubre con un cubreobjeto. Despus de 45 minutos se cambia la solucin y se contina por otros 45 minutos a temperatura
ambiente. La hoja que estuvo en contacto con el fijador se corta en tiras de 0.5mm. Estas tiras se colocan ahora en solucin fijadora por
30 min. a 4 C . Luego se lavan con la solucin tampn y se postfijan con tetrxido de Osmio al 2% por 2h.

132

....25mg.

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Ca Cl 2

2.11.1.5 Tejidos blandos vegetales:

Prefijacin por 1 hora con 5% glutaraldehdo en 0.08M Pipes ( pH 6.8) y postfijacin en tetrxido de osmio por 1 hora en 0.18M Pipes, la
osmolaridad 800, 600 y 680 mOsM. Todos los tratamientos a temperatura ambiente, con agitacin. La solucin Pipes- tetrxido de Osmio
se debe preparar un momento antes de usarla sino se deteriorara cambiando a color marrn.

2.11.1.6 Granos de polen:

Pared (TEM) : 2% Glutaraldehdo y 0,5% cido tnico en 0.1M de tampn fosfato 0.1M .
Por 1 o 2 horas a temperatura ambiente. Despus de lavar tres veces en tampn post fijar con tetrxido de osmio al 0.2% en el mismo tampn
por 1h.

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Se cortan las races en segmentos menores a 1mm de lado, se fijan en glutaraldehdo al 3% en tampn Pipes 0.1M ( pH 8.0) con una
osmolaridad de 750 mOsM . Se dejan fijar por una hora a Temperatura ambiente y luego se lavan en tampn por 30 min., se post fijan en
tetrxido de osmio en el mismo tampn por 1 hora a 4C.(TEM y SEM).

133

2.11.1.7 Races:

Referencias :Schultz y Case,1968; Millonig y Marinozzi-1968; Karnovsky, 1971;

Principles and Techniques of Electron Microscopy. Biological applications. Fourth edition : MA Hayat. Pg:13 y 14.

2.12- Preparacin de muestras de materiales para su observacin por Microscopa electrnica de Transmisin.

2.12.1- Aplicaciones a polmeros, catalizadores y minerales

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Esta tcnica consiste bsicamente en efectuar cortes ultra finos de un material para poder estudiarlas por TEM. En la
seccin de ultramicrotoma se dieron los fundamentos de esta tcnica.
La ultramicrotoma se ha comenzado a utilizar ampliamente para obtener secciones ultrafinas de polmeros y algunos casos
de minerales y catalizadores. Sin embargo, debe tenerse en cuenta el dao mecnico que puede ocurrir durante el corte. La deformacin es el comn
en muchos materiales y en especial en los polmeros. Para evitar este tipo de artefacto, el material debe tener una temperatura de transicin vtrea
(Tv) mayor que la temperatura ambiente (Ta), a fin de que el material no sufran distorsin en su morfologa. Si la Tv es menor que Ta, los cortes
debern realizarse en un crio-ultramicrtomo. El mismo permite realizar cortes ultra delgados a muy bajas temperaturas (menores que 0C). Para esto
emplea nitrgeno lquido como refrigerante.
Las secciones obtenidas son colocadas en grillas sin film soporte.

134

La preparacin de muestras para microscopa electrnica de transmisin, requiere una atencin especial, ya que de ella depende la calidad
de los resultados que se obtengan. La principal condicin que debe cumplir una muestra para observarla por TEM es que sea delgada. Entendindose
por delgada cuando se tienen espesores menores de 1000 .
La diversidad de tcnicas de preparacin de muestras es muy amplia. Es importante considerar los factores que darn un mximo de
informacin sobre la muestra para poder seleccionar la tcnica de preparacin ms adecuada.
Entre las tcnicas ms usadas en la preparacin de catalizadores, minerales y polmeros se pueden citar:

2.12.3-Molienda y Suspensin:

Este mtodo es empleado para materiales en polvo. El mismo se muele en un mortero y el resultado de la molienda se dispersa
en un solvente inerte seleccionado teniendo en cuenta la composicin del material. La suspensin resultante se coloca en un bao ultrasnico unos
minutos para lograr una buena dispersin del material. Por ltimo se deposita una gota de la solucin anterior sobre una grilla con film soporte y se
deja secar a temperatura ambiente.
Para polvos muy finos, o materiales que pueden sufrir daos en la micro estructura durante el mortereado, este paso no se realiza y
directamente se coloca en el solvente y se lleva a bao ultrasnico mayor tiempo.
En el caso que el material no pueda suspenderse en ningn solvente adecuado, se puede realizar el mortereado, y colocar una pequea cantidad
del polvo resultante sobre una grilla con film soporte.

2.12.4-Contraste de polmeros

(Ver captulo VI.1.5)

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La microscopa electrnica es ampliamente usada en la caracterizacin de catalizadores metlicos soportados. La principal ventaja de esta
tcnica es dar una imagen directa del catalizador, brindando informacin sobre forma, tamao y estructura tanto de las partculas como del soporte.
Uno de los estudios que suelen realizarse utilizando TEM es la distribucin estadstica de tamaos de partcula. En este caso, se asume:

135

2.12.5-Caracterizacin de catalizadores soportados por TEM

1) El tamao de la partcula relacionada a la escala en la imagen representa el tamao real de la partcula. Esto
contempla una correcta calibracin de la magnificacin y del microscopio.
2) Se detectaran todas las partculas que sean mayores que la resolucin del microscopio.
3) Contraste por amplitud. Diferencia de contraste entre partcula y soporte.
4) Forma asumida de partcula.
Estas hiptesis son vlidas para trabajos en TEM convencional, pero no para TEM de alta resolucin (HREM) en el cual la deteccin de las partculas y
el tamao, son sensitivos al fuera de enfoque.
Diversas consideraciones hay que tener en cuenta en el estudio de catalizadores con TEM convencional. Entre ellas podemos nombrar: definicin
de tamao, definicin de promedio, representatividad de la cantidad de catalizador observada respecto a la totalidad de la muestra, interaccin haz
electrnico con el material, preparacin de la muestra, forma de las partculas, caractersticas del contraste, identificacin de partculas. Todos estos
puntos inciden sobre el resultado final.
Teniendo en cuenta la definicin de tamao seleccionada, el tipo promedio y los errores inherentes de la tcnica, es posible obtener un tamao
promedio de partcula metlica representativo.
Si se obtienen promedios utilizando distintas tcnicas experimentales, es importante conocer la definicin de promedio empleada en cada una a fin
de realizar una adecuada comparacin.
La principal dificultad que presenta el estudio por TEM de catalizadores soportados es la pequea cantidad de material examinado. En una
imagen tpica de un catalizador soportado, la masa total de material observada es del orden de 10-17 gramos.
El problema de estimar el grado en que la poblacin observada es representativa de la totalidad de la muestra, se debe tratar por mtodos
estadsticos de muestreo y anlisis de datos.

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En la observacin por TEM de catalizadores soportados la interaccin del haz electrnico con el catalizador puede causar alteraciones
estructurales y morfolgicas tanto del soporte como de las partculas.
Soportes como SiO2 y Al2O3 son aislantes trmicos y elctricos, que los hace inadecuados para estudios por microscopa electrnica. La baja
conductividad trmica produce calentamiento de los cristales durante la irradiacin, dando lugar a posible sinterizacin, evaporacin o fusin de las
partculas metlicas. Tambin el haz electrnico puede inducir cambios estructurales en el soporte.

136

2.12.6- Interaccin haz electrnico con el catalizador.

Las propiedades aislantes de algunos soportes pueden causar carga elctrica en la muestra y la misma acta como una lente extra que
degrada la imagen. Adems la carga y el calentamiento pueden llevar a un corrimiento del material a travs del film soporte lo cual impide obtener
una imagen con buena definicin.

2.12.4-Contraste de la imagen:

Hay dos consideraciones que deben hacerse respecto al contraste de la imagen en catalizadores soportados. Una es la apariencia de las partculas
metlicas; y la otra, como distinguir entre los granos de soporte y las partculas soportadas en l.
En lo referente a la apariencia de las partculas se debe tener en cuenta que la imagen formada en la pantalla es 2D. Esta imagen contiene
partculas y material con orientaciones diferentes respecto del haz de electrones. Una partcula que aparece en la imagen redondeada se puede
asumir como esfrica, pero tambin se puede tratar de una partcula cilndrica con su parte longitudinal paralelo a la direccin del haz primario.
Las partculas metlicas suelen distinguirse del soporte por diferencia de nmeros atmicos y densidad atmica. Esto genera un contraste por
masa espesor y, si existe cristalinidad, el contraste por difraccin contribuir tambin a la imagen. En estos casos la observacin y el anlisis de la
imagen se debe efectuar con extremo cuidado. Tcnicas de difraccin electrnica y campo oscuro deben complementar el estudio por campo claro a
fin de evitar errores de interpretacin.

1234-

Medicin de los tamaos de las partculas identificadas en una imagen.


Confeccin de una tabla tamaos vs. frecuencias.
Clculo estadstico del tamao promedio.
Distribucin estadstica de tamaos. Por ej. histograma de tamaos.

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Una vez seleccionada la definicin de dimetro a usar, la determinacin del tamao promedio de partcula siempre involucra:

137

2.12.5-Determinacin de tamaos:

Todos los pasos sealados anteriormente pueden realizarse manualmente o mediante programas de procesamiento y anlisis de
imgenes.
Las diferentes tcnicas experimentales usadas para la caracterizacin de tamaos son sensitivas a distintas partes de la distribucin, por eso
es importante que la definicin de tamao de partcula promedio que se emplee se corresponda con la tcnica experimental que se utilice. En otras
palabras, cuando se realizan experiencias de quimisorcin y TEM, la definicin de tamao promedio ms apropiada es el dimetro volumen-rea que
por su significado fsico, permite asociar ambas tcnicas directamente.
Cuando se comparan resultados de TEM con difraccin de rayos X (XRD) se emplea el dimetro promedio volumen-pesado que surge de la
frmula de Scherer.

2.13.2-Efecto de la forma de las partculas:

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Particle size, particle size distribution and related measurements of supports metal catalysts. R.J. Matyi, L. Schwartz, J.B.Butt. Catalysis
reviewers vol. 29, issue 1, (1987) Pg.41-99.

138

En sistemas en los cuales hay variaciones en la forma de las partculas se debe tener recaudos al seleccionar la definicin de dimetro a usar.
Matyi y colaboradores muestrearon el efecto del descriptor de dimetro tamao utilizado sobre la distribucin de tamaos. Ellos tomaron como
ejemplo partculas elpticas y compararon las distribuciones obtenidas empleando dos descriptores distintos. Demostraron que la distribucin de
tamaos est fuertemente influenciada por el descriptor de tamao empleado y concluyeron que en el caso de partculas elpticas el dimetro del
crculo equivalente fue el ms adecuado.
Si la distribucin de formas es ms angosta que la de tamaos, se puede inferir que el efecto de la forma sobre el tamao sea relativamente
pequeo. Por el contrario, si las partculas fueran todas del mismo tamao, cualquier cambio en la forma de las mismas, ensanchara la distribucin de
tamaos.
Referencias:
The limitation of the Transmission Electron Microscope for characterization of supported metal catalysts. P.C. Flynn, S. Wanke, P. Turner. Journal of
Catalysis. Volume 33, Issue 2, May 1974, Pages 233-248.

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139

CAPITULO III

DESHIDRATACION

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140

Prof. Viviana Sorrivas, Dra. Alfonsina Morales

3.1 Objeto de la deshidratacin

La deshidratacin es un paso necesario e importante en la preparacin de muestras para microscopa electrnica de transmisin ya que los medios
de infiltracin no son miscibles generalmente con el agua. Mientras que para microscopa electrnica de Barrido convencional es una etapa previa al
montaje muy importante para que el tejido se mantenga en buenas condiciones para su observacin. Para remover el agua de los tejidos se utilizan
solventes orgnicos, como acetona y alcohol.
Muchas resinas epoxi utilizadas para infiltrar tejidos para microscopa electrnica de transmisin son solubles en etanol o acetona, pero se mezclan
ms rpidamente con xido de propileno (1,2 epoxi propano), por eso puede usarse como intermediario en el ltimo paso de la deshidratacin. El xileno,
tolueno y estireno son adecuados como intermediarios, pero se prefiere el xido de propileno porque no se separa de la resina epoxi durante la
polimerizacin. Este no se puede usar luego del acido fosfotngstico.
NOTA:

Los materiales que deben ser guardados de un da para otro o transladados, se dejan en alcohol o acetona 80%.

La extraccin de lpidos y protenas se acompaa con la contraccin celular y subcelular (se ve la disminucin de la periodicidad de la mielina de los nervios
y el encogimiento de los cromosomas, encorvndose sobre su eje, se contraen los filamentos de msculo estriado, etc). Es menor la variacin al usar acetona,
pero no se sabe cul de estos agentes preserva mejor las relaciones intermembranas que existen en vivo.
3.1 .1 Mtodos

El material se puede lavar luego de fijarlo y antes de deshidratarlo, pero eso no es necesario.

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Se trabaja a temperatura ambiente o en fro. Si se hace en fro, se debe elevar la temperatura hasta la ambiente cuando el material ya est en la solucin al
90%. A bajas temperaturas hay que cuidar la condensacin de H20.

141

En el mismo vial donde se fij el tejido, se quita el lquido fijador y se reemplaza por el primer lquido deshidratante, as hasta llegar al ltimo, que es el
puro. Se hace con pipeta Pasteur, cuidando que el volumen de la solucin siempre sea mayor, por lo menos 10 veces, al del material.

Un esquema tpico de deshidratacin es el siguiente:


*EtOH o acetona 30% (slo para embriones) ........................15min.
50% ........................................................... ...... 15min.
75% ........................................................... ...... 15min.
95% ........................................................... .. ... 15min.

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Fig.3.1

142

100%. (tres veces 15min).

Para acelerar el proceso de deshidratacin:

el tejido se seccionar en trozos pequeos.

agitar los viales.

hacerla a temperatura ambiente.

usar ms cambios de cada solucin.

3.1.2 Mtodo de diluciones infinitas

1.- La pieza se sumerge en lquido de lavado.


2.- Se lleva a alcohol 50%.
3.- Se agrega gota a gota alcohol 96. ( se quita la mitad del volumen y se lleva a alcohol 75%

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143

4.- Se quita todo el acohol dejando una delgada capa sobre el material y se agrega Et OH 100%.

3.1.3 Deshidratacin parcial

Para evitar la extraccin de lpidos se omiten los pasos con EtOH ms de 70% y de xido de propileno. Se puede hacer porque la
resina Epon-812 es soluble en etanol 70%. Adems del EtOH y la acetona se pueden usar otros agentes deshidratantes, como
etilenglicol, polietilen-glicol, xido de propileno, acroleina y alcohol, etc. segn el caso.
Notas tiles sobre deshidratacin
No dejar secar el tejido al recambiar los solventes.
La diferencia de accin entre el etanol y la acetona es que el etanol no endurece los tejidos y la acetona s.

El alcohol
no endurece
los tejidos,
la acetona
SI

Una cierta cantidad de tetrxido de osmio puede quedar en el tejido cuando no se lav con buffer, y es reducido a dixido
de osmio, de color negro por el alcohol. El dixido de osmio es insoluble y produce un granulado fino o una suspensin coloidal en
los 10 primeros de la deshidratacin con etanol (no se produce la precipitacin de dixido de osmio con acetona).

Conviene terminar con dos cambios de etanol 100% (con sulfato de cobre anhidro para mantenerlo absoluto y que debe cambiarse al pasar a azul).

El xido de propileno es muy voltil y de baja viscosidad, por eso entra rpidamente en los tejidos y arrastra consigo a la resina. Se debe trabajar
bajo campana. Puede dar polimerizacin irregular.

- Para diferentes diluciones de etanol, partir del 95% y tratar como si fuese 100%
- Cuando el material flota (como clulas vegetales) porque contiene aire, conviene evacuar las burbujas con vaco.
Se evita deshidratar con resinas miscibles en agua, algunas resinas disuelven componentes de la muestra (las epoxi reaccionan con
protenas y cidos nucleicos, los metacrilatos disuelven los lpidos neutros y fosfolpidos).

144

Es mejor usar acetona, pero se usa etanol porque es ms barato, y como es menos hidroflico, el etanol absoluto es ms fiable.

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CAPITULO IV

Infiltracin con resinas

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145

Dra. Alfonsina Morales y Prof. Viviana Sorrivas

El medio de infiltracin ideal

.
Monmero de resina.
Endurecedor o provocador de entrecruzamientos: dianhdrido que produce uniones
covalentes con las molculas de epxido dando una matriz de un copolmero insoluble.
Flexibilizador: es un endurecedor modificado para llenar los espacios en la matriz final y
disminuye el entrecruzamiento. No interviene en el polmero final.
Catalizador: Debe coincidir la dureza del bloque de resina con la del tejido: se prepara
una mezcla ms dura en los tejidos que tienen mayor cantidad de colgeno, por
ejemplo.

El xido de propileno y
El cido fosfotngstico
mezclados forman un
complejo explosivo.

No debe ser solvente de los


componentes celulares (las resinas
epoxi extraen protenas y cidos
nucleicos, y las resinas metacrilato a
los lpidos neutros y fosfolpidos no
fijados).
Debe ser soluble en los agentes
deshidratantes.
El monmero debe tener baja
viscosidad para aumentar su
infiltracin
Debe polimerizar uniformemente,
sin polos.
Debe sufrir la mnima variacin de
volumen al polimerizar
Debe ser fcil de cortar (en general,
cuando es un polmero lineal corto y
con pocas ligaduras transversales se
corta ms fcil).
Las secciones deben ser estables al
haz de electrones.
Una vez polimerizado debe ser
qumicamente inerte y permitir el
contraste, reacciones histoqumicas
e inmunohistoqumicas.

146

En general los kits de resinas constan de 4 elementos que deben mantener anhidros:

Cumple con los siguientes requisitos:

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Tambin llamada embebido o inclusin, se denomina al proceso


mediante el cual la resina lquida (con distintas viscosidades segn
el tipo) penetra en el material completamente. Entacado se refiere
a cuando se coloca el material ya infiltrado en moldes apropiados.
Luego se polimeriza la resina y se vuelve slida, formando el taco.

4.1 Tipos de resina:

1. polister
2. epoxi
3. metacrilato

4.1.1 Resinas Polister:

Ej. Vestopal y 4.1.1.2 Rigolac

Tiene componentes inestables que es necesario recambiar peridicamente.


El catalizador es el perxido de benzolo.
Pueden producirse explosiones al mezclar los componentes.
Son ms viscosos porque se usan parcialmente polimerizados.
No son solubles en etanol, pero s en acetona.

147

Sufre una contraccin menor al 2 % al polimerizar.

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4.1.1.1

4.1.2 Resinas Epoxi:

Forman un polmero tridimensional estable al calor y a los solventes. La polimerizacin es irreversible y uniforme.
Mantienen la ultraestructura.
Sufren poca contraccin, menor del 2%
Tienen alta viscosidad .
necesitan largos tiempos de infiltracin.

viscosidad
Araldita
Epon
Spurr

. endurecedor: DDSA
. flexibilizador: DBP
. catalizador: DMP-30, que como se inactiva con el agua
Se reemplaz por BDMA (0.2 g DMP-30 = 0.4 g BDMA).

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Se encuentra comercialmente como Epn 812, Epicote, EMBED,


Polybed, Medcast, o Maragls.
La mezcla final se hace con:

148

4.1.2.1 Epn

La resina Epn polimeriza a 60C en 48 hs.


Su viscosidad 150-210 cp a 25C.
La resina Spurr, de menor viscosidad, tiene mejor penetracin.
Viscosidad: 7,8 cp.

Componente:
Resina

mezcla media
ERL-406(dixido de vinil ciclohexano)

mezcla blanda
DRL-4206 o VCD

flexibilizador:
endurecedor
catalizador

DER-736(diglicidil ter polipropilenglicol)


NSA (anhdrido nonenil-succnico)
DMAE

DER-736
NSA
DMAE

polimeriza

70C 16 hs-

70C 8 hs.

El NSA se altera al aire. Conviene polimerizar en tacos cerrados o se vuelve quebradizo.


Cuesta el contraste con uranilo y hay que usar la solucin.

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Se prepara con el mtodo gravimtrico (pesando los componentes en la balanza). Si se forman burbujas de aire se puede aplicar un poco de vaco,
pero si se exagera se pueden evaporar algunos de los componentes. La mezcla puede guardarse varios meses a -20C, en el freezer, cuidando de que
tome temperatura ambiente antes de usar para que no se hidrate y vuelva a bajar la viscosidad.
Se puede mezclar directamente con etanol o acetona luego de la deshidratacin.
La mezcla es fcil de preparar.
Es fcil de cortar una vez polimerizado el taco.
Sus secciones son estables al haz de electrones.
Mejor penetracin

149

Tabla4.1

Las reacciones inmunocitoqumicas se pueden


realizar:
Antes de la fijacin:
Sirve para localizar antgenos superficiales de
clulas aisladas. Es muy caro para trozos de tejidos.
Inmediatamente debe fijarse la muestra y continuar
con la tcnica convencional. Su ventaja es que se
obtienen imgenes con el mejor contraste.

4.1.2.2 Mezcla de Araldita: (araldita + DDSA + DMP 30)

Luego de la fijacin y antes de la


infiltracin en resina:
Con una fijacin suave. Se puede permeabilizar
luego la membrana plasmtica de las clulas para
permitir el ingreso de anticuerpos al interior. Se
contina con la tcnica convencional. Slo para
clulas aisladas. Se altera la estructura de las
membranas.

En la tabla se puede observar las cantidades de los componentes


a usar respecto de la dureza que se requiere utilizar:
DUREZA

Epn o Araldita

9.44 g

9.44 g

9.44 g

9.44 g

10g

5g

DDSA

20 g

9.44 g
15 g

NMA

3.33

6.67

10

13.3

0.2 g

0.2 g

0.2 g

0.2 g

0.2 g

DMP-30

150

2. Con una fijacin suave. Luego de la


polimerizacin se carcome (etching) la resina de
las secciones ultrafinas con KOH o H2O2 al 2% por
15 min. La desventaja es que el oro pega
inespecficamente sobre las resinas hidrofbicas, y
disminuye el marcado. Se corta en ultramicrtomo.
La reaccin se hace sobre las grillas.

Polimeriza mal luego de la deshidratacin con etanol. Requiere xido de propileno

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Luego de la fijacin y polimerizacin en


una resina epoxi:

Es miscible en etanol.
Se puede mezclar con Epn.
Tiene baja contraccin durante la polimerizacin.

3.
Luego de la fijacin y polimerizacin en una resina
hidroflica:
Con una fijacin suave. Se incluye la muestra en una resina
hidroflica, que se polimeriza y se corta en ultramicrtomo. La
reaccin se hace sobre las grillas. Las secciones son muy
inestables al haz. Esta fijacin suave no preserva la estructura
ptimamente, y sin osmio el contraste es pobre. Permite usar
colorantes acuosos en los preparados de microscopa pticaCrioultramicrotoma.
Fijacin suave. El material se coloca en un crioprotector y se
congela en LN2. Se corta el taco en crioultramicrtomo. Se hace
la reaccin sobre la grilla y luego se cubre con un film plstico
que incluye uranilo para darle algo de contraste.
: sirve para estudiar clulas libres o en trozos de tejidos, y para
antgenos internos.
Tabla 4.2

Epn

Araldita

endurecedor
flexibilizador
catalizador

DDSA o NMA
DBP
BDMA o DMP-30

DDSA o NMA
DBP
BDMA o DMP-30

Spurr
(ERL 406, DRL 4206)
NSA
DER-736
DMAE

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Resina

151

En resumen: tabla 4.3

No mezclar el catalizador con el endurecedor porque puede explotar.

4.1.2.3 Medcast (Epn):

Medcast
DDSA
NMA
DMP-30

6.14 g
1.64 g
4.34 g
0.2 g

Tabla 4.4

Tabla 4.5

5g
3g
13 g
0.2 g

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ERL VCD
DER
NSA
DMAE

152

4.1.2.4 Spurr:

4.1.3 Resinas Metacrilato

Pertenece a la familia de los acrlicos.

R: ---CH3 : metil-metacrilato
Proporcin Butil-metil metacrilato
1:4
1:2
1:1

R: ---(CH2)3---CH3 : butil-metacrilato.

dureza del bloque


duro
medio
blando.

Luego apareci el glicol-metacrilato o estireno, mejor para cortar.


Tambin existen los monmeros metacrilatos solubles en agua, pero son difciles de cortar.
Sirven para infiltrar en un gradiente creciente de resina a un trozo de tejido en buffer, sin
deshidratar.
Las resinas metacrilato, una vez polimerizadas, se pueden quitar con cloroformo.

Est formado por los componentes

A: agente de ligaduras cruzadas


B: monmero
C: catalizador.

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Existe en varias versiones. La K4M es hidroflica, y se mantiene lquida hasta 35C.


La HM20 es hidrofbica, se mantiene lquida hasta 70C y se usa en crio sustitucin.

153

4.1.3.1 Lowilcryl:

Baja viscosidad, an a bajas temperaturas. Es un lquido transparente. Infiltra la quitina de insectos y las paredes de clulas vegetales.

Sirve para inmunohistoqumica porque una vez polimerizado es un material no soluble en agua pero s permeables al agua.

Tambin se pueden hacer todas las coloraciones acuosas sobre los cortes de 1 m, como la hematoxilina eosina.
No se necesita una deshidratacin completa, incluso un poco de agua (hasta un 10 %) conviene para las reacciones Se deshidrata en la
heladera.
Es soluble en etanol y en acetona pero conviene usar etanol para deshidratar porque la acetona interfiere con la polimerizacin.
Igual que Historesin, permite obtener cortes de 1m para microscopa ptica, de gran calidad.
Polimeriza con luz UV 360 nm, a bajas temperaturas, temperatura ambiente o a 60C cambiando el catalizador por
perxido de Benzolo.

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Ningn anticuerpo penetra la resina. El xito del Lowilcryl es que es ms rugoso que el Epon, que tiene superficie ms lisa. Tambin tiene menor
pegado inespecfico al oro.

154

En la fijacin no se puede usar Osmio porque toma color negro que interfiere con UV.
Las resinas hidroflicas traen problemas con los antgenos solubles en agua.
Los metacrilatos son los que ms contraen (+20%) durante la polimerizacin. Esto mejora con una pre-polimerizacin con 15 min. en estufa,
pero se usaran ms viscosos.
Produce dermatitis agudas cuando todava no estn polimerizados.
Los metacrilatos son solventes fuertes de lpidos, an a bajas temperaturas.
El oxgeno del aire inhibe su polimerizacin, usar moldes cerrados. Anaerbicas.
Las secciones de metacrilato son inestables al haz de electrones, se contaminan las aperturas. Esto mejora usando la trampa de LN2 en el
microscopio, evaporando carbono sobre la grilla o usando film de PVA.
Como no se us osmio en la fijacin el contraste que se obtiene es pobre.
Tanto las secciones montadas sobre las grillas como los tacos absorben agua del ambiente y se ablandan: hay que Mantenerlos en un
recipiente hermtico con slica gel o en vaco.

4.1.3.2 Unicryl:

Es el mejor para cito qumica. Es un lquido de baja viscosidad hasta 20C


Tiene un solo componente, lo que evita la manipulacin de varias sustancias.
Es el ms txico. USAR GORRO PORQUE SE CAE EL CABELLO.

4.1.3.3 London Resin: LR

Existen en las versiones Gold, de bajas temperaturas, y White, que polimeriza a temperatura ambiente.
Es la menos irritante de las resinas hidroflicas.

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155

4.2- Seguridad en el uso de resinas:

Seguridad en el laboratorio
Usar guantes: de nitrilo con los metacrilatos y de vinilo o ltex con las
resinas epoxi.
LOS GUANTES DE LATEX NO SIERVEN PARA LAS RESINAS METACRILATO.
-Observar que LOS GUANTES DE NITRILO SE DISUELVEN CON ACETONA.

-No limpiar la piel con solventes orgnicos porque la resina penetra ms


rpido.

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-Preparar la mezcla en recipientes plsticos que no se disuelvan, por el


mtodo gravimtrico. El recipiente se puede reusar polimerizando
previamente los restos de resina.

156

-El descarte de las resinas, puras o las mezclas con acetona, debe hacerse en
un recipiente que una vez lleno se polimeriza antes de disponerse en la
basura comn.

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Se prepara y se utiliza la mezcla de resinas bajo campana.


Manipular los reactivos siempre con medidas de seguridad extrema

157

Los componentes ms txicos son los aceleradores, en general aminas, como el BDMA, DMP-30, DMAE o S1.
Son muy voltiles y producen asma. (ver 1)
No flamear las botellas con monmeros por peligro de explosin.
El xido de propileno lastima la crnea, produce dermatitis y es muy inflamable. Es un epxido que se usa
como intermediario entre la deshidratacin y la resina, pero conviene sustituirlo por acetonitrilo o bien no
usarlo, como en el caso de la resina Spurr.
Tambin como agente deshidratante y de transicin en las resinas acrlicas se usa la dimetil-formamida, pero
es txico para la piel, pulmones e hgados.
El estireno es solvente de transicin en las resinas polister: es irritante de los ojos y mucosas, deprime el SNC.
El Spurr es cancergeno. El VCD (dixido de vinil ciclohexano) que contiene produce anticuerpos. Produce
problemas nasales, oculares, de piel y trax.
Las resinas acrlicas producen reacciones neurotxicas y parestesias por destruccin de los lpidos de la mielina.
Tambin hay que cuidar de no inhalar las virutas que se forman al tallar los tacos, ya que produce alveolitos.
Cuando se use el molde de embebido plano conviene dejarlo en la estufa dentro de una caja de Petri, para
evitar aspirar sus vapores.
Los tacos de acrlico a veces estn pegoteados al sacarlos de los moldes porque atraparon O2 y no
polimerizaron en su superficie: CUIDADO. Desmoldar con guantes. Se puede burbujear tambin N2 para
desplazar el O2.

4.3. Pre-infiltracin
La pre infiltracin se puede hacer antes de la fijacin, entre la primera y segunda fijacin (recomendado) o antes de la deshidratacin. El medio
usado para pre infiltrar no interfiere con la penetracin de los fijadores ni toma color con el osmio en general, se deshidrata y se embebe junto con la
muestra incluida.
Algunos soportes:

Se utiliza en el caso que los especmenes no sean lo suficientemente grandes o cohesivos para formar un buen pellet,
o demasiado frgiles como para manipularse con las pinzas. Si el material est formado por clulas aisladas, organelas,
microorganismos, etc. se evitan las mltiples centrifugaciones que implica la deshidratacin y por otro lado permite
orientar mejor el material. El material se trata como si fuera un bloque de tejido compacto a partir de este paso.

Luego de la fijacin en aldehdo, se lava en buffer con un poco de glicina para neutralizarlo.
Se centrifuga el material en un tubo eppendorf y se desecha el sobrenadante.

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Se prepara una suspensin de agar al 2% en agua o solucin fisiolgica, calentando en BM hasta disolver, agitando, sin que se queme.
Se puede alicuotar en viales y auto clavar para luego guardarse hermtico en la heladera.
En el momento de usar se vuelve a poner en bao mara o en el microondas hasta disolver.
Esperar a que baje la temperatura a 43-45C antes de agregrselo al material.

158

4.3.1- agar o agarosa:

Se deja tomar 40 C en un bao de Mara.


Se agrega agar al 2% a 43C en el mismo volumen que la muestra, y se re suspende.
TODO DEBE QUEDAR A LA MISMA TEMPERATURA, INCLUSO LAS PIPETAS QUE SE USAN.
Sacar del bao y centrifugar el eppendorf dentro de un tubo falcn con agua caliente.

Dejar enfriar hasta solidificar. Puede ayudar la heladera cuidando de no congelar.


Quitar el bloque de agar con una jeringa con agua fra.
Cortar el bloque y continuar con el protocolo general como si fuese un trozo de tejido.
Para ver le material dentro del bloque de agar o agarosa (opacas) se puede teir previamente con fucsina leuco
base (Schiff) o con cido pcrico.
Se usa tambin la agarosa de bajo punto de fusin, con punto de ebullicin de 62-68C, y punto de solidificacin a
27-29C, que tambin se usa a 43C (ms bajo se vuelve viscoso). An as algunos antgenos pueden deteriorarse. La
viscosidad til est relacionada con la concentracin y la temperatura de la suspensin de agarosa:

Fig.2.1

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Se usa una solucin al 10%, que es lquida hasta 37C.


La ventaja es que si queda mal embebido se vuelve otra vez lquida calentndola a 37C.
Infiltra mejor el material biolgico que la agarosa.
Se puede quitar de la muestra con agua.
Es ms econmico.

159

6.2 .Gelatina:

Para mantener el bloque slido hay que trabajar sobre hielo, porque a temperatura ambiente es lquida. Sirve para crioultramicrotoma.
No se puede retirar del eppendorf con una jeringa con agua como la agarosa porque se disuelve. Hay que cortar el tubo.
Si luego de la pre infiltracin se contina con la tcnica convencional, el osmio oscurece la gelatina y no la agarosa: cuidado con la
orientacin de la muestra.

4.3.2- otros soportes.

Otro mtodo para pre infiltrar muestras muy pequeas es aumentar su volumen con algo claramente distinguible que luego pueda
ser ignorado, como unas gotas de sangre. En este caso se mezcla y se centrifuga hasta tener un pellet compacto. Tambin se puede
usar fantasmas de glbulos rojos, queratina, cogulo de fibrina, etc.
Todos estos soportes toman color negro con el osmio.

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Forrar un portaobjetos con parafilm. Poner 2 barritas de cera o parafilm pegndolas con calor.
Poner una gotita de material sobre el porta, y luego agregar la gelatina al 10%.

160

Idea

Fig.4.2
Hacer un sndwich con el otro porta. Sostener con un clip para que no se separen.
Enfriar en hielo y mantenerlo as.
Seleccionar la regin que nos interesa y orientarla.

Sobre un portaobjetos poner una gota chica de agar lquido. Mantener tibio.
Antes que endurezca inyectar una suspensin de clulas con una pipeta en el interior de la gota de agar.
Dejar enfriar. La muestra quedar encapsulada.

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Otra idea:

161

Fig.4.3

4.3.3.- Tipos de moldes de inclusin:

1) cpsulas Beem de polipropileno con o sin tapa. Se cortan antes del ultramicrtomo.
2) Cpsulas de gelatina (grageas transparentes). Se disuelven en agua caliente.
3) Pirotines de papel aluminio, moldes de portaobjetos de resina, etc.
4) Moldes de infiltrado plano de goma o silicona.
5) Para muestras muy pequeas, slo visibles en el microscopio ptico, se puede usar un cubreobjetos de plstico o vidrio con un
crculo grabado para localizar la muestra y con polilisina, silane o alcian blue para que la muestra se pegue. Fijar la muestra,
deshidratar, y colocarle una gota de resina. Polimerizar. Luego se quita el cubreobjeto sumergindolo en LN2 si es de vidrio o
disolvindolo en solvente si es de plstico.
Moldes de portaobjeto:
Forrar 2 portaobjetos con parafilm o tratarlos con un agente esmerilante. Separarlos con dos palitos (fsforos).
Entre los dos portas colocar y polimerizar la muestra

1
2
3
4
Fig.4.4-Moldes para inclusin, (1,2, y 3), cpsulas beem (4) y cpsula de gelatina(5)

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162

Variante:
Con un portaobjetos marcar papel aluminio para hacer un molde de portaobjeto de resina que tendr incluida la muestra.

.
6
7
Fig.4.5-Cmara para polimerizar con luz ultravioleta casera (6) y guantes de nitrilo ( 7) .

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Resina mal mezclada: hay tacos duros y tacos blandos.


Resina vieja o pre-polimerizada: no infiltra.
Burbujas de aire: produce agujeros.
Aumento de la temperatura de la estufa. Da tacos marrones.
Cuando la dureza del tejido no coincide con la de la resina se producen desgarros al cortarse.
Mala deshidratacin: impide la infiltracin de la resina. El centro del material queda blando.

163

4.4- Errores en la infiltracin y la polimerizacin:

4.5-Protocolos tipo.
4.5.1-Lowilcryl K4M

El kit se mantiene al resguardo de la luz y no se guarda en la heladera.


Preparar la resina antes de usar en un recipiente oscuro. Mezclar suavemente para evitar la entrada de aire con una varilla el crosslinker A, el
monmero B. Agregar el catalizador C. Pre enfriar.
La resina metacrilato DISUELVE EL POLIESTIRENO de las cajitas de Petri.
Los trozos de material deben ser menores de 0.5 mm3 para poder polimerizarse.
Esquema de deshidratacin: (Lowilcryl es miscible en etanol).

Etanol
30%
50%
70%
95%
100%
100%

Temperatura
0
-20C
-35C
-35C
-35C
-35C

tiempo
30 min
60 min
60 min
60 min
60 min
60 min

TABLA 4.6

TABLA 4.7

Temperatura
-35C
-35C
-35C
-35C

tiempo
60 min
60 min
60 min
60 min

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Mezcla
Resina a etanol 1:1
Resina a etanol 2:1
Resina pura
Resina pura

164

La temperatura de 20C se puede conseguir en un congelador o bien con la mezcla de Hielo a NaCl 3:1 mantenido en la heladera.
La temperatura de cada paso est por encima del punto de congelamiento de la solucin posterior.
Infiltracin. Seguimos en el freezer.

Inclusin: se llenan las cpsulas de gelatina FRIAS hasta el tope y se cierran. Acomodar las cpsulas en la cmara de UV.
Conviene usar cpsulas de gelatina, que son ms transparentes que las Beem.
Polimerizacin:
Foto polimeriza en UV a 360 nm. La cmara debe tener una lmpara de 15 a 20 W de la muestra, porque a menor distancia los tacos se
vuelven frgiles. Se coloca a una distancia entre 15 y 30 cm (que hay que estandarizar previamente). Si hay mucha contraccin de la resina en las
paredes de las cpsulas es porque polimeriz muy rpido y hay que aumentar la distancia de la lmpara. Si es posible, que la lmpara quede por
debajo de los tacos.
Hay que invertir los tacos cada 3 o 4 das hasta la polimerizacin completa.
Los tacos son polimerizados a la misma temperatura que se us en la infiltracin, en el freezer.
Ultramicrtomo:
Usar guantes. Limpiar bien la superficie del taco.
Evitar el agua: bajar el nivel del agua del bote de la cuchilla y juntar rpido las secciones.
Cortar a baja velocidad para evitar que se astille: 2-5 mm/seg.
Usar grillas de nquel con ms de 400 # (mesh) sin film para las reacciones inmunocitoqumicas.
Conservar las grillas con los cortes y los tacos en un recipiente hermtico con slica gel.
Contraste:
Puede hacerse con uranilo y plomo, pero con tiempos ms cortos para que no se arruguen las secciones.

Idea:

Las resinas metacrilato no son compatibles con los soportes plsticos donde se cultivan las clulas. Por otro lado, las clulas de cultivo pueden
ser levantadas con tripsina, pero quedan muy alteradas. Entonces:
Cortar un cubreobjeto (10x10) en un extremo para saber dnde estn las clulas. Lavarlos bien y esterilizarlos.
Cultivar las clulas sobre ellos dentro de una caja de Petri de vidrio chica.
All mismo fijar, deshidratar en etanol, embeber en monmero de LR White.
Cubrir con el monmero de resina y dejar la caja cubierta toda la noche a 4C.

165

-Embebido plano para monocapas celulares con LR White:

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4.5.2

Fig. 4.6
Por otro lado:
Con el catalizador se hace un frotis sobre un portaobjeto e inmediatamente se colocan cpsulas de gelatina invertidas sobre l para infiltrar
el borde en catalizador.
Se llena las 2/3 partes de cada cpsula con resina (sin catalizador) cuidando de no tocar los bordes.
Poner los cubreobjetos con las clulas ya embebidas en el monmero tapando cada cpsula, con las clulas hacia abajo. El catalizador del
borde sella rpidamente la cpsula al cubre.
Luego de 30 min se invierten las cpsulas
Se polimeriza a 50C por 1-2 hs.
Con la contraccin de la resina se abollara la cpsula: hay que clavar una aguja de odontologa. Se deja 24 hs sin acelerador.
Sumergir en LN2 o enfriar a 40C para estallar el vidrio.

Fig.4.7

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166

Los tacos pueden quedar 4 meses antes de ser cortados y hacer la reaccin de inmunohistoqumica.

Otra idea:
4.5.3- Monocapas de clulas en resina epoxi.
Cultivar las clulas sobre un cubreobjeto estril. All mismo fijar, deshidratar y colocar una gota de resina sin ensuciar el reverso del cubreobjeto.
Recortar la punta de una cpsula Beem y pararla sobre la gota de resina. Dejar polimerizar en la estufa toda la noche.
Si se quiere una imagen tangencial de la mono capa, se llena la cpsula con resina y se vuelve a polimerizar. Romper el vidrio con LN2.
Si, en cambio, se quiere obtener una imagen transversal de la mono capa, slo se llena la cpsula 1 mm con resina y se procede de igual modo.
Una vez polimerizado, se retira el vidrio, se cortan con una sierra dos trocitos, se enfrentan las monocapas y se re-entacan en otra cpsula Beem.

Fig.4.8

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Estos cortes de resina sirven para orientarnos sobre el estado del material y conocer la zona que luego vemos en el TEM. Adems, por ser tan
finos, permiten sacar fotos de clulas que estn en foco en todo el campo, con mayor grado de detalle.
Las secciones se juntan con un ansa del bote.
Se reciben en una gota de agua sobre un portaobjeto.
Por debajo del porta se marca la localizacin con una fibra.
Se deja secar el porta sobre un plato caliente hasta que las secciones se adhieran al vidrio.

167

4.6- Tincin de cortes 1 m para microscopa ptica

Se agrega una gota de azul de toluidina, tambin en caliente, hasta que se forma un borde iridiscente (slo unos segundos), cuidando de no
aspirar directamente sus vapores.
Se enjuaga con agua destilada.
Los cortes as teidos se pueden ver directamente en el microscopio ptico o con un lquido de montaje y un cubreobjeto, cuidando de que
no se formen burbujas.
Los preparados deben resguardarse de la luz.

4.6.1- Para cortes de resina epoxi:

Azul de Toluidina ......................1g


Borato de sodio.........................1g
AD (cnp).............................100 ml
Tambin:
0.5 % en Na2CO3 0.1% a pH 11.1
0.25 % en borato de sodio 0.25 %

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Azul de toluidina ( tincin cortes gruesos)

168

Borato de sodio

4.6.2-Para cortes de resina metacrilato:

diluir 1:10 la suspensin usada para resinas epoxi.

Azul de Toluidina 0.05% en buffer benzoato de sodio, a pH 4,4.

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169

Buffer benzoato: cido benzoico........0.25 g


Benzoato de sodio..0.29 g
AD..........................200 ml

CAPTULO V:

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170

Ultramicrotoma

Dra. Alfonsina Morales

5.1- Introduccin a la ultramicrotoma:

Los ultramicrtomos son totalmente automticos y pueden hacer secciones de la muestra entre 40 y 1000 nm, aunque el grosor
tambin depende de la calidad de la cuchilla, la dureza del bloque de resina y de la experiencia del operador.

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Fig.5.1

171

La imagen en el microscopio electrnico de transmisin se forma por contraste de masa, es decir que los puntos de luz en la pantalla fluorescente
corresponden a los electrones del haz que lograron atravesar la muestra, los electrones transmitidos, y los puntos oscuros corresponden a los
electrones que fueron retenidos por ella.
Los electrones acelerados entre 60 y 100 kV debern atravesar una lmina muy delgada de la muestra, a lo sumo 150 nm, o sern totalmente
absorbidos.
Por otro lado, el microscopio electrnico de transmisin tiene escasa profundidad de campo (para una resolucin de 1nm es de 50 nm a 60 kV) y
con secciones ms gruesas no obtendramos imgenes en foco.
Por todo ello es necesario cortar nuestro material en lminas delgadas, de alrededor de 70 nm, con la ayuda del ultramicrtomo.

El ultramicrtomo tiene un diseo de corte similar al micrtomo de parafina de rotacin, pero mucho ms preciso y sofisticado.
Consiste fundamentalmente en un brazo oscilatorio que sostiene el taco, un soporte para la cuchilla y un sistema de iluminacin.

Cuchilla de
diamante
Brazo del ultramicrtomo que
Sostiene la muestra y avanza

fig.5.2

El avance del taco puede ser mecnico con un tornillo o por expansin trmica por dilatacin del brazo. En el ltimo caso, el avance es
continuo: si existe mayor tiempo entre 2 ciclos de corte, la seccin ser ms gruesa.

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Un sistema delicado hace avanzar el bloque sobre la cuchilla con pasos de algunos nanmetros segn el grosor de corte establecido y
describe ciclos de rotacin en el plano vertical donde al bajar el brazo, se corta el taco, y luego sufre una retraccin en el retorno para no
volver a rozar la cara posterior de la cuchilla.

172

El plano de corte se determina orientando tanto la cuchilla como el taco. La cuchilla se ajusta firmemente a su soporte, que gira sobre
la base para ubicarse paralelo al frente del taco. La base de la cuchilla tambin tiene un movimiento manual lateral y de avance hacia el
brazo del taco. La posicin final de la cuchilla se fija antes de iniciar el corte.

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Fig.5.3

173

El sistema de iluminacin consiste en una lupa binocular estereoscpica y una fuente de luz con un tubo fluorescente (luz fra que no
dilata la resina del taco) que pueden cambiar de posiciones. El ultramicrtomo tambin contiene un foco de tungsteno debajo de la
cuchilla para poder identificar las mellas y alinear la cuchilla.
El ultramicrtomo debe situarse en una habitacin donde no haya vibraciones ni cambios de temperatura para evitar dilataciones del
brazo que porta la muestra. Todos los ultramicrtomos actuales tienen un panel de control externo al aparato desde donde se controla
electrnicamente el proceso de corte: inicio de corte, grosor de la seccin, velocidad de corte, ventana de corte, iluminacin de la
muestra, etctera.
En el panel de control de los ultramicrtomos automticos se selecciona:
el grosor de corte.
la velocidad de corte: entre 0.2 y 90 mm/seg. La velocidad baja permite cortar tacos con frentes amplios y la velocidad alta sirve
para tacos muy elsticos.
La ventana de corte: es el sector del arco que describe el brazo portamuestra desde 1 mm por encima a 1 mm por debajo del
borde de la cuchilla. Es la zona donde se respeta la velocidad seleccionada. El resto del ciclo se realiza ms rpido.

Pgina

Las cuchillas empleadas para hacer secciones deben tener filos muy agudos. Las ms comnmente usadas son de un vidrio especial, que
se comercializa en barras de un grosor fijo. Con un aparato adecuado se cortan cuadrados de vidrio y luego se parten al medio, dando las
cuchillas, dos tringulos rectngulos.

174

5.2-Las cuchillas:

fig.5.4
Las barras de vidrio se deben limpiar previamente con acetona o alcohol. No conviene dejar las cuchillas de vidrio armadas sin usar.

figs.5.5 y 5.6

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175

Barra
de vidrio

Fig.5.7 Corte de los tringulos a partir de un cuadrado de vidrio

Fijar la barra de vidrio en el aparato. Seleccionar el corte cuadrado. Bajar con cuidado el brazo con la rueda de diamante hasta el
vidrio. Hacer la marca de corte. Cortar. Levantar el brazo. Liberar los sostenes de la barra. Retirar el cuadrado de vidrio y girarlo 45 en
sentido anti horario. Volver a trabarlo al equipo. Seleccionar el corte diagonal. Bajar el brazo y hacer la marca de corte. Cortar.
Levantar el brazo. Liberar los sostenes. Retirar los dos tringulos.

Luego de hacer las cuchillas las evaluamos bajo lupa vistas de frente y con la luz inferior: los ngulos deben ser rectos y el filo debe
estar libre de imperfecciones (aparece como una lnea brillante continua).

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La cara posterior debe ser lisa y sin defectos, si no, ha sido mal rotado el vidrio.

176

Hay que examinar las aristas. La inferior puede tener un zcalo, que debe ser menor de 1 mm. La superior es el filo. Vista de frente, la
cuchilla tiene una dbil lnea de fractura.

i
Figs. 5.7, 5.8 y 5.9 Se pueden usar las cuchillas malas para tallar el taco, sin el bote.
A las cuchillas buenas hay que agregarles una cubeta para retener el agua donde flotarn los cortes. Las cubetas las podemos hacer
con una cinta de 3 cm por 0,5 cm y luego lo sellamos con parafina. Hay que pegar la cinta a nivel exacto del filo. Figs. 5. 10

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La mejor calidad de cortes ultra finos se consigue con cuchillas de diamante, pero son mucho ms caras porque se fabrican con
autnticos diamantes de 3 a 5 quilates. Se usan slo para hacer cortes ultra finos. Tienen larga vida y se pueden re afilar. Estn diseadas
con una cubeta metlica incluida, pero no en el caso de las cuchillas para crio cortes. Cuchilla de diamante para crio cortes, sin bote:

177

Tambin se pueden adquirir cubetas de plsticos comerciales que se fijan al vidrio con parafina o esmalte de uas. Aunque son
descartables se los puede reutilizar lavndolos previamente para quitarles los restos de cortes pegados.

diamante

Fig.5.10
Los ngulos de las cuchillas de diamante son de 40 a 60. Los ngulos menores se usan para tacos blandos, como los de material
biolgico, y los ngulos mayores para los materiales ms duros. En general se usan de 45 , con un ngulo libre de 5.

fig. 5..11

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178

Una vez usada la cuchilla de diamante se debe limpiar el bote con un chorro de agua destilada y el filo, pasando a lo largo una barrita
de poliestireno mojada en alcohol etlico en un solo sentido.

Nunca se debe tocar su filo, especialmente con la pinza o con la grilla al juntar los cortes.
Nunca se debe parar el ultramicrtomo cuando se est cortando una seccin.
Nunca hay que tratar a estas cuchillas con solventes porque se puede disolver el cemento que une el diamante. S se puede usar
alcohol etlico al 10% en un bao ultrasonido por 30 minutos.

Fig.5.12

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179

5.3-Herramientas necesarias para ultramicrotoma:

Una jeringa para cargar el agua de la cubeta, un ansa para recolectar los cortes semifinos, palitos con un cabello pegado en la punta,
caja de grillas, caja Petri con un papel de filtro, portaobjetos y un juego de cuchillas (acero, vidrio y diamante)
5.3.1-Tipos de pinzas o bruselas:

Fig.5.13

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Las grillas o rejillas son discos circulares de 3 mm de dimetro con un enrejado de hilos (que llamamos barras) que dejan ventanas
de distinto tamao segn el mesh o malla, que es la cantidad de ventanas por pulgada cuadrada. Normalmente se usan de 200 o 300
mesh. Estas grillas sostienen los cortes de tejido y los electrones los atraviesan cuando pasan por las ventanas. Sin embargo, la porcin de
seccin que caiga sobre la barra quedar oculta.

180

5.3.2-Las grillas:

En ciertas ocasiones necesitaremos usar grillas cubiertas con un film plstico, como en el caso de elegir grillas de ventanas ms
grandes.

cuchillas nuevas de vidrio


cubetas pegadas en las cuchillas
grillas limpias con o sin film de plstico,

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Hay distintos diseos de grillas y estn fabricadas con distintos materiales. Las ms comnmente usadas son las de cobre, aunque
existen tambin de nquel, oro e incluso de nylon para hacer sobre ellas reacciones especiales, como inmunocitoqumica. En resumen,
teniendo ya listas :

181

fig.5.14

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1. Quitar el taco de su molde (Beem, gelatina, etc.)


2. Comprobar la dureza de taco al marcarlo con una ua.
3. Tallado grueso del taco manualmente.
4. Colocar el taco en el ultramicrtomo y ajustar la cuchilla de vidrio con bote.
5. Alinear la cuchilla al taco
6. Eleccin del ngulo libre de la cuchilla
7. Llenar la cubeta con agua
8. Hacer cortes semifinos, de 1 m. Recolectarlos y ponerlos en un portaobjetos.
9. Tincin con azul de toluidina.
10.Seleccionar la zona de inters en el microscopio ptico.
11.Retallar el taco manualmente con una cuchilla de acero o en el ultramicrtomo con una cuchilla mala sin cubeta
12.Colocar el taco nuevamente en el ultramicrtomo. Cambiar la cuchilla por una de vidrio buena con cubeta o la
cuchilla de diamante.
13.Alinear la cuchilla al taco
14.Llenar el bote con agua
15.Hacer los cortes ultra finos.
16.Estirar los cortes con cloroformo
17.Recolectar los cortes con la grilla flameada.
18.Dejar secar sobre papel de filtro.

182

5.4-Sintetizando el proceso

5.5-Cmo extraer el taco de su molde

Para retirar el taco de su molde, si se usaron cpsulas Beem hay que hacer una ranura con una cuchilla de acero y si se usaron
cpsulas de gelatina hay que sumergirlas en agua caliente hasta que la gelatina se disuelva.
5.6-Tallado del taco:

Antes de realizar el primer corte de una muestra, al igual que ocurra con los cortes de parafina, es necesario desbastar el bloque
(llegar hasta la muestra) y tallar una pirmide truncada.

El tallado es un paso muy preciso porque la superficie de corte o frente del taco debe ser muy pequea, de unos 0,5 mm2. Se
prefieren los frentes con forma de trapecio para que las secciones una vez cortadas y ya flotando sobre el agua del bote, formen tiras
rectas que llamamos tenias. Posicin del soporte para tallar el taco de resina manualmente:

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En general, el tallado se puede hacer manualmente con una cuchilla de acero pero tambin se suele utilizar un aparato denominado
piramitomo que lima y crea las caras de la pirmide con un dispositivo a modo de torno.

183

Fig.5.15- Desvastado

fi

Fig.5,16

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hacia un lado y se talla un lado del trapecio. Luego se gira la cuchilla 45 hacia el otro lado y se
talla el lado paralelo. Ahora se gira el taco de modo de poder tallar los otros dos lados oblicuos.

184

Tambin se puede tallar en el mismo ultramicrtomo, con cuchillas de acero en un soporte


adecuado o con cuchillas de vidrio sin la cubeta. El taco se coloca en su soporte horizontal y se
enfrenta a la cuchilla. Primero se desvasta la punta del taco. Se gira la cuchilla 45 .

fig.5. 17

Fig.5.18

fig.5.19

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185

Cuando se acumula mucha viruta de resina, se limpia el taco y la cuchilla con un pincel de pelo suave o una pera de goma.

5.6-Tipos de pirmides talladas-5.6.1-Tallado en mesa: 5.6.2-Alineacin de la cuchilla:

fig.5.20
Cuando se coloca la cuchilla en su soporte en el ultramicrtomo es conveniente alinear el filo para asegurarse que los planos son
paralelos al plano del frente del taco. Para ello, cuando iluminamos el taco con una luz inferior, aprovechamos el hecho que la banda de
luz reflejada en el frente del taco, que acta como un espejo, tiene un grosor igual a la distancia que separa la cuchilla del taco en cada
punto.

fig.5.21

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186

Cuando se aproxima el taco a la cuchilla, el grosor de su reflejo disminuye. Se debe primero rotar el taco para que los lados del
trapecio sean paralelos al filo de la cuchilla. Se corrige el foco de la lupa en cada paso. Vista desde el frente:

fig.5.22

fig.5.23

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187

Alineacin en el plano vertical: (vista desde el costado)

En el caso A est ms lejos de la cuchilla la parte superior del trapecio, por eso se vera su reflejo desde el frente as:

Figs.5.24 y5.25: Se debe girar el taco hasta que el brillo tenga el mismo grosor en toda la altura del trapecio.

corregido

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Alineacin en el plano horizontal: (vista desde arriba)

188

Fig.5.26

Fig.5.27
En este caso la cuchilla est ms lejos de la parte B del trapecio, por eso se vera su reflejo desde el frente as:

corregido- Fig. 5.29

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189

Fig.5.28: Se debe rotar la cuchilla hasta que el brillo quede parejo:

5.7-Eleccin del ngulo libre:

Los ngulos que aparecen en la escala del soporte de la cuchilla slo indican el ngulo libre de dejan paredes posteriores de las
cuchillas con la normal.
Un ngulo libre muy angosto da cortes frgiles, quebradizos y que pueden mostrar vibracin. Generalmente se usan ngulos libres
entre 1 y 5, pero los tacos blandos necesitan ngulos mayores o sufriran mucha retraccin.

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190

Se ajusta cuando la cara del bloque no est en contacto con la cuchilla.

Figs.5.31 y 5.32
Fig.5.30
5.8-Cortes semifinos (1 m)

Los cortes semifinos se tien con azul de toluidina en un medio alcalino, porque los colorantes comunes acuosos, como hematoxilina
y eosina, no pueden penetrar en el plstico..

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Los cortes semifinos que flotan en el bote quedan adheridas unas a otras formando una tira. Con la ayuda de un cabello pegado en un
palito se puede separar la tira de cortes del borde de la cuchilla.

191

Una vez alineada la cuchilla al taco, avanzamos lentamente hasta hacer una seccin delgada. Se llena el bote con agua destilada con una jeringa.
Seleccionamos la velocidad de corte, el grosor de 1 m y realizamos secciones semifinas para tener una imagen de la muestra observable al
microscopio ptico que sirven para identificar el tejido, ver su conservacin, la orientacin de la seccin (longitudinal o transversal) y tambin para
seleccionar el rea que nos interesa estudiar luego en el microscopio electrnico.
Adems, por ser cortes tan finos, permiten sacar fotos de clulas que estn en foco en todo el campo, con mayor grado de detalle.

Fig.5.34
Estos preparados as teidos se pueden decolorar con una gota de etanol 96 o colocndolos nuevamente en el plato caliente.

192

Las secciones se juntan con un ansa o una varilla de punta redonda del
bote donde estn flotando en el agua.
Se reciben en una gota de agua sobre un portaobjeto.
Por debajo del portaobjeto se marca la localizacin con una fibra.
Se deja secar el portaobjeto sobre un plato caliente varios minutos para
que las secciones se adhieran al vidrio.
Se agrega una gota de azul de toluidina sobre los cortes, tambin en el
plato caliente, hasta que se forme un borde iridiscente (slo unos
segundos), cuidando que no se seque y de no aspirar directamente sus
vapores.
Se enjuaga con agua destilada.
Los cortes as teidos se pueden ver directamente en el microscopio
ptico o con un lquido de montaje y un cubreobjeto, cuidando de que
no se formen burbujas. Al lquido de montaje no se le debe agregar xilol
para hacerlo ms fluido porque esto puede virar el color de la toluidina.
Los preparados deben resguardarse de la luz.

El azul de toluidina teir las estructuras


basfilas y adems las osmioflicas (membranas),
por lo tanto, la imagen que resulta es semejante a
la de la micrografa de TEM: el azul en el
microscopio ptico corresponde con la densidad
electrnica.

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5.9-Tincin de cortes de resina de 1 m para microscopa ptica

5.9.1- Azul de toluidina para cortes de resina epoxi:

Azul de Toluidina ......................1g


Borato de sodio.........................1g

Tambin:
0.5 % en Na2CO3 0.1% a pH 11.1
0.25 % en borato de sodio 0.25 %

AD (ccp).............................100 m

5.9.2- Colorante policromo (azul y rojo)

Una vez que se tieron los cortes con azul de toluidina como se indic anteriormente, se puede optar por teir tambin con fucsina bsica,
colocando una gota de la solucin colorante roja sobre el portaobjeto y lavando inmediatamente con agua destilada.
La solucin colorante roja se prepara antes de usar mezclando:
Un volumen de fucsina bsica 0,1% +Un volumen de borato de sodio 0.1%
La fucsina bsica 0,1% se prepara disolviendo 0.1 g de la droga seca en 100 ml de agua destilada, se disuelve a 100C y se filtra una vez fra. Dura
casi un ao a temperatura ambiente.

Buffer benzoato: cido benzoico........0.25 g


Benzoato de sodio..0.29 g
AD..........................200 ml

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Lo ms conveniente es diluir 1:10 la suspensin usada para resinas epoxi. Otra forma es teir con la solucin de Azul de Toluidina 0.05% en buffer
benzoato de sodio, a pH 4,4.

193

5.9.3-Azul de toluidina para cortes de resina metacrilato:

Fig.5.35
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194

5.10-Re tallado del taco manualmente con una cuchilla de acero o en el


ultramicrtomo con una cuchilla sin cubeta.

Una vez hechos los cortes semifinos y seleccionado el sector que nos interesa en
el microscopio ptico, debemos volver a tallar el taco con un frente mucho ms chico
para hacer los cortes ultra finos.

Colocar el taco nuevamente en el ultramicrtomo. Cambiar la cuchilla por una


de vidrio buena con cubeta o la cuchilla de diamante.
Alinear la cuchilla al taco.
Llenar la cubeta con agua.
Hacer los cortes ultra finos.

195

Fig.5.36

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Las secciones ultrafinas no se recogen sobre


portaobjetos sino directamente sobre las grillas.

5.10.1-Corte y recogida de secciones en una grilla.

Se coloca el taco retallado en el ultramicrtomo. Se elige la mejor cuchilla de vidrio con bote o la cuchilla de diamante y se alinea al
taco. Se avanza muy lentamente la cuchilla hacia el taco y se selecciona la velocidad de corte y el grosor de alrededor de 60-70 nm.

Antes de recolectar los cortes, conviene flamear las grillas para disminuir su carga esttica y aumentar la adherencia de los cortes.
Esto se consigue sosteniendo cada grilla por su borde con una pinza y pasndola rpidamente por la zona fra (azul) de la llama de un
encendedor.

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Figs. 5.37 y 5.38: Se hacen los cortes ultra finos y se obtiene la tenia que flota sobre el agua

196

Se llena la cubeta con agua hasta que la superficie aparece espejada con la luz superior. Se conecta el avance automtico.

Estirar los cortes con cloroformo


Recolectar los cortes con la grilla flameada.
Los cortes se estiran con los vapores de un solvente epoxi o cloroformo. Para eso se moja un palillo en el solvente y se pasa por
encima de los cortes, sin tocarlos.
Se recolectan del bote sumergiendo la grilla por debajo de ellos y levantndola con cuidado:

fig. 5.39

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197

Tambin se puede recolectar la tira tocando por encima con la grilla invertida y levantndola junto a una gota de agua por tensin
superficial. Las secciones de la muestra siempre se adhieren a la cara opaca de la grilla.

Fig. 5.40

Poniendo la grilla perpendicular a la superficie del agua se descarga el exceso de agua. Las grillas se dejan secar con los cortes hacia
arriba sobre un papel de filtro en una caja Petri de vidrio.
Cuando se juntan muchas secciones sobre el agua podemos retirarlas agregando ms agua en el bote hasta tener una superficie
convexa y apoyando suavemente un trocito de papel que no deje pelusa sobre ella.
5.11-Cmo se sabe el grosor del corte?

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198

Aunque los ultramicrtomos actuales tienen mecanismos de corte precisos, durante el proceso de corte se pueden obtener secciones
de distinto grosor. El grosor de una seccin ultra fina se conoce por el color que produce el reflejo de la luz sobre su superficie. Este color
puede ser gris (menos de 60 nm), plata (60 a 90 nm), oro plido (90 a 120 nm), oro intenso (120 a 150 nm), prpura (150 a 190 nm),
etctera.

Fig.5.41

Onda
incidente

Ondas
emergentes

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El color del corte se debe al fenmeno de interferencia entre las distintas ondas que surgen de su superficie por la reflexin y refraccin de la luz
incidente.
Al incidir sobre el corte de resina la luz que proviene del foco del ultramicrtomo, una parte del rayo luminoso se refleja directamente, y otra
parte se refracta hacia el interior de la resina, acercndose a la normal por pasar a un medio ms denso. Al contactar con el agua, una parte se
refracta y otra se refleja, volviendo a la superficie. Aqu, nuevamente, una parte se refleja hacia el interior del corte y otra parte se refracta, pero en
este caso alejndose de la normal por pasar de resina a aire.
A nuestros ojos llegan entonces las ondas emergentes. Al sumarse las ondas que emergen, pueden anularse por interferencia negativa, o se
obtiene una nueva onda, cuya longitud de onda determina el color final. El desfasaje de las ondas emergentes es por la distinta trayectoria de estas
ondas, que a su vez depende del grosor del corte.
Los colores se hacen ms intensos al aumentar el grosor, pasando por el azul, verde y amarillo. Las secciones con colores por encima del prpura
son demasiado gruesas para usarlas en microscopa electrnica.

199

Fig. 5.42

5.11.1- Referencias de colores:

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Como ya dijimos, el mesh o malla de la grilla (#) es el nmero de ventanas por unidad de rea. Las grillas de 200#, 300# o ms, soportan bien las
secciones de resina, pro aparecen frecuentemente las barras que interrumpen la imagen. Cuando queremos tomar fotos panormicas de cortes de
resina, se prefieren grillas de menor mesh, pero podemos perder el material. Obviamente es necesario suministrar un soporte para que la seccin no
se cuele por la cavidad. El soporte es normalmente una membrana muy fina de plstico, que debe ser lo suficientemente resistente para sostener las
secciones y lo suficientemente transparente al paso de los electrones, de modo que permita que los electrones del haz lo atraviesen sin ser
absorbidos.

200

5.12-Preparacin de grillas con film soporte

Fig.5.43
Tambin se usan grillas con film plstico para ubicar cortes seriados para hacer una reconstruccin tridimensional (se usan grillas con
un agujero), o depositar directamente sobre la grilla una suspensin de partculas (virus, organelas aisladas, etc.) o dar mayor resistencia
a las secciones de resina metacrilato o criocortes.

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Las grillas deben estar limpias y flameadas con el encendedor. Es muy importante hacer este proceso en un ambiente seco, para
que el film que se va a realizar no se agujeree y sin corrientes de aire.
Llenar un vaso de precipitado con agua destilada limpia.
Colocar una lmpara para que la luz llegue tangencialmente a la superficie del agua.
Echar una gota de la solucin de plstico suavemente hasta que se extienda la pelcula y retirarla con la pinza, para limpiar la
superficie.
Echar otra gota y observar la zona de la pelcula ms delgada (color gris por interferencia de la luz) y que no tenga arrugas. Tratar
de no respirar encima. Colocar suavemente sobre esta zona las grillas. Cuando se haya completado, poner un pedazo de papel aluminio y
retirarlo, para levantar las grillas.

201

5.12.1-Film de Parlodion o Colodion:

Dejar secar en una caja Petri con papel de filtro. Chequear bajo lupa y separar las
grillas con una pinza fina.
Chequear en el TEM que el film est limpio, fino y sin demasiados agujeros.
5.12.2-Film de Formvar:

Solucin de Formvar al 0.5%:


0.5 g Formvar y llevar a 100 ml. con cloroformo. No agitar. Dejar disolver de 2 hs a toda
la noche.
Sumergir un portaobjetos 5 segundos y dejar escurrir en un ambiente saturado de
cloroformo.
Una vez seco el film, cortar los cantos con otro portaobjetos.
Sumergir el portaobjeto en un recipiente con agua limpia lentamente con un ngulo
de 45 hasta desprender la pelcula, y que quede flotando sobre el agua. Con una luz
incidente tangencial colocar las grillas limpias con la cara brillante hacia el film. De no ser
as quedan las dos caras de la grilla brillantes y no se pueden reconocer. Recoger con una
etiqueta blanca, parafilm o papel tipo manteca. Quedar el film hacia arriba. Figs. 37 y 38

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202

fig.5.44

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203

Fig.5.45

5.13-Problemas en el corte con el ultramicrtomo:

1. las secciones quedan separadas en el agua del bote y no forman una tenialos lados del trapecio no estn paralelos entre s
el lado inferior del trapecio no es paralelo al filo de la cuchilla.
El nivel del lquido es demasiado alto.

1
5.

2. la tenia se curva hacia un lado.


los lados del trapecio no estn paralelos entre s
un lado de las secciones est comprimida, y puede ser porque en ese sector le falte filo a
la cuchilla.

4. Al pasar el bloque por la cuchilla queda una gota de agua mojando el frente. No aparecen
nuevos cortes o se hunden.
.El nivel del lquido es demasiado alto.
Hay que ir secando el frente del taco con una tira de papel de filtro, sin tocar la cuchilla.
El frente del taco es muy rugoso o tiene agujeros por burbujas que quedaron de la
polimerizacin.

7
3

204

3. Cuando pasa el bloque por la cuchilla se superpone el nuevo corte a los que estaban flotando.
El taco de la muestra est demasiado blando y pegajoso.
El filo tiene rugosidades que no permiten despegar los cortes de l
.El nivel del lquido es demasiado alto.

2
6

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5. Agujeros en las secciones.


burbujas que quedaron de la polimerizacin.
La resina plstica no infiltr bien la muestra.
Hay diferencia de dureza dentro de la muestra, por ejemplo un cristal que no fue infiltrado.
8
4

6. Aparecen ranuras y rayas verticales en los cortes, perpendiculares al filo de la cuchilla.


Defecto en el filo de la cuchilla. Hay que correrlo a otro sector.
Se ha ensuciado el filo. Retirar y limpiar la cuchilla.
7. Aparecen secciones con bandas de distintos colores perpendiculares al filo de la cuchilla.
El filo de la cuchilla no es parejo. Seleccionar otro sector de la cuchilla.

8. Colores irregulares en las secciones.


Consistencia desigual entre la muestra y la resina o entre distintas zonas de la muestra. Hay que
retallar seleccionando slo una zona homognea.
9.

Aparecen secciones con bandas de distintos colores paralelas al filo de la cuchilla.


Se producen vibraciones entre el taco y la cuchilla. Se debe revisar el ajuste de todos los tornillos
de los soportes. Puede ser que el frente del taco sea demasiado grande. Tambin se puede probar
cortar con una velocidad ms baja.

11.las pequeas mellas de la cuchilla a veces produce rayas en el corte que slo se ven en el TEM, y
que se abren como agujeros alineados cuando impacta el haz de electrones sobre ellas.

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205

10 Chatter:
Vibraciones de alta frecuencia durante
el corte, que produce bandas gruesas y
finas alternadas (oscuras y claras). Puede
ser que se observe slo al TEM

Captulo VI:

Contraste.

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206

Dra. Alfonsina Morales , Prof. Viviana Sorrivas e Ing. Mara Julia Yaez

6.1-Objetivo del contrastado de secciones:

Los tejidos biolgicos estn constituidos por elementos livianos, por lo tanto, para realizar observaciones en el TEM tradicional, la contribucin al
contraste debida a los tomos endgenos en insignificante. Los elementos qumicos que constituyen las clulas son carbn, hidrgeno, oxgeno y
nitrgeno entre los mayoritarios. De todas maneras las clulas pueden ser observadas sin contraste con metales pesados por STEM ( scanning
transmisin electron microscopy) o EELS (energy loss espectrometer).
Adems de facilitar el estudio de la ultraestructura, puede realizarse un contraste selectivo para un tipo particular de clula de un tejido u otra
organela. Histricamente se han llevado a cabo procedimientos empricos que luego por ensayos de prueba y error fueron aprobados para su
utilizacin en microscopa electrnica.
El contraste en la imagen se produce por una dispersin diferencial de los electrones que atraviesan una fina seccin de muestra incluida en
resina. Es obvio que una sustancia que se agregue a la muestra incrementar la masa o la densidad de ciertos sitios selectivamente tendr valor como
agente de contraste en el microscopio electrnico de transmisin (TEM).
La dispersin en la seccin por tomo para electrones vara a diferentes potenciales de trabajo. Como la estructura bajo estudio tiene muchos
sitios de unin para el agente de contraste, el que tenga ms masa o densidad ser el ms eficiente. Por eso los agentes de contraste de mayor
nmero atmico son mejores. Otro factor que influye en el contraste es el tamao de las aperturas.
Otra ventaja del contraste consiste en que contribuye a mejorar la resolucin y estabiliza los componentes de manera que se tornan ms
resistentes al dao por el haz.

Iones de metales pesados que reaccionan con constituyentes celulares o simplemente quedan adsorbidos. Por ejemplo:
El acetato de uranilo se combina con protenas y cidos nucleicos, el hidrxido de plomo se adsorbe selectivamente sobre el
material lipdico.

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El contraste se logra por medio de:

207

6.1.1- Cmo se logra el contraste?

Grupos orgnicos que reaccionan directamente o transportando tomos pesados


sobre compuestos de coordinacin especficos (ej.: molculas per yodadas).
Anticuerpos especficos contra una cierta estructura, ligados a un metal pesado.
Reacciones enzimticas o sustratos con tomos pesados: se produce la precipitacin del metal en el sitio de reaccin. La enzima debe estar
localizada en una estructura (no difusa). Sirven para interpretar el estado de actividad en una clula normal o patolgica. Ej.: se determinan
fosfatasas en el aparato de Golgi y en los lisosomas.

6.1.2-Condiciones que debe tener un medio de contraste:

Dar adecuado contraste.


Permitir el depsito de metales pesados por reaccin selectiva.
No producir artefactos por precipitacin o distorsin de la estructura fina.
No extraer constituyentes celulares.
No reaccionar con los fijadores.
Permitir el contraste uniforme.
Ser de aplicacin y preparacin simple.
Ser estable en condiciones normales.

El fijador: el hidrxido de plomo contrasta ms cuando el tejido ha sido fijado con tetrxido de osmio y se preservaron los fosfolpidos
que cuando se utiliza formaldehdo.
El pH: la alcalinidad favorece la precipitacin de los metales como hidrxidos.
La temperatura: modula la penetracin y reactividad del contrastante.
La concentracin y tiempo de aplicacin del agente de contraste permiten distinguir zonas ms o menos reactivas (sensibles) a
adquirir contraste.
Los inhibidores: removedores enzimticos, agentes bloqueantes o que disuelven especficamente algn componente celular.

208

Los factores que intervienen son:

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1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

6.1.3-Clasificacin de medios de contraste:

1. No selectivos: acetato de uranilo, citrato de plomo, etc.


2. Especficos para una determinada estructura:
el tetrxido de osmio en uso prolongado aumenta el contraste del aparato de Golgi y lisosomas. Una vez diferenciadas
estas estructuras, se podrn aplicar mtodos cuantitativos, como el microanlisis dispersivo de rayos x.
Adems de aumentar el contraste, dan idea de la estructura qumica de la organela.
Se han clasificado por su forma de aplicacin en:

intravital.
en bloque: durante la fijacin o el lavado, antes o durante la deshidratacin.
En cortes montados en grillas.
Negativo.

6.1.3.1- Contraste intravital.

Luego de la fijacin con tetrxido de Osmio y antes de la deshidratacin. Se realiza con U, Bi, Fe, KMnO4 (permanganato de potasio) o PTA (cido
fosfotngstico) al 1%.

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6.1.3.2-En bloque:

209

Consiste en administrar al animal, por vas naturales o artificiales (va bucal, intraperitoneal, intraocular o intravenosa) sustancias de alta
densidad electrnica, que pueden ser detectadas en los tejidos luego de asimiladas y metabolizadas. Su aplicacin est limitada a unos pocos
organismos vivos porque se necesitan dosis altas que alteran los procesos metablicos normales.

Las piezas de tejido fijadas y lavadas se sumergen en acetato de uranilo al 2% en solucin tampn o PTA
al 2% en etanol. Esta solucin de acetato de uranilo a pH =6 contiene partculas coloidales y cristales que lo
enturbian, sin importancia. Se puede lavar el tejido previamente con agua destilada (A.D) y utilizar acetato
de uranilo al 2% en agua para que no se precipite con el tampn fosfato o el de cacodilato de sodio. Se deja
12 a 24h. a 60 C ( o a 4C para mantener el DNA y ciertas organelas) , en oscuridad. As penetra 15 en
cada cara. Se debe deshidratar rpido en etanol o acetona y embeber. Este mtodo se utiliza para evitar
futuras contaminaciones. Tambin se puede aplicar para secciones gruesas para microscopa de alto voltaje. Se preservan las membranas y las
nucleoprotenas, pero pueden extraer algunos elementos, si el tiempo se prolonga. Luego de tener las secciones finas sobre la grilla se aplicar una
segunda fase de contraste con citrato de plomo.
Otra opcin es usar acetato de uranilo en bloque al 2%, 2h. a 60C en etanol absoluto despus de la deshidratacin.

6.1.3.3- Contraste de cortes finos montados en grillas:

Presenta las siguientes ventajas:


La extraccin o distorsin que produce el medio de contraste
despus de la infiltracin es mnima.
Acta ms rpido el agente contrastante.
La distribucin del contrastante es ms uniforme.
Se pueden controlar mejor los factores que intervienen en el contraste.

Nota: el fosfato de uranilo es insoluble, por lo


tanto no se puede hacer una tincin con acetato
de uranilo inmediatamente despus de haber
usado un fijador tamponado con fosfato

Pgina

Protocolo : 1.- dilucin de la muestra ( 1/1.000.000 para bacterias y virus)


2.- colocar una gota de muestra en la grilla y secar el excedente
3.- colocar sobre una gota de agente de contraste, acetato de uranilo o cido
fosfotngstico en parafilm.

210

6.1.3.4 Contraste negativo

4.- dejar actuar 3 minutos, lavar con agua destilada y secar.

Pgina

6.1.4-Materiales difciles de contrastar: tcnica.

211

Fig 6.1

Cuando un material es difcil de contrastar se puede probar con el siguiente mtodo:

1. Tratamiento previo de las secciones con solventes orgnicos: someter las grillas con los cortes a vapores de bicloruro de etileno, acetato de
amilo por 30 minutos. No se aconseja utilizar grillas con film porque se disuelve.
2. Hacer flotar las grillas con los cortes hacia abajo, en acetona o etanol por 20-30 minutos. Permite una mejor penetracin del agente
contrastante.
3. Usar agentes quelantes, tratar con acetato de uranilo, luego dejar flotar en EDTA ( 0,2M) tratar con citrato de plomo ( cuidar que no se
separen los cortes de la grilla). Estos quelantes aumentan la capacidad de contraste.
4. Utilizar los medios de contraste diluidos en alcohol.
5. Calentar el sistema grilla-gota de contrastante (acetato de uranilo) de 37C a 42C.

Nota: Para que no se contamine la muestra


con la gota que queda en la pinza, se puede secar
con un tringulo de papel de filtro o lavar con
agua bidestilada descarbonatada.

Pgina

La caja de Petri de vidrio contendr un papel de filtro embebido en solvente para evitar que precipite por evaporacin el agente de contraste.
Encima se colocar una placa de toque o cera dental o se puede utilizar una caja de Petri de plstico descartable.
Se colocan las grillas con los cortes hacia abajo, para que floten por tensin superficial sobre la gota o se pueden sumergir con los cortes hacia
arriba. Para varias grillas se usan recipientes comunes a todas ellas. No hay peligro de evaporacin como con las gotitas, pero se pueden
mezclar las grillas o sea que conviene utilizar este mtodo con grillas del mismo tratamiento.

212

Tcnica:
Todo el material debe estar escrupulosamente limpio, sin grasa.
Las soluciones de contraste se filtran o centrifugan. Se pueden guardar en jeringas hipodrmicas para evitar su contaminacin, sin aire y
con la aguja clavada en un tapn de goma. Estas contaminaciones podran interferir en la interpretacin de las imgenes.
Lavar las grillas con A.D antes de contrastarlas.
Conviene que las grillas estn hmedas hasta finalizar el contraste, bien tapadas para que la suciedad no se adhiera en ellas.

Las grillas contrastadas se dejan secar en un papel de filtro, debidamente rotulado en una caja de Petri.

6.1.5-Medios de contraste para Microscopa Electrnica de Transmisin (TEM )

Los ms usados son:

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Da un excelente contraste para trabajar a alta resolucin, pero siendo radiactivo, txico y muy foto lbil se deben tomar medidas de
seguridad extremas.
Se une a los cidos nucleicos por sus grupos fosfato y a las protenas por sus grupos aminos libres.
Reacciona especficamente con los cidos nucleicos en clulas ya fijadas a pH= 3,5 y concentracin de 1.10 -5 M de acetato de uranilo. Al
aumentar el pH o la concentracin, aumenta su reactividad, pero disminuye su selectividad.
El acetato de uranilo puede unirse a varias protenas, como histonas, riboncleo-protenas, fibras colgenas y fosfoprotenas (por eso
contrasta las membranas).
Ocurre una reaccin diferencial de las ribo-ncleo-protenas en tejidos fijados con glutaraldehdo, tratados con EDTA ( cido
etilendiaminotetraactico ) como quelante y luego contrastados con plomo, porque el EDTA destie o lava el DNA. Para una
contrastacin comn el acetato de uranilo es ms efectivo que el cido fosfotngstico, pero menos que el citrato de plomo.
La solucin ms usada es la saturada en etanol 50-70% (solubilidad de acetato de uranilo en etanol 50%=5% a 15 , porque tiene mayor
penetracin en 15-30 a temperatura ambiente.
Las otras soluciones necesitan mayor tiempo (con mayor probabilidad de contaminacin) y son ms fotolbiles.
En etanol 50% -70% es ms vigoroso que el absoluto. Para evitar la evaporacin conviene la tcnica de los recipientes comunes a varias grillas.
La solucin que tiene mayor solubilidad en agua destilada es el acetato de Magnesio y Uranilo que es muy estable (se mantiene varios meses
en oscuridad a temperatura ambiente. Se usan al 7,5% en agua, 3h a 40 C (el acetato de uranilo es soluble en agua hasta 7,7% a 15 C).
Cuando el acetato de uranilo se utiliza en bloque tambin tiene efecto fijador:

213

6.1.5.1-Acetato de Uranilo: U: PM=238

Preserva la estructura del DNA, membranas y uniones celulares, mitocondrias, miofibrillas y pared de las clulas vegetales, pero utilizado un
mayor tiempo puede extraer fosfolpidos y protenas durante la deshidratacin posterior con etanol.

6.1.5.2-Soluciones de plomo: (Pb=PM 207)

Si el tejido fue fijado solo con aldehdos no habr reaccin con las membranas. Slo se contrastan cuando han sido fijadas con
tetrxido de Osmio, o sea que es necesaria la reduccin a dixido de osmio OS O2 para que el plomo reaccione con los grupos
polares de fosfolpidos. El OS O4 reacciona con los grupos no saturados de los lpidos, rompiendo enlaces dister y dando grupos
polares acdicos que reaccionan con el OS O2. Estos sitios son muy reactivos con compuestos positivos como los cationes de plomo.

Al glucgeno le da aspecto de grnulos por reaccin de los iones de plomo con grupos hidroxilos (efecto quelante) y luego se
acumulan hidrxidos de plomo sobre el quelato (el OS O4 no contrasta el glucgeno). Tambin reacciona con carbohidratos y
protenas.
No extrae componentes celulares y da buen contraste en la segunda tincin. En contacto con CO 2 produce carbonato de plomo
insoluble, por eso se utiliza agua hervida descarbonatada por lo menos por 10. Se centrifuga a 6000 rpm. por15 o se filtra con
millipore un gran volumen y se descarta la primera porcin del filtrado antes de usar estas soluciones.

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Es una contrastacin aninica con alto grado de unin al hidrgeno.


Sirve para estudiar fibras proteicas. Su desventaja es que el taco de resina es ms difcil de seccionar y puede producir explosiones si se utiliza
xido de propileno en la infiltracin, porque el PTA cataliza la reaccin entre el etanol que se utiliza en la deshidratacin y el xido de propileno.

214

6.1.5.3 Acido fosfotngstico (PTA) (H 3 PO4.12 WO3.24H2O)

Tambin puede utilizarse en bloque y para ver vesculas sinpticas, al 1% en etanol (1h.), luego de fijar el contenido en glutaraldehdo, sin OS
O4 .
Tanto en solucin etanlica como acuosa, es selectivo al colgeno y elastina cuando se usa luego del OS O4 .Se usa ms en soluciones
alcohlicas porque las acuosas distorsionan el tejido. Se puede distinguir la estructura macromolecular de las membranas.
El PTA reacciona con los grupos hidroxilos. Su especificidad es relativa a su pH, siendo ms efectiva a pH cido (1-3).
Los grupos fosfricos del PTA reaccionan con grupos de carga positiva como las protenas de membrana. Tambin reacciona con glucgeno,
aminocidos bsicos como lisina, arginina e histonas.
En Bloque:

Protocolo:
1. La grilla con las secciones ya montadas se colocan en una gota del contrastante.
2. Por 15 a 45 minutos.
3. Se lava a grilla con golpes suaves en agua destilada filtrada y se coloca en un
papel de filtro.
4. Sin dejar secar se traspasa la grilla a una gota de citrato de plomo ( ph 12) .
preparar cmara libre de anhdrido carbnico colocando en una cpsula de Petri
un papel de filtro embebido en Na OH 1N y con algunos pellets de OH Na
dispersos en la cpsula.
5. El tiempo ser de 1 minuto a 20.
6. Si precipita el citrato de plomo, se puede extraer el precipitado sumergiendo las
grillas en cido actico 10 % por 1 minuto.

El PTA no reacciona con las resinas


polimerizadas. Contrasta intensamente la matriz mitocondrial, retculo endoplsmico rugoso, miofibrillas y bandas Z del msculo. El glucgeno,

215

Secciones:

-Doble contraste con Acetato de uranilo y citrato de plomo

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Fijacin con Glutaraldehdo.


Deshidratacin con etanol
absoluto (este tratamiento previo
hace ms efectiva la
contrastacin).
PTA 2% en etanol absoluto durante
h-1h. con agitacin.
Lavado del etanol para evitar la
explosin con xido de propileno.
Lavado con oxido de propileno
rpido a 4C.
Lavado con etanol, no ms de 1.
Lavado con hidrxido de sodio en
xido de propileno, 2 veces de 510. ( no fijar con OS O4 , porque
enmascara la fijacin).
Infiltracin en resina epoxi.

las gotas de lpidos y las dems estructuras de membrana no se contrastan. Dejar las secciones en cido fosfotngstico (PTA) 1% en etanol 10%
por 15 a 30 min

6.1.5.4-Permanganato de potasio: KMnO4 : (Mn=55)

Es un fuerte oxidante. Es fijador y medio de contraste al 3% en tampn veronal acetato (pH=7,4) 2 h. a temperatura ambiente. Contrasta las
membranas y los lisosomas, pero es malo para observar ncleo y estructuras citoplasmticas. Se utiliza para visualizar vesculas sinpticas densas
de las terminaciones nerviosas adrenrgicas.
El material fijado con OsO4 y contrastado con KMnO4 muestra los tonofilamentos, vaina de mielina, membranas basales, glucgeno,
desmosomas y citomembranas. En vegetales es comn su uso.
Se aplica en grillas o en bloque:

a.) en bloque: el tejido es fijado con OsO4 y ya deshidratado con acetona, se trata con el KMnO4 al 1% en acetona
absoluta por 10 min. El bloque se lava con agente reductor como una solucin de metacrilato con acetona ( 2 gotas de
metacrilato en 25 ml. de acetona) durante 5 -10 min para quitar el exceso de permanganato de potasio.

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No hay que filtrar el contrastante porque aumenta la oxidacin y precipitacin.


(Se toma con una pipeta desde el centro del frasco).
El triple contraste: produce una gran dispersin de electrones por alteracin de las protenas cuando el KMnO4 reacciona con el acetato de
uranilo y el citrato de plomo.
Las grillas previamente mojadas con agua destilada se dejan en KMnO4 0,9% en tampn fosfato 0,1M a pH=6,5 y se lavan en el tampn
inmediatamente. Luego se enjuagan con etanol 50% y se contrastan con acetato de uranilo y citrato de plomo.

216

b.) en secciones: se usa KMnO4 1% en solucin acuosa.

6.1.5.5-Rojo de Rutenio :

Es un compuesto inorgnico, cuya frmula emprica es:

Ru2 (OH) 2 Cl 4 .7NH3. 3H2 O y su PM= 551,3.


Se utiliza para contrastar glicoclix ( polisacridos extracelulares) de clulas de alvolos pulmonares, microvellosidades
intestinales, o pared celular de vegetales.
Si se hacen cortes semifinos para M.O se ven depsitos marrones extracelulares.
El rojo de rutenio contrasta en bloque, mezclndolo con las soluciones fijadoras, con 1500-3000ppm ( VER APNDICE DE RECETAS)

mtodo
Flotacin
de
las

solucin
*Et(OH) 50%
Me(OH) 25%
*Acetato de Mg
y U 7,5% AD

tiempo
15-30
15
3h.

T
Amb
Amb
40

pH
3,5
4,8
-

lavado
*ET(OH) 50% y AD
*AD
*AD

caractersticas
* Fotolbil
*radiactivo
*Txico
*Usar pizas de acero
inox.
*el Me(OH) disuelve

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Acetato
de uranio

contraste
*DNA NRA
(pH 3.5)
*Fibras
colgeno.
*Todas
protenas.

217

Luego de la deshidratacin se embebe el tejido rpidamente. No debe usarse EPON 812 o el endurecedor NMA ( anhdrido metil
ndico) Se utiliza agua destilada hervida y se evita el contacto con vidrio.
Formacin y remocin de precipitados formados por soluciones de contraste en cortes ultrafinos . ver apndice

el formvar y es
txico.
*El pp se lava con
CH3COOH 2% o
CH3COOU 10% de 1
a 5 .

KMnO4

Plomo

Bloque

*2% ET(OH)
100% (despus
de la
deshidratacin)

*Membrana basal
*Tonofibrillas
*Glucgeno
*Barrera Terminal
*Desmosoma
*Vesculas
Sinpticas

*Flotacin

*0.1-1% en AD 15- 2h.


descarbonatada.
Sin filtrar

*bloque

*1% en acetona
100% ( despus
de dehidratar)

*DNA y RNA
5-10, 0C
*Desmosomas

Flotacin

*Pb (OH) 2

* 2h.

* AD o Buffer

* La solucin buffer
queda turbia conviene
lavar el buffer con AD.
y usar AU en AD.

*Et(OH) 100%

6,5

amb 1.-AD
2.-cido ctrico
30,3-AD

10

am

Metacrilato en
acetona

mayor

amb

* Puede extraer
lpidos.
* Acta como fijador
de
Protenas y DNA.
* Fuerte oxidante
deja cortes sensibles
al bombardeo de
electrones
*pp: AD hervida

218

2% buffer pH=6 12-24


-60C
o AD ( antes de horas en -4C
la
oscuridad para
deshidratacin)
DNA

12+- 1-Na 0.02N


0.1 2-AD
descarbonatada

*txico
Forma PBCO3
*Acta previo

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Bloque

Os O4

*1% AD

1.-En GA/Buffer
2.-En OS O4
/buffer
1mg/ml

De
fijacin

De
fijacin

*Buffer

*En cortes gruesos.


Tambin produce
contraste.
*No usar buffer
fosfato.
*Admite triple
contraste con U y
Pb.
*Evitar el contacto
con el vidrio.
*Evitar el
endurecedor NMA.

CONTRASTANTE DNA MEMBRANA AP


- RNA NUCLEAR Y
GPOLGI
REG
Y REL
+
+
+

MEMBRANA
MITOCONDRIAS LPIDOS
PLASMSTICA
Y DERIVADOS
+
+
++

POLISACRIDOS PROT.

Pb(OH)2

++

++

++

++

++

++

++

+++

219

FIJADOR

tratamiento con OS
O4
*
No
extrae
elementos celulares.

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Rojo
Rutenio

*Glucgeno
* Membrana
Basal
*Ribosomas
*Queratina
*Glicoclix
Flotacin
*Microvellosidades
* Pared clulas
vegetales
Bloque

Citrato de Pb

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

+++

PTA

++

+++

UO2

+++

++

++

++

++

+++

Pb(OH)2

++

++

++

++

Citrato de Pb

++

+++

++

++

++

PTA

++

++

++

++

++

++

UO2

++

+++

++

++

++

Pgina

Notas:
DNA Y RNA en muchas clulas estn asociados a protenas y la coloracin puede deberse a ellas.

Cuando se ha fijado con formaldehdo las membranas no se contrastan. En el retculo endoplasmtico rugoso se observan lmites

debido a los ribosomas.


Se puede ver la membrana plasmtica, las vesculas pinocticas, vacuolas fagocticas, etc. con tincin con cido fosfotngstico si antes

del contraste se quita el OsO4 con H2O2 al 2%.


En un material fijado con formaldehdo, al contrastarlo, aparece una imagen negativa de las mitocondrias, ya que se contrast su matriz

pero no las membranas.


Los lpidos son a veces extrados en la fijacin con formaldehdo, dejando vacas las vacuolas. Las grasas naturales se pueden perder

luego de la fijacin con Os O4 y luego no se contrastan.


El glucgeno es fuertemente contrastado por el plomo. Las cubiertas superficiales se tien porque contiene protenas y polisacridos.

220

Formaldehdo

Los derivados de la membrana plasmtica son: vacuolas fagocticas y pinocticas, microvellosidades, etc.

Referencia: Mercer, EH.1963 a cheme for section staining in electrn microscopy J.Roy. Micros.Soc.81:179-182

6.1.5.6-Contraste de polmeros

Pgina

221

Como ocurre con los materiales biolgicos, el contraste de polmeros en el TEM es dbil debido a los elementos de bajo nmero
atmico que los componen, y que producen escasa dispersin de electrones (scattering electrnico). Esto constituye un factor limitante en la
observacin de este tipo de materiales.
La tcnica de teido permite mejorar el contraste mediante la incorporacin de tomos pesados que reaccionan selectivamente con
ciertas caractersticas estructurales de la muestra. Esto produce un alto scattering electrnico local que realza el contraste.
.
La mayora del teido de polmeros es por contraste positivo. En este tipo de contraste, la regin de inters es teida (oscura) por una
interaccin qumica en la cual el agente contrastante penetra en las algunas regiones debido a una mayor velocidad de difusin.
El contraste negativo, es empleado en algunos materiales como por ejemplo emulsiones en los cuales las partculas se encuentran en un sustrato.
En este caso, el teido se efecta en las zonas circundantes de las partculas revelando la forma de las mismas.
En los polmeros el agente de contraste a utilizar depender del tipo de polmero y las condiciones ptimas de teido que en muchos casos se
deben obtener experimentalmente.
En la tabla I se presentan los agentes de contraste para los distintos grupos funcionales de polmeros.

Tabla I

cidos

Hidracina y despus tetrxido de osmio

Alcoholes

Tetrxido de rutenio

Amidas

Acido fosfotngstico

Aminas

Tetrxido de rutenio

Aromticos

Tetrxido de rutenio

steres

Hidracina y despus tetrxido de osmio

teres

Tetrxido de rutenio

Hidrocarburos no saturados

Tetrxido de osmio

Hidrocarburos saturados

Tetrxido de rutenio
cido clorosulfnico
cido fosfotngstico

Polisteres

cido fosfotngstico

Resinas epoxi

Tetrxido de rutenio

El teido se puede efectuar antes o despus del seccionamiento. Cuando se realiza antes, la muestra cortada en pequeos bloques (1-3mm
espesor) es colocada en la solucin o en el vapor del agente contrastante. Si el teido se hace despus del seccionamiento, los cortes
depositados sobre la grilla se colocan en contacto sobre una gota del contrastante.
Referencia:
Polymer Microscopy . Sawyer, L., Grubb, D. Chapman & Hall Publ., 2nd. Ed. (1996).

222

Agente contrastante

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Polmero

6.1.5.7- Tetrxido de Osmio

Polmeros multifase conteniendo fase goma no saturada es uno de los grupos de polmeros ms estudiados por microscopia electrnica de
transmisin. El tetrxido de Osmio (OsO4) ha sido ampliamente utilizado como agente de contraste para este tipo de material.

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La reaccin fija y tie el polmero. La fijacin es un entrecruzamiento qumico de la fase goma que produce endurecimiento e incremento de la
densidad en esa zona. Este efecto es ventajoso en particular para aquellos polmeros que se deforman al seccionarlos a temperatura ambiente, tales
como elastmeros con fase goma, resinas ABS y HIPS.
Es importante destacar que los tiempos de teido dependen del espesor y forma del espcimen, de la temperatura y el grado de insaturacin.

223

El OsO4 reacciona qumicamente con los dobles enlaces de las fases no saturadas produciendo un excelente contraste. Esto es debido a un
incremento del scattering electrnico generado por la presencia de los tomos de Osmio en la fase no saturada comparado con la matriz que no
reacciona con el agente de tincin.

Mtodo:
El OsO4 es voltil y txico, por lo que deben seguirse las normas de seguridad sugeridas para este tipo de compuesto. El procedimiento debe
realizarse bajo campana, con guantes, antiparras y guardapolvo.
El OsO4 se vende en pequeas ampollas de 0.5g.
1- Se forma una solucin al 2% disolviendo la ampolla en agua.
2-El espcimen (bloque) se sumerge en frasco hermticamente cerrado conteniendo la solucin.
3- Se deja 1 semana aproximadamente.
4- Se retira cuidadosamente del frasco y se hacen lavados sucesivos en agua bidestilada.
5- La solucin de OsO4 usada se neutraliza con aceite y se guarda en frasco hermticamente cerrado en un lugar apartado.

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6.1.5.8-Tetrxido de Rutenio

224

En el caso de haber seccionado el material previamente al teido, se coloca una gota de solucin de OsO4 al 2% en contacto con las secciones
del espcimen montado sobre la grilla. El tiempo de teido puede variar entre 1-3 h.
Tambin pueden usarse los vapores de la solucin de OsO4 al 2%. Para esto se siguen los mismos pasos enunciados anteriormente. En
general, los tiempos de teido son mayores a los empleados con la solucin lquida.
Un procedimiento similar puede realizarse para el teido de suspensiones diluidas de partculas ltex . En este caso, el tiempo de teido
estimativo es de 30 min para el teido en solucin liquida.

El tetrxido de Rutenio (RuO4) es un agente oxidante ms fuerte que el OsO4. Este agente oxida los anillos aromticos produciendo cidos
mono o dicarboxlicos. En la bibliografa se encuentran reportadas distintas aplicaciones de teido con RuO4 para alcoholes, aromticos y aminas. En
algunos polmeros, como resinas ABS se utiliza la combinacin de RuO4 con OsO4 para revelar detalles estructurales.
Las reaccin qumica que ocurre durante el teido con este agente contrastante se muestra en la fig:

Mtodo :
Las soluciones de RuO4 son poco estables por lo que es necesario trabajar con soluciones frescas. Existen dos formas de obtener soluciones
de RuO4. Una de ellas es a partir de la oxidacin de Dixido de Rutenio (RuO2) hidratado usando Periodato de Sodio. La reaccin se completa a las 3-4
h. Sin embargo esta reaccin es muy inestable. Por esta razn, se suele utilizar una solucin al 2% de RuO4 a partir de la reaccin de Tricloruro de
Rutenio (RuCl3) hidratado e Hipoclororito de Sodio (NaClO). El teido se realiza con los vapores del RuO4 resultante.
El RuO4 es voltil y muy txico, por lo que deben seguirse las normas de seguridad sugeridas para este tipo de compuesto. El procedimiento

234567-

Se colocan, en un recipiente de vidrio (de 10 ml), 0.02g de RuCl3 y las grillas conteniendo los especmenes a contrastar. Los
bordes de las mismas se sujetan a un vidrio portaobjetos con una cinta doble faz.
Se cierra el envase. Es importante que el recipiente pueda cerrarse hermticamente y permita la entrada de lquido mediante una
jeringa.
Se inyecta 1ml de (NaClO) y se retira la jeringa. Se formar una solucin color marrn.
Se deja actuar durante 1.0 h. Este tiempo puede variar de acuerdo al tipo de polmero que se desee contrastar.
Se abre con cuidado el recipiente, se retiran los especmenes y se vuelve a cerrar.
Se neutraliza la solucin de RuO4 con una solucin acuosa de Sulfato de Sodio (NaSO4) al 10 % w/w. Se deja en la misma 1
semana. Posteriormente se lava con agua destilada. El agua de lavado se coloca en bidones destinados a residuos de este tipo.
Todos los elementos descartables utilizados se guardan como residuo en un recipiente cerrado y se coloca en un rea especfica
para residuos txicos.

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1-

225

Debe realizarse bajo campana, con los elementos de seguridad necesarios (guantes, antiparras, guardapolvo, mscara).

6.1.5.9-cido clorosulfnico

Este agente contrastante ha sido ampliamente usado para el mejoramiento de contraste en muestras de polietileno (PE), el cual es inestable
frente al haz de electrones debido al dao por radiacin que sufre. Para poliolefinas cristalinas, en general, la reaccin del cido Clorosulfnico con el
PE produce entrecruzamientos, estabiliza y tie el material facilitando de esta forma el seccionamiento y la estabilidad durante la observacin.
El acido clorosulfnico difunde selectivamente en las regiones amorfas en polmeros semicristalinos, incrementando la densidad en dichas
regiones y creando un contraste adicional que permite diferenciar estas regiones del resto del material.
El mtodo, tie las lamelas debido a la incorporacin de cloro (Cl) y azufre (S). El tratamiento con solucin salina resulta en una reaccin con
grupos polares e iones metlicos se depositan e incrementan la densidad electrnica. Asimismo un tratamiento posterior con Acetato de Uranilo
intensifica y estabiliza el contraste.
Mtodo:
El teido de PE con cido Clorosulfnico tiene como procedimiento general el siguiente:
1- Se coloca la muestra en cido Clorosulfnico a 60 C durante 6-9 h.
2- La muestra teida, se lava en acido sulfrico concentrado y posteriormente en agua.
3- Se seca y embebe la muestra en resina epoxi.
4- Se realizan cortes ultradelados con cuchilla de diamante.
5- Se colocan las secciones en solucin acuosa de acetato de uranilo al 0.7 %. durante 3 h.

El Acido Fosfotngstico (PTA) es un agente contrastante aninico con alto peso molecular que produce una alta densidad al material teido.
No se encuentra bien determinada la forma de interaccin de este agente con el material orgnico. Existen dos interpretaciones: una es la

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226

6.1.5.10-cido Fosfotngstico

precipitacin inica y la otra es la formacin de un complejo en solucin acuosa. Sin embargo, en ambos casos la especificidad del teido est
relacionada al pH de la solucin.
El PTA (solucin al 2%) reacciona con grupos funcionales como hidrxidos, carbxidos, y aminas como un agente contrastante positivo. Se han
reportado en la literatura aplicaciones de este agente contrastante en ltex y nylon 6.

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Para entender y apreciar una micrografa electrnica es esencial familiarizarse con la fsica de la produccin de la imagen. Para comenzar se
debe aclarar que las fotografas tomadas con electrones son en blanco y negro (niveles de grises) y en Microscopa ptica obtenemos imgenes en
colores y tambin en blanco y negro. La diferencia fundamental de la formacin de la imagen entre los dos sistemas es la manera en la cual los
fotones de la luz visible y los electrones interactan con la materia orgnica. Una fotomicrografa resulta de la interaccin de fotones con grupos
especficos qumicos en la muestra, en contraste, una micrografa electrnica deriva de interacciones no especficas entre electrones y tomos en
vez de molculas. En el microscopio de luz, un fotn es absorbido por un cromforo (grupo qumico especfico) o pasa inalterado a travs de la
muestra. En el microscopio electrnico el electrn interacta con la muestra elstica o inelsticamente. (Ver captulo II). Un electrn dispersado
pasa muy cerca del ncleo de un tomo y no pierde energa. Es reflejado por atraccin electrosttica, su paso es desviado por un ngulo mayor a
medio grado, suficiente para no pasar por la apertura de objetivo. La dispersin inelstica ocurre a travs de la interaccin con un electrn del
orbital de la muestra. La prdida de energa es alrededor de 20 40 eV y la desviacin es menor a medio grado. Entonces estos electrones
atraviesan la columna, tienen diferente foco porque han perdido energa. Los que realmente contribuyen al contraste son los que fueron
desviados sin prdida de energa.
Cuanto ms lento va el electrn y ms cargada la molcula, el electrn ser desviado en un ngulo ms grande, suficiente para no pasar por la
apertura de objetivo, contribuyendo as al contraste. Esto se hace muy claro cuando uno disminuye el potencial para obtener ms contraste.
Tambin los elementos pesados como el Osmio que poseen alto nmero atmico y mucha carga nuclear producen ms contraste que las
muestras con elementos livianos que constituyen la totalidad de los especmenes. Esta es la razn por la cual los colorantes orgnicos que han
contribuido al conocimiento celular en la Microscopa ptica no sirven en Microscopa Electrnica.
En el caso de bajar el potencial para mejorar el contraste, las desventajas son que como los electrones de baja energa tienen menores
longitudes de onda, se afecta la resolucin y la aberracin cromtica. Por otro lado si se utilizan pequeas aperturas que sacarn ms electrones
perifricos aumentar el contraste. (La relacin ruido-seal se incrementar) La desventaja es que aumentar el astigmatismo.

227

6.2-Contraste de la imagen

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El contraste de la imagen en TEM se debe a la dispersin sufrida por los electrones cuando interactan con la muestra.
Cuando el haz de electrones pasa a travs de una muestra, interacta con el ncleo del tomo o con los electrones de las capas externas,
pero la primera es ms importante. Estos electrones se dispersan cuando se aproximan al ncleo atmico cargado positivamente. Los electrones
dispersados siguen una trayectoria hiperblica alrededor del ncleo como un punto focal. Electrones de una velocidad dada que pasan a una
distancia dada del ncleo sern ms reflectados por un ncleo cuya carga positiva es alta (alto nmero atmico). Entonces: el contraste de la
imagen a un dado potencial y determinado tamao de apertura es proporcional al nmero atmico. La medida del ncleo atmico est
directamente relacionada con el nmero atmico y con la densidad. Consecuentemente cuando mayor es la densidad del espcimen, mayor ser
la dispersin de electrones.
Bajo nmero atmico en la muestra causa dispersin inelstica, acompaada por aberracin cromtica. Este efecto tiene como consecuencia
una imagen sin bordes definidos con menos contraste y menos resolucin. Se puede solucionar utilizando elementos pesados como Osmio.
Otro factor que influencia el grado de dispersin es el grosor de la muestra. Esto ocurre ya que al pasar los electrones se encuentran con ms
material de la muestra produciendo ms dispersiones. Pero hay que tener en cuenta que el contraste se deber al producto de la densidad del
espcimen con el grosor. Lo que se denomina contraste de masa por grosor (mass thickness) del espcimen. Como los especmenes biolgicos
tienen una densidad menor que 1, si queremos observarlos sin contraste deben tener un espesor de 10nm aproximadamente. (secciones
doradas). Hay un nmero fijo de sitios de unin en los tejidos que depende de la densidad de la muestra y del espesor de la seccin. La eficiencia
de un agente contrastante ser determinada por la masa del contrastante agregado al sustrato biolgico. Los agentes de mayor masa son ms
eficientes como contrastantes para microscopa electrnica. Estas son las razones por las cuales se usan metales pesados.
El pH de la solucin es otro tema muy importante que tiene que ver con el grado de incremento del contraste del tejido. Se conoce que sales
de metales pesados se hidrolizan a niveles de pH incrementados y forman iones polinucleares. (Son agregaciones de iones que se forman cuando
pierden protones durante la hidrlisis). Estos iones precipitan como hidrxidos lo que lleva a incrementar el contraste.
Las variaciones en el contraste de diferentes zonas de la muestra pueden deberse tambin a prdida diferencial de partes del tejido y del
medio de inclusin durante la exposicin al haz de electrones. Ambos tipos de prdidas incrementan el contraste. Algunos elementos celulares
son ms resistentes a la radiacin que otros. (ADN y algunas protenas)

228

6.2.1-Factores que afectan el contraste:

Variando el pH de la
solucin, (PTA). Cuando se
usa a pH 2.0, muestra
afinidad por polisacridos,
mientras que a pH 3.0-3.5 la
muestra con protenas y
nucleoprotenas

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Tiene que ver con la velocidad de absorcin de los iones de metal, las alteraciones de las soluciones de contraste y la posible extraccin de
elementos celulares.

229

.2.3-Tiempo de accin y penetracin del agente contrastante.

La gran profundidad de campo del microscopio de transmisin hace que se pueda enfocar las estructuras celulares en todos niveles de la
seccin al mismo tiempo. La profundidad de foco de un TEM de 0.6 nm de resolucin es 400nm. Permite focalizar enteramente una seccin de
80nm.
La penetracin del agente de contraste no es uniforme, ni completa. El medio de inclusin es uno de los mayores obstculos en la penetracin
del contrastante ya que la mayora de las resinas son no polares, mientras que los agentes de contraste son polares o inicos.
El citrato de plomo penetra en la resina de inclusin mucho ms rpido que el cido fosfotngstico (PTA) o el acetato de uranilo. La
penetracin del PTA est limitada a 100nm desde la superficie de la seccin.

6.2.4-Especificidad del contrastante.

Probablemente la especificidad del contraste sea una de las tcnicas ms importantes para la determinacin de la composicin qumica
de las estructuras celulares. La mayora de los contrastantes conocidos son multipropsito, por lo que no son muy especficos. Aunque se
ha reportado (Monneron y Bernhard, 1969) que se puede diferenciar entre RNA y DNA usando acetato de uranilo en condiciones muy
especiales.

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230

La especificidad del contrastante se puede demostrar utilizando muy bajas concentraciones, generalmente se
utilizan las soluciones saturadas. Otro mtodo es controlando estrictamente los tiempos de contraste. En este
caso el vehculo en que es disuelto el contrastante tambin es importante.

6.2.5-Factores que afectan al acetato de uranilo

Contaminacin debida a la fijacin:


Una de las causas de que aparezcan finos
precipitados en la seccin del preparado es que el
tejido haya sido mal lavado antes de la segunda
fijacin con tetrxido de osmio o tambin puede
deberse a la presencia de tetrxido de osmio que
pas a dixido. Este artefacto puede reducirse
sometiendo la seccin a cido peridico 1% o H2O2

Con respecto al PH: Los grupos fosfato y carboxilo se unen a los iones
de acetato de uranilo, se debe tener en cuenta que depende del pH de la
solucin ya que a pH 3,5 la unin con el DNA es muy fuerte y especfica. A
pH de 4 o 5 se une a grupos fosfato y carboxilo mientras que a valores
menores que 4 se une a grupos fosfato.
Con soluciones tampn: Cuando se realiza un contraste con acetato de
uranilo antes de la infiltracin ( en bloque) conviene lavar muy bien el tejido
con acetona o alcohol diluido ya que el acetato de uranilo precipita con los
tampones tradicionales como fosfato y cacodilato de sodio haciendo
precipitar sus sales. Se ha comprobado que utilizando esta tcnica se
incrementa el contraste adems de estabilizar la estructura fina.

al 3% por 5 a 10 minutos.

6.2.6-Contaminacin de las secciones

aceite, partculas del agua de lavado, precipitados de los contrastantes, etc

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La seccin se ve sucia, con partculas que pueden provenir de

231

Contaminacin superficial:

Contaminacin por los agentes de contraste. Generalmente el acetato de uranilo no precipita (slo si
se expone a la luz directa)
Un prolongado contraste de ms de 10 minutos con citrato de plomo provoca precipitados de carbonato
de plomo electrodensos y esfricos. Para extraerlos se expone la grilla contaminada a acetato de uranilo
acuoso por 7 minutos o con cido actico acuoso al 10% por 1 minuto. (puede daar las secciones). Esta
ltima es efectiva para quitar otros contrastantes precipitados. Hay que volver a contrastar. Si se contrasta
con citrato de plomo y no se lav bien el acetato de uranilo, se ven unos precipitados con forma de agujas
que son insolubles en agua. Pueden disolverse con0.5% de cido oxlico, 10% de cido actico por 1 minuto
o mejor an, aplicar una solucin alcohlica de acetato de uranilo por un minuto. Se puede prevenir
utilizando EDTA al 1% antes de contrastar.

Precauciones necesarias para no tener contaminacin:

3. Usar pellets nuevos de OH Na en la caja de contraste de Citrato de plomo.

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2. Utilizar envases de plstico para las soluciones de citrato de plomo.

232

1. Descartar soluciones de citrato de plomo si se ven opacas o con cristales (pueden centrifugarse).

Captulo VII:

Inmunolocalizacin

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233

Dra. Alfonsina Morales

7.- inmunolocalizacin

Se usa esta tcnica para identificar el sitio donde se encuentra determinada molcula, con ayuda de anticuerpos marcados con una partcula
electrodensa, como el oro.

Puede usarse peroxidasa o ferritina, pero en estudios cualitativos, porque dan una marca menos definida.
Cuando se utiliza peroxidasa, hay que poner cuidado en anular con H2O2 la peroxidasa endgena y los perxidos dejados por la
fijacin con aldehdos.

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7.1.1-Antes de la fijacin:
Se hace la inmunolocalizacin e inmediatamente debe fijarse la muestra y continuar con la tcnica convencional. Sirve para localizar antgenos
superficiales de clulas aisladas. Es muy caro para trozos de tejidos porque consume mucho anticuerpo. Su ventaja es que se obtienen imgenes con
el mejor contraste.
7.1.2-Luego de la fijacin y antes de la infiltracin en resina:
Con una fijacin suave. Se puede permeabilizar luego la membrana plasmtica de las clulas para permitir el ingreso de anticuerpos al interior y
detectar antgenos internos. Se contina con la tcnica convencional. Slo para clulas aisladas. Se altera la estructura de las membranas.
7.1.3-Luego de la fijacin y polimerizacin en una resina epoxi:
Con una fijacin suave. Luego de la polimerizacin se carcome (etching) la resina de las secciones ultrafinas con KOH o H2O2 al 2% por 15 min. La
desventaja es que el oro pega inespecficamente sobre las resinas hidrofbicas y disminuye el marcado (hay que concentrar ms el oro). Sirve para
secreciones y productos del Golgi, que toleran la temperatura.
7.1.4-Luego de la fijacin y polimerizacin en una resina hidroflica:
Con una fijacin suave. Se incluye la muestra en una resina hidroflica, que se polimeriza y se corta en ultramicrtomo. La reaccin se hace sobre
las grillas. Las secciones son muy inestables al haz. Esta fijacin suave no preserva la estructura ptimamente y sin osmio y plomo el contraste es
pobre.
7.1.5-Sobre crio cortes.

234

7.1-La reaccin inmunocitoqumica se puede realizar:

Fijacin suave con aldehdos. El material se coloca en un crioprotector y se congela en LN2. Se corta el taco en el crio ultramicrtomo. Se hace la
reaccin sobre la grilla y luego se cubre con un film plstico que incluye uranilo para darle contraste.
Se necesita disponer de una cmara de crio cortes.
Salvo cuando la reaccin se hace antes de la fijacin, todas las dems alternativas sirven para estudiar clulas libres o trozos de tejidos, y para
antgenos internos o superficiales. De ellas, son recomendables la tcnica de resina hidroflica y la de crio cortes.

7.2-Cuando utilizar Lowicryl y cuando crio-cortes?

Como patrn de ultraestructura.


Cuando tengo disponibilidad de nueva muestra.
Porque es ms rpida (sin 2 fijacin, sin deshidratacin ni polimerizacin).
Para detectar antgenos muy lbiles o en baja cantidad.
Para hibridizacin in situ.

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235

7.2.1Usamos CUM (crio-ultramicrotoma)

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236

Fig.7.1

7.2.2-Fijacin suave:

Una fijacin con glutaraldehdo 5 % seguida por osmio escondera los epitopes que se busca identificar. Es por ello que se utiliza slo una
fijacin suave con formaldehdo 2-4 %, y a lo sumo, con el agregado de 0.1 % de glutaraldehdo para mejorar la conservacin de la
estructura siempre y cuando el antgeno est en suficiente cantidad y lo permita.

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En el caso de tener clulas, partculas u organelas aisladas conviene agregar este paso de preinfiltracin en agarosa o gelatina para
procesarlas incluidas en un pequeo bloque (ver apartado de Preinfiltracin). Si se elige el camino de las resinas metacrilato como el
camino de los crio-cortes, recomendamos usar la gelatina, ya que ambos procesos continan a baja temperatura y si el material ha sido
mal ubicado, el bloque de gelatina es reversible. No es necesario el paso de preinfiltracin cuando nuestro material es un trozo de tejido
compacto.

237

7.2.3-Preinfiltracin:

7.2.4-Resinas metacrilato: Inmunolocalizacin luego de la fijacin y polimerizacin:

Se usan para esta tcnica las resinas metacrilato, como Lowilcryl, cuyo protocolo completo aparece en captulo de Infiltracin. En
resumen:

Aislamiento del material.


1 fijacin suave.
(Preinfiltracin agarosa o gelatina en el caso de clulas aisladas).
Deshidratacin EtOH a bajas temperaturas.
Resinas hidroflicas a bajas temperaturas.
Entacado y polimerizado UV.
Ultramicrotoma.
Inmunomarcado.
Contraste.
Observacin en TEM.

Es posible realizar distintas reacciones en cortes sucesivos en TEM.


Permite usar colorantes acuosos en los preparados de microscopa
ptica.

La fijacin suave con aldehdos seguida de la deshidratacin no


preserva bien la ultraestructura, especialmente de
membranas.

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238

La preservacin de la antigenicidad es buena.

Las resinas metacrilato producen dermatitis graves.


La polimerizacin es engorrosa y poco reproducible.
Como no se us osmio en la fijacin, el contraste final es pobre.
Las secciones son muy inestables al haz.

7.2.5- Los criocortes:

Qu ocurre cuando se congela agua pura a distintas velocidades?


Diagrama terico que muestra la relacin entre los estados del agua a presiones normales:

H2O LQUIDA

Enfriamiento
lento

Enfriamiento muy
rpido de microgotas

HIELO
HEXAGONAL
100 m3
Posibilidad terica
> -110 C

HIELO CBICO (10 nm3)

fig.7.2

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HIELO AMORFO O VTREO


Velocidad de enfriamiento: >
105 C/s

239

> -140 C

El hielo hexagonal o cbico tiene estructuras cristalinas confirmadas con rayos X caractersticos y esquema de difraccin.
El congelamiento sper-rpido se hace con un enfriado a una velocidad mayor que 105 C/ seg.
El estado vtreo no es cristalino, sino que solidifica cada molcula en el sitio donde estaba en el estado lquido (como el vidrio).
Para alcanzar el estado vtreo hay que saltar la franja de -40C a -130 C.

Qu ocurre cuando se congela una solucin acuosa a distintas velocidades?

Cuando una solucin acuosa se congela, se forma un ncleo de cristal de agua

(hexagonal o cbico) que crece con otras molculas de agua, sin el soluto. El soluto entonces se va concentrando en el resto de la
solucin. Al final tambin solidifica este resto con soluto, sin cristalizar, es el eutectoide entre los cristales de agua pura.

Fig.7.3

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En sistemas biolgicos todo esto se complica por la presencia de membranas semipermeables y


porque aproximadamente el 15 % del agua total est asociada a la superficie de otras molculas,
como hidratacin y no quedan disponibles para formar cristales. Esto es una ventaja, ya que
dentro de la clula hay crioprotectores naturales (protenas, azcares), disminuyendo la franja a -40
C a -80C.

240

Qu ocurre cuando las clulas estn en una solucin acuosa?

A baja velocidad de congelamiento se forman cristales hexagonales fuera de la clula, se concentran los solutos y hace que el agua salga de la
clula para lograr el equilibrio osmtico. En consecuencia, la clula se deshidrata y concentra sus propios solutos.
A velocidad media de congelamiento los cristales se forman fuera de la clula tambin, pero antes que difunda el agua desde el interior, se
nuclean cristales hexagonales dentro de ella, de 100 m y bordes irregulares, que rompen su estructura.
A velocidad ultrarrpida de congelamiento, -10 000 C/seg., se forman cristales cbicos chicos, de aproximadamente 10 nm3 o vtreos (no se
distinguen en TEM). Las molculas son detenidas en el mismo lugar que en el estado hidratado. En experimentos con embriones se comprob que
luego de la desvitrificacin las estructuras se mantienen vivas.
En la prctica se usa el trmino vitrificacin como el enfriamiento que no deja daos por formacin de cristal a nivel de TEM. En realidad solo
sera posible con tejido hidratados ms chicos que 10-20 m! (una capa de clulas). Esto se consigue solamente con
una tcnica sin fijacin donde los criocortes se mantienen a -150 C, que no sirve para inmunohistoqumica hasta ahora, pero s como
referencia de estructura.
-5 C
Lento: -1C/ min

Ultrarrpido:
10000C/seg

fig.7.4

241

Velocidad media

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T amb

Si se quiere cortar un tejido (hidratado) sin fijar y sin el tratamiento con sacarosa, se necesitara:
o Congelamiento ultrarrpido todos los pasos por debajo de -140C para evitar la desvitrificacin.
o Las secciones se transfieren de la cuchilla a la grilla dentro de la criocmara, y luego se presionan sobre la grilla . Las grillas se
transfieren bajo nitrgeno lq. directamente al TEM enfriado a -140C
Estos cortes sufren ms compresin, se mellan ms, y tambin tienen muy bajo contraste al no estar teidos, por eso se usa el
contraste de fase en TEM.
o El mtodo de congelamiento a alta presin. La alta presin (2100 bar) previene el aumento de volumen que ocurre cuando el agua
congela a presin normal, y esto permite achicar la velocidad de -106 0C/ s a -100C/ s.

El aparato es un Balzers, que deja el tejido en un sandwich de 600 rn entre 2 metales que lo presionan a 2100
bar menos de 10 milisegundos antes que reciba una corriente de N-liq. durante 0.5 s. Tampoco se lo us todava
para inmunocitoqumica pero habra que combinarlo con una criosustitucin.

Fijacin qumica suave.


Pre-inclusin de clulas o tejidos en gelatina.
Crioproteccin y congelamiento.
Criultramicrtomo.
Recuperacin de las secciones, descongelado y montaje en las grillas con Formvar.
Reaccin de inmunomarcacin.
Contraste positivo-negativo con metil celulosa .

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242

Se soluciona el problema con la tcnica de Tokuyasu, que agrega el paso de crioproteccin:

7.2.6-FIJACION:

Ya con el 2% de paraformaldehdo durante 1 h. hay buena morfologa y permeabilidad a la sacarosa. Si la clula no estuviese
fijada, la
Presencia de la sacarosa en el medio extracelular la deshidratara.
Si se va a hacer inmunohistoqumica en TEM, hay que chequear la antigenicidad a nivel ptico para estandarizar la fijacin con
cortes de CUM o cristato de 5 m.
Para clulas de cultivo se puede usar 4-8% de formaldehdo directamente en 2.1 M sacarosa para que se fije durante la infusin
Si el material son clulas aisladas, se necesita preinfiltrar con agarosa o gelatina antes de poner la sacarosa.
7.2.7-CRIOPROTECCIN:

Los crioprotectores son compuestos que interfieren en la formacin de cristales


de agua.

1) PVP (polivinil pirrolidona). No atraviesa la membrana de las clulas vivas.

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Como crioprotectores se usan:

243

La franja a saltar pasa de ser -40 a -130C a ser de -15 a -70 C, pero igual se
trabaja a -90. C por seguridad

2) Sacarosa: las clulas fijadas son permeables a ella. Si no se fija, la sacarosa es


muy densa y deshidratara a las clulas.
3) Glicerol
4) DMSO (dimetil sulfxido)
El glicerol y DMSO son permeables en clulas vivas y al descongelarse continan vivas. Paradjicamente destruyen o modifican
parcialmente la organizacin de la clula, pero las clulas vivas pueden repararlo.
Los bloques tienen mayor plasticidad con PVP- Sacarosa
Mezclar 1.8M Sac y 20% CNN) PVP (MW: 10000) Y preparar una pasta:
PVP .................................................. 20 G
Carbonato de sodio 1.1 M en buffer fosfato

.4 mI.

Sacarosa 2.3 M en igual buffer ....... 80 mi


Dejar toda la noche para que escapen burbujas a temperatura ambiente. (si no salen hay que sonicar o centrifugar)Ajustar el pH con NaOH 1 N

Se hacen cortes semifininos a -60 a-80C, y ultra- finos de -80 a -120C.

Tanto en esta solucin o la de sacarosa sola, se puede dejar el tejido toda la noche a 4C. Los pedazos de tejido que no han sido bien
embebidos se reconocen luego del congelamiento porque los cristales hexagonales le confieren un aspecto opaco y arenoso. En el

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Congelar en N-liquido.

244

Dejar el bloque de tejido de 1 mm3 por lo menos 2 hs.

caso que la sacarosa no difunda dentro del bloque probar con dimetil sulfxido, de mucha menor viscosidad, que puede entrar en las
membranas, an en las no fijadas.
Con 0.6M de sacarosa la clula puede tener dentro cristales cbicos y por fuera hexagonales, y con 1 M sacarosa tambin habra c
cristales hexagonales por fuera y dentro. La concentracin ptima es 2,3 mM de sacarosa.
Con mucha ms sacarosa los bloques se vuelven muy blandos y hay que cortarlos a menor temperatura, aunque a -120C se tornan
quebradizos.
7.2.8-Corte

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Fig.7.5 -Ultramicrtomo con una cmara de criocorte instalada.

245

Conviene ms tallar el bloque antes del congelamiento. No conviene cubrir


todo el bloque con sacarosa, slo pegarlo con una gota al tornillo.
Tallar el taco puntiagudo.
Poner la cuchilla y la muestra en la cmara y esperar 10 minutos a que se
estabilice la temperatura. Poner lo ms angosto del frente del bloque hacia la
cuchilla.
Es importante asegurarse que el bloque no avance trmicamente por la
diferencia de temperatura entre el bloque, la cuchilla o la cmara: poner AVANCE
en O y ver que no corte.
Sirven los cortes de interferencia dorada (aunque mucho se debe a la
compresin) y hasta el rojo, prpura y azul para inmunomarcado.

7.2.8.1- Problemas de corte:

Pobre la cuchilla (las cro-secciones sin medio de infiltracin, son muy vulnerables)
Temperatura inestable en la criocmara.
Mal congelamiento del tejido.
7.2.8.2 Las cuchillas de diamante

Cargan mas esttica, y los cortes se le pegan


Los ciclos de enfriamiento y calentamiento de la cmara pueden romper el pegamento del diamante al bote, por lo tanto hay usar las
especiales disponibles comercialmente.
Se usan con un ngulo libre de 6.

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Usar en el centro, donde no hay estras ni cua.


La ideal es la que tiene una contraparte con zcalo menor de 0.1 mm.
Conviene que los cortes se deslicen ms fcil sobre el vidrio con cubierta de tungsteno.
Que No se acumulen restos de tejido o hielo, que aumenta la friccin.

246

7.2.8.3-La cuchilla de vidrio

7.3-Artefactos del corte:

1) compresin: da un corte ms bajo, igual de ancho, pero ms grueso, se recupera al levantarlo en sacarosa (hasta las clulas se
vuelven otra vez circulares).
Sera mejor juntar los cortes con un lquido que se mantuviese as a la temperatura de corte, pero el Fren o etano tienen menor
tensin superficial, y los cortes se hundiran.
2) agrietamiento: sobre el taco, despus del ltimo corte. Son paralelos al borde de la cuchilla. Aparecen en muestras cristalizadas o
cuando la cuchilla no es buena.
3) Chatter: es una variacin peridica del grosor del corte. Hay que disminuir el ngulo libre de la cuchilla. LAS MANOS FUERA DE LA
CAMARA.
4) Mellas de la cuchilla.

Fig.7.6

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247

5) Deformacin de la superficie: se fractura o craquea la seccin.

A muy baja temperatura se necesita mucha fuerza para cortar y se puede fracturar el bloque. A temperatura intermedia, el taco no es
tan duro, se corta mejor pero es algo ms grueso.
Por lo tanto, conviene trabajar a menor velocidad de corte (0.1 mm/s) por debajo de -120C para que no fracture. Hay que cortar el
taco por debajo de la temperatura de recristalizacin, que es -135C para el agua pura, y mayor para material biolgico, o sea cuando
est vitrificado y tratar que no se genere calor por friccin al pasar la cuchilla (desvitrifica).
Con sacarosa el bloque tiene mayor elasticidad, y no es tan crtico lo de la velocidad de corte.
Por lo tanto:
Tejido sin sacarosa

trabajar por debajo -135C (a -100 adems el agua evapora por sublimacin.)
Con 2-2.3M Sac

cortes finos: -100C


0.5 um (500nm): -60C

CONVIENE USAR CUCHILLAS DE 45, AUNQUE AUMENTEN LA FRICCION. Esto puede dar mayor esttica.

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Cuando hay carga esttica los cortes de desprenden de la cuchilla y se pegan al bloque. Hay un dispositivo comercial que emite una
corriente elctrica pequea que permite escapar a los electrones acumulados. Si no se cuenta con este dispositivo, se puede utilizar la
chispa de un encendedor cerca de la cuchilla.

248

Antiesttica:

7.4-PROTOCOLO PARA OBTENER SECCIONES POR CUM

A las clulas en cultivo nuevo en suspensin o adheridas a un soporte, se le agrega


igual volumen de fijador (2x) a 37C. Puede ser formaldehdo 2% o 4% + glutaraldehdo
0.4 % + CaCl2 5mM en buffer cacodilato 0,1 M. No se puede usar el calcio con PBS.
Se puede teir tambin con cido pcrico 0,2 %para poder luego identificarlas por su
color amarillo.
Dejar 1 hora a la temperatura ptima de las clulas y luego de 1- 12 hs en la heladera.
(Si fuese un trozo de tejido, de 3 mm3 , se le agrega directamente el fijador en buffer).
Lavar 3 veces en PBS + 0.15 M Gly con 5 minutos cada cambio.
Si fuese un cultivo de clulas adherentes, se tratan en este momento con un lavado
en PBS + 1% gelatina a 37C por 30 min que ayuda a despegar las clulas. Se pasan a
un tubo Falcon de 15 ml y se centrifuga 3 min a 3000 rpm.

No usar pipetas automticas, que pueden romper las clulas.

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Nota:
Usar pipetas de vidrio porque las clulas se adhieren al plstico.

249

Fig.7.7

Conviene pre-infiltrar las clulas libres en gelatina:


Resuspender el pellet en gelatina 10% en agua en un eppendorf.
Centrifugar 3 min a 3000 rpm.
Enfriar 30 min en hielo hasta que solidifique la gelatina
Cortar el eppendorf y remover el pellet.
Cortar en cubos, siempre sobre hielo.
Pasar los cubos de gelatina o los trozos de tejido a un eppendorf con 1 ml de sacarosa 2.3 M. Dejar toda la noche en la heladera.
Tallar los cubos aproximadamente, siempre sobre hielo.
Pasar a un tornillo portamuestra limpio
Sumergir en LN2 con una pinza apropiada.
Transferir con la pinza pre-enfriada a la crio-cmara entre -90C a -120C.
CUM: Cortar secciones de 80 nm a velocidad 0.6-2mm/seg. Mientras, la solucin de sacarosa se mantiene en hielo.

EL FILM DE FORMVAR SE HA PUESTO SOBRE LA CARA BRILLANTE DE LA GRILLA, Y SOBRE STA LOS CORTES. Si se pusiese el Formvar
sobre la opaca quedaran las 2 caras brillantes y no se podra distinguir dnde estn los cortes.
Girar el anza y dejar la grilla flotando sobre gelatina 2% por 30 min a 37C. Con esto se disuelve la gelatina al 10% y la sacarosa.

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La grilla debe estar recubierta con un film de Formvar (formato de polivinilo). Las anzas grandes llevan cortes hacia la periferia de la
grilla, pero las anzas demasiado chichas se congelan muy rpidamente.

250

Los cortes se separan con una pestaa del borde de la cuchilla y se levantan con un anza de 2 mm con una gota de la solucin de
sacarosa 2.3 M. Al acercar el anza al corte no hay que tocar la cuchilla porque se congela la gota de sacarosa y se forma una banda de
hielo sobre la cuchilla.

El descongelamiento es muy rpido el paso de agua vitrificada a lquida y no trae mayor problema.
Antes de hacer la reaccin de inmunomarcado conviene chequear el estado de una de las grillas en el TEM:
De la criocmara se pasa con la sacarosa a la grilla y de all al agua algunos minutos. Poner en la mezcla de acetato de uranilo y metil
celulosa.

Las grillas se guardan hasta la inmunoreaccin:

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251

Flotando sobre la superficie de buffer fosfato salino (PBS) fro


Sobre un capa slida hecha de gelatina 2% sobre hielo. Antes de empezar la marcacin se lo deja a temperatura ambiente y se vuelve
lquido, con lo que tambin se evita el paso del bloqueo por saturacin de los sitios inespecficos.
Sobre 1-5 % de suero fetal de cabra o neonato en PBS sobre hielo por 1-2 hs a 4C y hasta 24 hs.
Flotando sobre sacarosa 2.3 M y dejarlo a -20C. Antes del inmunomarcado se lo equilibra a temperatura. Es la mejor manera).

252
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Fig.7.8- Crioseccin de Tripanosoma brucei incubada con transferrina bobina conjugada


con oro 5 nm.

7.5-Pasos del protocolo de inmunomarcacin sobre secciones montadas en grillas


7.5.1-(CUM o Lowilcryl)

1. PBS/ Gly o ClNH4

-quenching o bloqueo de los grupos aldehdos.

2. PBS con BSA

- satura los sitios inespecficos

- eliminar el anticuerpo no pegado

5. Protena A-oro (PAG) o 2 Ac-oro

- marca electrodensa

6. PBS

- eliminar la PAG o 2 Ac no pegada y lavar el BSA que quitara nitidez en el TEM.

7. GA/PBS

- estabilizar el inmuno-complejo

8. agua destilada

- lava el fijador

9. acetato de uranilo

- contraste

10. acetato de uranilo + metil-celulosa

- cubrir el corte (slo para CUM)

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4. PBS con BSA

253

3. 1 anticuerpo

Tomar la grilla con el ansa de dimetro mayor que el de ella y pasarla por las siguientes gotas de 100 l sobre una plancha de

parafilm:
5 gotas de PBS con 0.15 M Gly por 2 min en cada una. Esto es por el quenching o bloqueo de los grupos aldehdos. Tambin se
puede usar ClNH4 50 mM por 30 min.
1 gota de PBS con 1% BSA por 3 min. Tambin se puede usar suero fetal de cabra (10% por 10 min.), gelatina de peces de fondo de
mar o leche condensada (pero la lactosa pega mucho oro). Esto satura los sitios inespecficos.
Los cortes tienen que ser neutros porque las cargas positivas, como el ncleo o el citoesqueleto, pegan oro inespecficamente. Para
ver una marca en el ncleo conviene usar heparn sulfato 1mg/ml por 30 min.
1 gota de 5 l del 1 anticuerpo, a temperatura ambiente, desde 40 min a toda la noche en concentracin aprox. 0.2 g/ml en
PBS/ 1% BSA. Probar distintas diluciones hasta 20 g/ml. Los anticuerpos monoclonales vienen ms diluidos que los policlonales: se
puede usar 1:5 el monoclonal y 1: 50 los policlonales.
En cortes de Lowilcryl no se deja ms de 3 hs o se agujerea la resina.
5 gotas de PBS/ 1% BSA, con 3 min cada una, para eliminar el anticuerpo no pegado.
1 gota de 10 l de protena A-oro (PAG) de 10 nm en PBS/ 1% BSA por 20 40 min. Hay que usar un puente si el 1 anticuerpo no
es afn a la protena A (como los de ratn). Por ejemplo, si el tejido con el que trabajo es de rata, y el 1 anticuerpo es de ratn, se pone
el 2 anticuerpo conejo a- ratn y luego la PAG. El oro-coloidal no se congela porque precipita.

Si el corte es de Lowilcryl se deja secar y se contrasta al da siguiente con acetato de uranilo solamente.

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5 gotas de PBS por 3 min para eliminar la PAG o 2 Ac no pegada y lavar el BSA que quitara nitidez en el TEM.
1 gota de GA 1% /PBS por 5 min para estabilizar el inmuno-complejo
5 gotas agua destilada con 2 min cada una.
1 gota acetato de uranilo 4% pH 7 por 5 min.

254

Tambin se puede usar un 2 anticuerpo-oro, en cuyo caso a menor tamao del oro se usa mayor dilucin:
5nm
1:50
10
1:100
15
1:75
20
1.50
El 2 anticuerpo se usa ms diluido que el 1.

1 gota acetato de uranilo 4% pH 4/ metil-celulosa 2% por 10 min sobre el parafilm sobre hielo. Se usa 1 gota de acetato de uranilo
+ 9gotas de metil celulosa.
Tambin puede usarse 1 gota de acetato de uranilo 5% + 9gotas de PVA (polivinil alcohol), donde se sumerge la grilla a T
ambiente.
Tomar la grilla con un ansa mayor a su dimetro y pasarla a 45 por un papel de filtro Whatman 1 (o de caf) hasta descargarla y
ver el film azul/amarillo iridiscente. Se deja secar la grilla con el ansa suspendida al aire.
Se quita la grilla del ansa una vez seca sosteniendo con una pinza.

Contraste positivo negativo: metil-celulosa 2% + acetato de uranilo.


Contraste positivo: polietilenglicol 2% + metilcelulosa 0,2 % + acetato de
uranilo 0,02%.
Contraste negativo: metilcelulosa 2% + molibdato de amonio 1%

Fig.7.9

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255

7.6-Tipos de contraste:

7.7-Ventajas y desventajas de la tcnica de CUM.

Llas ventajas del CUM con la tcnica de congelamiento y descongela miento de Tokuyasu son:
Es ms fcil el corte.
No se trabaja a tan baja T
La compresin del corte se compensa al descongelar.
Y respecto a la tcnica con resina:
Es mucho ms sensible para inmunohistoqumica. Preservacin de los epitopes antignicos
Mejor preservacin de la ultraestructura
Se termina todo el procedimiento en un da. Evita varias etapas del procedimiento de rutina para TEM.
Mejor accesibilidad de sondas macromoleculares como anticuerpos, oligonucletidos, etc.
Se puede usar para microscopa ptica de fluorescencia.
Al no haber deshidratacin, se conservan los lpidos y, al no haber movimiento del agua, se mantienen tambin los antgenos en
su lugar de origen.

Tcnica muy laboriosa y de bajo rendimiento.


Disponibilidad de un buen crioultramicrtomo
Consumo de LN2
Las imgenes tienen poco contraste y necesitan una interpretacin diferente.
Se necesita mayor cuidado porque el material cortado queda desprotegido.

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256

Las desventajas son:

Captulo VIII:

Preparacin de muestras para microscopa


electrnica de barrido

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257

Prof. Viviana Sorrivas e Ing.Mara Julia Yaez

258
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Fig.8.1 Bacterias y esporas de Alga.

La preparacin de las muestras para microscopa electrnica de barrido es un proceso muy


delicado en el que interactan muchos aspectos. Tener xito depender del control y de la
exactitud de todos los parmetros que se utilizan.
8.Introduccin

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259

La metodologa que se emplee para preparar la muestra que ser observada por microscopa electrnica de barrido, tendr como objetivo
lograr que la misma se encuentre en condiciones idnticas a su estado natural, sin que aparezcan artefactos que introduzcan errores durante la
interpretacin de las imgenes.
Para seleccionar el mtodo a usar, se deber elegir la ruta de acuerdo a la naturaleza de la muestra (ver esquema 8.1). Para obtener informacin
de la topografa superficial se podr realizar observaciones por microscopa electrnica de barrido con detector de electrones secundarios o
retrodifundidos, si se necesita realizar reconstruccin tridimensional, los nuevos instrumentos poseen incorporado un haz de Galio que va
liberando zonas de observacin y si se requiere conocer los elementos qumicos que la componen se decidir por un sistema de microanlisis con
detector de rayos x. Las condiciones de operacin del equipo que se utilizar para su observacin dependern del tipo de muestra y la clase de
instrumento utilizado.

Fig.8.2 -Pulpa de manzana.

8.1- Tipos de muestras y mtodo de preparacin (SEM)

muestras
biolgicas

no biolgica

Hidratado

fresco
vpsem

secado al aire

no conductora

conductora

montaje

mecnicamente
(congelacin)

montaje

montaje

montaje

deshidratado

deshidratado

metalizado

metalizado

metalizado

metalizado

metalizado

260

qumicamente

Fig.8.3

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fijado

seca

8.2-Preparacin de superficies:

8.2.1-Superficies no biolgicas:

Seleccin de la muestra: se toma una porcin de la muestra representativa. Se elige la zona a observar, si es necesario se lava, ya sea lavado
simple, o bien con aparato limpiador de ultrasonido, pulido o lavado con solventes. Puede secarse al aire, en estufa a 25 C, fracturarse por
congelamiento, etc. Se acondiciona la superficie que se desea observar de la mejor manera posible.

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Seleccin de la muestra: la muestra ser tomada de acuerdo al detalle que necesita ser observado, cuando ms pequea mejor se mantendr la
estructura. (1,2 mm aproximadamente como tamao ptimo para tejidos). Se tendrn en cuenta las limitaciones en el tamao de la cmara del
microscopio en que se observar y las posibilidades de inclinacin y rotacin. Se pueden disear portamuestras especiales para orientar de la mejor
manera posible lo que desea observarse. Ser importante prever que la muestra puede contener suciedad superficial que imposibilite la observacin
de la superficie de estudio. Se lavan las superficies con los lquidos adecuados en cada caso particular. Deber tenerse en cuenta al lavar, la
osmolaridad de la solucin, el tampn, el pH, la duracin del lavado, la cantidad de los mismos, si usar ultrasonido, el tiempo y por ltimo la
temperatura.
Un simple lavado puede ser efectivo para remover contaminantes solubles conteniendo partculas tales como protenas, sales, eritrocitos, etc.
Tcnicas ms drsticas pueden usarse cuando la muestra posee en su superficie estructuras inorgnicas resistentes, como por ejemplo: diatomeas, (la
taxonoma de estas algas depende de la identificacin de finos detalles estructurales que pueden estar ocultos por sedimentos o material orgnico
adherido). En ese caso, lavados sucesivos con equipo de ultrasonido, seguido de centrifugados suaves son muy efectivos.

261

8.2.2-Superficies de especmenes biolgicos:

8.3-Mtodos para remover materiales extraos de la superficie de la muestra:

Durante la preparacin de especmenes acuticos, es necesario remover materiales de la superficie tales como mucus y partculas. Estas pueden
ser restos de animales, suciedad, fragmentos de tejido, bacterias y detritos que casi siempre estn adheridos al mucus o a los cilios.
Un mtodo que puede utilizarse es el de lavados mltiples con solucin tampn. Tambin se pueden tratar las muestras con glicerol para extraer
mucus de cnidarios, moluscos y telesteos marinos. Se utilizan soluciones cidas, ej: 1% CL H o cido ascrbico para remover el mucus de ciliados y
gasterpodos. Los acantocfalos se pueden limpiar lavando con 0,005 M de EDTA. Para rotferos se usa 0,1% de hipoclorito de sodio.
El tiempo de lavado variar segn el grado de contaminacin y debe determinarse empricamente. Un mtodo que ha dado excelentes resultados
es el tratamiento con ultrasonido (desde 5 a 30 seg.) para nemtodos, artrpodos, vertebrados, larvas y otros tipo de muestras . El nico cuidado que
hay que tener es no pasarse con el tiempo. El mismo mtodo se utiliza para limpiar superficies de rocas, metales, piezas con corrosin, etc.

8.3.1-Desmineralizacin:

Se realiza con EDTA (cido etilen- diamina-tetraactico).


Otra tcnica es utilizar una solucin 1N de ClH o
una solucin de cido ascrbico 1% para remover grnulos de calcio o esqueletos calcreos.

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Suspender y agitar en agua de mar fra e hipertnica (conteniendo 30 mg /l de Na Cl adicionales) por 2 minutos.
Aspirar varias veces con una jeringa los especmenes (protozoos).

262

8.3.2-Para remover cilios o flagelos:

Para manipularlos:

Luego de secado por punto crtico, con una pestaa pegada a un palillo
estereoscpica.
Conviene ir chequeando con lupa a medida que se lava.

se tocan suavemente, bajo lupa

En el caso de tejidos animales o vegetales, es necesario volver a cortar el tejido antes de la segunda fijacin en trozos
menores para facilitar el secado. Si se necesitara aplicar anestsicos, utilizar locales como: novocana, xilocana y otros.
8.4-Fijacinde especmenes biolgicos:

La mayora de las muestras biolgicas que se necesita observar al microscopio electrnico convencional, cuando se colocan en la cmara en alto
vaco, debido al gran contenido de agua que poseen, se ven colapsadas y a medida que transcurre el tiempo de observacin se van deteriorando. En
la actualidad, con los microscopios ambientales se puede observar la muestra sin tratamiento previo pero hay que tener en cuenta que tambin sufre
una deshidratacin al ser sometida al haz de electrones. Hay que considerar los tiempos de observacin en los cuales el espcimen sufre
naturalmente una deshidratacin. Algunos instrumentos actuales poseen un sistema de congelamiento de la muestra que permite fijarla y es muy
aconsejable. En el caso de no poseer este accesorio o un equipo de secado por congelamiento externo, se recurre a la fijacin qumica. Esta es la
tcnica ms complicada y crtica en la observacin con microscopios convencionales.

Congelar la imagen
en el momento que se
necesita estudiar la muestra.

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Tiene por objeto mantener la estructura estable para lo cual se fijan las protenas y lpidos.
Se utilizan fundamentalmente dos tipos de fijadores:
8.4.1.1-. coagulantes
8.4.1.2-. no coagulantes.

263

8.4.1-Fijacin qumica:

8.4.1.1. coagulantes:
F.A.A : formol-cido actico alcohol
C.R.A.F: cido crmico-formol-cido actico

Actan coagulando las protenas, formando en el nucleoplasma y citoplasma una


intrincada red en donde quedan atrapadas las organelas. (Similar a la clara de huevo duro).
Es muy conveniente cuando se desea observar slo superficies. Tener en cuenta que no sirve
para Microscopa Electrnica de Transmisin, ya que la ultraestructura interna se deteriora. Es
til tambin para recolectar muestras a campo, muy usado en vegetales. Su accin visible es un
endurecimiento de la muestra.

264

La fijacin por coagulacin, desnaturaliza las protenas y altera la ultraestructura.

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Nota: Los conceptos anteriores


son muy generales, cada muestra en
particular tendr su fijador ptimo.
Un
conocimiento
ntimo
del
material, del medio en que se
desarrolla y todos los parmetros
fisiolgicos ayudar al momento de
decidir cul ser el mejor
procedimiento para tratarla. En la
mayora de los casos se utiliza el
mtodo de prueba y error.

Una vez fijadas las protenas con fijadores no-coagulantes que mantienen la estructura terciaria de las molculas, s se puede usar etanol o
acetona en la deshidratacin.

Porqu se agregan cationes?

El punto isoelctrico de las protenas es menor que el pH neutro del fijador y las protenas quedan cargadas negativamente. Para evitar que las
protenas se repelan, se agregan cationes que permiten su acercamiento como para poder establecer las uniones transversales en la fijacin.

Para organismos marinos, agregar:

sales de magnesio:
7,5% Mg Cl2. 6H2 O
20% Mg SO4 7H2 O
Para animales de agua dulce.

2,5%Mg Cl 6H2 O

Cmo fijar

1. Como vapor: Tetrxido de Osmio (Os O4 )


2. Por inmersin: (Os O4) Tetrxido de Osmio,
glutaraldehdo, F.A.A, etc.
1. Por perfusin: Glutaraldehdo, Karnovsky,
formaldehdo.

265

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8.4.1.2-No coagulantes:

Mantienen la estructura en mejores condiciones, similares a su estado natural. Pertenecen a esta clase: glutaraldehdo, tetrxido de
osmio, etc. Ver en captulo de fijacin (captulo III).Actan formando entrecruzamientos entre las molculas lo que da estabilidad a las
estructuras.

8.4.2-Formas de utilizacin de los fijadores:

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2) Por inmersin: Requiere una cuidadosa diseccin del espcimen como primer paso. Luego se sigue el procedimiento indicado
en LINK para doble fijacin o simplemente slo con glutaraldehdo.

266

1) Como vapor: Generalmente se utiliza cuando por alguna razn no se puede sumergir la muestra en el fijador. Para realizar
este mtodo se deben tomar todos los recaudos de seguridad (ver Captulo XII de seguridad en laboratorio) A saber: se
colocar la muestra en una cmara cerrada, debajo de campana extractora y el espcimen se expondr a los vapores durante
determinado tiempo, depender de su tamao. Considerar que el tetrxido de osmio tarda en penetrar 0.5mm en una hora
cuando est en solucin. Es muy voltil y como vapor fija muy rpido. Se utiliza por ejemplo en tejidos muy frgiles como hifas
de hongos, esporas y granos de polen.

8.4.3-El vehculo ideal:

Los fijadores tendrn que ir diluidos en un vehculo. Debe ser una solucin con las siguientes caractersticas:

Que mantenga el pH: de esa manera no se alteran las protenas. (Siempre se mide el pH final del fijador a temperatura
ambiente).
Que mantenga la fuerza o constitucin inica: como es muy diferente la del vehculo a la de la clula se pueden producir extraccin de
materiales celulares o precipitados. Conviene acortar el tiempo de fijacin y es por eso que el 1 fijador es GA, que entra y reacciona ms
rpido que el osmio.
Que tenga mxima solubilidad en agua y mnima en membranas biolgicas. Esto aumenta su poder de penetracin.
Que no sea txico: el vehculo entra antes que el fijador y podra daar el tejido que an no est fijado.
Que posea una osmolaridad que mantenga un medio isotnico a las clulas y prevenga que las mismas se hinchen o se contraigan.

NOTA :

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UNO DE LOS FACTORES DE XITO EN LA OBSERVACION SER APLICAR LA OSMOLARIDAD JUSTA A CADA TIPO DE TEJIDO

267

Los materiales que deban ser guardados de un da para otro o


transladados, se almacenan en alcohol o acetona 80%..

8.5-Deshidratacin- 8.5.1-Objetivo de la deshidratacin

Para acelerar el proceso de deshidratacin:


Es una etapa muy importante, previa al montaje para microscopa electrnica de
barrido convencional, con el objetivo de que el tejido se mantenga en buenas
condiciones para su observacin. Para remover el agua de los tejidos se utilizan
solventes orgnicos, como acetona o alcohol.
La extraccin de lpidos y protenas se acompaa con la contraccin celular y
subcelular. Es menor la variacin al usar acetona, pero no se sabe cul de estos
agentes preserva mejor las relaciones intermembranas que existen en vivo.

- El tejido se secciona en trozos pequeos.


- Se agitan los viales.
- Se realiza a temperatura ambiente.
- Se usan ms cambios de cada solucin.

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En el mismo vial donde se fij el tejido, se extrae el lquido fijador (sin dejar la muestra al aire) y se reemplaza por el primer lquido
deshidratante, as hasta llegar al ltimo, que es el puro (100%). Se hace con pipeta Pasteur, cuidando que el volumen de la solucin
siempre sea mayor, por lo menos 10 veces, al del material. (Captulo IV). Se trabaja a temperatura ambiente o en fro. Si se hace en fro,
se debe elevar la temperatura hasta la ambiente cuando el material ya est en la solucin al 96%. A bajas temperaturas hay que cuidar la
condensacin de H2 O. El material se puede lavar luego de fijarlo y antes de deshidratarlo.

268

8.5.2-Mtodos de deshidratacin

8.5.2.1-Un esquema tpico de deshidratacin es el siguiente:

*Etanol o acetona 30% (slo para embriones) ...................... 15min.


50% ...................................................................................... 15min.
75% ...................................................................................... 15min.
95%.......................................................................... 15min.
100%. ( tres veces) ....................................................................................15min.
8.5.2.2-Mtodo de diluciones infinitas

Quitar todo dejando una delgada capa sobre el material y agregar Et OH 100% gota a gota.
Notas:

Muy importante! NUNCA dejar al aire la muestra una vez fijada.

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En el caso de utilizar slo alcohol, conviene finalizar con dos cambios de etanol 100%

269

La diferencia de accin entre el etanol y la acetona es que el etanol no solidifica los tejidos y la acetona si.

(con sulfato de cobre anhidro para mantenerlo absoluto y que debe cambiarse al pasar a azul).

Es mejor usar acetona, pero se usa etanol porque es ms econmico, y como es menos hidrfilo, el etanol
absoluto es ms fiable.

.
Hifas de hongos, sin fijar, deshidratados dentro de la cmara del microscopio, modo VP.

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Fig.8.4

270

Para diferentes diluciones de etanol, partir del 96% y tratar como si fuese 100%.
Cuando el material flota, como las clulas vegetales, porque contienen aire, utilizar las muestras que no flotan o
someterlas a vaco.

8.6-Secado - 8.6.1 Secado por congelamiento:

El espcimen se congela rpidamente en nitrgeno lquido y el hielo es sublimado a baja temperatura y alto vaco. Cuando el hielo se ha
vaporizado completamente, la muestra se lleva a temperatura ambiente y se prepara para su observacin.
Los lquidos para congelarla pueden ser: Nitrgeno lquido, propano y otros. Como el nitrgeno lquido burbujea mucho cuando entra en
contacto con un elemento ms caliente hay que agitarlo sostenido por una pinza para favorecer el enfriamiento rpido. Pueden utilizarse
crioprotectores como glicerol, glicerol ms sacarosa, solucin saturada de cloroformo en agua destilada, etanol, acetona, polivinil pirrolidona,
hidroxietil y dextrano. Reducen la formacin de cristales de hielo pero pueden producir artefactos.

Procedimientos:

Varan de acuerdo a la instrumentacin que se utilice.


I . El tejido congelado se traspasa a una cmara de vaco enfriada con nitrgeno lquido.
II. El espcimen puede permanecer en nitrgeno lquido para prevenir la condensacin de vapor de agua sobre la superficie fra y para evitar un
cambio drstico en la temperatura. Se incrementa el vaco, el nitrgeno lquido se vaporiza y la temperatura se lleva a tal punto que permita la
sublimacin del hielo ( 60 a 70 C). El proceso se completa en varios das. Ver condiciones de seguridad para trabajar con nitrgeno lquido

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La muestra se fija en glutaraldehdo ( 2 a 4 horas) y se deja en tampn por toda la noche, se deshidrata en etanol o acetona. Se seca al aire.

271

8.6.2-Secado al aire desde solventes orgnicos:

8.6.3-Secado por punto crtico:

Esta tcnica utiliza la propiedad de los lquidos de cambiar de la fase lquida a la


gaseosa sin generar calor latente de vaporizacin o cambio de densidad. La temperatura y presin a la cual este fenmeno ocurre se
denomina punto crtico .
Aparato de secado por punto crtico marca POLARON (ENGLAND)

8.6.3.1-Fluidos intermediarios y de transicin:

En la mayora de los casos el solvente a ser removido desde una muestra para microscopa de barrido es agua. Pero como el punto crtico del
agua llega a una temperatura de 374 C y la presin crtica a 3184 psi, no se utiliza sta sino lquidos que posean un punto crtico en parmetros
ms bajos y fciles de alcanzar. Pueden ser: CO2 (temperatura crtica 31 C y presin crtica 1072 psi ) , Fren 13 (TC= 28,9 C y PC 561 psi) y Fren
TF 113 ( T=214 C y PC= 495 psi ). Estos ltimos estn prohibidos porque aumentan la capa de Ozono.
Como fluidos intermediarios, que son miscibles en agua y en el lquido de transicin se utilizan: etanol, acetato de amilo o acetona. (
generalmente se usan los mismos solventes de la deshidratacin) .

Fig.8.5

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El instrumento posee unos recipientes metlicos para colocar las muestras y se


pueden fabricar fcilmente portamuestras adaptados al tipo y tamao del espcimen.
(foto)

272

8.6.3.2-Portamuestras para secado por punto crtico:

Cpsulas beem modificadas: estas cpsulas se compran en los proveedores de artculos de microscopa electrnica y se adecuan a las
necesidades. Hay de varios tipos y de acuerdo a la muestra que se va a procesar se pueden fabricar diferentes. foto)
Ejemplo: con cpsulas beem cilndricas, se corta la base y con las tapas de dos cpsulas se fabrican aros en los cuales se coloca malla de
plancton con un determinado tamao de poro que no deje escapar la muestra y a su vez permita un buen intercambio de fluidos. Es conveniente
realizar con una aguja muy fina recalentada orificios en las paredes del cilindro. Se venden cpsulas porosas.
Otra forma de sostener muestras para ser procesadas en el secador por punto crtico es adhirindola por medio de polilisina u otra protena a
un cubreobjeto, recortado del tamao que quepa en la cmara del secador. O utilizar jeringas con filtros nucleopore que no se disuelvan con
acetona.

8.7-Montaje de especmenes para microscopa electrnica de barrido

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El soporte para la muestra es generalmente un cilindro de bronce, aluminio, o


carbn. Los hay de diferentes tamaos. Los convencionales son de 1cm y 2,5 cm de
dimetro. En algunos instrumentos tiene una base de menos dimetro que se utiliza para
fijar el portamuestra con un tornillo a la platina de la cmara del SEM.

273

Fig.8.6

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Una vez que la muestra est seca, se fija al portamuestra con un material adhesivo. Entre los adhesivos ms utilizados se mencionan: cintas
adhesivas conductoras de aluminio, carbn, doble faz, esmalte para uas, pintura de plata y protenas que adhieren la muestra por carga
elctrica.
La muestra se debe fijar al portamuestra con un adhesivo, preferentemente, conductor. Si se utiliza un adhesivo no conductor, se puede
realizar un puente con pintura de plata (conexin) entre la muestra y el portamuestra para facilitar la conduccin.
En primer lugar, se deber considerar el propsito del estudio, las caractersticas de la muestra y del adhesivo. Las caractersticas de la
muestra que deben tenerse en cuenta son: tamao, porosidad, estado de hidratacin, solubilidad, resistencia al dao del haz, rea de inters y
conductividad. Con este conocimiento se buscara el adhesivo ms adecuado. El mismo deber cumplir ciertas condiciones como: viscosidad
apropiada para evitar que la muestra se hunda en el sustrato, proveer estabilidad de la muestra, resistir el calentamiento causado por el haz,
rpido tiempo de secado, baja presin de vapor para que no contamine el sistema de vaco y no interferir con la composicin de la muestra.
Materiales como pintura de plata son lquidos viscosos que pueden aplicarse sobre el portamuestra antes de colocar la misma. Sin embargo,
el adhesivo puede cubrir inadvertidamente o ser absorbido por la muestra oscureciendo reas de inters. Por esta razn, no es conveniente
montar con un adhesivo lquido pequeas partculas sobre el portamuestras. En estos casos, se emplea la cinta doble faz. Esta se adhiere al
portamuestra y las partculas son esparcidas cuidadosamente sobre su superficie.
Los adhesivos que contienen carbn producen baja seal de electrones secundarios si se comparan con pintura de plata. Como resultado de
esto, el fondo en la imagen aparecer ms oscuro si usamos el segundo. Entre las propiedades que tienen estos adhesivos figuran su buena
adherencia y conduccin.
Las cintas doble faz comunes y las de aluminio son las ms usadas en el montaje para SEM. Entre las ventajas se pueden citar: facilidad de
aplicacin, no requieren tiempo de secado, suficiente adherencia para proveer buena estabilidad, se mantienen durante largos perodos de
tiempo, alta viscosidad que minimiza el hundimiento de la muestra. Las cintas de aluminio se utilizan para minimizar los efectos de carga y el dao
causado por el haz electrnico en la cinta. Son fciles de aplicar, delgadas, muy lisas y econmicas.
Entre las desventajas que presentan las cintas adhesivas doble faz, figuran: posibilidad de producir contaminacin en el sistema de vaco, poca
adherencia para muestras esfricas, susceptibles al haz electrnico, baja conductividad trmica.
Las cintas ms delgadas son menos susceptibles al dao causado por calentamiento por el haz que las cintas gruesas.
Todos los adhesivos tienen sus ventajas y desventajas, pero las cintas pueden utilizarse como un medio de montaje si se usan en condiciones
apropiadas. Los proveedores de insumos para microscopa electrnica ofrecen gran variedad de adhesivos.

274

8.7.1-Adhesivos para sostener la muestra:

En la tabla siguiente se presentan los adhesivos ms comunes :

Pintura de plata

Adhesivos de PVC

Cinta doble faz

Baja adherencia.
Excelente conduccin.
Recomendable para muestras no porosas.

Rpido secado.
Buena firmeza.
Adherencia moderada.
Superficie lisa.
Buena para partculas menores de 1 .

Baja conduccin elctrica y trmica.


Fcil aplicacin.
Excelente adherencia.
Puede vaporizar levemente en la columna.
Viscosa (ideal para partculas).
La superficie puede agrietarse.

275

Pintura en base carbn

PROPIEDADES
Buena adherencia.
Buena conduccin.
Rpido tiempo de secado.

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MEDIO

8.7.2-Montaje de la muestra:

Es importante, que la muestra haga buen contacto con el portamuestra. Un contacto insuficiente provocar efecto de carga, distorsin
de la imagen o desprendimiento de la misma dentro del microscopio. La muestra deber montarse cuidadosamente exponiendo las

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8.7.2.1-Orientacin de la muestra:

276

La muestra seleccionada seca y limpia, debe ser adherida al portamuestra de manera tal que no se mueva durante la observacin. Hay varios
factores para tener en cuenta antes que la muestra sea montada en el portamuestras. Entre ellos podemos citar: el tipo de material, el tamao del
portamuestra, la seal que se detectar, el adhesivo a emplear, y la orientacin de la muestra dentro del microscopio.
El portamuestra, es de material conductor, generalmente bronce o aluminio. El montaje involucra adems, seleccionar el adhesivo apropiado. Del
mismo depender el fondo de la imagen adquirida. Por ejemplo, cuando se requiere realizar una determinacin de tamao de partculas es
importante elegir un adhesivo que tenga superficie lisa.
La muestra debe montarse y mantenerse cubierta en un lugar libre de polvos contaminantes. Si no es conductora la superficie de la muestra se
debe cubrir con un film de material conductor para facilitar el flujo de cargas (metalizacin) durante la observacin.
Las muestras pueden guardarse por un tiempo bajo ciertas condiciones. Para protegerlas de ser daadas deben manejarse con cuidado y evitar su
contaminacin con polvo en suspensin. Muchas muestras son mantenidas en desecador bajo vaco durante varios meses, sin que se deterioren.
Otra opcin para solucionar el problema del deterioro que sufren las muestras al guardarlas durante mucho tiempo es colocarlas sobre
plataformas que puedan ser fcilmente ubicadas y retiradas del portamuestras. Una posibilidad es poner la muestra sobre un cubreobjeto. Este se
montar sobre el portamuestra con cinta doble faz o pintura de plata cuando se quiera observar nuevamente. La pintura debe ser aplicada de forma
tal que cubra no slo el fondo del cubreobjeto sino tambin los bordes superiores del mismo para garantizar una buena conduccin de cargas desde
la muestra hasta el portamuestra. Una buena opcin es cortar discos de aluminio con un sacabocado y utilizarlo como si fueran los portamuestras, de
esa manera se podrn guardar e incluso, a raz del bajo costo, el usuario puede quedarse con la muestra preparada.

reas de inters . En todos los casos que se tengan dudas sobre la conduccin, por ejemplo muestras esfricas o con pocos puntos de
contacto con el portamuestras es aconsejable realizar puentes de plata conductores entre la muestra y el portamuestras.

Un paso importante es colocar el sitio de la muestra que queremos observar hacia arriba, de manera que podamos enfrentarla al detector, rotarla
e inclinarla. De esta manera se facilitar la toma de imgenes y la calidad de los resultados que obtengamos.

Fig.8.7- Portamuestras para Microscopa electrnica de barrido

8.8-Preparacin de muestras no conductoras para microscopa electrnica convencional

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277

La mayora de los materiales no son buenos conductores del calor y de la electricidad y causan dificultades durante la observacin en el SEM. La
manera ms simple y difundida de convertir a stos materiales en conductores, es cubrir su superficie con una capa delgada de algn metal. Mediante
este procedimiento, adems de evitar problemas de carga se mejora la seal de electrones secundarios.

8.8.1-Materiales para depositar

Para elegir el metal apropiado y el mtodo de aplicacin deben tenerse en cuenta varios factores, que se enumeran a continuacin:
1) El tipo de observacin que se realizar (SEM de alto vaco, presin variable o ambiental). La seal de electrones secundarios se mejora con una
cubierta de metal pesado como por ejemplo Au, Pd, Pt, o aleacin de Au-Pd.
2) Las propiedades de la muestra (tamao, peso molecular, susceptibilidad al calor y al haz de electrones, etc.) determinarn el tipo de metal y el
mtodo de deposicin a emplear.
3) La informacin que se desea obtener. Por ejemplo, para estudios de pequeas partculas (menores a 0.5 micras) el metal ms adecuado es el
Au-Pd dado que posee un tamao de grano que permite visualizar las partculas a altas amplificaciones.

Plaqueta de oro

La principal condicin que debe cumplir el material que se utilizar para depositar es que conduzca el calor y la electricidad desde la superficie
de la muestra hacia el portamuestra.

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Fig.8.8-

278

Portamuestras

Los films obtenidos deben cumplir ciertas caractersticas, entre las que se pueden citar:
Conductividad: El film conductor debe ser continuo y uniforme en toda la superficie cubierta. Cuanto mayor es la conductividad entre el
portamuestra, el adhesivo y la superficie, mayor ser la remocin de las cargas en exceso y del calor generado evitando problemas de
deterioro de la imagen durante la observacin.
Estabilidad: El metal conductor no deber reaccionar con la superficie de la muestra u oxidarse durante un perodo largo de tiempo. Entre los
materiales conductores los ms usados son el Au y el Au-Pd. Otros excelentes conductores, tales como Ag y Al se utilizan menos por su rpida
oxidacin a estados menos conductores.
Compatibilidad: El material empleado para cubrir la superficie de la muestra debe ser compatible con los requerimientos del estudio a
realizar. Los metales pesados son usados para imgenes de electrones secundarios, mientras que el C se emplea en microanlisis de rayos X,
debido a que la seal de C no interfiere con la de algunos elementos (S, Pt,Mo,Pb, Nb) en el espectro obtenido. Para imgenes de electrones
retrodifundidos, se emplean elementos de bajo peso molecular, como el Al y C.

Los distintos materiales para depositar han sido utilizados para distintos propsitos, considerando aspectos como:

El depsito conductor adems, debe ser suficientemente delgado para evitar enmascarar detalles de la muestra. En trabajos de rutina, los
espesores oscilan en los 200 .
Una tabla conteniendo los principales materiales utilizados para depositar y las principales propiedades de los mismos, se muestra a
continuacin:

279

Capacidad de conduccin trmica y elctrica en la muestra.


Capacidad para mejorar la seal.
Interaccin con la superficie de la muestra.
Capacidad para permanecer inalterable durante un perodo de tiempo.
Capacidad para formar cubiertas delgadas, uniformes y estables.
Facilidad de deposicin sobre la superficie de la muestra.

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8.9-CONSTANTES FISICAS DE VARIOS ELEMENTOS EMPLEADOS EN LA FORMACION DE FILMS CONDUCTORES.

Al

Au

Pd

Pt

Nmero Atmico

13

79

46

78

Densidad
Kg/m x 10-3

2.70

2.26

19.30

12

21.5

Conductividad Trmica
300 KW/ cm K
300

2.37

1.29

3.17

0.718

0.716

1273

2954

1734

1839

2363

Temperatura vaporizacin en
1.3 Pa (K)

Si no se va a evaporar metales inmediatamente hay que mantenerla seca, puede ser en un desecador de vaco, o en una cpsula con un
agente deshidratante. Hay muestras que son muy higroscpicas y es necesario observarlas inmediatamente a su metalizacin. Ejemplos:
sedimentos y arcillas.

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280

8.10-Cuidados con la muestra despus que ha sido montada:

Los dos mtodos ms usados para cubrir la superficie de la muestra con un metal que la convierta
en conductora del calor y de la electricidad son: evaporacin en vaco y metalizacin por plasma de
Argn. Se explican a continuacin los principios bsicos de cada uno de ellos.

8.11-Evaporador de metales en alto vaco

Mediante esta tcnica, el metal a depositar es calentado hasta su punto de fusin. Un evaporador de vaco tpico, es el que se muestra en la
figura. El sistema est compuesto por una cmara de evaporacin, un sistema elctrico y un sistema de vaco. Dentro de la cmara de evaporacin se
encuentran cuatro electrodos dos de ellos sostienen a una barra de C y los otros dos una canastita de tungsteno (W ) en la que se coloca el metal a
evaporar (Au, Au/Pd, Pt, etc.). Tambin dentro de esta cmara se halla un soporte para ubicar los portamuestras. El mismo puede girar e inclinarse
desde el exterior.
El sistema de vaco est constituido por una bomba mecnica y una difusora. La accin combinada de ambas permite alcanzar una presin
dentro de la cmara de evaporacin de 10-5 Torr.

Metal a depositar

Electrodos

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muestra

281

Alto
vaco

.figs. 8.9

+ +

Todo el sistema debe mantenerse en condiciones de ptima limpieza que proteja a la muestra de la contaminacin externa. El fenmeno de
retrodifusin de vapores de aceite de la bomba difusora puede minimizarse mediante una trampa fra de nitrgeno lquido.
La deposicin trmica se basa en el principio por el cual el calor producido es el resultado de la resistencia que ofrece un material al paso de una
corriente elctrica. El calor es producido gradualmente incrementando la diferencia de voltaje entre dos electrodos. Esto resulta en la produccin de
una corriente desde un electrodo hacia el otro. La resistencia se incrementa a medida que el dimetro del material decrece y el calor producido ser
mayor en el punto ms angosto de la barra de C, comenzando su sublimacin.
Los electrodos que se emplean para evaporar el metal elegido para depositar, estn unidos por una canasta de tungsteno cuyo punto de fusin es
ms alto que el del metal a depositar. Al circular corriente, la canastita se calienta hasta que el metal se funde y vaporiza.
La cantidad de metal depositado puede ser estimado segn la siguiente expresin:

W . sen( ) 4. d 2 . . x

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Por ejemplo: para una distancia entre muestra y metal de 8 cm y una cantidad de Au de 0.014 grs. se obtiene un espesor tpico de 300 .
Esta tcnica ha sido ampliamente usada para producir films conductores delgados. Sin embargo, presenta ciertas desventajas entre las que
podemos citar:
Requiere extremada limpieza.
Expone a la muestra a una fuente de calor que puede deteriorarla.
La continuidad y la conductividad del film depositado para capas delgadas puede no ser de ptima calidad.
En muestras con mucha rugosidad algunas reas no son expuestas al evaporante durante la deposicin.
Consume mucho tiempo

282

siendo W: peso del metal


: densidad del metal.
d: distancia entre muestra y metal.
: ngulo entre muestra y metal.
x : espesor de la capa metlica depositada.

8.11.1- Produccin de films conductores delgados

Un film depositado puede pensarse originado desde mltiples puntos en la superficie de la muestra. La formacin de un film delgado sobre la
superficie de la muestra es un efecto complejo y puede pensarse en tres
pasos: nucleacin, migracin y coalescencia. Cuando los primeros
tomos que llegan a la superficie de la muestra, permanecern all , slo
si pueden difundir, colisionar y adherirse unos con otros para formar
sitios de nucleacin. Cuanto ms fuerte es el enlace entre estos tomos
adsorbidos y el sustrato, mayores sern las frecuencias de nucleacin y
menor el tamao de estos ncleos. A medida que contina este proceso,
los centros de nucleacin crecen y se convierten en islas, las que
coalescen gradualmente para dar un film contnuo. La afinidad del metal
con la superficie de la muestra juega un rol importante, ya que la
capacidad de la misma para absorber humedad determinar la textura
del film depositado. Films metlicos con pobre adhesin y/o
discontinuos se presentan en superficies hmedas o contaminadas .
Fig. 8.10
con hidrocarburos, por ej. Plastificantes
Dao por calentamiento: Si bien la cmara de evaporacin trabaja en vaco, el calor irradiado alcanza la muestra. Los cortos tiempos de
evaporacin empleados rutinariamente hacen que el dao por calentamiento no sea un problema serio.
Sin embargo, el evaporador en alto vaco, es una herramienta til para la produccin de films delgados, especialmente depsitos de C.

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Estos sistemas se disearon para depositar films delgados de metal sobre muestras sensibles al calor, como lo son los materiales biolgicos y los
materiales polimricos, en la actualidad su uso se extendi a la mayora de los materiales.
La tcnica mantiene la muestra a temperatura ambiente, mientras se deposita metal sobre su superficie.

283

1.1.2-Evaporadora de metales en plasma de Argn:

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d= k. i.v. t

284

El sistema consta de una cmara dentro de la cual se encuentra adosado el metal que se desea depositar y el soporte del portamuestra. En
dicha cmara, se hace un vaco de 10-3 Torr. por medio de una bomba mecnica y se introduce un gas inerte, generalmente Argn (Ar).
La excitacin de las molculas de gas, involucra la aplicacin de un campo elctrico entre polos cargados positiva y negativamente. El metal a
depositar est localizado en el polo negativo (ctodo) y el portamuestra en el polo positivo (nodo). (Ver esquema).
Al aplicar una diferencia de potencial, el campo elctrico producido cerca del ctodo hace que las molculas de gas se ionicen y produzcan iones
positivos y electrones libres. Los primeros bombardean el metal cargado negativamente, removiendo partculas del mismo. Estas continan
colisionando con molculas de gas y se mueven al azar. Muchas de estas partculas llegan a la superficie de la muestra desde distintos ngulos
produciendo un film metlico uniforme. El instrumento contiene en la cmara unos imanes que dirigen en todas direcciones las partculas cargadas
colaborando en la deposicin del metal en forma pareja.
El evaporador de metal en plasma de Argn, es ampliamente usado para depositar materiales conductores, tales como metales pesados (Au,
Au/Pd). El estado excitado de las molculas de gas entre el ctodo y el nodo se conoce como plasma y se caracteriza por una luminiscencia color
prpura cuando se usa gas Argn (Ar). Esta es producida por la generacin de iones positivos y electrones libres durante las colisiones entre las
molculas de gas y los electrones que se mueven dentro de la cmara.
La operacin de deposicin es monitoreada midiendo la corriente producida entre nodo y ctodo (corriente de plasma) y se mide en mA.
Los parmetros de operacin del instrumento generalmente los provee el fabricante. Las muestras para estudios morfolgicos de rutina tienen
una cubierta de aproximadamente 300 . La expresin para determinar el espesor del film metlico depositado sobre la superficie esta dada por:
siendo: d: espesor del film
k: constante experimental, funcin del metal. Tiene el valor 0.17 para Au.
i: constante de plasma (mA).
v: voltaje aplicado.
t: tiempo (seg.).
Para valores de rutina tales como: i:18 mA; v: 1 kv, t:60 sg. y k: 0.17, el espesor obtenido es de 360 .

Alto voltaje

Ctodo

Anodo

Vaco
tomos
de metal
Molculas
de
gas
ionizadas

Fig.8.11- Evaporadora de metales en plasma de Argn

8.12-Comparacin entre evaporador en vacio y evaporadora en plasma de argn.

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Ambos procedimientos incluyen contaminacin y pobre adhesin del film a la superficie de la muestra. Estos problemas pueden minimizarse con
el uso cuidadoso y apropiado de los instrumentos. La contaminacin proveniente de la retrodifusin de vapores de aceite de las bombas de vaco es
un problema de ambos sistemas. La evaporadora en plasma de Argn emplea menor vaco durante la deposicin y los contaminantes son ms
fcilmente removidos de la cmara de vaco que en la deposicin trmica la cual emplea mayor grado de vaco.

285

La comparacin entre ambas tcnicas de deposicin se basa en considerar la uniformidad del film para evitar efectos de carga de la
muestra durante la observacin, el calentamiento de la misma y la produccin de artefactos durante la deposicin.

Contaminantes en la cmara de vaco, pueden ser responsables de la poca adherencia de los depsitos. Hidrocarburos, vapor de agua u otros
materiales sobre la superficie de la muestra puede prevenir la deposicin de films delgados. Debe ponerse mucha atencin en el mantenimiento y
limpieza de estos sistemas como as tambin en el secado y composicin de la muestra. Materiales voltiles y lquidos no voltiles deben ser
eliminados antes de hacer el depsito.
Respecto de la uniformidad de films delgados sobre superficies rugosas, la evaporadora en plasma de Argn, tiene ventajas sobre el evaporador
en vaco.
Evaporadora de Carbn:

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286

Es el mismo sistema similar a la que la evaporadora de metales de alto vaco pero con presiones de alrededor de 10-3 torr. Trabaja con dos
electrodos. Se utilizan barras o fibras de carbn dependiendo de los cabezales que posea el evaporador.

Captulo IX

Protocolos ejemplo para SEM

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287

Prof. Viviana Sorrivas e Ing. Mara Julia Yaez.

9- Protocolos gua para la preparacin de muestras para Microscopa Electrnica de Barrido:


9.1-Tejidos blandos animales:

Doble fijacin: Primera fijacin con glutaraldehdo y segunda fijacin con tetrxido de osmio.
Procedimiento:
Cortar un trozo de tejido y lavar en solucin fisiolgica.
Lavar la sangre, mucosidad y cortar en trozos ms pequeos ( menor que 1mm de
dimetro ya que los fijadores tardan una hora para penetrar 1mm)
Colocar el tejido en glutaraldehdo: 2,5% en tampn fosfato 0,1M pH 7,2 por 48 horas.
Lavar con tampn fosfato 0,1M en 3 cambios de 30 minutos.
Remuever el tejido y colocarlo en una solucin de OS O4 1% para llevar a cabo la
segunda fijacin durante 2 horas.
Lavar con agua bi destilada en tres lavados de 30 min. cada uno.
Deshidratar en una serie de concentraciones crecientes de acetona ( 50,75, 95 y 100%
tres veces) por 10 min. cada uno.
Secar en el desecador por punto crtico.
Montar el espcimen asegurando una buena adherencia, si hace falta agregar puentes
de pintura de plata. Dejar secar.
Metalizar con oro u oro-paladio. (dependiendo de la resolucin que se requiera, al oropaladio es para mayor resolucin).

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288

Fig.9.1-Imagen de clulas de epitelio ciliar ( Atn: Dra. Elena Galindez)

9.1.1 Protocolo para procesar geles.

Las muestras fueron recibidas en solucin fijadora de Glutaraldehdo 2,5% en buffer fosfato de Sorensen 0,1M, ph 7,2. Eran discos de 1 cm de
alto por 2,5 cm de dimetro ( aprox.), se tomaron varios cubos de 2mm. de lado de zonas ms internas de la muestra.
Se procedi a pasar las muestras re- seccionadas a una solucin fresca de fijador con buffer.
Se lavaron 3 veces buffer fosfato de Srensen. por espacio de 30 minutos.
Se comenz la deshidratacin desde 30% alcohol ( 50, 75 , 100% tres veces) y 1 acetona /1 alcohol y pura un cambio.
Se realiz el secado por punto crtico ( Critical point dryer) desde acetona 100% y con CO2 como lquido intermediario, en un equipo Polaron (
England) .
Se evapor oro en una evaporadora de metales en plasma de argn ( Sputter coater ) aproximadamente 300 angstrom de espesor.
La observacin se realiz en un microscopio electrnico de barrido a un potencial de aceleracin de 5 Kv.

9.2 Clulas libres:

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Colocar las clulas libres en una solucin de glutaraldehdo al 1% en 0,1M de


tampn
Separar las clulas libres por centrifugacin (1.500 rpm.) y descartar el
sobrenadante.
Fig9.2-.espermatozoide humano

289

Algunos tipos de clulas son muy sensibles a la presin osmtica del fijador, como por
ejemplo: los eritrocitos y los espermatozoides. Por ejemplo, algunos eritrocitos aparecern
esfricos si la presin osmtica es baja, mientras que aparecern verrugas si es alta, estas
formaciones son las llamadas ARTEFACTOS en microscopa electrnica.
Procedimiento:

Colocar el tampn fosfato, pH 7,4 en el tubo de centrfuga, agitar, dejar unos minutos (10 a 15min.) en suspensin, centrifugar
nuevamente y desechar el sobrenadante.
Deshidratar en una serie de concentraciones crecientes de acetonas (60, 70, 80, 90, 95, y 100%) por lo menos 10 min. cada uno.
Resuspender las clulas en 100% acetona. luego haga gotear con una pipeta la solucin sobre un cubreobjeto, secar rpidamente bajo
corriente de aire.
Evaporar metal sobre la muestra.
Una variante: (Laboratorio de UAT)
Colocar las clulas libres en una solucin de glutaraldehdo al 2,5% en 0,1M de tampn fosfato pH 7,2 agitar y colocar una gota
conteniendo una concentracin adecuada para que las clulas se dispersen bien, sobre un cubreobjetos con poli-l-lisina claramente
identificado. Deje fijar por 20 o 30 min. a una hora.
Desde este momento y en todos los pasos subsiguientes, tratar el portaobjetos como si fuera la muestra sin dejarla al aire. Quitar la
solucin fijadora absorbiendo el lquido con una pipeta Pasteur. Lavar con tampn fosfato, pH 7,4 (10 a 15min.) .
Espermatozoide humano
Deshidratar en serie de concentraciones crecientes de acetonas (25, 50, 70, 90 y 3 veces 100%) por lo menos 10 min. cada uno.
Realizar el secado por punto crtico.
Montar la muestra adhiriendo el cubreobjeto al portamuestras del microscopio.
Evaporar metal sobre la muestra.
9.3-Microorganismos en suspensin:

Secar por punto crtico.


Montar en un portamuestras adecuado segn el microscopio se vaya a utilizar.

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Concentracin ptima: 10 organismos por ml.


Agregar 3 gotas a 1,5ml de fijador ( glutaraldehdo 2,5% en tampn fosfato 0.067M pH 7,2).
Fijar a un soporte y dejar con la solucin fijadora 30min. Como se trata de microorganismos utilizar un cubreobjeto con poli-l-lisina o un
filtro nucleopore que no se disuelva con solventes orgnicos, si es un cultivo en agar, raspar y resuspender en solucin salina.
Lavar con tampn fosfato.
Realizar la deshidratacin gradual ( 25%, 50%, 75% y 3 veces 100%).

290

Procedimiento utilizado en el lab. de Microscopia Electrnica UAT:

Generalmente la penetracin de los fijadores no es un problema. Se ha


obtenido una buena fijacin en tiempos tan cortos como 10 minutos en GA, 3%
seguido de OsO4 10 minutos. Si se realiza un procedimiento de rutina que lleva
involucrado TEM y SEM, se puede fijar con ambos fijadores por espacio de una
hora y no presenta problemas. Puede realizarse colocando el cultivo en la
solucin fijadora o cambiando el medio de cultivo por la misma. El cultivo en
fijador puede almacenarse por una semana. Luego se reaizan tres lavados con
buffer fosfato o cacodilato de sodio 0.1M + 0.1M de sacarosa. La molaridad
del vehculo es de 300 mOs, seguido de la fijacin con OSO4 en el mismo buffer
por 1 hora. La deshidratacin se realiza en alcoholes.

Fig.9.3- bacterias.

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Los medios slidos para cultivos son muy utilizados. Ya sea agar o metilcelulosa, mientras tenga una viscosidad de 1500 a 6000 centipoise. En
estos casos lo que se hace es realizar una primera fijacin en el medio de cultivo, luego se filtra y se prosigue como si el filtro fuera la muestra.
Yamatori,T Para no romper la morfologa de la colonia realiza la fijacin con vapores de OS O4 al 2% por 10 min. ( ver fijacin por vapores )
Funciona muy bien con hongos.

291

9.4-Microorganismos en agar:

9.5-Bacterias

Ref:

Postek
1.- Seleccionar los especmenes adheridos al agar.
2.- Sumergir en FAA (formol-acido actico- alcohol) por 24 horas a
temperatura ambiente.
3.- Lavar en agua destilada.
4.- Deshidratar por 24 horas en 2,2 dimetoxy-propano acidificado
(DMP) acidificado con Cl H (1 gota de CLH 750 ml. DMP).
4.- Transferir la muestra a acetona, dejar 48 horas y secar por punto crtico.

Fig..9..4-bacilos

Imagen de bacteria de tos convulsa Bordetella Pertussis Gentileza: Dra. Daniela Bottero.

Maugel,T.K 1980
Mtodos de relajacin:
El anestsico debe aplicarse gradualmente hasta que el organismo est suficientemente anestesiado y no reaccione cuando se lo estimula. El
tiempo depende de la muestra, desde pocos minutos a varias horas. Luego debe realizarse la fijacin de inmediato.
Anestsicos locales: novocana, xilocana y otros.

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REF:

292

9.6-Organismos acuticos

9.7-Plancton ( Lab. de microscopa Electrnica de la UAT)

1. Filtrar la muestra con un filtro que no se disuelva con solvente orgnicos.


2. Colocar los filtros en recipientes adecuados para el secado por punto
crtico.
3. Fijar con una solucin de glutaraldehdo 2, 5% en 0.1M de tampn
fosfato preparada con agua de mar filtrada.
4. Para eliminar las sales transferir las muestras a concentraciones
decrecientes de agua de mar. Despus de la fijacin.
5. Deshidratar en series crecientes de etanol.
6. Secar en el desecador por punto crtico.
7. Montar y evaporar oro.

Fig. 9.5- diatomea


9.7.2-Protocolo para fijar zooplancton. (Laboratorio de Microscopa Electrnica UAT)

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293

1. Filtrar bajo vaco (suave) el agua de mar con jeringa para filtros (por ejemplo
Nucleopore) tener en cuenta que no se disuelva con acetona.
2. Colocar los filtros cpsulas para secado por Punto crtico (adaptar el tamao
del filtro a la cpsula, si se corta no exponer al aire).
3. Sumergir los filtros en 2% solucin de Glutaraldehdo en agua de mar filtrada (
muy importante)
4. Luego de la fijacin, lavar en concentraciones decrecientes de agua de
mar, para quitar las sales que pueden haber quedado. Cambiar las soluciones
sin exponer al aire las muestras.
Fig:9.6 radiolario

5.
6.
7.
8.

Deshidratar los filtros (la muestra) con series de etanol en agua desde 25% , 50 % 75% y 96% y dos cambios en acetona 100%.
Realizar el secado por punto crtico.
Montar los filtros y evaporar oro u oro/paladio.
Observar de en el microscopio de Barrido entre 5 y 7 KV:

9.7.2.1 Protocolo SEM para huevos de coppodos

Fig.9.7 huevo coppodo

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294

1-Prefijar huevos de coppodos en: agua de mar formol 4% ( formalina). Se pueden


preservar en formalina o en FAA. (ver receta).
2-Enjuagar con agua de mar filtrada (0.20 m)
3-PROCESO DE LIMPIEZA: 1 ULTRASONIDO 30 SEGUNDOS (Lozano y Morales, 1986),
2 Acido clorhdrico 1%( 30 minutos)(Tcnica de palinizacin Van- Waveren y Marcus,
1993; Lozano y Morales, 1986).
3-Enjuagar con agua destilada.
4-Deshidratar en alcoholes. Ethanol 30%, 50%, 75%,95%, 100% (tres veces) Cada 15
minutos, realizado a temp. ambiente agitando los viales.
6-Punto crtico y metalizacin con oro en evaporadora de metales en plasma de argn
por 60 .

9.8-Vegetales:

El tratamiento que se le realice a los vegetales depender de lo que se quiera observar y de la naturaleza del tejido u rgano.
Algunos puntos importantes para tener en cuenta:

Fig9.8:. Imagen de corte transversal de una hoja

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295

Si se va a estudiar la muestra por microscopia electrnica de Transmisin y


tambin por barrido conviene realizar una sola fijacin, la misma para ambos.
Si se fijan separadamente, para barrido se recomienda usar soluciones de
fijacin isotnicas y para transmisin, algo hipertnicas.
Tampones, los ms usados son: fosfato de sodio y cacodilato de sodio.
pH : cerca de la neutralidad.
Temperatura: algunos autores ( HAYAT) recomiendan fijar a temperatura
ambiente, mientras que otros de 0 a 4C. Duracin: una fijacin prolongada con glutaraldehdo endurece los tejidos y
puede ser una ventaja para microscopa electrnica de barrido, pero al
realizar la deshidratacin pueden extraerse constituyentes lipdicos.
Deshidratacin: los agentes para deshidratacin ms utilizados son acetona y
alcohol.
Secado: a. - al aire desde solventes orgnicos
b. - secado por punto crtico.
c. en estufa de vaco.

9.8.1 Procesamiento para la observacin de semillas por SEM

Las semillas se colocaron en Nitrgeno lquido y se fracturaron con cuchilla de


acero. Se montaron en portamuestras de aluminio se adhirieron con cinta
conductora adhesiva doble faz. Se montaron de manera que la superficie de
corte se orientara hacia el detector de electrones secundarios. Se evapor oro
con una evaporadora de metales en Plasma de Argn y se observaron en un Mic
de barrido a 5 kv.

Fig.9.9 Corte longitudinal de semilla de quinoa

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Solucin fijadora: Glutaraldehdo al 4% en tampn cacodilato de sodio 0.1 M ( pH 7,2)- Una pieza de tejido se cort segn la necesidad de
observacin con una hoja de afeitar en gajos de 2mm x de lado y se coloc inmediatamente en el fijador.
Se dej 2 horas a temperatura ambiente.
Se lavaron las muestras con la solucin tampn cacodilato de sodio 0.1 M ( pH 7,2).

296

9.8.2 procesamiento de frutos (arndanos, cerezas, guindas, frutos rojos, etc.)

Se deshidrataron en pasos de 30 minutos con: acetona 30%, 50%, 75% y 100%t


tres veces.)
Se secaron por punto crtico en un equipo POLARON ( ENGLAND) Fludo intermediario,
CO2 .
Se montaron sobre cinta adhesiva doble faz con la cara a observar hacia arriba.
Se evapor oro en una evaporadora en plasma de Argn.
Las muestras se observaron en un Microscopio de Barrido a un potencial de aceleracin
de 5 KV.

Fig.9.10 Cereza.

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Las muestras fueron recibidas en seco.


Se realiz el montaje en portamuestras de bronce con cinta adhesiva doble faz
de aluminio. Se dispersaron los granos de almidn .
Se vapor oro en una evaporadora de metales en plasma de argn. ( Sputter
coater ) aproximadamente 300 Angstrom de espesor.
La observacin se realiz en un microscopio electrnico de barrido a un
potencial de aceleracin de 5 Kv.
Fig.9.11 almidn

297

9.8.3allmidn

9.9-Notas de inters (vegetales)

Pelos, glndulas, clulas epidrmicas: es mejor verlas en microscopio ambiental o


en presin variable, pero se pueden observar con el de alto vaco tambin
realizando el protocolo de fijacin y secado por punto crtico.
En el caso de ceras, se ha tenido buenos resultados secando es estufa a 30 por
varios das las hojas y luego metalizando oro, un detalle es la observacin con bajo
voltaje, menor a 5 KV.
En el caso de rganos florales, si no se posee un instrumento ambiental o de presin variable se puede fijar con FAA deshidratar y secar por punto crtico. Es
importante atender a las instrucciones del secado por punto crtico y no dejar la
muestra nunca al aire. (ver secado por punto crtico). El caso de las diatomeas que
deben ser observadas a altos aumentos para poder se requiere de una clasificarlas
buena limpieza por lo que son recomendados el bao ultrasnico y diversos
lavados.
Dado que el tetrxido de osmio es un reactivo caro adems de muy peligroso y
difcil de disponer como residuo, se trata de utilizarlo lo menos posible. Por
esa causa, generalmente, se fija con glutaraldehdo o FAA, se deshidrata con
acetonas y se seca por punto crtico.

Fig.9.12 Alga Anabaena.

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El material particulado puede encontrarse: seco, con un cierto contenido de humedad o en suspensin. En funcin de estas
caractersticas se seleccionar procedimiento de preparacin de muestras adecuado. Se deber considerar: la informacin que se desea
obtener, las caractersticas del material (morfologa, distribucin de tamaos, detalles superficiales, etc.), el soporte o adhesivo en el cual
se colocar la muestra, la cantidad de especmenes a preparar, el tipo de metal que se emplear en la metalizacin.

298

9.10-Polvos particulados

9.10.1- Partculas en seco

9.10.1.1-Mtodo 1: Dispersin por espolvoreo

La dispersin obtenida del material sobre la cinta, depende, en gran medida, de la velocidad de espolvoreo, la distancia a la cual se
realiza y del tamao promedio de las partculas.

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Fig. 9.10.1 Mtodo de dispersin por espolvoreo

299

Este mtodo es ampliamente utilizado en la preparacin de particulas secas para observacin en SEM. Es rpido, sencillo y no requiere
agentes dispersantes.
Procedimiento: Con la ayuda de una esptula se esparce el material particulado sobre una cinta adhesiva doble faz adherida al
portamuestras SEM. Las partculas caen, al azar, por gravedad sobre la superficie de la cinta (Fig.9.11.1).

El mtodo presenta algunas desventajas, como por ejemplo, la inhomogeneidad de la dispersin observada como acumulacin de
partculas en algunas zonas y la escases de las mismas en otras. Otro efecto no deseado del mtodo es la superposicin de partculas, en
sistemas con una amplia diversidad de tamaos.

9.10.1.2-Mtodo 2:Dispersin bajo corriente de aire

La dispersin de partculas obtenida sobre la cinta depende de la densidad de las partculas, el flujo de aire aplicado, la distancia entre el
portamuestra y las partculas, la forma y el tamao de las partculas.

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Fig.9.10.2: Mtodo de dispersin bajo corriente de aire

300

Una variante del mtodo de espolvoreo, es la dispersin bajo corriente de aire.


Procedimiento: El material particulado es arrastrado por una suave corriente de aire facilitando que el mismo se disperse sobre una cinta
adhesiva doble faz adosada al portamuestras SEM. (Fig.9.11.2)

Las desventajas que se presentan con este mtodo de preparacin en general estn ligadas con la mala dispersin de las partculas en el
portamuestra. La diferencia de densidad, tamao y formas de las mismas ocasiona disparidad en el arrastre que sufren las partculas,
dando como resultado ausencia de partculas con similares caractersticas y extrema presencia de otras.
Otro efecto negativo del mtodo es la prdida de material que no queda adherido a la cinta adhesiva.

9.10.3-Mtodo 3:Dispersin en recipiente semi-cerrado:

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Fig. 9.10.3: Mtodo de dispersin en recipiente semi-cerrado.

301

El mtodo consiste en generar un movimiento envolvente de las partculas en un recipiente semi-cerrado.


Procedimiento: se coloca la muestra particulada en un recipiente abierto. Se ubica una cinta adhesiva cubriendo parte de la abertura del
mismo. Se hace circular una corriente de aire para provocar el movimiento de las partculas, las cuales quedan adheridas aleatoriamente a
la cinta. Posteriormente, se retira la misma y se coloca la cara sin partculas sobre el portamuestra SEM . (Fig. 9.11.3)

La densidad, el tamao de las partculas y el caudal de aire aplicado tienen una fuerte incidencia en la dispersin lograda. Se encontr
que en sistemas particulados con diversidad de tamaos, las partculas ms grandes escapan fcilmente del recipiente, quedando
adheridas a la cinta, mayoritariamente las partculas pequeas.
Otra desventaja del mtodo es la acumulacin de material sobre los bordes del recipiente.

fig.9.10.4- Cenizas volcnicas

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Si se desea obtener una buena dispersin de las partculas utilizar el mtodo por suspensin. Para su preparacin es necesario seleccionar un
lquido inerte en el cual se suspender el material. Por esta razn ser importante tener en cuenta la composicin qumica de la muestra de manera
tal que no sufra alteracin al contacto con el lquido. Alcohol etlico, agua bi-destilada y alcohol isoproplico son los ms utilizados. Los alcoholes se
prefieren sobre el agua dado que poseen una tensin superficial menor que el agua y ayudan a una mejor dispersin del material durante la
evaporacin del lquido.

302

9.10.2-Partculas en suspensin lquida

Procedimiento:
1. Dispersar el polvo se en un lquido inerte escogido formando una suspensin.
2. La suspensin se coloca en un bao ultrasnico 15 - 30 minutos aproximadamente para lograr una buena dispersin del
material.
3. Con una pipeta se deposita una gota de la solucin anterior sobre un vidrio cubreobjetos limpio.
4. Se deja secar a temperatura ambiente en ambiente limpio.
5. Se evapora metal en su superficie.

Para muestras que ya se encuentran en suspensin se sigue el procedimiento anterior a partir del paso 2. Es importante que la muestra est
suficientemente diluida para evitar la aglomeracin de partculas. Se aconseja preparar muchos especmenes de suspensiones diluidas en lugar
de pocos con diluciones concentradas. Si no se conoce la naturaleza de las partculas ni la concentracin es conveniente preparar varios
especmenes a distintas diluciones.

9.11-Muestras filtradas

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a) Filtros nucleopore de policarbonato: Son lisos y permiten la observacin directa de las partculas, sin necesidad de removerlas del mismo.
b) Filtros de camino tortuoso: las partculas entran en el interior del filtro, siendo necesaria la remocin o exposicin de las mismas para su
observacin SEM. Con este propsito se puede realizar un ataque qumico parcial del filtro, exponiendo uno de los lados del filtro a vapores
de un solvente adecuado (por ej. cloroformo).

303

Muchas muestras de partculas son colectadas sobre un filtro, por ej. partculas ambientales. La preparacin de esta clase de muestras para
su observacin en SEM, depende de la naturaleza del filtro y de las partculas.
Existen diferentes tipos de filtros los cuales son utilizados en diversas aplicaciones. Entre los ms usados se pueden citar:

fig 9.11.1. Filtro

Si se desea remover las partculas se pueden realizar los siguientes pasos:

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Un mtodo alternativo para remover partculas desde un filtro es colocar al mismo en un lquido inerte con ambos materiales y utilizar un
aparato de ultrasonido por 1-2 hs. Las partculas se desprendern y quedarn suspendidas en el lquido. Se toma una alcuota de esta suspensin
y se coloca en un cubreobjetos de vidrio. Se deja secar a temperatura ambiente. Este mtodo tiene la desventaja que no todas las partculas
logran desprenderse y si se realiza una distribucin de tamaos la misma puede verse afectada en determinados rangos de tamaos.

304

1- las partculas expuestas se cubren con un film de carbn (por evaporacin).


2- el film obtenido se da vuelta y se aplica solvente de ataque en el lado del filtro sin atacar hasta disolucin completa del mismo.
3- film de carbn con las partculas unidas al mismo se transfiere a un portamuestra provisto de cinta adhesiva doble faz.

9.13-Fractura (materiales polimricos)

Entre las caractersticas de los materiales polimricos se pueden citar: estn compuestos por elementos de bajo peso molecular (C, H, O, etc.),
su bajo punto de fusin, baja emisividad electrnica y pobre conductividad trmica y elctrica. La preparacin de este tipo de muestras, para su
observacin SEM, deber tener en cuenta dichas caractersticas, en especial la temperatura de transicin vtrea (Tg). Caracterizacin del tipo de
fractura, superficie interna y distribucin de fases de polmeros compuestos son algunos estudios que se pueden realizar por SEM.El mtodo de
preparacin de muestra utilizado con estos propsitos, se realiza fracturando el material por medios mecnicos. Polmero con inclusin de goma
Si la Tg (temperatura de transicin vtrea) es menor que la temperatura ambiente, se debe fracturar el material en condiciones criognicas a fin
de evitar deformaciones del material mediante el siguiente procedimiento:

Es importante, poner atencin cual superficie es la de fractura a fin de realizar el montaje


correcto.

Fig. 9.13.1- polmero con goma incluida

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305

1- Llenar un recipiente trmico aislante (puede ser de telgopor) con nitrgeno


lquido hasta que deje de burbujear.
2- Colocar el polmero dentro del nitrgeno. El cese de burbujas indica que el
polmero alcanz la temperatura de enfriamiento adecuada.
3- Tomar los extremos de material polimrico con pinzas y dejar enfriar las mismas.
4- Aplica una fuerza suficiente para fracturar el material.
5- Retirar las partes fracturadas y se dejar secar a temperatura ambiente.

9.14 Protocolo para procesar muestras de masas hmedas( alimentos) .

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Fig.9.14.1- Imagen de masa de pan con distintos tipos de granos de almidn.

306

Se prepar la solucin fijadora glutaraldehdo al 2.5% en tampn fosfato de


sodio 0.67 M (pH 7,2).
Se colocaron trozos de masa menores a dos milmetros de dimetro en el
fijador.
Se dejaron 2 horas a temperatura ambiente.
Se lavaron 3 veces con el mismo buffer.
Se comenz la deshidratacin desde 30% alcohol ( 50 ,75 , 100% tres veces) y
acetona pura dos cambios.
Se realiz el secado por punto crtico ( Critical point dryer) en un equipo Polaron
(England) .
Se vapor oro en una evaporadora de metales en plasma de argn ( Sputter
coater ) marca Pelco 91000 (aproximadamente 300 angstrom de espesor).
La observacin se realiz en un microscopio electrnico de barrido a un
potencial de aceleracin de 5 Kv.

Captulo X:

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Prof.Viviana Sorrivas , Dra. Alfonsina Morales e Ing. Mara Julia Yaez

307

Artefactos

Se denominan as a errores o malformaciones que aparecen durante la observacin de las muestras y pueden ser debidos
al proceso de fijacin, deshidratacin, inclusin, seccionamiento, contraste, irradiacin o adquisicin de imgenes.

10. Artefactos : Definicin.


10- Factores que inducen alteraciones de la ultraestructura celular anteriores a la fijacin.

La diseccin y el procedimiento experimental provocan alteraciones en la distribucin o forma de organelas especificas. La acumulacin de
productos de metabolismo anormal se ven como inclusiones irregulares, presencia de bacterias, virus, parsitos, etc. Los efectos post mortem son
referidos al cambio de nutrientes y desperdicios entre clulas y sus organelas a travs de sus membranas, que se encuentran perturbadas.
Otros artefactos pueden deberse a la falta de oxgeno (anoxia) del tejido y a problemas en las tcnicas de obtencin de la muestra.
Los artefactos producidos por la anoxia son:
1. Compactacin de la cromatina nuclear.
2. Vacuolizacin, ruptura del retculo endoplsmico liso, aparicin de grnulos que contienen enzimas hidrolticas, crestas mitocondriales y del
R.E. rugoso disgregados.
3. Lisis de las membranas nuclear y plasmtica.

Recordamos que fijacin es el proceso por el cual se intenta mantener la integridad de la muestra a estudiar.
El proceso de fijacin se realiza por medios qumicos o fsicos. La aparicin de precipitados en la fijacin qumica es frecuente observndose como
cambios en el citoplasma o en las organelas.

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308

10.1- Artefactos causados por la fijacin:

Uno de los ms comunes es la aparicin de espacios vacos en el citoplasma, organelas o entre membranas del ncleo o entre crestas y matriz
mitocondriales. En los tejidos vivos, todos los espacios estn rellenos con una solucin acuosa de coloide de protenas y sales (fluido tisular).
Discontinuidad en las membranas: Si se observan membranas segmentadas, seguramente es un artefacto debido probablemente a una
diferencia de osmolaridad entre el medio y el tejido. Los fijadores son transportados a la clula por un buffer, ya que si se realiza la primera fijacin en
una solucin acuosa cambia radicalmente el pH fisiolgico de la clula y los efectos osmticos que se producirn sern muy notables, vindose
como hinchazn o contraccin de la muestra. Palade, (1952); Caulfield, (1957); Tooze, (1964); OBrien et al, (1973); Arborgh et al (1976). Claude
(1961) y Malora (1962) determinaron que el pH caa de 6.2 a 4.4 cuando las clulas eran fijadas con solucin de Osmio acuosa. Una cada del pH, ya
sea por muerte natural de la clula o por otro mecanismo reduce las macro protenas en pequeos fragmentos ionizados. Como la ultraestructura es
una funcin de las protenas, si la conformacin de stas se pierde aparecern disrupciones a nivel morfolgico. El efecto es similar al de la muerte
natural de la clula, donde una cada del pH por disociacin macromolecular comienza la autolisis.
Entonces hay que usar buffers artificiales para acomodar los iones generados en la reaccin hacia un nivel cercano a los valores fisiolgicos. La
tonicidad (respuesta volumtrica de las clulas sumergidas en una solucin) es tambin controlada por el buffer. El buffer cumple el propsito de
llevar tambin electrolitos tales como Calcio o Magnesio o no electrolitos como glucosa o sacarosa. Generalmente los tejidos vegetales tienen un pH
de 6.8 a 7 y los animales de 7.0 a 7.4.

10.2) Artefactos de fijacin en TEM

Los azcares se metabolizan antes de la fijacin.


Los aminocidos y ATP difunden.
Los lpidos no fijados se lavan en la deshidratacin.
Se preservan mal las mucosustancias.

10.2.3- Falsa localizacin: el glucgeno o el hierro en el hgado, por ejemplo.


10.2.4-Prdida de la actividad biolgica (enzimtica o la antigenicidad): la fijacin puede esconder epitopes o centros activos. En este caso se
puede intentar con crioultramicrotoma, tripsina, fijacin en presencia de sustratos o microondas.

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309

10.2.1- Tiempo de agona


Anoxia: Se produce cuando el bloque de tejido es de tamao grande. Las clulas de la superficie del bloque se fijan, pero las centrales sufren
anoxia o por dficit de gliclisis aerbica baja el ATP se alteran las bombas de Na+/K+ aumenta el Na+ intracelular edema celular.
10.2.2-Prdida de sustancias:

10.2.5- Reacciones inespecficas:


La fijacin con glutaraldehdo deja un exceso de aldehdos (cuidado con las reacciones con plata) y peroxidasa, que luego
dan marcajes inespecficos.
La fijacin con formaldehdo aumenta el marcaje de aminocidos tritiados.

10.2.6-Alteracin del volumen de las estructuras:

La mala regulacin de la osmolaridad trae errores al hacer morfometra.


La clula es sensible, dependiendo de las bombas Na/K- ATPasas, y las organelas, por ejemplo dependen de la ATPasa que concentra calcio dentro de
la mitocondria.

EJEMPLO: En este caso se realiz la primera


fijacin con glutaraldehdo al 2 % en tampn
fosfato 0.1 M a pH7.3, la segunda fijacin con
tetrxido de osmio al 1%, se deshidrat con etanol
y se embebi en resina araldite. Las retracciones
del tejido que se observaron fueron las que se
muestran en el grfico

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Las retracciones mximas se vieron en hgado y


pncreas.

310

Tambin depende de la presin osmtica de las protenas intracelulares,que disminuyen


la concentracin de agua dentro
de la clula.

Fig.10.1

10.3-Artefactos causados por deshidratacin e inclusin para TEM

Es importante el paso de deshidratacin ya que luego contina la infiltracin en resina y no puede quedar agua en el tejido ya que la
mayora de las resinas son hidrofbicas. SI queda algo de agua la polimerizacin ser discontinua y habr problemas en los pasos
subsiguientes. Adems podrn aparecer agujeros grandes y pequeos. Como se ha referido en el captulo de deshidratacin hay fluidos
deshidratantes como acetona, alcohol etlico que son los ms comunes. El xido de propileno se considera tambin de uso comn. (Se usa en
los pasos previos a la inclusin desde acetona o alcohol 100% porque es inmiscible en agua).

10.4-Resinas epoxi:

desplazamiento de elementos del tejido en el bloque.


movimiento de secciones bajo el haz.
desvo en el contraste de la imagen y cambios de dimensin de la muestra.

311

Artefactos ms comunes:

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El agente deshidratante debe ser lo


ms anhidro posible y guardarse a
temperatura ambiente

Uno de los artefactos ms comunes es la alteracin en el tamao de las


organelas por problemas en la formulacin de la resina o
por separacin de los constituyentes de la resina durante la infiltracin.
Mezclado: Si los componentes de la resina no estn bien mezclados habr
problemas en la polimerizacin.
Estabilidad de la resina:
Las epoxi son muy inestables (Mollenhauer, 1986)

Desplazamiento: movimiento relativo de los elementos del tejido con respecto a la matriz de inclusin.
Bajo el haz: inmediatamente de expuesta la seccin al haz, puede moverse cientos de angstrom. La primera causa es inducida por el
calentamiento y vaporizacin de la resina y tambin las cargas elctricas. Las cargas del haz de electrones atrapadas en la seccin se repelen
entre s, esto genera fuerzas que mueven la seccin. Los efectos de carga son ms pronunciados inmediatamente de expuesta la seccin al haz de
electrones mientras la resina sigue siendo buena aislante y antes de que las secciones se carbonicen o calienten.
Probablemente las resinas epoxi se hacen conductoras cuando son calentadas. Una manera de prevenir cuando hay mucha carga es evaporar
carbn sobre las grillas de ambos lados.
Contraste: Vara de acuerdo a la frmula de la resina. Algunas pueden rechazar los agentes de contraste.
Puede ocurrir prdida de masa de la secciones o que los constituyentes de la resina se evaporen cuando el haz calienta los cortes.
Dependiendo de la frmula de la resina y de la intensidad del haz la muestra puede perder hasta un 20% de la masa total. Si la imagen electrnica
es primariamente el resultado de la diferencia de masa, el contraste de la imagen sera proporcional a la prdida de masa.

10.5-Artefactos en seccionamiento ultra fino

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Un bloque duro requiere velocidades de corte ms bajas.

312

Todos los pasos que llevan a obtener buenos resultados en la obtencin de imgenes de transmisin son importantes. El seccionamiento de las
muestras biolgicas es un paso fundamental que requiere de la habilidad y paciencia del ultramicrotomista.

La muestra que se seccionar se encontrar


embebida en una resina que deber estar
perfectamente polimerizada
Una pobre infiltracin y embebido darn como
resultado la aparicin de artefactos.

Perfil del
Ultramicrotomista:
1. Paciencia
2. Desarrollo de
la habilidad.
3. Dedicacin
4. Pulcritud

10.6-Artefactos relacionados con la ultramicrotoma

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313

Cuando la cuchilla toca la zona del taco de resina tallado para realizar la seccin, ejerce una presin que puede llegar a deformar el corte. Hay
dos tipos de deformacin segn Black (1971): elstica (reversible) y plstica (irreversible).

10.6.1-Parmetros para tener en cuenta

10.6.1-AMBIENTALES:

El ultra micrtomo deber estar ubicado en una sala aislada, en donde no haya corrientes de aire, ni vibraciones, no debe estar cerca de reas
de mucho trnsito.

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Entre los artefactos que se presentan al variar las condiciones ambientales podemos encontrar por ejemplo : diferencias en el grosor de las
secciones alternantes, denominadas chatter, que se observan como bandas ms oscuras (gruesas) y ms claras (ms finitas) que se forman
cuando se realizan los cortes y se resalta la diferencia durante la observacin al Microscopio Electrnico de transmisin. Las bandas claro-oscuras
pueden observarse en un rea del espcimen o en toda la seccin. En este ltimo caso se debe a una diferente composicin del espcimen con
respecto a los alrededores. El chatter se ve y se reconoce por ser paralelo al borde de la cuchilla.
Entre las posibles causas del chatter se incluyen una vibracin de alta frecuencia que ocurre cuando la cuchilla y el bloque de resina interactan, o
la vibracin de componentes del ultra micrtomo tales como el block que contiene la muestra, el porta muestras, la cuchilla que no est bien
asegurada, etc.
Otro problema puede ser que la cara de corte del bloque sea demasiado grande, habr que tratar de reducirla a un tamao menor de 0.5mm de
longitud en la parte ms larga del trapezoide y los dems lados menores a 0.5mm.

314

10.6.2-Chatter

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Para corregir este artefacto primero el ultramicrotomista deber asegurarse que los parmetros anteriores estn controlados, de esa manera si
no se soluciona el problema del chatter podr: cambiar el ngulo de la cuchilla o la velocidad de corte,
Otros parmetros a tener en cuenta son la temperatura y humedad del ambiente en donde se encuentra el ultramicrtomo. Si el ambiente se
encuentra muy hmedo, o muy clido ser ms difcil conseguir secciones viables.

315

Fig.10.2 chatter

Fig.10.3 mellas

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316

Las cargas estticas debidas a la sequedad del aire pueden dificultar el seccionamiento o la recoleccin de las secciones. Para evitarlo se pueden
hacer descargas de chispas con un encendedor piezoelctrico ( magiclic)

El trapezoide se ve acortado en su alto con respecto a su ancho (borde que da a la


cuchilla) y el grado de compresin depende de la dureza del bloque las zonas ms blandas
se comprimen ms. Al microscopio se ven como ondas y arrugas. Para prevenir este
artefacto, la resina deber ser de la dureza adecuada respecto de la muestra. Una vez
cortadas las secciones se puede remediar estas arrugas utilizando lo que se denomina
planchado que se realiza con vapores de cloroformo, xileno o tricloro etileno con un papel
enroscado en un palillo y pasado por encima de las secciones embebido en el solvente. (sin
tocarlas y muy rpido) cuando las secciones estn todava flotando en el agua. Se puede ver
este efecto de planchado observando el color de la seccin al cambiar su grosor.
10.6.4- Marcas de cuchilla:

Se reconocen al TEM como rasguos perpendiculares al filo de la cuchilla y pueden


deberse a imperfecciones de la cuchilla, mellas, debido a sus reiterado uso (cuchilla de
diamante) o zonas de la muestra de mayor dureza que se arrastran en el corte (slice en
gramneas,)uesos, semillas etc).

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Las arrugas son provocadas al colocar los cortes en la grilla. Hay dos formas de capturar los
cortes: 1), tocando los cortes con la grilla por arriba y 2) recogiendo los corte por debajo. Por
supuesto no es tan fcil, requiere habilidad que se adquiere con experiencia.

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10.6.6- Arrugas al recoger la seccin:

fig.10.5

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10.6.3- Compresin:

10.6.7- Secciones irregulares:

Fig.10.6- Imagen superior: corte delgado, imagen inferior: corte grueso

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Las secciones en corte salen gruesas y finas en forma alternada. Puede deberse a que el boque es muy blando, se remedia aumentando la
velocidad de corte, pero puede provocar mayor compresin. Tambin observar el nivel de agua de la cubeta en la que caen los cortes. Una solucin
para los tacos blandos es colocarlos en la estufa a polimerizar nuevamente hasta que endurezcan.
El trapezoide deber estar bien tallado con las dimensiones apropiadas. Los bordes del trapezoide no deben tener superficie irregular para
favorecer la formacin de la cinta (ribbon)

10. 7- No se logran cortes en serie:

Si no se consiguen es debido a que la cara de corte ha sido mal tallada, por lo tanto es necesario seguir las indicaciones apropiadas. La superficie
de corte de la cuchilla debe ser perfecta, sin mellas ni basura. Por eso conviene tallar una trapezoide lo ms pequeo posible.

<0.5mm
<0.5mm
0.5mm

posicin correcta zona dura

posicin incorrecta zona dura

10.8-Contaminacin de las secciones debido a ultramicrotoma:

Puede ser en forma de partculas presentes en el aire, bacterias o productos qumicos como solventes, grasa, etc.
Es conveniente que el instrumento no est expuesto a corrientes de aire y el ambiente se encuentre lo ms limpio posible.
Cuando el operador se encuentra con un proceso infeccioso deber usar mscara adems del protector de acrlico para los cortes.
Ref: Klomparens Karen. L. from Michigan , State University , East Lansing, Michigan.

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Pueden ocurrir por una mala operacin del microscopio en s mismo o por problemas de manufactura del equipo o del tubo de rayos catdicos.
Las primeras se deben a que las condiciones de operacin no son las adecuadas para tomar la imagen. Las variaciones en la velocidad de barrido
pueden deberse a fallas en el generador de barrido o movimiento de la muestra por no estar sta debidamente sostenida, contener humedad o que la
carga producida en la muestra por una mala metalizacin produzca una desviacin del haz de electrones. Podra pensarse que la causa de esas fallas
es fcil de detectar pero no es as.

320

10.9.1-Distorsin en las imgenes por:10.9.1.1- problemas mecnicos

Una distorsin de la imagen tambin puede ser causada por una desviacin del foco, producida por el movimiento de la muestra o por la
inestabilidad del voltaje de aceleracin o variaciones en la corriente de las lentes. Si el foco cambia en el medio de una foto dar la impresin al
observador que una parte esta a otro nivel.

10.9.1.2-Penetracin del haz:

La mayora de las investigaciones en SEM son realizadas con muestras que han sido deshidratadas. Al remover el agua de los tejidos cambia la
densidad. La penetracin del haz es un problema importante. El haz penetrar varias capas dentro de la muestra y puede suceder que los electrones
emerjan de zonas ms internas entonces la superficie puede aparecer transparente. Puede reducirse este problema utilizando metales pesados en su
fijacin, pero lo ms conveniente es reducir el voltaje de aceleracin. Tambin una gruesa capa de metalizado reduce la penetracin del haz, pero
enmascara detalles superficiales. El propsito de metalizar es hacer la muestra conductora y no detener la penetracin del haz.

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Astigmatismo, tanto como disminucin del contraste son causados por la contaminacin de la columna y del espcimen con material de
baja conductividad elctrica, el cual se carga cuando es golpeado por electrones dispersados y esto introduce campos electrostticos que
pueden variar en fuerza durante la carga y descarga del material contaminado.
La variacin en la fuerza del campo puede hacer que la imagen se mueva en determinada direccin. La contaminacin de la columna,
usualmente del porta muestras, produce un movimiento en la imagen cuando se mueve la iluminacin del haz. Con el tiempo, pequeas
estructuras de la muestra se oscurecen con una capa de contaminacin y el contraste del espcimen se reduce totalmente debido a la
deposicin de una capa de contaminacin. El grosor resultante produce un efecto de aberracin cromtica que limita la resolucin.
Afortunadamente, la contaminacin se elimina cuando se usa un accesorio anticontaminante.

321

10.9.1.3-Contaminacin

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10.9.1.4- Deriva de la imagen e inestabilidades mecnicas.

322

Fig.10.7. Contaminaciones

Tiempos de exposicin de 1 a 4 segundos son los requeridos para adquirir una imagen que implica que el movimiento del espcimen por unos nm
por Segundo puede limitar la resolucin de la imagen. El movimiento de la imagen pueden ser provocado por inestabilidad del porta muestras y el
soporte del mismo.
10.9.1.5-Desviacin trmica.

Se debe a la expansin o contraccin del film soporte o la expansin asimtrica de la grilla cuando
son expuestos al haz, es una causa comn de imgenes borrosas.
El desplazamiento trmico se puede deber a que los films soporte son demasiados finos, la presencia
de partculas de suciedad, el contacto entre el film soporte y la grilla, a la presencia de agujeros o
roturas. Una forma de minimizar el dao trmico es reducir el rea de la muestra que ser expuesta al
haz, de esa manera se disminuye el calentamiento del espcimen. Por eso conviene usar grillas con
film y carbn o grillas de cobre, que son buenas conductoras del calor.

El sitio donde est ubicado el instrumento puede tener vibraciones debido al trfico exterior, a
golpeteo de puertas, terremotos, etc. causando una imagen borrosa en la direccin de la vibracin.
Una apropiada ubicacin de los instrumentos es indispensable para obtener buenos resultados. Las
vibraciones de la bomba mecnica deben ser anuladas as como las vibraciones en la columna del
microscopio.

Fig.10.8- Una doble exposicin de un


agujero de carbn que muestra el
movimiento entre las dos exposiciones
y tambin el depsito de una lmina de
contaminacin que demuestra una
disminucin en el dimetro del agujero.
Magnificacin ~300,000X. (de Agar)

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10.9.5.6-Vibracin Mecnica

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Desviaciones nfimas pueden no verse durante la observacin, pero s, al obtener la fotografa


como una imagen borrosa en una direccin. La cantidad de desviacin puede medirse haciendo
exposiciones mltiples en determinado perodo de tiempo. Se puede distinguir de astigmatismo
comparando las imgenes obtenidas bajo determinadas condiciones de enfoque.

10.9.5.7- Inestabilidades elctricas y magnticas.

Las variaciones de la corriente de la lente inducen fluctuaciones en la longitud focal. Estas fluctuaciones son rpidas, e imgenes de diferentes
magnificaciones y rotaciones se superponen. El uso de lentes superconductoras con un pulso de voltaje simple, hace que la corriente fluya por un
tiempo indefinido y reduce las fluctuaciones de corriente. Las columnas de los Microscopios Electrnicos estn construidas de materiales diseados
para aislar el haz de electrones de campos exteriores, magnetos, equipos elctricos grandes, etc. El efecto del campo ambiental ser uniforme a
travs del campo de visin y con respecto a esto, ser similar en apariencia al efecto de la vibracin mecnica. Si el origen del problema es una
campo, la imagen borrosa ser reducida a altos voltajes, mientras que si el borroso resulta de vibraciones mecnicas la magnitud del efecto no
cambiar a diferentes voltajes, an como grillas no-ferromagnticas como de cobre, imgenes de regiones de la muestra que estn cercanas a la grilla
no sern registradas.

10.10-Artefactos propios de la microscopa electrnica de barrido (SEM)

Astigmatismo: El campo de la lente magntica no es simtrico y deforma en un sentido ms que en otro. Puede ser causado por suciedad en
la columna, apertura o porta espcimen. Con los correctores de astigmatismo del instrumento se corrige esta asimetra.
.

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324

10.10.1-Artefactos ms comunes durante la observacin en el microscopio

Fig.10.9La imagen de la derecha aparece borrosa y deformada. No tiene buen foco.


Una pequea cantidad de astigmatismo imperceptible a bajas magnificaciones es muy notable a altas. Este tipo de aberracin no permite
tener una imagen con foco ntido. Aparece completamente deformada. Se evita con el microscopio escrupulosamente limpio y con la debida
correccin de astigmatismo.

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325

Carga: en grano de polen : Euphorbia sp


Fig-10.10

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Cambios estructurales.

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Fig.10.11- Carga

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Hifas de hongos que al deshidratarse cambian


su estructura.

Dao por radiacin. Fig.10.12- cambios estructurales

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Fig.10.13- Epidermis de hoja despus de ser observada a presin variable unos minutos.
Este tipo de ao es irreversible y el grado de deterioro de la muestra se puede determinar si se tiene una idea previa de la apariencia superficial.
Conociendo los bordes agudos, estos podran perder agudeza. Y tambin se perder turgencia. Se deber preparar la muestra nuevamente teniendo
especial cuidado en el secado.

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Este dao es irreversible, ya que daa la superficie de la muestra. Se puede ver como grietas, burbujas o manchas.
Vara de una muestra a otra. Tambin se observa en muestras donde el haz craquea las capas contaminantes sobre la superficie,
especialmente a altas amplificaciones. Aparece como una mancha oscura del tamao l rea irradiada.
Se demostr ( Thornton, 1968) que algunos films de xidos sobre semiconductores pueden absorber una capa de aceite de las
bombas difusoras o mecnicas. El haz craquea esta capa. Por este efecto se ve un rea oscura al bajar la magnificacin ( fig. de la
izquierda). Una forma de evitar el dao hecho por el haz primario es reduciendo la energa del haz o bien su intensidad
mediante la disminucin del tamao de la apertura final o incrementando la corriente de las lentes.
Daos por vaco.

Defectos de carga debido a la esfericidad de la partcula.

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Fig.10.14-

329

Dao por fallas en la columna:


La mayora de las fallas en la columna provocan distorsiones en la imagen, debidas a una mala alineacin del haz de
electrones respecto del eje ptico o a suciedad. Tambin cuando la apertura final est desalineada se presentan
efectos similares.
Una imagen ruidosa puede reconocerse por su granulosidad. Se origina por varias razones: carga de la muestra,
pobre contacto elctrico en el sistema colector, reduccin de la sensibilidad del detector (centellador) o rpida
velocidad de barrido.

Pobre emisin electrnica.

Fig.10.15- Si la imagen se presenta ruidosa, se


dificulta la observacin de pequeos detalles. Para que
la imagen no presente este tipo de problemas se debe
saturar bien el filamento, chequear el funcionamiento
del sistema colector y tomar las micrografas a una baja
velocidad. Se aconseja utilizar filtros para quitar el
ruido. La mejor resolucin se obtendr con un haz de
mucha energa y pequeo tamao. Sin embargo la
eleccin del potencial de aceleracin depende del
material que vaya a estudiarse. Para un tamao
pequeo de haz, se ajustan las lentes condensadoras, se
disminuye la apertura final y se acorta la distancia de
trabajo para reducir la profundidad de foco.

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330

Fig

Fig.10.16

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331

Vibraciones en la columna del microscopio

10.10.2 -Daos producidos en la muestra durante la preparacin


Algunas causas probables:

332

Las burbujas sobre la superficie, pueden deberse a que el lavado inicial fue mal realizado o el fijador hipotnico.
Las burbujas explotadas son causadas por el uso de un fijador hipotnico.
Las depresiones en la superficie de las clulas aparecen cuando el secado al aire es incipiente.
Los cristales sobre la superficie pueden deberse a la precipitacin de los electrolitos del buffer.
La separacin de las clulas, si el tejido fue congelado, se debe a un congelamiento mal realizado.
La ruptura de clulas o la presencia de arrugas se debe a una pobre fijacin, congelamiento o secado por aire incipiente.
Si la superficie no ha sido bien preparada, limpia y seca se puede presentar carga.
Si el secado no fue bien realizado aparecen arrugas y deformidad en la forma de las clulas o en el caso de materiales
inorgnicos, carga.
Una mala ubicacin de la muestra en el portamuestra puede no permitir la observacin del detalle que quiere
observarse.
Una mala adhesin de la muestra al portamuestra provoca movimiento de la misma cuando es fotografiada y rayas de
carga.
Si la muestra es de partculas y est mal calculada la dilucin puede haber superposicin de partculas, una mala
evaporacin de metal lo que hace que no sea buena conductora.
Hay que lograr que el portamuestra sea conductor, se pueden hacer puentes de pintura de plata.
Si la muestra tena en su superficie mucus y no fue bien preparada, el detalle que quiere observarse quedar oculto.

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Captulo XI

Micrografa Electrnica

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333

Tc. Carlos Alberto Jones

11-La Micrografa Electrnica


11.1-El cuarto oscuro electrnico: Imgenes digitales.

Un sensor CCD no detecta directamente los electrones primarios rpidos, los electrones deben ser primero convertidos a una seal de luz,
usando una fina capa de material, conocida como centellador. Los electrones rpidos sufren un proceso de dispersin en el centellador al generar
luz en este proceso, se desvan significativamente de su camino original, luego de la dispersin al azar. Como resultado, la resolucin de la imagen de
luz es inferior a la imagen original de la muestra. El control y minimizacin de esta prdida de resolucin de la imagen durante la conversin de
electrones a luz, es una tecnologa crtica en el diseo de una cmara de CCD de alta resolucin.
Hay adems una prdida de resolucin, debida al sistema de transmisin de la luz (por fibra ptica o lentes pticos)
En otras palabras, un electrn que afecta al centellador, genera una mancha de luz, debido a la prdida global de resolucin, mas que un punto
solo. Esta mancha es lo que forma la imagen en el sensor CCD.

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Para entender la resolucin de una cmara de CCD, se debe tener en cuenta la prdida de resolucin explicada anteriormente y tambin el
tamao del pixel. En un diseo ptimo, el tamao del pixel del sensor CCD, debera ser del tamao de la mancha. Ya que esta es generada por un
nico punto, producido por un nico electrn en la imagen original. Idealmente, esta mancha debera corresponder a un nico pixel en la imagen
detectada. Si no es as y el pixel es menor que esa mancha, el punto invadir ms de un pixel en el sensor. Esto se llama untado y genera una
prdida de definicin en los bordes (sharpness). En este caso, la cmara tendr una pobre resolucin, a pesar del alto nmero de pixeles de su sensor.
(Resolucin: la mnima distancia que hay entre dos puntos contiguos para ser distinguidos como entidades separadas).

334

11.2-Importancia del tamao del pixel:

11.3-Cmo se puede saber si todos los pixeles en una cmara CCD, contribuyen a mejorar la resolucin?

La mejor forma de comprobar esto es usar el test de resolucin de lnea, como se realiza en los instrumentos pticos.
La idea bsica es ver cul es la mnima distancia entre lneas que el sensor puede resolver. (Resolucin del sensor)
Solamente cuando un par de lneas es resuelta con aproximadamente 2 pixeles, se puede concluir que todos los pixeles en la cmara
CCD contribuyen a mejorar la resolucin.

Conclusin:

El teorema del muestreo digital de Nyquist de 2 pixeles por par de lneas , describe el lmite de usar puntos
discretos para representar seales continuas.

El nmero de pixeles de la cmara no define su resolucin. La resolucin verdadera y significativa se puede obtener solamente por la
correspondencia del tamao del pixel y el de la mancha generada por el electrn.

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En las publicaciones se debe colocar siempre la barra indicadora del tamao. Salvo que se trate de una imagen artstica. Tambin en la publicacin
debe constar el instrumento utilizado, con marca, modelo y su ao de fabricacin. El procesamiento de la muestra para la obtencin de la micrografa
y los detalles operativos, como potencial, distancia de trabajo, ngulo de inclinacin, detector utilizado y todo lo que el cientfico considere
importante para poder repetir la foto publicada.

335

11.4-Publicacin de las micrografas:

11.5-Imagen digital:

En la fotografa tradicional, al revelarse la pelcula obtenemos una imagen impresa sobre papel fotogrfico. En cambio con la imagen
digital tenemos un archivo informtico. (Con extensiones : .jpg, .bmp, .tiff, etc)

La imagen digital est formada por una serie de matrices numricas de ceros y unos que se almacenan en una memoria informtica y
que definen las caractersticas de una fotografa.

Una vez que esta imagen es interpretada (leda), el software apropiado la transforma en una imagen visible a travs de la pantalla e
imprimible a travs de cualquier dispositivo de salida. La gran ventaja del archivo digital es que puede duplicarse y copiarse tantas veces
como se quiera.

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La trayectoria que sigue la informacin en la cmara para formar la imagen digital es la siguiente: La luz que detecta el objetivo de la cmara llega
hasta el sensor de imagen, denominado CCD, formado por multitud de receptores fotosensibles denominados fotodiodos. La luz incidente genera
una pequea seal elctrica a cada receptor. Posteriormente, esta seal se transformar en datos digitales por el conversor ADC, como una serie de
cadenas de nmeros ceros y unos, denominados dgitos binarios. Estos nmeros binarios (O,1 ), se representan como pequeos cuadraditos, en forma
de mosaico individual denominados pxeles.

336

11.5.1-Formacin de la imagen digital

Fig. 11.1
11.5.2-El sistema binario y su funcionamiento

La informacin que procede del sensor de nuestra cmara digital est formada por datos analgicos. Para que estos datos se puedan almacenar
en la tarjeta de memoria y que el software pueda interpretarlos se deben convertir a formato binario bytes.

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337

El software reconoce un estado activo que lo representa con el (1) y otro estado inactivo que lo representa con el (0). Las cifras binarias se forman por
un nmero total de ceros y unos. Estos ceros y unos tienen el doble del valor que el primero potencia de 2, 8, 16 etc.
Un BIT es igual a la unidad mnima de informacin del sistema binario, siendo el 0 y el 1. Un byte es igual a 8 bits u octeto.
En esta imagen se puede observar cmo se forma un Byte y el valor de cada bit.

El nmero de esta cadena de bits, es el resultado de multiplicar cada BIT por su valor de posicin, (1x1), (1x2), (0x4), (1x8), y as sucesivamente hasta
llegar a obtener el resultado final el 43.

11.5.3-Pixeles: Los puntos de una imagen

Al visualizar todos los pxeles juntos, uno al lado de otro, dan la impresin de continuidad respecto a la tonalidad del color, formando as la
imagen.

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Pero en el caso de la fotografa digital, este granito pequeito es substituido por el pixel. La imagen que obtenemos ya sea a travs de una pantalla, o
un escner o una cmara digital, es un enorme mosaico lleno de millones de pixeles. Cada pixel o cuadrito contiene la informacin del color de esa
pequea porcin.
El pixel solo puede ser de color rojo, verde o azul (RGB). Un pixel, solo tiene un color no puede tener dos colores.

338

Si comparamos con la fotografa tradicional, observamos que una pelcula fotogrfica est formada por pequeos granitos formados por haluros
de plata sensibles a la luz, stos al encontrarse muy juntos forman la imagen que vemos. Cada uno de estos granitos es la unidad ms pequea que
hay en una fotografa tradicional.

11.5.4-La resolucin, cantidad de pxeles

La resolucin de la imagen, es la cantidad de pixeles. La resolucin se utiliza tambin para clasificar casi todos los dispositivos relacionados con la
imagen digital ya sean pantallas de computadora o televisin, impresoras, escneres, cmaras, etc.
La resolucin expresa el nmero de pixeles que forman una imagen de mapa de bits. La calidad de una imagen, tambin depende de la resolucin que
tenga el dispositivo que la capta. El nmero de pixeles que contenga una imagen depende de cuntos pixeles utilice el sensor CCD de la cmara para
captar la imagen.

La resolucin de una imagen digital se expresa


multiplicando su ancho por la altura en pantalla. Por ejemplo la
imagen de 1200 x 1200 pxeles = 1.440.000 pxeles, expresado
en Mp megapixel es igual a 1,4 Mp. Conviene tener en cuenta

Fig.11.2

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339

que 1 Megapixel = 1024 pixeles.

11.5.5-La resolucin de la impresin: Puntos por pulgada (ppp) Pxels por pulgada (ppi)

La resolucin expresada en (ppp) o (ppi), son pixeles por unidad de longitud, es decir, los pixeles por pulgada. La pulgada mide 2,54 cm. La
resolucin define la cantidad de pixeles que contiene una imagen y la dimensin de estos pixeles expresan de qu forma se reparten en el espacio. La
resolucin es la relacin entre las dimensiones digitales (los pixeles) y las fsicas, las que tendr una vez impresa sobre papel.
Para calcular el tamao en pxeles a tamao en centmetros para la impresin podemos aplicar la siguiente frmula:
* Tamao de impresin= Nmero de pxeles/ Resolucin (PPI pixeles por pulgada)
Podemos poner como ejemplo la imagen siguiente:

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Existen diferentes resoluciones, depende del trabajo o destino que le demos a la imagen. Se recomiendan las siguientes:
* Imgenes para visualizar en pantalla ordenador o subir a Internet : 72 ppp
* Imgenes para impresin de 150 ppp como mnimo, pero se aconseja los 300 ppp, dan ptimos resultados.

340

Fig.11.3

11.5.6-Pixelacin

En la fotografa tradicional se produca el famoso efecto de granulacin cuando se ampliaba la fotografa, en cambio en la imagen digital este
efecto es substituido por el de pixelado.

Si reproducimos una imagen con baja resolucin quiere decir que el pixel ocupa ms espacio y deforma la imagen con el efecto de
pixelado, (pxeles de gran tamao) aportando poca definicin a la imagen. En cambio si la resolucin en ppp, es ms alta, existe ms
detalle y ms definicin.

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Sabemos que el pixel es una pequea porcin de una imagen y que a su vez guarda en l una pequea parte del tono de color de esa misma imagen.
La profundidad del BIT o profundidad del pixel o profundidad del color, estima los valores que puede llegar a tener cada pixel que forma la imagen. Si
tiene ms cantidad de bits por pixel ms colores, mayor resolucin de imagen y mayor tamao del archivo

341

11.5.7- Cmo guarda el color el pixel: El Bit y el color

La profundidad del BIT se puede medir en:


1 BIT, blanco o negro
8 bits de color y
256 matices de color
24 bits de color o colores RGB, imgenes en color
32 bits CMYK, para impresin de las imgenes
La imagen digital puede ser en escala de grises o en color.
La imagen digital que utiliza un solo BIT para definir el color de cada pixel, solamente podr tener dos
estados de color el blanco y el negro.

fig.11.4-

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Con 8 bits se muestra una imagen de 256 tonos de grises diferentes y comparable con una imagen de las tradicionales en blanco y negro.
Cuantos ms bits tenga una imagen mayor nmero de tonos podr contener la imagen. Lo normal es 8 0 16 bits. Utilizando los 8 bits slo existe
256 tonos o estados.

342

8 bits 256 tonos de grises

24 bits de color
Una imagen digital en color se crea con los parmetros en R G B, por la sntesis aditiva, el color rojo, verde y azul.
Sntesis aditiva
Si anteriormente necesitbamos 8 bits para captar una imagen de 256 tonos de un solo color, ahora precisamos 8 bytes, es decir 24 bits:
* 8 bits de color rojo.
* 8 bits de color verde.
* 8 bits de color azul.
para llegar a representar el tono adecuado a cada pixel de la fotografa en color.

Una imagen de 24 bits de color, mostrar 16,7 millones de colores, los suficientes para mostrar cualquier matiz de color que se necesite. Los 16,7
millones de colores los traduciramos a 256 tonos de color azul x 256 tonos de verde y 256 tonos de rojo, el resultado de esta operacin es lo que da
los 16,7 millones de colores.

11.6-Formatos de archivos

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11.6.1-Imgenes Vectoriales

343

Al captar una nueva imagen a travs de nuestra cmara digital o bien a travs cualquier otro dispositivo de entrada como el escner,
obtenemos una imagen digital en dgitos binarios, tal y como hemos explicado anteriormente.
Actualmente existen muchas clases de archivos del tipo informtico, pero para guardar el archivo existen muchsimos formatos y cada
programa informtico utiliza su propio tipo . En este apartado explicaremos algunos de los formatos de archivos de imgenes que utilizan
las cmaras digitales, as como los archivos que utilizan diferentes clases de software, programas informticos.

Las imgenes digitales pueden ser mapa de bits o vectoriales. Las imgenes vectoriales son grficos formados a base de curvas y lneas a travs de
elementos geomtricos definidos como vectores. La gran ventaja de las imgenes vectoriales es que no sufren prdida de resolucin al producirse una
ampliacin de los mismos. Se utiliza mucho para trabajos de rotulacin, rtulos, iconos, dibujos, logotipos de empresa etc. Esta clase de imagen tiene
poco peso como archivo informtico, medido en Kilobytes.
Este tipo de archivos lo utilizan programas de dibujo y de diseo tales como: El Adobe Ilustrator, Freehand, Corel Draw entre otros.
Otra particularidad de esta clase de archivos es que solo pueden visualizarse a travs del programa que los cre, sino se transforman en mapa de bits.

11.6.2-Mapa de bits

Los archivos de las imgenes se guardan normalmente en forma de mapa de bits o mosaico de pixeles. Cada pixel guarda la informacin de color
de la parte de imagen que ocupa.
Este tipo de imgenes son las que crean los escneres y las cmaras digitales. Esta clase de archivos ocupan mucha ms memoria que las imgenes
vectoriales.
El principal inconveniente que presenta esta clase de archivos es el de la ampliacin, cuando un archivo se amplia mucho, se distorsiona la imagen
mostrndose el mosaico de pixeles y una degradacin en los colores llegando al efecto pixelado (definido en el apartado de imagen digital), debido
a la deformacin de la fotografa.
La imagen de mapa de bits, al ampliar excesivamente su tamao pierde nitidez y resolucin.

Las cmaras digitales suelen realizar una forma de compresin del archivo para reducir el tamao del mismo, eliminan lo que carece de
valor, pero una vez que se visualiza de nuevo la imagen, el proceso de compresin se invierte.
Existen diferentes clases de archivos digitales, unos sufren prdida de calidad y otros no.

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Los formatos de archivos digitales almacenan la informacin codificando en toda la imagen cada pixel de forma individual, esto ocasiona
que el archivo pese mucho (ocupa mucho espacio en MB a la PC) y no pierda ninguna clase de informacin.

344

11.6.3-Compresin de los archivos digitales

Las cmaras digitales utilizan un formato que mantiene el archivo de la imagen en su estado virgen, en el cul no realizan ninguna clase
de compresin y el archivo se mantiene en su mxima calidad, igual que en el momento que se capt la imagen. Podemos citar el
formato RAW y el TIFF. Otros formatos sin prdida de calidad: BMP,EPS, PSD, PDF.

11.6.4-Formatos con prdida de calidad

En la imagen y archivos digitales, existen formatos de archivo que desechan informacin innecesaria al almacenarlas sufriendo una prdida de
calidad, pero con la ventaja de que obtienen archivos informticos con menor peso y espacio en las computadoras, hacindolas ms manejables.
Algunos de estos formatos: JPEG, GIF, PNG.

11.6.5-Formato de archivo Tiff

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Al almacenar un archivo en formato TIFF, este lo guarda con 48 bits de color incluyendo capas y canales alfa.

345

TIFF, viene de Tagged Image File Format, es un formato que lo desarrollo Aldus, una Compaa propiedad actualmente de Adobe. Es un tipo de
archivo estndar para guardar imgenes de alta calidad, ya que es compatible con los sistemas operativos Windows, Linux, Mac, etc. Se encuentra
reconocido por muchos programas de retoque y edicin grfica, tales como Paint Shop Pro, Adobe, Quark, Corel etc. No obstante si tenemos alguna
duda sobre como enviar un archivo para su impresin o edicin, optaremos por el formato universal TIFF, para que se pueda abrir y editar sin
problemas.

fig.11.5
No obstante el formato TIFF empieza a no utilizarse en lo que respecta a algunas cmaras fotogrficas profesionales, porque al procesar una foto
con tanta informacin, resulta difcil de moverla, visualizarla etc., este proceso lo ralentiza muchsimo, adems de que ocupa mucho espacio en la
tarjeta de memoria de la cmara, por esto las cmaras incluyen el formato JPEG y el formato RAW para la calidad del archivo.
En cambio utilizar el formato TIFF para escanear una imagen, es adecuado porque el archivo se manejar directamente en la PC, y puede destinarse
tambin para la impresin precisando para ello de la mxima resolucin posible.

Los datos del archivo RAW, no han sufrido ninguna clase de compresin, lo que hace que este archivo mantenga el mximo detalle de la imagen.
Estos archivos son de tipo pticos para imgenes de especial importancia.
Uno de los inconvenientes que presenta el formato RAW: El peso del archivo, ocupa mucho espacio y no podremos guardar la misma cantidad de
imgenes en nuestra tarjeta en este formato. Este archivo RAW, no se puede imprimir ni visualizar directamente, precisa del tratamiento informtico

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El formato RAW, slo se encuentra disponible en cmaras digitales sofisticadas, indicadas para fotgrafos profesionales. Este formato ofrece la
mxima calidad ya que contiene los pixeles en bruto tal y como se han adquirido.
Normalmente en el funcionamiento de los otros formatos que utilizan las cmaras digitales (Tiff y JPEG) participa el sensor para transmitir la seal
elctrica y convertir los datos de analgicos a digitales, pero en cambio los pixeles que capta el procesador de la cmara en el caso del RAW, no se
procesan ni transforman, se mantienen tal cual. A ste proceso se le llama tambin negativo digital.

346

11.6.6-Formato Raw

y realizar conversin que se pueda utilizar.


La gran ventaja es que los datos del formato RAW son puros del sensor de la cmara. Uno de los programas que trata los archivos RAW, es el camera
Raw de Adobe.

11.6.7-Formato de archivo BMP

Esta clase de formato lo utiliza el sistema de Windows y el Ms-Dos, para guardar sus imgenes. Este sistema de archivo puede guardar imgenes
de 24 bits (millones de colores), 8 bits (256 colores) y menos.
Para esta clase de archivos puede seleccionarse una compresin RLE (Run Length Encoding) sin prdida de calidad.
El uso ms comn de este formato, es generar imgenes de poco peso y no se aconseja utilizarlo en imgenes recin captadas, sino en imgenes
una vez reducidas a los 24 bits. Se utiliza mucho para crear fondos para el escritorio de Windows.

11.6.8-Eps: Encapsulated Postscript

Aunque fue creado por Adobe, una vez que se abre el archivo con Photoshop los datos de la imagen y los grficos vectoriales que pueda contener el
encapsulado se rasterizan, es decir se convierten a pixeles.

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EPS es adecuado para realizar intercambio de archivos entre programas de maquetacin, tales como page Maker o quarkxpress incluyendo los de
dibujo vectorial (Freehand o corel). Es junto con el formato TIFF, uno de los estndares en el mundo de la autoedicin.

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Este archivo lo ha desarrollado la compaa Adobe y se pueden guardar en este formato, tanto mapa de bits como imgenes vectoriales. Es muy
utilizado en la impresin profesional y en otras aplicaciones llegando hasta la impresora de tipo Postcript.

Si se quiere imprimir un archivo EPS directamente, debemos utilizar una impresora compatible con PostScript.
Estos archivos a su vez son ms lentos en procesarlos que los TIFF, pero en los programas de maquetacin la visualizacin se procesa ms rpida.
Los datos guardados se encuentran dentro de una cpsula, encapsulados, por lo que si se quieren modificar, se deben tratar con el programa que los
cre.

11.6.9-Psd, formato de archivo de photoshop

El PSD es un formato nativo de photoshop y permite guardar todas las presentaciones, retoques, nuevas creaciones realizadas con este
programa. Guarda los archivos con 48 bits de color y permite almacenar todas las capas, canales etc. que exista en el archivo de imagen.
PSD casi no tiene compatibilidad con otros programas, por lo que se recomienda tener dos archivos: uno en el propio formato nativo
(.PSD), y otro en algn formato compatible con otros programas, como JPGE o TIFF. En algunos casos puede ser que tengamos alguna
versin antigua de photoshop y que necesitamos abrir una imagen guardada en PSD y que esta no sea compatible con otras versiones,
con lo que se aconseja activar las siguientes opciones:
* Para Windows, abrimos Photoshop> seleccionamos> Edicin>Preferencias>Manejo de archivos.
* Luego marcamos la casilla de verificacin: compatibilidad para los archivos de Photoshop.

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11.6.10-PDF, portable document format.

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De este modo sern compatibles los archivos con distintas versiones del programa.

Este formato lo cre Adobe para poder intercambiar archivos entre diferentes sistemas operativos. Por ejemplo: un archivo o documento creado
con algn programa de Windows, puede verse en la plataforma Linux o Mac, con slo tener el visualizador de PDF, (Acrobat Reader) disponible
gratuitamente en Adobe y muchos otros sitios.
Este formato guarda con toda precisin el diseo del archivo incluyendo sus fuentes, imgenes y dems grficos.

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.PDF, se utiliza cada vez ms y es considerado otro formato de los estndares junto con EPS y TIFF. Se encuentra muy extendido entre la red, en la
que encontramos numerosos archivos con ste formato.

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fig.11.6

11.6.11-JPEG y la fotografa digital

Este formato lo cre The Joint Photographers Experts Group. Es uno de los formatos ms conocidos para la compresin de fotografas digitales.
Es uno de los pocos formatos que se soporta en Internet (Web)
Todas las cmaras digitales y escneres almacenan las imgenes en formato JPEG, no obstante y dado que la compresin de este formato afecta a la
calidad de imagen, se puede escoger diferentes niveles de compresin:
A ms baja compresin mayor calidad.
A ms alta compresin menor calidad.

original, sin que el ojo humano pueda percibir diferencias, antes y despus del proceso de compresin.
JPEG soporta 24 bits.

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fig.11.7

350

Cuando se opta por una compresin alta, es para crear archivos que ocupen poco espacio para la Web o enviarlas por correo electrnico. JPEG es el
nico formato de archivo, que puede llegar a comprimir una imagen hasta slo un 10% de su tamao

11.6.11.1-Normas a seguir antes de editar un JPEG

Antes de editar una imagen en JPEG, conviene que tengamos en cuenta los siguientes puntos, para no perder calidad en el archivo:
* No guardar imgenes en formato JPEG si se van a modificar.
* Cada vez que abramos un archivo o lo editemos, la imagen sufre una compresin y prdida de calidad.
* Antes de editar una imagen en JPG, la guardaremos inicialmente una copia en formato BMP o TIFF con la mxima profundidad de color.

11.6.12-Formato de archivo GIF

.GIF, es un formato de archivo bastante antiguo. Lo desarroll Compuserve para su propia red comercial. Este tipo de archivo se cre
con la finalidad de obtener archivos de tamao muy pequeos. GIF es muy indicado para guardar imgenes no fotogrficas tales como:
logotipos, imgenes de colores planos, dibujos, etc.
El formato GIF guarda imgenes de 8 bits, no 8 bits por cada color RGB, sino que indexa solo 256 colores cmo mximo.
Para guardar una imagen en formato GIF utilizaremos la opcin Guardar para la Web. Una gran ventaja de este formato, es que
podemos realizar transparencias en la paleta de colores, haciendo que ese color quede invisible.

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Este formato permite crear animaciones a travs de fotogramas secuenciales.

11.6.13-Formato PNG

Considerado un formato para sustituir al famoso .GIF, debido a que el PNG utiliza sistemas de compresin estndares gratuitos, como el mtodo
ZIP, y permite al mismo tiempo mayor profundidad de color en las imgenes, llegando hasta los 24 bits de profundidad de color, mientras que el
formato GIF solo recoge 8 Bits.
Si utilizamos PNG, para comprimir imgenes de 24 bits podremos realizar una interesante compresin sin prdida alguna de calidad. Este formato
tambin posee la caracterstica de reconocer los navegadores, pero en el caso del Internet Explorer, opera a partir de la versin 5.0. Lo nico que
debemos tener en cuenta es que si utilizamos ste formato para la red, los usuarios que posean versiones anteriores del Internet Explorer, no podrn
visualizarlas

La nica diferencia que estriba entre GIF a PNG, es que en PNG, no permite archivos animados

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Los procesos de mejora de imagen pueden agruparse en distintas categoras, teniendo en cuenta el efecto que producen sobre la imagen
(modificacin del brillo y contraste, mejora del contraste, reduccin de ruido, desenfoque o suavizado de bordes, mejora del enfoque o realce de
contornos, delineacin de contornos, deteccin de microestructuras, iluminacin de masas, etc. ). Pero tambin pueden agruparse en categoras
teniendo en cuenta el mecanismo que utilizan para la modificacin de la imagen digital. As, existen algoritmos que modifican el histograma o funcin
de distribucin de las intensidades, algoritmos que filtran determinadas frecuencias y otros que modifican el contenido de cada pxel de la imagen de
acuerdo con el valor de los pxeles colindantes aplicando una funcin predeterminada.

352

11.7-Procesos de mejora de las imgenes

11.7.1-Procesos de modificacin del brillo y contraste por transformacin del histograma.

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Fig.11.8

353

Mejora del contraste de una imagen por normalizacin o expansin del histograma
Frecuentemente, los niveles de gris de una imagen en b/n o los niveles de intensidad en cada componente RGB, no ocupan todo el rango posible
(generalmente 256 niveles), sino slo una pequea parte de los mismos. Esto produce en la imagen un efecto de falta de contraste, debido a la
cercana de las distintas intensidades. El ojo humano no puede diferenciar intensidades muy prximas en un rango de 256 niveles, ya que en general
se admite que el ojo humano distingue menos de 64 niveles de intensidad en una misma imagen.
La operacin de expandir el histograma de valores de intensidad, de tal manera, que sin modificar su forma, se logre que ocupe todo el rango
disponible en el equipo de visualizacin (monitor o impresora) produce un efecto de mejora o aumento del contraste. Este efecto de mejora del
contraste puede ser til para corregir efectos de neblina o ciertos defectos de exceso de luz de Fondo.

Tablas de transformacin de grises


Cuando se genera una imagen en forma digital, se utiliza una funcin que transforma las distintas intensidades de luz irradiadas desde el objeto y
que llegan al sensor de digitalizacin, a valores numricos discretos entre unos umbrales determinados. El umbral inferior corresponde a la cantidad
de luz mnima necesaria para activar el sensor y suele digitalizarse con un valor cero, mientras que el umbral superior corresponde al nivel de
saturacin (nivel por encima del cual no puede distinguir entre distintas intensidades de energa) y se digitaliza con el mximo valor de la escala de
digitalizacin correspondiente al color blanco. Este mximo valor de digitalizacin depende del nmero de bits que se empleen para codificar cada
pixel. En la mayora de los sistemas comerciales, cada pixel se codifica con 8 bits y por lo tanto al nivel mximo o blanco se le asigna el valor 255. La
funcin que realiza esta transformacin de valores de energa luminosa recibidos a valores digitales, se denomina funcin de transferencia.
Cuando se quiere visualizar la imagen digital en un monitor o pantalla es necesario utilizar una nueva funcin de transformacin, que convierta
los valores numricos discretos (digitales) de la imagen digital en intensidades de energa que activan los puntos sensibles del monitor o de la
pantalla. Utilizando una funcin rectilnea de pendiente 1, se pretende que la funcin de transformacin reproduzca los mismos niveles de intensidad
luminosa que digitaliz la funcin de transferencia, o por lo menos que se mantengan las mismas proporciones y relaciones entre los distintos niveles
de intensidad presentes en la imagen y en el objeto convertido en imagen.
Sin embargo, esta relacin de equivalencia 1 a 1, entre los valores de intensidad luminosa del objeto y los valores de reproduccin de la imagen,
no es siempre la ms adecuada para obtener unos resultados de visualizacin ptimos. Por esto, con frecuencia, suelen emplearse funciones de
transformacin ms o menos complejas (logartmicas, exponenciales, polinmicas), que modifican estas relaciones y mejoran los resultados de
visualizacin.

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En el ejemplo siguiente, puede observarse el efecto de una transformacin polinmica de grado 5 sobre una imagen de microscopia electrnica
de transmisin.

354

Las funciones de transformacin pueden almacenarse como tales funciones y cada vez que se visualiza la imagen se calcula para cada valor digital
de cada pixel, cual debe ser el valor de visualizacin, o en muchas ocasiones se almacenan en tablas. Estas tablas, denominadas tablas de
transformacin de grises, guardan para cada valor digital de entrada el valor correspondiente de salida o de visualizacin. En los programas de
proceso de imagen suelen incluirse instrumentos para generar estas tablas de transformacin.

Comparacin de la imagen original muy poco contrastada (izquierda), debido a la poca luminosidad del microscopio, con la
imagen transformada (derecha).

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355

Fig 11.9

Fig.11.10

Fig.11.10

11.8-Filtros de convolucin

Una parte muy importante de los procesos de mejora se basan en la aplicacin de funciones, cuyo resultado depende nicamente de los niveles
de intensidad de cada pixel de la imagen pero no de la posicin dentro de la imagen (position-invariant), que permiten resaltar determinados
elementos de la imagen (como resaltar los contornos de los objetos), mejorar el enfoque o reducir el ruido de fondo.

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356

11.8.1- Teora y definiciones

Estas funciones, a las que por analoga con la teora de seales se las denomina comunmente filtros, se basan en el proceso de convolucin y en
las propiedades de la convolucin respecto a la transformacin de Fourier, lo que simplifica el clculo matemtico y los tiempos de computacin. Por
esto, a muchos de estos filtros, se les sola denominar segn su accin en el espacio de las frecuencias (filtros de baja o alta frecuencia, filtros
direccionales) . Sin embargo, cada vez es ms frecuente, en los sistemas de proceso de imagen, adjudicarles nombres ms de acuerdo con el resultado
visual que producen sobre la imagen filtrada (filtros de enfoque, desenfoque).
Un filtro de convolucin, para una imagen digital, en el espacio real (X,Y), puede representarse como una matriz cuadrada o rectangular (matriz de
convolucin), de dimensiones (M,N) mucho ms pequeas que la de la imagen. La matriz de convolucin se desplaza sobre la imagen de tal forma que
el elemento central de la matriz de convolucin coincida con cada uno de los pixeles de la imagen. En cada posicin, se multiplica el valor de cada
pixel de la imagen, que coincide en posicin con un elemento de la matriz de convolucin, por el valor de este. El pixel de la imagen, que coincide con
el elemento central de la matriz de convolucin, es substituido por la suma de los productos.
As por ejemplo, si tenemos la siguiente matriz de convolucin:
El resultado de su aplicacin ser sustituir cada pixel de la imagen por el promedio de dicho pixel con los ocho pixeles de su inmediato alrededor.

/9
1

/9

/9
1

/9
1

/9

1
1
/9

1
/9

1
/9

357

/9

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Fig.11.12-Ej: filtrado de realce de contornos en Photoshop, aplicndole una matriz de convolucin de 3x3

-1 -1 -1

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-1 -1 -1

358

-1 7 -1

Fig.11.15- Aplicacin de Mscara de enfoque

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359

Fig.11.14- Reduccin de ruido y artefactos de JPEG

Captulo XII

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Mg. Cecilia Gutierrez Ayesta

360

Seguridad en el laboratorio de microscopa


electrnica

El laboratorio de microscopa electrnica constituye un lugar potencialmente peligroso, siendo fundamental la adopcin de
medidas preventivas para garantizar la seguridad de los trabajadores. Existen precauciones universales que se aplican a
cualquier tipo de laboratorio y otras especficas en base a la clase de estudio que se realiza. Adems de los peligros propios
que conlleva el trabajo en un laboratorio de procesamiento de muestras biolgicas y/o qumicas, los protocolos ms
comnmente empleados para microscopa electrnica engloban cuidados especiales. A continuacin se enumerarn los ms
destacados, en base a la informacin hallada y a la prctica obtenida.
12-1.1. Reactivos

Los reactivos empleados en los diferentes pasos de preparacin de muestras para microscopa electrnica (fijacin, lavado,
deshidratacin, inclusin, contraste) poseen distintos grados de peligrosidad. La mayora de estas sustancias puede ingresar al organismo
al ser inhaladas, ingeridas y/o absorbidas por piel. Como regla general e independientemente del tiempo de exposicin o del tipo de
actividad que se realice con el producto, se deben manipular bajo campana y usando los elementos de proteccin personal adecuados.

Utilizar SIEMPRE guardapolvo de mangas largas, anteojos de seguridad,


calzado cerrado o zapatos de seguridad y guantes (caucho, ltex,

qumicos tambin usar proteccin respiratoria.

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En presencia de altas concentraciones, aerosoles, vapores o polvos

361

neopreno, nitrilo, etc).

Se recomienda leer las instrucciones de la etiqueta impresa en el producto y las


hojas de seguridad antes de usarlo, prestando especial atencin en conocer el manejo
seguro de cada sustancia y sus peligros potenciales. Se debe usar las menores

Mantener la higiene del lugar,


no comer, beber ni fumar dentro del
mismo y no guardar productos
alimenticios en donde se almacenan los
reactivos y drogas.
Nunca se debe pipetear con la boca,
tocar con la mano o probar las
sustancias qumicas. El lavado de
manos debe ser frecuente y en especial
al finalizar el trabajo y antes de salir
del laboratorio.

cantidades posibles y en caso de trasvasarlos, rotular los recipientes inmediatamente.

Cabe aqu recordar las normas generales dispuestas para el


laboratorio qumico, entre las cuales se destacan :

En el caso que existiese un derrame o salpicaduras se debe actuar con rapidez para
lograr la neutralizacin, absorcin y eliminacin del producto. Los elementos de
proteccin empleados sern en funcin de la peligrosidad del producto y se debe tener

cada trabajador debe conocer en dnde se encuentra el equipo para la atencin de emergencias.

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fuentes de calor, especialmente si el producto derramado es inflamable. El laboratorio debe disponer de duchas y lavaojos accesibles y

362

la precaucin de quitarse las ropas contaminadas. Es conveniente alejar todas las

A continuacin se enumeran algunas recomendaciones para el manejo de los reactivos ms empleados en la preparacin de muestras
en nuestro laboratorio de microscopa electrnica:

12.1.1.1. Acetato de uranilo

Cancergeno. Qumica y radiolgicamente txico. Posee una toxicidad mayor en relacin a su radioactividad, aunque ambos
peligros deben ser altamente considerados.
Produce trastornos de rin, hgado, pulmn y tracto respiratorio. Acumulativo en el organismo.
Trabajar bajo campana. Emplear proteccin personal adecuada (guantes de goma y anteojos de seguridad).
Almacenar a temperatura ambiente en un recipiente apropiado, lejos de la luz y en un ambiente ventilado.
Descartar en un frasco de vidrio rotulado bajo campana.

Trabajar bajo campana y con elementos de proteccin.


No inhalar. Evitar la formacin de aerosoles y/o vapores.

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Produce efectos nocivos en la salud por inhalacin, ingestin y contacto. Afecta la piel, los ojos, el sistema respiratorio y el SNC.

363

12.1.1.2. Acetona

Almacenar en un recipiente cerrado, en un lugar bien aireado.


Mantener alejado de fuentes de ignicin. Evitar la carga electrosttica
Evitar las temperaturas elevadas, la exposicin a la luz y la formacin de perxidos.
Evitar su eliminacin por el desage. Riesgo de explosin.
Descartar en un frasco de vidrio rotulado bajo campana.

12.1.1.3. Alcohol etlico

Produce efectos nocivos en la salud por inhalacin, ingestin y contacto.


Trabajar bajo campana y con elementos de proteccin.
Mantener el lugar ventilado, fresco y seco, para asegurar que la concentracin no exceda los lmites de exposicin ocupacional.
Rotular los recipientes adecuadamente. Depositar en contenedores hermticamente cerrados.
Evitar toda fuente de ignicin o calor y separar los contenedores de los materiales incompatibles.

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364

Descartar en un frasco de vidrio rotulado bajo campana.

12.1.1.4. Azul de toluidina

Irritante de ojos y piel. Se absorbe por inhalacin, a travs de la piel y por ingestin. Puede causar efectos en la sangre dando
lugar a la formacin de metahemoglobina.
Trabajar bajo campana. Emplear proteccin personal adecuada.
Se descompone al calentarlo intensamente, produciendo humos txicos, incluyendo xidos de nitrgeno. Reacciona
violentamente con oxidantes, especialmente con el cido ntrico. Pueden formarse mezclas explosivas vapor/aire.
Ventilar los ambientes donde se manipula.
Almacenar en recipientes bien cerrados a temperatura ambiente.
Descartar en un frasco de vidrio rotulado bajo campana.

Evitar el contacto con la piel, los ojos y la ropa.


Trabajar bajo campana con elementos de proteccin adecuados.
Almacenar en recipientes cerrados en reas secas, templadas y bien ventiladas.

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Txicos y cancergenos. El cacodilato contiene arsnico.

365

12.1.1.5. Buffer (fosfato y cacodilato)

En caso de derrames, quitarse las ropas contaminadas. Lavarse las manos entre las pausas y al finalizar el trabajo.
Descartar junto con el glutaraldehdo, en frasco de vidrio bajo campana y bidn etiquetado.

12.1.1.6. Citrato de plomo

Cancergeno. Txico. Nocivo por inhalacin e ingestin. Irritante de piel y mucosas. Acumulativo.
Riesgo durante el embarazo para el feto. Puede perjudicar la fertilidad.
Trabajar bajo campana. Emplear proteccin personal adecuada (guantes y proteccin ocular).
Su uso es restringido a personas tcnicamente cualificadas.
Realizar una buena ventilacin (no si es polvo). Evitar la inhalacin de polvo fino y niebla (proteccin respiratoria).
Almacenar en recipientes bien cerrados, en ambiente seco y bien ventilado. Mantener alejado de sustancias inflamables, fuentes
de ignicin y calor, sustancias oxidantes y cidas.
Descartar en un frasco de vidrio rotulado bajo campana. Eliminar el producto y su recipiente como residuo peligroso. Evitar su

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366

liberacin al medio ambiente. Muy txico para los organismos acuticos.

12.1.1.7. F.A.A.

Txico por inhalacin, ingestin y contacto con la piel, los ojos y la ropa.
Trabajar bajo campana. Usar proteccin personal. En caso de formarse vapores/aerosoles, usar proteccin respiratoria.
Manipular alejado de fuentes de ignicin y calor. Evitar las temperaturas elevadas.
Emplearlo en lugares secos, ventilados y frescos. Asegurar que la concentracin no excede los lmites ocupacionales.
Conservar el recipiente que lo contiene bien cerrado.
En caso de derrames o fugas recoger con materiales absorbentes o en su defecto arena o tierra secas. Quitarse las ropas
contaminadas.
Descartar en un frasco de vidrio bajo campana o bidn etiquetado.

Trabajar bajo campana. Utilizar guantes de ltex, caucho butlico, neopreno, o PVC y mscara para vapores orgnicos.
Mantener una buena ventilacin.
Eliminar toda fuente de ignicin.

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Carcingeno, alergnico y sensibilizante. Minimizar la exposicin.

367

12.1.1.8. Glutaraldehdo

Almacenar en recipientes bien cerrados y en lugar fresco, alejado del calor y de material incompatible.
Para su transporte utilizar etiqueta de precaucin. No transportar con sustancias explosivas, sustancias que en contacto con agua
puedan desprender gases inflamables, comburentes y perxidos orgnicos, radioactivas, sustancias incompatibles ni alimentos.
En caso de derrame neutralizar con glicina.
Utilizar material descartable o en su defecto lavar con agua. Recoger la primera solucin de lavado para descartarla.
Descartar dentro de un frasco de vidrio o bidn rotulado y cerrado bajo campana, junto con la solucin de lavado y las soluciones
buffers.
12.1.1.9. Permanganato de potasio

Oxidante fuerte. Se absorbe por inhalacin y por ingestin. Corrosivo para los ojos, la piel, el tracto respiratorio y digestivo. Puede
afectar los pulmones, produciendo bronquitis y neumona.
Trabajar bajo campana. Emplear proteccin personal adecuada.
Manipularlo en lugares ventilados y/o con ventilacin mecnica. Luego lavarse las manos con abundante agua.
Almacenar en envase cerrado, en un lugar seco, aireado y a la sombra, lejos de fuentes de calor y llama viva.

No colocarlo en contacto con sustancias inflamables. Se descompone al calentarlo intensamente, produciendo gases txicos y
humos irritantes.
Descartar en un frasco de vidrio rotulado bajo campana.

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explosin).

368

Reacciona violentamente con materiales combustibles y reductores y con metales en forma de polvo (peligro de incendio o

12.1.1.10. Resina Spurr (epoxi)

Cancergena. Irritante. Afecta los ojos y la piel. Posibilidad de sensibilizacin. Evitar su contacto e inhalacin.
Trabajar bajo campana. Emplear proteccin personal (guantes de de nitrilo, cloropreno o latex, anteojos de seguridad y mscara).
Procurar suficiente ventilacin y aireacin. Evitar la formacin de polvo.
Almacenar en su embalaje original cerrado y respetar las medidas de separacin.
Una vez abierto, almacenar dentro de una campana hasta su desecho, protegido de la humedad y en lugar fresco. Se puede
emplear una lata o una botella.
Evitar el calor intenso, las aminas, alcoholes y bases.
En caso de derrame usar avena o vermiculita.
Cubrir el rea de trabajo con papel y limpiar los derrames inmediatamente con alcohol.
No emplear alcohol para remover resina de la piel debido a que incrementa su velocidad de penetracin. Usar agua y jabn.

etiquetados y bajo campana. Polimerizar cuidadosamente todos los restos de resina antes de descartarlos.

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Descartar la resina y los elementos contaminados (viales, pipetas, tubos) polimerizados, en recipientes cerrados (cajas de cartn),

369

Evitar su liberacin al medio ambiente y al alcantarillado.

12. 1.1.11. Solucin Formvar (resina de polivinil formal-dicloruro de etileno)

Txico. Irritante. Cancergeno. Evitar el contacto con la piel y con los ojos. Se absorbe por inhalacin y por ingestin. La exposicin
prolongada puede causar dermatitis y/o conjuntivitis. Afecta a los riones, el SNC, la crnea y el hgado.
Trabajar bajo campana. Emplear proteccin personal adecuada (proteccin respiratoria).
Manipular en ambientes ventilados.
Lavar las manos y la cara luego de emplearla. Quitarse las ropas contaminadas.
Almacenar en lugar fresco, seco y alejado de la luz solar. Separar de materiales oxidantes, agentes reductores, aluminio, aminas,
cido ntrico, perxidos orgnicos y soluciones alcalinas. La mezcla del polvo con el aire puede ser explosiva. Produce combustin
con monxido de carbono, dixido de carbono, formaldehido, cido actico y acrolena.
Fcilmente inflamable. Evitar fuentes de ignicin como el calor o las llamas.
Recoger los derrames inmediatamente con material absorbente inerte (vermiculita, arena o tierra).

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370

Descartar el producto y los elementos contaminados en recipientes cerrados, rotulados y bajo campana.

12.1.1.12.Tetrxido de osmio

Carcinognico y teratognico.
Altamente peligroso, voltil y reactivo. Su vapor es extremadamente riesgoso y posee lmites de exposicin muy bajos.
Trabajar bajo campana. Utilizar guantes de nitrilo, proteccin respiratoria y ocular.
Almacenarlo refrigerado, en los frascos originales y separado de las sustancias combustibles y reductoras.
Limpiar cuidadosamente el exterior de la ampolla con acetona antes de romperla, con el fin de remover cualquier contaminacin.
Para preparar la solucin de trabajo, verter la mezcla de tetrxido de osmio y agua en una botella de vidrio con tapn envuelto
con film y a su vez colocarla dentro de otra botella. Colocar la botella de vidrio exterior dentro de una tercera botella de plstico
opaco. Dejar bajo campana y despus de doce horas, la solucin est lista para usarse (disolucin completa).
Verificar regularmente la botella que contiene la solucin y reemplazar las envolturas del film, con el fin de evitar la fuga de los
vapores de tetrxido de osmio. En el caso que esto suceda, se observara un ennegrecimiento y se debe retirar inmediatamente el
recipiente hacia otro almacenamiento.
Descartar neutralizado con aceite vegetal (preferentemente de maz), junto con el agua de lavado. Colocarlo en un frasco de vidrio

(guantes, frascos vacos) deben almacenarse de forma separada.

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Utilizar material descartable o en su defecto dejar actuar el aceite y luego lavar con detergente y agua. Los objetos contaminados

371

tapado bajo campana o bidn etiquetado. En aproximadamente dos das, se produce la reduccin del osmio.

12.1.1.13. Tetrxido de rutenio

Irritante de ojos, piel, vas respiratorias y tracto digestivo. Evitar el contacto con la piel, los ojos y la ropa. No inhalar los vapores.
Trabajar bajo campana. Emplear proteccin personal adecuada. Los guantes (neopreno, nitrilo, ltex) deben controlarse antes de
su utilizacin y quitarse sin tocar la superficie exterior. En caso de formarse vapores/aerosoles, usar equipo respiratorio
adecuado.
Lavar las manos y la cara antes de las pausas y al finalizar el trabajo Quitarse las ropas contaminadas.
Asegurar una buena ventilacin.
Almacenar en lugar fresco, seco y bien ventilado y en recipientes bien cerrados (no metlicos). En caso de incendio pueden
formarse vapores txicos de HCl.
No permitir el paso al sistema de desages. Evitar la contaminacin del suelo y el agua.

Descartar neutralizado con sulfato de sodio al 10 % en frasco de vidrio bajo campana y bidn etiquetado. Los envases y
embalajes contaminados tendrn el mismo tratamiento que los propios productos contenidos.

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restos con abundante agua. Neutralizar con solucin de carbonato sdico.

372

Recoger con materiales absorbentes (arena o tierra seca) y depositar en contenedores para su posterior eliminacin. Limpiar los

Fuentes de informacin:
http://iio.ens.uabc.mx/hojas-seguridad/alcohol_etilico.pdf
http://merck.com.ar
http://www.2spi.com.mx/catalog/chem/osmium-tetroxide.shtml
http://www.2spi.com.mx/catalog/chem/Uranyl_Acetate.shtml
http://www.aga.com.ar/International/Web/LG/VE/Likelgagave.nsf/repositorybyalias/pdf_msds_n/$file/Nitrogen.pdf
http://www.analytyka.com.mx/spanish/FDS/R/775994.htm
http://www.apolo.es/pdf/resifix/epoxipure.pdf
http://www.asociart.com.ar/Capacitacionasociart/documentos/Cartel_EPP.pdf
http://www.cicarelli.com
http://www.cisproquim.org.co/HOJAS_SEGURIDAD/Acido_acetico.pdf
http://www.corquiven.com.ve

http://www.ilpi.com/MSDS
http://www.laddresearch.com/wsmsds/10835msds.pdf
http://www.mtas.es/insht

Pgina

http://www.fichasdeseguridad.com

373

http://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/safety.aspx

http://www.pancanal.com/esp/legal/reglamentos/security/safety/116.pdf
http://www.proscitech.com.ar
http://www.scif.com/safety/safetymeeting/Article.asp?ArticleID=161
http://www.sigmaaldrich.com
http://www.tedpella.com/

1.2. Gases comprimidos y licuados

El manejo de cilindros constituye un riesgo para el trabajador debido a su considerable peso y/o tamao, pudiendo generar lesiones
msculo-esquelticas, aplastamiento, golpes, cortes, fracturas y sobre esfuerzo. Asimismo, puede generar explosiones e incendios.
Muchos gases empleados en el laboratorio, al ser envasados a altas presiones, pueden liberarse de forma repentina y daar tejidos
humanos o producir que el cilindro caiga sobre una persona. Se debe tener siempre presente que la liberacin del contenido de un

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Todo cilindro es potencialmente explosivo

374

cilindro es una amenaza fsica y representa un peligro qumico.

Ante una eventual fuga:


* se deben abrir todas las ventanas,
* encender las campanas de extraccin del laboratorio y
* apagar las fuentes de ignicin, especialmente si el contaminante es voltil e inflamable

El personal que manipula cilindros debe recibir capacitacin permanente sobre los peligros y las acciones a seguir en caso de emergencia,
siendo sta una prctica de vital importancia. Las reglas de seguridad que rigen a los cilindros llenos deben ser tambin aplicadas para los
cilindros vacos. Entre ellas se destacan la utilizacin del equipo de proteccin personal (guantes industriales, anteojos de seguridad y
botas con puntera de acero); la sealizacin (Prohibido fumar y Peligro explosin) y proteccin del rea de almacenamiento (daos
fsicos, qumicos y/o mecnicos); el manejo de matafuegos y su mantenimiento a cargo de personal calificado. Para casos que sean
necesarios debe emplearse proteccin respiratoria (mscara o equipos de respiracin autnoma).

A continuacin se enumeran algunas recomendaciones generales, con el fin de lograr una manipulacin y un uso seguro de los tubos o

cilindro.

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Fijarlos individualmente a la pared empleando cadenas, correas o jaulas a aproximadamente las 2/3 partes de la altura del

375

cilindros contenedores de gases:

Rotularlos mediante una etiqueta impresa que identifique su contenido y el tipo de gas (la codificacin por colores no se halla
estandarizada).
Manipularlos cuidadosamente, evitando cadas o golpes y libres de grasa o aceite (especialmente los de oxgeno). Los cilindros
que presentan fugas, daos o dificultades en el funcionamiento de la vlvula no deben ser utilizados.
Almacenarlos en posicin vertical, en espacios delimitados, secos, frescos y bien ventilados (puede ser a la intemperie, protegidos
de la humedad). Deben separarse los cilindros vacos de los llenos (rotularlos como Vacio) y de materiales incompatibles,
fuentes de llama, calor o chispas. Retirarlos en orden de llegada.
Emplearlos lejos de fuentes de calor y en ambientes ventilados.
Trasladarlos en una carretilla, en posicin vertical, atados y con sus vlvulas cerradas. No se deben arrastrar, cargar, rodar ni
deslizar sobre el piso. Cada cilindro se debe mover individualmente.
Transportarlos en vehculos que aseguren una buena ventilacin, separados de las personas, en una posicin segura, atados y con
sus vlvulas cerradas. El conductor debe estar informado sobre los riesgos potenciales y el proceder en caso de accidente. Nunca
deben ser transportados en bales, compartimientos cerrados, cabinas o compartimientos de pasajeros.
Ajustar las vlvulas de forma segura. Deben estar completamente abiertas o cerradas. Abrirlas lentamente y colocarse al costado
del cilindro. Cerrarlas luego de emplear el cilindro, antes de moverlo y cuando se encuentra vaco (se recomienda dejar una

mecheros, aceites, grasas).


Jams descargar el contenido del cilindro hacia las personas, equipos, fuentes de ignicin, material incompatible o a la atmsfera.

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Inspeccionar el sistema para escapes empleando agua jabonosa o productos o detectores especficos para el gas (no usar fsforos,

376

presin residual).

No usar adaptadores ni herramientas que generen chispas o calienten el cilindro. No forzar las roscas de conexin y no alterar los
dispositivos de seguridad.

En el laboratorio de microscopa, trabajamos actualmente con cuatro cilindros; dos conteniendo gases comprimidos: Argn
(evaporadora de metales) y Nitrgeno (microscopio electrnico de barrido) y dos conteniendo gases licuados: Dixido de carbono
(secador por punto crtico) y Nitrgeno (criofractura y enfriamiento del detector del sistema de anlisis elemental por rayos X, acoplado
al SEM). Las principales especificaciones de seguridad para cada uno de ellos se mencionan seguidamente:

12.1.2.1. Argn

Gas inerte. Asfixiante simple. Puede absorberse por inhalacin.


A altas concentraciones en el aire puede producirse una deficiencia de oxgeno con riesgo de prdida de conocimiento o muerte.

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12.1.2.2. Nitrgeno gaseoso

377

En exposiciones de corta duracin, el lquido puede producir congelacin.

Asfixiante simple. No txico.


La liberacin de una gran cantidad en un rea confinada podra desplazar la concentracin de oxgeno necesario para mantener la
vida.

12.1.2.3. Dixido de carbono lquido

Al producirse prdidas en zonas confinadas, el lquido se evapora muy rpidamente originando una saturacin total del aire y
produciendo congelacin.
En estado lquido se condensa rpidamente para formar hielo seco el cual es extremadamente fro.
La exposicin prolongada puede afectar al metabolismo.
Gas estable. Asfixiante y poderoso vasodilatador cerebral. Puede absorberse por inhalacin y originar hiperventilacin, prdida de
conocimiento y muerte por deficiencia de oxgeno.
Al calor intenso produce humos txicos de monxido de carbono.

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inflamable.

378

A niveles de flujo rpido pueden generarse cargas electrostticas y provocar una explosin en presencia de una mezcla

12.1.2.4. Nitrgeno lquido

Lquido extremadamente fro. A 150 C puede producir congelamiento y/o quemaduras en los tejidos expuestos.
Al producirse prdidas, el lquido se evapora rpidamente originando una saturacin total del aire y causando deficiencia de
oxgeno con riesgo de prdida de conocimiento o muerte.
El contacto prolongado con la piel es muy nocivo. Nunca debe tocarse nada que haya sido congelado con nitrgeno lquido.
Gas asfixiante. Su gas puede absorberse por inhalacin.
El gas puede reaccionar en presencia de chispas con oxgeno e hidrgeno dando lugar a la formacin de xido ntrico y amonaco.
Trasvasar el contenido a un termo pequeo para trabajar en la mesada del laboratorio empleando la proteccin adecuada (cubrir
brazos, piernas y pies, usar proteccin ocular y guantes aislantes). En muchos casos el dao es menor si se manipula rpidamente
sin guantes debido a que puede alojarse dentro de ellos.
Manipular cuidadosamente el termo que contiene el nitrgeno lquido y tapar su boca con un material que permita el flujo de
nitrgeno hacia afuera y evite la entrada de aire y humedad.

http://www.slideshare.net/cbastyle/gases-comprimidos-y-licuados
http://descom.jmc.utfsm.cl/cparitario/manipulacion%20de%20gas.htm

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Fuentes de informacin:

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Evitar la acumulacin de sobrepresin dentro del termo.

12.1.3: Equipos

Nuestro servicio de microscopa electrnica cuenta con diversos equipos secundarios para la preparacin de las muestras. Entre ellos
se encuentran: una microcentrfuga (Beckman, USA), un sonicador (Bransonic 221), un horno (Sybron OV 10600 Thermolyne Corp, USA),
un secador por punto crtico (E3000, Polaron), un ultramicrtomo (LKB Bromma 2088 ultratome V, Alemania) y dos evaporadoras de
metal en plasma de Argn (Sputter coater 91000 Pelco y Carbon coater SPI, USA). Cada uno de ellos debe ser operado cumpliendo ciertas
normas de seguridad inherentes a su funcionamiento. A continuacin sern detalladas las principales.
Nunca se debe operar un equipo sin tener conocimiento previo de las instrucciones de uso y sin haber ledo
cuidadosamente el manual de operacin.
12.1.3.1: Microcentrfuga

Para lograr un buen funcionamiento de las centrfugas es necesario aplicar las recomendaciones propuestas por el fabricante. Algunas

mxima, densidad de muestras y cuidado especificados. En algunos laboratorios, es conveniente realizar un registro que contenga
los parmetros de operacin.

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Conocer los manuales de los rotores, equipo y tubos, antes de ser utilizados y cumplir con las indicaciones de uso, velocidad

380

de ellas son:

Suministrar un voltaje estable y con capacidad adecuada al consumo del equipo y disponer de un ambiente limpio, libre de polvo,
con piso firme y nivelado.
La ocupacin de la centrfuga debe realizarse de forma adecuada, con cargas balanceadas, para evitar vibraciones durante el
proceso de centrifugacin y aumentar la preservacin del rotor. Las cargas que poseen la misma masa o peso deben colocarse en
forma opuesta en el rotor.
El mecanismo de seguridad de la puerta debe ser controlado, as como el funcionamiento de los controles de tiempo y velocidad,
el freno de emergencia, la corriente elctrica y la presencia de vibraciones.
Nunca se debe abrir la tapa de la centrfuga en funcionamiento ni tratar de detener el rotor con la mano. La tapa debe
permanecer cerrada durante todo el proceso de centrifugacin, an cuando se produzca la ruptura de alguna de las muestras.
La limpieza debe realizarse con un pao hmedo sobre la superficie externa e interna y luego realizar la misma operacin para el
secado empleando un pao suave. Lavar el rotor inmediatamente en el caso de ocurrir derrames de sustancias corrosivas. Es
necesario mantener la centrfuga limpia, libre de restos de muestras, vidrios, polvo, etc.
Lubricar peridicamente las roscas y anillos, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Es conveniente el uso de
repuestos originales del equipo. Si contiene recipientes metlicos, stos no deben estar deformados debido a que producen una
presin no uniforme sobre el tubo, mientras que si los recipientes son de vidrio no deben contener grietas o ralladuras.

verificar la ausencia de polvo o manchas, el estado del mecanismo de los rotores y el cierre de la tapa. Anualmente se debe
comprobar el buen funcionamiento de los controles del equipo, el freno y la instalacin elctrica.

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elctrica y las condiciones del ambiente en donde se halla colocada. Pueden ser mensuales o anuales. Mensualmente se debe

381

La rutina de mantenimiento depende de diversos factores como la frecuencia de uso, la capacitacin de los usuarios, la corriente

12.1.3.2: Bao ultrasnico

Los baos utrasnicos poseen amplios usos en el laboratorio para la preparacin de muestras, como la disrupcin de clulas y la
dispersin de materiales particulados. Adicionalmente, la limpieza ultrasnica del material de laboratorio constituye un mtodo rpido y
seguro para el lavado de la mayora de los pequeos elementos empleados en microscopa electrnica (piezas del microscopio, tornillos,
grillas, etc). Mediante este procedimiento es posible remover una amplia variedad de contaminantes (residuos proteicos, aceites, grasas,
moho, etc), tanto de la superficie expuesta como de cavidades internas. Este tipo de limpieza resulta muy adecuada para el lavado de
materiales duros como vidrio, cermica, metales y plsticos, siendo menos eficiente en materiales porosos y blandos, como goma y
fibras.
Los dos principales peligros asociados al sonicador son:
El dao causado por el sonido de alta frecuencia. Las ondas de sonido generadas escapan el rango normal de audicin y el ruido
caracterstico es producido por la cavitacin del lquido dentro del contenedor de la muestra, pudiendo ser considerado como
riesgo acstico de contaminacin sonora. Con el fin de evitar daos auditivos se recomienda usar tapones en los odos y cerrar las
puertas del laboratorio donde se encuentra el sonicador.

bajo campana, siguiendo las hojas de seguridad de cada sustancia y evitando el contacto con las mismas. Tapar los recipientes que
se estn sonicando y esperar 5 minutos para destaparlos luego que el equipo se detiene.

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personal (guantes, gafas y guardapolvo) y en el caso de emplear soluciones que desprendan vapores, el equipo debe ser operado

382

La generacin de aerosoles durante su funcionamiento. Siempre se debe operar el equipo utilizando los elementos de proteccin

Para su correcto funcionamiento se requiere de cuidados especiales, considerando las precauciones y recomendaciones del
fabricante. Algunos consejos tiles son:
No accionar el sonicador en seco y emplear slo soluciones de limpieza compatibles con el equipamiento, evitando los solventes o
lquidos inflamables.
Cargar con lquido el tanque a una distancia de 2 cm y medio por debajo del borde, evitando el rebalse.
No emplear otros recipientes ajenos el equipo y no colocar los objetos a limpiar directamente en el fondo del tanque, sino utilizar
el accesorio adecuado segn el tamao del mismo.
No tratar de repararlo y/o desarmarlo si no se halla calificado para tal fin.
Operar el equipo enchufado con la toma a tierra y no introducir las manos dentro del tanque limpiador.
Desconectar el equipo de la corriente antes del llenado o vaciado del tanque.
12.1.3.3: Horno y plato agitador/calefactor)

El horno y el plato calefactor del laboratorio son empleados frecuentemente a altas temperaturas con el fin de evaporar agua o
solventes (Figura 1). Las quemaduras, especialmente en las extremidades superiores, y otros daos pueden ocurrir cuando estos

prctica, no es recomendable emplear termmetros de mercurio para monitorear la temperatura del horno debido a que la ruptura
accidental producir una rpida volatilizacin de su contenido.
Los hornos o platos calefactores requieren de ciertas condiciones de operacin, entre ellas se encuentran:

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El manual de operacin suministrado por el fabricante debe ser ledo, entendido y seguido por el operador antes de accionarlo. En la

383

dispositivos son manipulados incorrectamente.

La temperatura ambiente (entre 0 C a 30 C).


La humedad relativa (50-80 %).
Las distancias recomendadas entre la pared y el techo, etc.

Figura 1. Horno (http://www.hitechtrader.com).

Adems de operarlo empleando proteccin personal (en base a la sustancia que se esta manipulando), es necesario contar con una

Mantener el dispositivo limpio y seco.


Desenchufar la unidad para su limpieza (emplear limpiadores no abrasivos).
Nunca sumergirlo en agua.

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Recomendaciones:

384

buena instalacin elctrica. Un mal uso puede deteriorar al equipo as como producir serios daos personales.

Desenchufar inmediatamente la unidad ante el derrame o cada de material dentro de la misma. Recoger el material siguiendo las
recomendaciones de seguridad de cada sustancia.
Conocer el peso lmite que soporta. Si bien su parte superior cermica es resistente a ralladuras, corrosin y qumicos, sta puede
romperse ante un alto impacto.
Nunca calentar recipientes sellados ni calentar o agitar sustancias voltiles o inflamables o emplear el equipo en lugares prximos
a ellas.
Ubicar el horno en un lugar seguro, alejado de fuentes de combustin.
Evitar el uso de materiales metlicos sobre la placa calefactora.
Colocar los recipientes que contienen las sustancias en el centro del plato. En el caso que se empleen recipientes poco estables,
ser necesario el uso de dispositivos que lo fijen en su lugar (pinzas, soportes). El tamao de los recipientes no debe ser mayor al
del plato que lo sostiene.
Agitar a bajas revoluciones los materiales con alta viscosidad con el fin de evitar salpicaduras y proyecciones hacia el operador. La
viscosidad del material que se coloca en el agitador debe ser tenida en cuenta, debido a que afectar al magnetismo entre el imn
del agitador y el del plato calefactor.

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completamente apagado. La manipulacin debe realizarse cuando el dispositivo se encuentre a temperatura ambiente.

385

Luego de emplear el plato calefactor, ste permanece caliente durante un tiempo, aunque el botn de temperatura se encuentre

Fuentes de informacin:
http://www.labx.com/v2/spiderdealer2/vistaSearchDetails.cfm?LVid=20895799#MoreDesc
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac60335a732
http://www.industrycortex.com/datasheets/profile/18844952/digital-hot-plates-stirring-hot-plates-stirrers-with-digital-di
http://ebookbrowse.com/hot-plate-and-oven-cleaner-pdf-d406961159

12.1.3.4: Secador por punto critico

El secador por punto crtico es un dispositivo que emplea presiones en el rango de los 800 a 2000 psi. La alta presin que alcanza es
potencialmente peligrosa debido a que se pueden generar proyectiles ante la ruptura del cristal de cuarzo de la ventana. Las cmaras que
posee el equipo estn probadas a niveles de presin superiores a los que son sometidas y algunas unidades estn protegidas mediante
discos de ruptura. Sin embargo, la secadora de punto crtico (tambin llamada bomba de presin) constituye un peligro potencial tanto

Conocer y cumplir con las recomendaciones del fabricante.


Examinar la ventana de cuarzo antes de cada uso con el fin de asegurar la ausencia de grietas. Nunca remover la proteccin de la
misma (si posee).

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Recomendaciones:

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para el operador como as tambin para las personas que se encuentran a su alrededor.

Nunca mirar directamente hacia la ventana. Emplear un espejo.


Examinar diariamente la unidad en busca de fugas en vlvulas, sellos, etc.
Mantener bien cerradas las cmaras durante su empleo, controlar la temperatura y la presin del CO2, cuidando que esta ltima
no se dispare cuando el CO2 pasa al estado gaseoso.
Colocar el equipo dentro de una campana (idealmente) o proveerle una proteccin adecuada ante la ocasional explosin del

Estos equipos no poseen esencialmente partes mviles, a excepcin del ocasional reemplazo de O rings o sellos. En algunos modelos,
las vlvulas de entrada y salida pueden ser controladas manualmente, y la ventana permite ver lo que sucede en el interior. Si se emplea

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Figura 2. Secador por punto crtico.

387

mismo, como por ejemplo una jaula metlica (Figura 2).

agua caliente como control de temperatura (en lugar de un calentador elctrico), el riesgo de sobrecalentamiento y sobrepresin de la
cmara puede reducirse debido a la temperatura lmite impuesta por el agua.
Si es necesario emplear solventes diferentes del CO2, como en la preparacin de materiales inorgnicos, se debe tener en cuenta las
consideraciones especiales de cada solvente; aunque la mayora de las secadoras se encuentran preparadas para soportar solventes ms
agresivos. Los qumicos potencialmente peligrosos, deben ser manipulados segn sus hojas de seguridad.
Recordar siempre que una inadecuada operacin del equipo puede ocasionar serios daos o hasta la muerte.

Fuentes de informacin:
Instruction Manual, Polaron Equipment Limited, 1984, Watford, England.
http://www.usask.ca/biology/scopes/CDP%20instruction.html
http://www.polaron-range.com/
http://www.quorumtech.com/pdf/criticalPointDrying/CPD_technical_brief.pdf
http://www3.ncc.edu/faculty/BIO/becks/Path3f/EM_Manual.pdf
http://www.sunysb.edu/facilities/ehs/lab/cs.shtml

El empleo del ultramicrtomo requiere de personal capacitado y entrenado para cada modelo especfico. Debido a los peligros asociados,
se deben tomar precauciones en cada paso del proceso para proteger, especialmente, las manos y los dedos del operador y prevenir la

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12.1.3.5: Ultramicrtomo

388

http://www.2spi.es/catalog/instruments/critical-point-dryer.shtml

exposicin innecesaria a solventes y/o material biolgico. Se recomienda la consulta del manual del equipo para realizar su
mantenimiento, procurar un uso adecuado e informarse sobre el manejo seguro.
Recomendaciones:
Las cuchillas deben ser manipuladas cuidadosamente cuando son removidas o instaladas. Dependiendo del material, algunas
pueden atravesar hasta el calzado si caen de punta. Asimismo, deben almacenarse en cajas especiales para cuchillas, las cuales
poseen guas para mantenerlas paradas y una tapa para evitar cortes. Al emplear el ultramicrotomo, deben ser colocadas despus
de la muestra y el freno del equipo debe estar asegurado para evitar que se libere sobre la mano del operador.
La limpieza de las cuchillas debe realizarse regularmente para evitar marcas por compresin, empleando una barra de poliestireno
y evitado su contacto con los dedos.
Para retirar los cortes del bote con agua se debe emplear un ansa o elementos que posean un cabo para su manipulacin, con el
fin de mantener los dedos fuera de las partes mviles del ultramicrotomo.
Si el laboratorio tambin cuenta con el equipo generador de cuchillas, partiendo de la ruptura de una barra de vidrio, sta debe
ser manipulada con guantes durante el lavado y la fractura.

El tallado del taco de resina, previo al uso del ultramicrtomo, tambin debe realizarse con sumo cuidado. Se deben emplear hojas de

restos de resina pueden proyectarse hacia los ojos durante el tallado, recomendando el uso de antiparras o gafas de seguridad.
Para la manipulacin de sustancias qumicas se deben consultar las hojas de seguridad y si existe contacto con material biolgico
potencialmente contaminante, deben seguirse los recaudos necesarios para cada caso.

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trabajar y la resina debera poseer una consistencia firme como sostn de la muestra pero manejable para ser tallada. Asimismo, algunos

389

afeitar nuevas y prestar especial atencin a los ngulos de corte y a la fuerza aplicada. El taco debe estar fijo en su soporte para poderlo

Fuentes de informacin:
http://www.bcbiolibrary.icapture.ubc.ca/pathologistsresearchers/docs/BL.LAB.GN.001.01%20Sectioning%20of%20Paraffin%20Embedded%20Tissue.pdf
http://ehs.unl.edu/sop/s-microtome_safety.pdf

12.1.3.6: Evaporacin de metales

La evaporacin de metales en atmsfera de plasma de argn y en alto vaco posee sus ventajas y desventajas. El manejo y el
mantenimiento de ambos equipos se asemejan y por ello son considerados aqu como uno.
Recomendaciones:

Las partes metlicas pueden ser lavadas con alcohol isoproplico en reemplazo de la acetona, con el fin de reducir la generacin
de vapores y mejorar el vaco de la cmara.

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secarla. Tambin pueden usarse solventes, aunque constituyen una opcin menos saludable y ms costosa.

390

Mantener limpia la cmara. Es conveniente frotar suavemente la parte vtrea con un pao humedecido en agua jabonosa y luego

Asegurarse siempre que el equipo este seco y que la bomba de vaco funcione correctamente antes de colocar las muestras, para
evitar su contaminacin y una deficiente deposicin del metal. La mayora de los equipos poseen una bomba que mantiene el
vaco aun cuando se hallan apagados. La falla sobre este sistema aumenta el riesgo de retrosuccin de los hidrocarburos
provenientes del aceite de la bomba sobre la cmara, aumentando la contaminacin. Por ello resulta necesario controlar las
bombas regularmente por personal capacitado.
La contaminacin del filtro y del aceite depende de la frecuencia de uso y del tipo de muestras que se procesen dentro del equipo.
Es recomendable cambiar el aceite por lo menos una vez al ao. El aceite viejo adquiere un color amarillo oscuro o marrn,
mientras que el aceite nuevo posee un aspecto transparente, incoloro o ligeramente amarillento.
Al manipular el equipo se recomienda el uso de guardapolvo, gafas de seguridad y guantes. En algunas personas se puede
producir sensibilidad, irritacin mecnica o reaccin alrgica al mantener contacto con metales (dermatitis, rash cutneo). En el
caso de emplear carbn, tambin es necesario usar proteccin respiratoria y trabajar bajo campana debido a que la inhalacin de
las fibras o del polvo puede ser peligrosa para la salud. Asimismo, se debe evitar mirar a ojo desnudo la cmara cuando se evapora
el metal, debido a que el brillo intenso que se produce cuando est en funcionamiento puede daar la retina.
Algunos equipos emplean un gas inerte y de alta pureza para asegurar un rpido recubrimiento y un buen tiempo de vaco.
Generalmente el gas Argn cumple con estos requisitos debido a su relativamente elevado peso atmico y a su disponibilidad en

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de la vlvula del cilindro puede daarla y producir una entrada brusca de gas.

391

el mercado. La entrada del gas a la cmara debe ser suave y en todo momento se debe evitar forzar las vlvulas. Un mal manejo

Fuentes de informacin:
http://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/sputter_coating.aspx
http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/equipment/carbon_coater.aspx
http://www.2spi.com/catalog/msds/msds01701.html
http://users.ece.gatech.edu/~alan/ECE6450/Lectures/ECE6450L12-Physical%20Deposition.pdf
12.1.4: Microscopios electrnicos

En algunos laboratorios de microscopa electrnica de nuestro pas, incluyendo el nuestro, existen actualmente instrumentos antiguos
(adquiridos hace mas de 30 aos) que son empleados cotidianamente. Estos equipos no son tan estables como los nuevos y por ello
requieren de una frecuente limpieza y mantenimiento. En comparacin, los equipos nuevos poseen una mayor estabilidad,
principalmente en el sistema de lentes y el sistema de vaco. Muchos microscopios cuentan con una cobertura y/o garanta suministrada
por parte de la compaa vendedora al momento de la compra, la cual incluye la asistencia tcnica. El correcto uso y el frecuente
mantenimiento de los microscopios a partir del momento de su adquisicin, es una buena prctica para prolongar su vida til y mejorar el
funcionamiento diario.

sea empleado adecuadamente y se halle dentro de los estndares de emisin. Los microscopios modernos se hallan diseados
como seguros aunque no se debe olvidar que el instrumento constituye un peligro potencial debido a los niveles de radiacin que
genera. Si el sellado del equipo es deficiente, la emisin de rayos-X por el haz de electrones puede alcanzar y daar al operador

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Los rayos X que son emitidos durante el uso del microscopio no deberan constituir un inconveniente, siempre que el instrumento

392

A continuacin se enumeran algunos factores a tener en cuenta para realizar un manejo seguro de los microscopios electrnicos:

durante el empleo repetido del microscopio. El fabricante debe asegurar la proteccin total de los usuarios evitando prdidas de
radiacin, siendo conveniente la inspeccin regular de la columna del equipo. Nunca se debe modificar la estructura del
microscopio y se debe llevar a cabo la rutina de fuga de radiacin peridicamente. No es recomendable operar un equipo que
exhiba fisuras (principalmente en la ventana de observacin) o sin la primera apertura condensadora colocada. La presencia de
fugas puede manifestarse cuando alguna unidad de la columna fue removida (excluyendo la operacin de cambio de filamento) y
en este caso debe evitarse el uso del microscopio. Cuando es detectada alguna falla en el funcionamiento del equipo, se debe
parar su operacin y llamar al tcnico calificado para prestar asistencia. Este procedimiento constituye una manera de prevenir
accidentes, daos al microscopio y reducir los costos debido a operaciones deficientes.
La mayora de los problemas de salud asociados al manejo de microscopios electrnicos se presenta en los operarios que emplean
largas horas en la observacin de especmenes. La escasez de luz en la habitacin donde se halla el microscopio, los prolongados
turnos (mayores de tres horas) y/o las altas magnificaciones durante la observacin, contribuyen a la fatiga visual y al progresivo
deterioro de la vista del operador. Los riesgos ergonmicos asociados a la mala postura, la gran cantidad de tiempo sentado y el
manejo del teclado, mouse y/o joystick son causa de enfermedades asociadas a los microscopios. Una postura incorrecta puede
ocasionar desrdenes msculo-esquelticos produciendo dolor en hombros, cintura, brazos, cuello o muecas. Los movimientos
repetitivos realizados durante el manejo del microscopio pueden causar daos en las extremidades superiores como el sndrome

monitor y el contraste entre la pantalla del microscopio y la luz ambiental ayuda al cuidado ocular cotidiano de los operadores.
El cambio de filamentos es un proceso crtico que debe ser realizado con precaucin para evitar quemaduras y descargas
elctricas. Se recomienda el empleo de guantes de gamuza para protegerse de la alta temperatura alcanzada por el ctodo y una

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cada media hora es recomendable para combatir la fatiga ocular y postural. Asimismo la reduccin del brillo de la pantalla del

393

del tnel carpiano. Estos peligros pueden reducirse mediante la adopcin de medidas preventivas. La toma de descansos cortos

especial atencin al alto voltaje generado en la cmara. La maniobra del cambio de filamento en s misma debe desarrollarse de
manera segura. En algunos modelos de microscopios el can se halla ubicado en altura, siendo imprescindible el empleo de una
escalera y evitando el uso de sillas u otros objetos de escasa estabilidad.
Es de vital importancia conocer las conexiones elctricas que posee el microscopio y asegurarse que al momento de realizar
reparaciones se encuentren cortadas. La desconexin total del microscopio consiste en un buen primer paso para realizar los
mantenimientos de rutina o solucionar problemas tcnicos.
Como en cualquier procedimiento que exponga al operador a algn tipo de peligro, es conveniente la presencia de otra persona
cercana para pedir auxilio en el caso de ser necesario.
Las sales de uranio, utilizadas frecuentemente para el contraste de estructuras biolgicas (acetato de uranilo), constituyen una
fuente de radiacin . En este caso adems de consultar y seguir las recomendaciones de las hojas de seguridad, es necesario
implementar un protocolo de trabajo adecuado que contemple el menor tiempo posible de exposicin con la menor cantidad de
reactivo.
Muchos equipos utilizan nitrgeno lquido para operar, en particular los que poseen detectores que deben ser refrigerados de
esta manera, siendo necesario el empleo de la proteccin adecuada para su manipulacin. Adicionalmente, el detector en s
mismo tambin pude ser un peligro potencial, ocasionando lesiones en el operador dependiendo de su posicin, tamao y lugar

pueden generar productos cancergenos y/o contaminantes. Con el fin de evitarlos es necesario revisar peridicamente el aceite y
el filtro de las mismas y cambiarlos en el caso que se encuentren contaminados. Es recomendable colocar mangueras en las bocas
de las bombas de manera tal que estos productos de combustin sean evacuados dentro de campanas de extraccin.

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Los humos y vapores emitidos durante el funcionamiento de las bombas rotatorias tambin deben ser considerados debido a que

394

que ocupe en el microscopio.

La cmara en donde se coloca la muestra, principalmente en los microscopios electrnicos de barrido, requiere de cierta
precaucin debido a que es posible tener contacto con alto voltaje (en el caso que existan problemas en el equipo). En
condiciones seguras, cuando el aire ingresa a la cmara, el alto voltaje debera ser automticamente apagado.
El mantenimiento del microscopio tambin requiere de ciertos cuidados, en particular cuando se realiza la limpieza de las piezas.
El uso de cremas de pulir y solventes debe ser considerado como potencialmente peligroso y deben emplearse siguiendo las
recomendaciones que figuran en las hojas de seguridad correspondientes.
El derrame de lquidos sobre el microscopio puede causar cortocircuitos y descargas elctricas, las cuales exponen al peligro tanto
al operador como al equipo. Se debe evitar posar recipientes con lquidos cerca de los controles del microscopio como vasos con
agua o refrescos, tazas con t o caf, etc.

Fuentes de informacin:
http://www.aiha.org
http://www.emcourses.com/safety.htm
http://www.ammrf.org.au/myscope/sem/practice/safety/hazards.php
http://www.ehow.com/list_7319635_hazards-handling-microscope.html

Racker, Darlene K. Transmission Electron Microscopy. Methods of Application. (1983) Charles C. Thomas Publisher.

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http://www.ammrf.org.au/myscope/sem/practice/safety/hazards.php

395

http://www.ammrf.org.au/myscope/sem/practice/safety/example2.php

12.1.5: Manipulacin, transporte y envo de muestras y productos qumicos

El manejo y transporte inadecuado de muestras biolgicas o sustancias qumicas no slo significa un riesgo para el bienestar de las
personas que trabajan en el laboratorio, sino tambin para todos los ciudadanos y para la conservacin del planeta.
Existen diferentes reglamentaciones que regulan el transporte de muestras y productos qumicos por va area (WHO: World Health
Organization, IATA: International Air Transport Association, ICAO: International Civil Aviation Organization) o terrestre (IRAM: Instituto
Argentino de Normalizacin y Certificacin, ANMAT: Administracin Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnologa, SENASA:
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria). Las mismas, dividen a las sustancias en diferentes clases segn sus
caractersticas predominantes (qumicas, radioactivas, txicas, infecciosas, etc.). Asimismo, dentro de estas clases existen categoras, por
ejemplo para las sustancias infecciosas, donde se describen especificaciones como el tipo de embalaje, la documentacin requerida, etc.
En el laboratorio de microscopa electrnica, es necesario tener especial cuidado con la manipulacin de las muestras cuando stas
llegan a destino. Siempre se debe tener la precaucin de conocer especficamente de qu muestra se trata y en qu medio se encuentra.
Los tubos y frascos, preferentemente de plstico, deben ser enviados cerrados y en posicin vertical para evitar derrames. Los recipientes
de vidrio deben colocarse dentro de recipientes plsticos o de Telgopor , con el objeto de contener los pedazos pequeos ante una

posibles derrames. La recepcin de agentes patgenos potencialmente activos debe ser evitada en aquellos laboratorios que, como el
nuestro, no se encuentran preparados para recibir ese tipo de muestras.

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de fro y rodeadas de geles refrigerantes. Adems, es recomendable colocar material absorbente en los alrededores para contener los

396

eventual ruptura. Las muestras que necesiten refrigeracin deben colocarse en recipientes que garanticen la conservacin de la cadena

Fuentes de informacin:
http://www.habitat-ecologico.com.ar/
http://www.desleronline.com/html/espanol/ipes/ipes_centro_ipes.html

12.1.6: Gestin de residuos

La generacin de residuos, independientemente del volumen generado, es inherente a cualquier laboratorio y por ello no debe ser
minimizada. Los residuos qumicos, si no son tratados adecuadamente, pueden constituir una amenaza para la salud de los trabajadores,
de la comunidad y para el medioambiente.
El tratamiento y la gestin de los residuos obedecen a las caractersticas, peligrosidad y posibilidad de recuperacin de los mismos.
Los residuos pueden clasificarse como inocuos (desechos domiciliarios) o peligrosos (residuos con riesgo biolgico o qumico). Para cada
uno de ellos existe un cdigo de colores de las bolsas de desecho, en base al riesgo potencial que engloban, pudiendo ser depositados en
distintos contenedores: riesgo biolgico en bolsa roja, riesgo qumico en bolsa amarilla (o azul) o sin riesgo, en bolsa negra. Existen
diferentes mtodos de tratamiento de residuos: incineracin, por procesos trmicos (calor hmedo o calor seco), procesos qumicos

en recipientes que contengan bolsa roja; si son lquidos deben recolectarse en envases de paredes rgidas conteniendo lavandina (5 g/L) y
luego de esperar una hora como mnimo, descartar el envase tapado en un recipiente con bolsa roja. Los residuos de riesgo qumico
slidos deben ser descartados en bolsas amarillas y ser tratados como residuos industriales. Los lquidos deben ser recolectados en

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como destino final un tratamiento que destruya toda actividad biolgica (esterilizacin). Si son slidos deben descartarse directamente

397

(cloro, O3), procesos biolgicos (enzimas) o irradiacin (UV, Co 60). Los residuos patognicos con riesgo biolgico infeccioso deben poseer

bidones, respetando la reactividad de cada sustancia e indicar siempre el contenido del bidn. Ambos tipos de residuos pueden necesitar
ser neutralizados antes de su descarte. Es recomendable conocer la informacin contenida en las hojas de seguridad de cada sustancia.
Los contenedores de residuos peligrosos deben estar perfectamente identificados y ubicarse en zonas de poco trnsito y alejados de
fuentes de calor. Nunca deben presentar derrames o fugas o estar deteriorados.
Los objetos corto-punzantes deben descartarse en recipientes de paredes rgidas, con tapa sellada y preferiblemente que no puedan
ser reabiertos. Los vidrios rotos u objetos filosos de mayor tamao deben ser colocados en cajas con envoltorios de proteccin como
bolsas, papeles, etc. Siempre es necesario rotularlos y se descartarn en base al riesgo que posea el material con el cual estuvieron en
contacto.
En el Centro Cientfico Tecnolgico Baha Blanca, los residuos patolgicos son retirados mensualmente por una empresa que se
encarga de los servicios de recoleccin, transporte, tratamiento (autoclave o incineracin) y disposicin final (rellenos sanitarios o de
seguridad). Los residuos qumicos son recogidos por otra empresa, en relacin al flujo generado (2.000 L o 1.500 kg slidos). La frecuencia
de recoleccin se estima cada seis meses a un ao en funcin del volumen acumulado. All los residuos son procesados, redestinados o
tratados para su disposicin final como residuos industriales. Existen algunos compuestos altamente contaminantes, como tetrxido de
osmio y tetrxido de rutenio, que no son recolectados debido a que actualmente ninguna empresa se encarga de su transporte y/o
disposicin. Adicionalmente, en el Centro se realizan muestreos peridicos de los efluentes de las piletas de laboratorios qumicos a fin

Provincial para el Desarrollo Sostenible (OPDS). Este organismo posee la facultad de emitir un certificado de aprobacin cuando el
proceso de tratamiento de residuos concluye, el cual omite de toda responsabilidad al generador del mismo, quien hasta el momento
debe responder por ellos.

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Con respecto a la disposicin de residuos, en el Centro Cientfico Tecnolgico Baha Blanca el ente regulador es el Organismo

398

de determinar las concentraciones de los principales contaminantes.

1- Identificacin del peligro.


2-Aviso

de

la

situacin

de

sustituir las sustancias peligrosas por otras menos nocivas, modificando los

emergencia.

protocolos de trabajo y disminuyendo al mnimo el volumen empleado y la

3-Movilizacin del coordinador o

estrictamente vigilada con el fin de reducir su stock y evitar su innecesaria


manipulacin.
La higiene del laboratorio tambin debe ser considerada, siendo conveniente
realizarla una vez por da y luego de un derrame. Se recomienda el empleo del

lder del sector.


4- Llamada de emergencia (911).
5-Corte de suministro de gas y

lampazo o de elementos que no generen polvo y evitar el uso de escobas,

electricidad.

escobillones y plumeros. Adems, es necesario contar con un equipo de limpieza

6-

accesible ante un eventual derrame, como toallas, envases para descartes, etc.

Apertura

de

salidas

de

emergencia
7- Coordinacin de la evacuacin.
8- Recuento de personas en el
punto de reunin.
9- Informe de la situacin a
servidores pblicos, servicio de
emergencia, etc.

399

frecuencia de uso. Asimismo, la adquisicin de sustancias peligrosas debe ser

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Una conducta responsable a seguir por parte de los trabajadores, consiste en

12.1.7: Emergencia

Las tareas habituales dentro del laboratorio qumico y particularmente en nuestro servicio de microscopa electrnica, involucra la
utilizacin de productos qumicos y protocolos de trabajo muy diversos, en base a las distintas muestras en estudio. Es por ello que ante
una falla o incumplimiento de las medidas de prevencin, es muy probable que exista una emergencia. Las emergencias ms comunes en
el laboratorio incluyen incendio, fuga de gases y accidentes personales. Si el empleo de los elementos apropiados para combatir la
emergencia (mantas ignfugas, extintores, duchas de seguridad, sistema lavaojos, neutralizadores) no son suficientes, entonces se debe
aplicar un plan de evacuacin. El mismo consiste en desalojar a todo el personal hacia un lugar seguro en el menor tiempo posible (desde
que se detecta la emergencia hasta que alcanzan el punto de reunin), y puede describirse segn las siguientes etapas:

Con el fin de lograr un exitoso plan de evacuacin, previamente se deben distribuir


1) los roles de evacuacin de cada uno de los integrantes del laboratorio.
2) Individualmente, cada persona debe conocer el plan de evacuacin, las vas de escape y los medios de extincin con los que cuenta.
3). Asimismo debe comprometerse a dar aviso de la emergencia al encargado del sector.

5). Ser encargado de coordinar la evacuacin,


6). Activar el plan de emergencia .
7). informar a los servidores pblicos.

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laboratorio y

400

4). Cada sector deber contar con un lder que conozca la cantidad de personas (y en lo posible sus horarios) que se desempean en el

Existen consignas a seguir durante la evacuacin, las cuales facilitan notablemente el desalojo del personal. Entre ellas se encuentran:

A) Suspender inmediatamente las actividades,


B) dirigirse hacia las vas de evacuacin ms cercanas,
C) Actuar con calma pero con decisin (evitar el pnico, no gritar),
D) Atender las indicaciones del lder del sector,
E) Caminar rpido (no correr),
F) Usar las escaleras (bajar siempre),
G) No retornar,
H) No detenerse,
I) Contar a las personas del sector y

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401

J) Colaborar con las autoridades.

La implementacin de simulacros de evacuacin regulares es altamente recomendable ya que permite no slo entrenar a los empleados
ante una posible emergencia, sino que tambin contribuye a detectar y reparar las
posibles falencias del procedimiento.

Ante un accidente de trabajo dentro del Centro Cientfico Tecnolgico Baha Blanca, se deber
llamar al servicio de emergencia contratado y completar la planilla de accidente laboral (denuncia),
realizando copias para el empleador (CONICET), el prestador del servicio (ART) y el centro de
derivacin (convenio con hospitales, especialistas, centros de medicina laboral, etc

Ante la presencia de un accidentado o una emergencia mdica, es conveniente capacitar al personal para que realice
los primeros auxilios hasta que arribe al lugar del siniestro la asistencia mdica.
Como norma general no se debe mover al accidentado ni suministrarle agua, alimentos o

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respirando y con pulso.

402

medicamentos. Se debe tratar de mantenerlo caliente, en un lugar protegido y verificar que este consiente,

Debido a la existencia de un convenio entre el empleador (CONICET) y la Aseguradora Riesgos de Trabajo (ART), TODOS los trabajadores
(becarios, investigadores, personal de planta permanente o transitoria, etc) se hallan cubiertos. Cada empleado posee una credencial de
la ART donde figuran sus datos personales y del empleador. La cobertura incluye accidente laboral dentro del lugar de trabajo, accidente
in itinere y enfermedad laboral. Para este ltimo caso debe documentarse la encuesta de exposicin anual del empleado y los debidos
exmenes donde coste su exposicin a los diferentes agentes: fsicos, qumicos y/o biolgicos. Si fuera necesario, y en cualquiera de los
casos, es posible iniciar una licencia laboral.

Fuentes de informacin:
http://www.gruposancorseguros.com/web/ES/preguntasfrecuentes_gss.aspx
Plan de Evacuacin. Arrieta & Madies S.A. consultora en Ingeniera.
12.1.8: Marco legal

Resulta conveniente conocer las leyes que regulan aspectos esenciales para el manejo de sustancias peligrosas como la clasificacin

Salud, asociaciones mdicas, institucionales y contratos, as como leyes de higiene y seguridad, de riesgos del trabajo, resoluciones, etc.
Para obtener una informacin mas minuciosa de la gua de anlisis de riesgo, se recomienda la lectura de: Normas nacionales e
internacionales (IRAM 3800, BS 8800), Ley nacional de higiene y seguridad en el trabajo N 19587, Decreto reglamentario N 351/79 y

Pgina

slo se mencionar que existen leyes y normas dentro de la Constitucin Nacional y Provincial, ordenanzas municipales, del Ministerio de

403

de los residuos, el transporte, los operadores, las empresas y los requerimientos necesarios para las habilitaciones. A modo informativo

Resolucin N 1069/91, Ley nacional de accidentes de trabajo N 24028, Leyes y reglamentaciones provinciales y municipales y Convenios
colectivos de trabajo vigentes para la actividad media sanatorial.

Fuentes de informacin:

Pgina

404

http://www.fcen.uba.ar
http://www.guindo.pntic.mec.es
http://www.icv.csic.es
http://www.personal.us.es
http://www.quiminet.com
http://www.swisscontact.bo
http://www.unirioja.es
http://www.webs.uvigo.es
http://www.odon.uba.ar
http://www.opds.gba.gov.ar/
Manual de H&S en el Laboratorio C.I.F Servicio de prevencin de Riesgos Laborales. Ing. Pedro D. Villagrn Departamento de
Mantenimiento.

APNDICE I: Soluciones de trabajo y reactivos


necesarios.

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405

Dra. Alfonsina Morales y Prof. Viviana Sorrivas

A1). Tincin para observar secciones gruesas en el microscopio ptico

Solucin de azul de toluidina en borato de sodio


Azul de toluidina

----------------------

1g

Borato de sodio

----------------------

1g

Agua destilada (c.n.p.)-------------------

100 ml.

25 ml.

NaOH

0.1-0.2 g

Citrato de plomo

0.18 g

A2). Para contraste de secciones ultrafinas:

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Agua destilada (recin hervida 10 min)

406

citrato de plomo:

Solucin saturada de acetato de uranilo (2%)

Acetato de uranilo
1g
Agua destilada (c.n.p.)
50ml.
A3). Fijadores

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Solucin stock acuosa (extempornea): por ej. al 40%.(o cualquier


mltiplo de 4, como 16%) .
Calentar a 65 C agitando bajo campana hasta disolver totalmente.
Aclarar con gotas de NaOH 0.1 N. Enfriar.
Se puede alicuotar y congelar.
Al usar se diluye con buffer hasta el 4 % (1:10) y controlar el pH.
Si se deja la muestra mucho tiempo conviene usarlo al 8%.
Si se va a preparar en el momento: solucin tamponada al 5%.
Calentar 45 ml de buffer fosfato o cacodilato 0.2 M, pH 7,4, a 65C.
Agregar 2.5 g PFA, agitar bajo campana.
Aclarar con gotas de NaOH 1N. Enfriar.
Llevar al 50 ml.

407

A3.a). Paraformaldehdo

A3.b).

GA 25 %
NaH2PO2.H2O
Na2HPO4.12H2O
AD (cnp)

Glutaraldehdo en buffer Sorensen 4 % (pH 7.25)

16 mL
0.74 g
5.52 g
100 mL

Karnovsky
Paraformaldehdo2%- glutaraldehdo 2 %
Buffer 0.2 M...........50 ml
PFA 8%.................25 ml

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AD17 ml

408

GA 25% 8 ml

Karnovsky modificado
Paraformaldehdo Glutaraldehdo

50 mL
20 mL
10 mL

Para preparar 20 mL de paraformaldehdo 10 %,


disolver 2 g de paraformaldehdo en 20 ml de AD y
calentar a 60-65 C bajo campana. Agregar NaOH 1 N de a
gotas hasta que la solucin se aclare. Dejar enfriar la
solucin antes de usarla.

409

100 mL

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Buffer fosfato o cacodilato


0.2 M (pH 7.4)
Paraformaldehdo 10 % en
agua
Glutaraldehdo 25 % en
agua
AD (cnp)

A3.c) .Formalina cido actico


Alcohol (FAA)
Para Microscopa
Electrnica de
BarridoAlcohol etlico

90 mL

5 mL

Formaldehdo (40 %)

5 mL

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cido actico glacial

410

(50 %)

A3.d) Tetrxido de osmio 2%:

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El osmio se vende en solucin o en cristales de 1 y 0.5 gr en ampollas de vidrio.


Para preparar la solucin es importante lavar bien las ampollas y enjuagarlas en
agua destilada. Se puede disolver el cristal dentro de la ampolla porque funde a 40C.
Se abre la ampolla bajo campana y se sumerge entera en agua destilada ya medida
en un frasco de vidrio color caramelo. El frasco debe estar limpio, tratado con
lavandina y muy bien enjuagado. Tendr una tapa hermtica (sus vapores atraviesan
el plstico). Se deja un da hasta que se disuelva el cristal, aunque se puede acelerar
con ultrasonido y calentando hasta 60C (CUIDADO!!). Se debe descartar la solucin
cuando presenta un color gris.
Para descartar el osmio se usa aceite vegetal (mejor de maz) en un frasco bajo
campana por 2 das. Se comprueba que el osmio ha sido reducido totalmente
colocando una gota de esta muestra en un papel de filtro tambin embebido
en aceite: si se pone negro todava est activo.

411

Tetrxido de
osmio

A.4. Soluciones Tampn

A4. a). Sorensen

Ajustar el pH segn la siguiente Tabla:

pH
6.0
6.2
6.4
6.6
6.8
7.0
7.2
7.4
7.6
7.8

A (mL)
1.4
2.0
3.0
4.0
5.0
6.1
7.0
7.8
8.5
9.1

B (mL)
8.6
8.0
7.0
6.0
5.0
3.9
3.0
2.2
1.5
0.9

Fosfato 0.067 M
Soluciones stock: A:
Na2HPO4.12H2O
__________ 5.97 g
AD
(cnp) __________ 250 mL
B: Na
H2PO4.2H2O __________ 2.61 g
AD
(cnp) __________ 250 mL

Pgina

412

MgCl2 2 mM (agregarlo en el momento de utilizarlo)

A4. b) cacodilato de sodio 0.4 M

Na(CH3)2AsO3.3H2O __________ 21.4 g


AD (cnp) ___________________ 250 mL
Ajustar el pH con HCl

A5. Soluciones para contraste

A5.a) Acetato de uranilo

Preparar la Solucin de acetato de uranilo en forma acuosa al 2 % (con AD y hervida).

50 mL
1 lenteja (0.1-0.2 g)
0.25 g

Controlar el pH final a 11.2. Centrifugar antes de usar. Mantener en heladera en frasco de cierre hermtico.

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AD hervida 10 minutos y filtrada


NaOH
Citrato de plomo

413

A5.b) Citrato de plomo

A5. c) Solucin de K2MnO4

Hacer solucin al 0.1 % en AD descarbonatada. Dejar en digestin 25 minutos. Centrifugar. Mantener a temperatura ambiente. Desechar
cuando aparezca brillo metlico en la superficie.

A5.d) Solucin de rojo de rutenio para contraste en bloque

Solucin B:
OsO4 5 % en AD
Buffer 0.2 M (pH = 7.3)
Rojo rutenio en AD (1500 3000 ppm)

Fijar el tejido con la solucin A.

0.5 mL
0.5 mL

0.5 mL

0.5 mL
0.5 mL
0.5 mL

Lavar con tres cambios de 10


minutos de buffer.
Fijar 3 horas en la solucin B a
temperatura ambiente.
Lavar con buffer.
Deshidratar con etanol.
Infiltrar con resina.

414

Glutaraldehdo 3.6 %
Buffer 0.2 M (cacodilato, s-colidina,
bicarbonato,
Veronal-acetato o glicerofosfato)
Rutenio rutenio en AD (1500 3000 ppm)

Fijar el tejido con la solucin A.

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(Lewis P. R. y Knight D. P. Staining Methods for Selectioned Material)


Solucin A:

Lavar con tres cambios de 10 minutos de buffer.


Fijar 3 horas en la solucin B a temperatura ambiente.
Lavar con buffer.
Deshidratar con etanol.
Infiltrar con resina.

A.6) Colorantes para cortes semifinos para microscopa ptica

Si la resina usada fue Epon o Spurr se recomienda la secuencia:

1. Azul de toluidina 1 % con Na2CO3 2.5 % a pH 11.0.


2. Fucsina bsica 5 % con acetona (7 min.).

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Al contrastar con uranilo y plomo, pueden formarse precipitados que se clasifican segn su morfologa en:
1. Partculas electrodensas: causadas por el uso prolongado de las sales de plomo. Se remueven con CH3COOH 10 % o CH3COOH 2 %
durante 2-8 min.

415

A.7 Formacin y remocin de precipitados formados por soluciones de contraste en cortes ultrafinos.

2. Redes amorfas: se producen durante el contraste doble con sales acuosas o alcohlicas de uranilo y plomo. Se remueven con la
misma solucin de uranio o bien con (COOH)2 5-10 % hasta 10 min.
3. Agujas cristalinas: resultan del doble contraste con soluciones alcohlicas de uranio y plomo. No pueden removerse.
Por ello es aconsejable usar soluciones de contraste de uranio en metanol o etanol slo si es absolutamente necesario, y evitar los
contrastes prolongados.

A.8) Pre-infiltracin con agar

Agregar 1 gr. de agar a 50 mL de agua destilada.


Calentar en bao de agua hirviente agitando hasta completa disolucin (la solucin deja de ser turbia).
Pasar la solucin a viales y autoclavarlos. Mantenerlos en heladera, hermticamente cerrados.
Antes de usar, calentar el agar nuevamente en bao de agua hirviente hasta que este lquido.

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416

Infiltacin previa: Agar

A.9) Resinas

A9.a) de baja viscosidad. Spurr. (1969).

El mtodo gravimtrico es ms conveniente para prepararlo, por ser ms preciso. Se deben agregar en orden los diferentes componentes
dentro de un recipiente plstico.
Blando

10
6
26
0.4
8
3-4

10
4
26
0.4
8
3-4

10
8
26
0.4
8
3-4

Curado
rpido
10
6
26
1
3
2

Menor
viscosidad
10
6
26
0.2
16
7

El catalizador (DMAE) puede agregarse ltimo luego de mezclar bien los otros tres
componentes. Las burbujas pueden eliminarse por vaco. La preparacin se deber usar
inmediatamente. En caso de existir algn sobrante, se guardar en una jeringa bien
cerrada, clavando la aguja en un tapn de goma, sin aire. De esta manera, puede
conservarse en freezer, por varios meses. Este medio es compatible con varios agentes
deshidratantes como acetona, etanol, alcohol isoproplico y xido de propileno

417

Duro

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ERL 4206 (g)


DER 736 (g)
NSA (g)
DMAE (g)
Hs. (a 70 C)
duracin

Standard

A9.b): Metacrilatos para estudios citoqumicos

Para evitar la polimerizacin durante el almacenamiento, se agrega hidroquinona como inhibidor al 1 %.

Dureza

1/1

La mezcla puede permanecer un ao en la heladera sin inhibidor y con el catalizador agregado hasta dos meses antes que
polimerice. Si el catalizador es 1,1- azobis (1 ciclohexano nitrilo) se conserva hasta un ao a temperatura ambiente.

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418

Ms duro
Bueno
Ms blando

Proporcin N-butilmetil/metacrilatos

A9.c) Epon Araldite

Mollenhauer, mod. E. H. Newcomb. Stain Technology 39:11, 1964.)


Para preparar la solucin stock, mezclar los siguientes componentes:
10 partes EPON 812
10 partes Araldite 6005
24 partes DDSA
La mezcla se realiza a 60 C de manera vigorosa. Luego se almacena en la heladera.
Para realizar la inclusin, agregar una mezcla de 2 mL de DMP y 30 a 100 mL de solucin stock.
Calentar los bloques durante toda la noche a 60 C en horno (para obtener un mayor endurecimiento, calentar por ms tiempo).

Na metlico
MeOH (alcohol metlico)
Preparar la solucin bajo campana, en un frasco de boca ancha y hervirla.
Luego agregar MeOH hasta completar un volumen de 25 ml.

2.5 g
20 mL

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Solucin stock

419

A.10) Cmo quitar la resina epoxi de los cortes

Tener precaucin, debido a que es una reaccin violenta y puede explotar si existe polvo en suspensin.
Adicionar 25 ml de benceno y agregar benceno extra para su almacenamiento (hasta que la solucin aclare) en una botella
oscura.

Solucin de trabajo

Solucin stock
Solucin alcohol
metlico/benceno

1 parte
2 partes

Despus de recoger los cortes sobre la grilla, sumergirlos en la siguiente solucin durante 30 segundos, sostenindola con las pinzas:

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Si luego de quitar la resina se sombrean los cortes con una aleacin de Pt-Pd, se podrn visualizar en relieve las subunidades de
celulosa o materia sea.

420

Solucin metanol:benceno (1:1) 2 veces


100 % acetona
AD.
Dejar secar

A.11) Cmo quitar la resina epoxi de los tacos mal infiltrados

(Ogura-ODU, 1973)

Mezclar lentejas de NaOH con EtOH hasta saturacin. Dejar varios das hasta obtener un color caoba (quedarn lentejas en el
fondo del recipiente).

Tratar el taco de tejido como sigue:

Para volver a infiltrar se debe retomar a partir del paso de deshidratacin en adelante.
Si fall la polimerizacin y el taco qued blando, se lo puede dejar en xido de propileno hasta disolverlo.

421

Tiempo (min.)
20
5
5
2 -3

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Ractivo
NaOH/EtOH sat.
EtOH 96 %
EtOH 70 %
A.D.

A.12) Tcnica de desparafinizacin

Para poder observar en TEM un tejido que ya ha sido montado en un taco de parafina para microscopa ptica, primeramente se
debe quitar la parafina. El tejido debe haber sido fijado con formaldehdo o glutaraldehdo, realizndose una post-fijacin con OsO4.
El taco de parafina se trata con xilol durante una hora en estufa a 70 C. Fuera de la estufa se agrega:

Luego se contina, segn el proceso estndar, con los pasos de lavado, deshidratacin e infiltracin en resina.

422

Buffer cacodilato o fosfato


OsO4 1 %

Tiempo
(min.)
30
2

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Ractivo

Soluciones de trabajo

A.13) Ejemplo

1 fijador:
Glutaraldehdo 25 %
Tampn cacodilato de sodio

1ml
4ml

2 fijador:
Tetrxido de osmio 2%
Ferrocianuro de potasio 3%
Buffer cacodilato de sodio

1 vol.
1 vol.
1 vol.

Soluciones madre para preparar las de trabajo

Tetrxido de osmio 2%:


OsO4
Agua destilada

0,5
25 ml

3.43g
100 ml

Tampn cacodilato de sodio 0,1 M ( pH 7,37,4)


Na (CH3)2 As O3.3H2O
Agua destilada (cnp)

21.40 g
1l

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K4 Fe(CN)6.3 H2O
Agua destilada (cnp)

423

Solucin de ferrocianuro de potasio 3%:

APENDICE II-Mantenimiento y operacin.

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424

Prof. Viviana Sorrivas e Ing. Mara Julia Yaez

AII.1-condiciones de operacin

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Si nos referimos al microscopio electrnico de barrido, y llegamos al paso en que la muestra ya ha sido montada y metalizada, llega el
momento de observarla al microscopio electrnico. Todo aparenta estar perfecto. El operador se sienta al microscopio, rompe el vaco,
es decir deja que entre aire a la columna, y coloca la o las muestras que va a observar en el portamuestras del instrumento, se fija que
hagan contacto muestra y porta muestra, cierra la cmara, selecciona: bombear (hacer vaco). Elije el potencial que va a utilizar, se fija
que el instrumento lo habilite y comienza a saturar el haz, lo templa de a poco y llega al punto en que dndole la mnima corriente
obtiene el mximo brillo. En los filamentos nuevos generalmente se utiliza el primer punto de saturacin por una hora y media y luego se
pasa al segundo punto. Todo esto para lograr una buena vida til del filamento de tungsteno.

425

El objetivo de este espacio es colaborar con quien va a iniciarse en Microscopa Electrnica o el ya iniciado, para llegar a una
comprensin del porqu de la importancia en la seleccin de los parmetros operativos en la observacin de una muestra y adems
cmo realizar el mantenimiento de rutina para lograr una utilizacin ptima del microscopio. Este apndice seguramente quedar
desactualizado rpidamente debido a los avances en la tecnologa, pero creemos que hay muchos instrumentos cuya antigedad
sobrepasa los 25 aos y funcionan perfectamente gracias a los cuidados en la operacin y el mantenimiento que realizan sus operadores.
Los microscopios poseen sistemas totalmente automticos de vaco. Poseen bombas mecnicas rotativas que realizan un vaco
grueso hasta 10-3 Torr. y tambin bombas de alto vaco que en los instrumentos ms antiguos eran difusoras de aceite y en los
modernos son turbomoleculares o inicas. Estas ltimas no requieren mantenimiento mientras que las rotativas y difusoras necesitan
cambios en el aceite al menos una vez al ao y una limpieza rigurosa. Una vez completada la secuencia de vaco correspondiente, el
encendido es habilitado. Hay en la actualidad una variedad muy extensa de microscopios electrnicos, en esta seccin slo
mencionaremos algunos modos. En realidad no es necesario conocer los principios fundamentales de la microscopa electrnica para
poder utilizar los instrumentos, pero un conocimiento bsico de cmo son y cmo funcionan otorga un beneficio extra al usuario y al
operador.
Los principios fundamentales se trataron en el captulo I .

Toma una cpsula de Whenelt, la limpia escrupulosamente con pasta de pulir, luego con una solucin acuosa con detergente, la
coloca en el equipo de lavar con ultrasonido, un bao de acetona, uno de alcohol y por ltimo de acetona nuevamente, la observa bajo
lupa estereoscpica, mira muy detalladamente el orificio por donde sale el haz, la seca con aire a presin y comienza a armar la cpsula.

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Capsula de Whenelt

426

Se corta la emisin, no hay imagen. Qu ocurre?. Es probable que el filamento haya cumplido sus horas de vida til. (Cuntas horas
sern? (Investiga) . Se requiere cambiar el filamento. Todo en el caso que sea el comn de tungsteno. El filamento de hexaboruro de
Lantano tiene una vida til ms larga y el de mayor precio. ( Requiere un vaco mejor) .
El operador se dirije al laboratorio. Si tuviese uno preparado sera muy rpido, siempre se debera tener uno de repuesto, listo para estos
casos.

Todo con guantes descartables quirrgicos, en la campana extractora. Ensambla todas las partes (en todos los equipos son distintos, si
es la primera vez que lo hacs, consult el manual del microscopio y tom fotos con tu celular).
Es sumamente importante que el filamento, que generalmente (el de tungsteno) y no es precentrado quede exactamente en el
centro, para lo cual se hace girar, mientras se observa en la lupa estereoscpica. Adems es importante fijarse en el manual a qu
distancia del borde del orificio de la cpsula tiene que estar la punta del filamento de tungsteno. En el caso de los filamentos que se usan
en emisin de campo ( field emission) es diferente.
A medida que el voltaje de aceleracin aumenta hay muchos factores que se ven afectados.

Cpsula de whenelt

Por ejemplo:

c. El brillo del haz de electrones se incrementa.


d. La eficiencia de la pantalla de fsforo mejora. (TEM)

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b. El contraste por amplitud decrece.

427

a. Existe una mayor penetracin del haz que permite estudiar especmenes ms gruesos. (TEM)

e. La dispersin inelstica decrece, por ende, la aberracin cromtica decrece, mejorando la resolucin y el dao por irradiacin
disminuye aumentando el tiempo de vida til de la muestra.
f. El haz de electrones es ms sensitivo al vaco por lo que la estabilidad de voltaje disminuye.
g. El lmite de resolucin debido al efecto de difraccin mejora. (TEM) En general, se prefieren altos voltajes de aceleracin (de 80 a 100
kV) cuando se estudian especmenes sensibles a la radiacin electrnica, porque se reduce el dao a la muestra y se mejora la resolucin.
Para aumentar el contraste se colocarn aperturas ms pequeas de objetivo o se utilizarn tcnicas de contraste especficas antes que
disminuir el voltaje de operacin.
Cuando se coloca el TEM en un determinado kilovoltaje (kV), el filamento tiene que estar apagado (es decir, inicialmente no debe circular
corriente) para prevenir el dao al mismo o a la muestra debido al voltaje. Cuando ms alto el KV elegido la corriente tardar ms en
estabilizarse y habr descargas debido a la desorcin de gases residuales. Una vez realizado este paso el filamento puede saturarse
incrementando la corriente. El haz tendr que ser ajustado y alineado para dar el mximo brillo posible en el voltaje y el bias elegido. El
bias puede cambiarse para dar una seal ms fuerte o dbil dependiendo de las condiciones de trabajo (grosor de la muestra,
magnificacin deseada, etc.).

Pgina

428

h. En el caso del SEM, el potencial que se elegir va a depender del tipo de detector y el material. Si es espectrometra por rayos x, el
potencial variar desde 10 kV hasta 39 kV. Si se trabaja a presin variable desde 10 kV en adelante. Si es el detector de electrones
secundarios convencional depender de la muestra y la resolucin a la que se quiere llegar. Hasta 7kv para muestras biolgicas a una
magnificacin menor a 20k. y se podr subir el potencial a medida que se requiere aumentar la magnificacin.

AII.2-Seleccin del Tamao del haz (spot size)en TEM

En la siguiente tabla se presenta un ejemplo de tamaos de spot referidos al tipo de estudio.


Spot size

Tipo Observacin

grande

Especmenes gruesos

medio

Observacin normal

pequeo

Observacin especmenes
sensitivos al haz electrnico

En las siguientes tablas se presentan diversas variantes de las acciones que se sugieren tomar para obtener una imagen de buena calidad, de
acuerdo a la magnificacin de trabajo y el contraste que se observa en la pantalla del TEM.

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Campo claro

429

Trabajos de alta resolucin.

Para muestras biolgicas y polmeros:


Magnificacin
Baja magnificacin
Baja magnificacin
Alta magnificacin
Alta magnificacin

Contraste observado
buen contraste
poco contraste
buen contraste
poco contraste

Apertura objetivo sugerida


Grande
Media
Grande
Pequea

Kilovoltaje sugerido
60 KV
60-80KV
80-100kv
80-100KV

Contraste observado
buen contraste
poco contraste
bueno
bajo

Apertura objetivo sugerida


Grande
Pequea
Media
Pequea

Kilovoltaje sugerido
80 kV
80 kV
100 kV
100 kV

Para muestras no biolgicas:


Magnificacin
Baja magnificacin
Baja magnificacin
Alta magnificacin
Alta magnificacin

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El tamao del haz se har ms pequeo a medida que aumentamos la magnificacin, para obtener una mejor resolucin. Para
detectar rayos x, se utilizar un tamao de spot mayor.

430

AII.2.1-En el caso del SEM

AII.3-Eleccin de aperturas:

Apertura fija de 100 si es presin variable.


Aperturas de 30 para anlisis por rayos X y de 20 para observacin normal.
a) De condensador
Esta define la mxima apertura de iluminacin que puede usarse. La mayora de los microscopios de transmisin usa aperturas en
lentes condensadoras en el rango de 100 a 300 m. A medida que se reduce el tamao de la apertura, la medida del haz se hace ms
pequea en el punto de entrecruzamiento y el nmero total de electrones se reduce. Las aperturas ms pequeas proveen las mejores
condiciones para obtener alta resolucin ya que el haz ser ms coherente.
En la siguiente tabla se presentan, de manera general, los tamaos de apertura ms adecuados para la clase de estudio que se quiere
realizar.

200

Alta corriente del haz


Observacin normal
Observacin especmenes
sensitivos al haz electrnico
Trabajos de alta resolucin

431

300

Tipo Observacin

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Dimetro
apertura
condensador (m)
400

b) de objetivo
La apertura de objetivo se usa para mejorar el contraste por dispersin. Mide entre 25 y 75 m. Cuanto ms pequea la apertura, es
mayor el contraste porque hay ms electrones dispersados. Aperturas ms pequeas mejoran la resolucin debida a las aberraciones
cromtica y esfrica pero reduce la resolucin debida a efectos de difraccin.
Entonces, hay una medida ptima de apertura en la cual esos defectos se balancean. La aperturas ms pequeas son ms difciles de
alinear y se contaminan fcilmente, introduciendo astigmatismo. Algunos microscopios poseen mecanismos de autolimpieza de las
aperturas que disminuyen la contaminacin.
A modo de referencia, en la siguiente tabla se muestran valores de dimetro de apertura en funcin del tipo de estudio que se realice.

Tipo Observacin

60

Observacin normal

40

Especmenes con bajo contraste

20

Trabajos de alto contraste

432

Especmenes con alto contraste

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Dimetro
apertura objetivo
(m )
120

c) de lente intermedia

La apertura de lente intermedia deber ser colocada cuando se desea realizar difraccin de rea selecta(SAD). Se seleccionar el
tamao de apertura de acuerdo al rea del cual se quiere obtener el patrn de difraccin.

AII.2.4-Limpieza del can.

Cada vez que se cambia el filamento hay que limpiar el can de electrones, que implica limpiar los contactos en la cpsula de
Wehenlt y toda la superficie con acetona de excelente calidad y una tela que no deje pelusa. Tambin limpiar el ctodo. Ya se puede
colocar el nuevo filamento en el microscopio. Rompe el vaco de la zona del filamento y lo inserta. Esta parte del equipo es el nodo,
adonde se aplicar una diferencia de voltaje para que se emita el haz de electrones.
Se puede continuar observando una vez que se restaure el vaco.

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Eleccin del Voltaje de aceleracin: Para acelerar los electrones en la columna del microscopio se utiliza alto voltaje que se aplica al
filamento o fuente emisora. Ser desde ese punto de donde se desprenden los electrones. En la mayora de los Microscopios
electrnicos de transmisin, los voltajes que se pueden utilizar van desde 20kV a 200 Kv. La mayora de los trabajos de rutina en biologa
se realizan a 60 u 80 KV, mientras que en materiales a 100 o 120 KV y ms. En Microscopa electrnica de barrido se puede seleccionar el
potencial desde 0.1kv hasta 39 Kv, dependiendo del tipo de muestra la eleccin que se realice.

433

AII.3-Seleccin de parmetros operativos

AII.4-Qu potencial utilizar en su muestra?

Es interesante que repase cmo interacta el haz con la muestra a diferentes potenciales. Se puede anticipar que la experiencia con
muestras biolgicas y aquellos minerales que contienen humedad en su constitucin es muy buena trabajando a potenciales bajos
cmo: 3, 5, 7KV. Si se requiere llegar a altas magnificaciones ser necesario aumentar el potencial a 15 KV. Si por alguna causa no ha
quedado bien la metalizacin la muestra puede llegar a cargarse (Ver artefactos) y adems hay que evaluar el posible riesgo de dao por
irradiacin con respecto al tiempo que se necesita para lograr la imagen que se busca.
Una vez elegido el potencial se dar emisin al filamento. (Siendo nuevo, la saturacin se realizar ms despacio y es muy importante
realizar ste paso con cuidado).El operador comienza a observar la muestra a baja magnificacin, toma una imagen panormica para
lograr la ubicacin del punto de inters. A continuacin buscar lo que interesa estudiar y lo enfoca a magnificaciones ms altas. Elige la
ms representativa para los requerimientos del trabajo.

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434

Guarda los archivos de imgenes en un directorio nombrado como el dueo de la muestra, y cada imagen con el nombre que permita
ubicar muy rpido el tipo de material y la magnificacin a la que fue obtenida. El interesado es conveniente que registre: el nombre de la
imagen, la fecha y el protocolo que se realiz para prepararla y cualquier otro dato de inters. Generalmente el turno dura una hora y se
toman todas las imgenes que se pueda en ese tiempo. Luego se estudiarn y cuanto mucho se repetir el turno. Las muestras bien
guardadas sirven para varias observaciones.

AII.5-Recambio de aperturas

Cuando las aperturas estn sucias, se complica enfocar la imagen y se muestra muy astigmtica. Una de las opciones es cambiar las
aperturas. Las hay fijas dentro de la columna y las de objetivo, que son las que podr cambiar el operador. No se aconseja al operador
inexperto desarmar el microscopio. Lo ideal es contar con juegos nuevos de aperturas pero en el caso de no tenerlas se pueden limpiar.
Siempre hay que evaluar el estado de las mismas con un microscopio ptico. Consultar los manuales de cada equipo.

En la siguiente tabla se presentan, de manera general, los tamaos de apertura ms adecuados para la clase de estudio que se quiere
realizar.

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a) de condensador.
Esta define la mxima apertura de iluminacin que puede usarse. La mayora de los microscopios de transmisin usa aperturas en
lentes condensadoras en el rango de 100 a 300 m. Cuando se va reduciendo el tamao de la apertura, la medida del haz se hace ms
pequea en el punto de entrecruzamiento y el nmero total de electrones disminuye. Las aperturas ms pequeas proveen las mejores
condiciones para obtener alta resolucin ya que el haz ser ms coherente.

435

AII.5.1-Eleccin de aperturas:

Dimetro
apertura
condensador (m)
400
300
200

Tipo Observacin

Alta corriente del haz


Observacin normal
Observacin especmenes
sensitivos al haz electrnico

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b).La apertura de objetivo se usa para mejorar el contraste por dispersin. Mide entre 25 y 75 m. Cuanto ms pequea la apertura,
es mayor el contraste porque hay ms electrones dispersados. Aperturas ms pequeas mejoran la resolucin debida a las aberraciones
cromtica y esfrica pero reduce la resolucin debida a efectos de difraccin.
Entonces, hay una medida ptima de apertura en la cual esos defectos se balancean. La aperturas ms pequeas son ms difciles de
alinear y se contaminan fcilmente, introduciendo astigmatismo. Algunos microscopios poseen mecanismos de autolimpieza de las
aperturas que disminuyen la contaminacin.
A modo de referencia, en la siguiente tabla se muestran valores de dimetro de apertura en funcin del tipo de estudio que se
realice.

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Trabajos de alta resolucin

Dimetro
apertura objetivo
(m )
120

Tipo Observacin

Especmenes con alto contraste

60

Observacin normal

40

Especmenes con bajo contraste

20

Trabajos de alto contraste

Alinear el haz consiste en: primeramente saturarlo, o sea llevarlo a la posicin en que emite con el mximo brillo y est bien centrado
en la pantalla. El mecanismo es sencillo y hay que verificar mientras se trabaja que no se desalinee.

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AII.6-Alineacin del haz.

437

c) de lente intermedia
La apertura de lente intermedia deber ser colocada cuando se desea realizar difraccin de rea selecta (SAD). Se seleccionar el
tamao de apertura de acuerdo al rea del cual se quiere obtener el patrn de difraccin.

AII.7-Correccin de astigmatismo

Cmo darse cuenta de que la imagen est astigmtica?. Qu es el astigmatismo ?. (Ver captulo de Fundamentos).
Cmo se corrige? La correccin no es automtica, generalmente se sube la magnificacin a ms de 6000x y se corrige cambiando el foco
fino y ajustando la corriente en el sentido de las Y y de las X. Cuando la imagen se sale de foco pero no flucta en uno de los ejes se
considera que est corregido.
AII.8-Enfoque

Lo ideal para enfocar una imagen es utilizar una pantalla ms pequea y variar el foco fino hasta que los bordes se vean bien enfocados.
Si no es as se corrige el astigmatismo. En SEM es importante tener en cuenta la distancia de trabajo (WD). A menores distancias de
trabajo mejor foco.

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Una vez obtenida la zona buscada, mediante barridos rpidos tipo TV, enfoca a alta magnificacin una zona aledaa, por el riesgo que
corre la muestra de sufrir dao por radiacin. La contaminacin de especmenes examinados en el microscopio electrnico es el
resultado de la reaccin entre haz y materia adsorbida en la superficie irradiada. El material que se ve como un cuadrado negro en SEM,
consiste de molculas de hidrocarburos, que puede contener algunas molculas de agua que existen en las superficies de todos los
sistemas desmontables de vaco. (Artefactos).
Se baja la magnificacin, se elige la velocidad de barrido para tomar la foto y la resolucin a la que va a adquirir la misma. En el caso de
los TEM si no se posee sistema de adquisicin de imgenes se toma una microfotografa tradicional, con la cmara CCD se adquiere la
imagen a la resolucin deseada.

438

AII.9-Adquisicin de imgenes

AII.10-Con respecto al porta muestras.

En el Microscopio Electrnico de transmisin, de gonimetro de entrada lateral se colocan dos grillas.

Grilla con la muestra.

Grilla con la muestra.

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Hay algunos puntos importantes para tener en cuenta.


nunca usar las manos directamente para trabajar ya que la grasa que contienen contamina la columna.
Estar seguro de que la grilla que contiene el espcimen est plana y bien sostenida.
La muestra generalmente se introduce al microscopio con el alto vaco (HV) en ON (prendido), el haz y las aperturas alineadas, el
haz expandido y la magnificacin baja. Para irradiar muestras sensitivas a la irradiacin utilizar el haz menos concentrado y la
menor magnificacin posible.

439

Portamuestras TEM (entrada lateral)

AII.11-Seleccin de la magnificacin:

La eleccin de la magnificacin depende de la naturaleza de las observaciones que se llevan a cabo.


a. Baja magnificacin: (<10,000X) se requiere para obtener un campo panormico (>10 m) de un espcimen en una sola micrografa.
Tambin se puede realizar un foto montaje para obtener una imagen de un espcimen completo a mayor magnificacin.
b. Para estudios estadsticos como determinar poblaciones relativas o medidas de diferentes partculas es necesario observar mayor
cantidad de muestra. Lo mejor es usar la menor magnificacin posible en la cual las partculas a medir pueden identificarse
perfectamente.
c. Cuando la muestra que se observa es sensible a la radiacin habr que usar la menor magnificacin posible y el nivel de iluminacin
que permita adquirir la imagen.
d. Cuando se requiere adquirir una imagen de mucha resolucin se utilizar una magnificacin en la que el microscopio pueda
resolver los detalles que se necesitan ver y no mayor. Una magnificacin excesiva llevar a una exposicin innecesaria a la
radiacin.
e. Para tomar imgenes a baja magnificacin conviene enfocar al mayor aumento posible, verificar la correccin de astigmatismo y
luego bajar la magnificacin.

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Una imagen en foco se caracteriza por la nitidez de los detalles caractersticos de la muestra.
Lo ms evidente de la imagen TEM fuera de foco es la aparicin de bordes claros (bajofoco) u oscuros (sobrefoco) en el contorno de una
caracterstica determinada. Los cambios de intensidad no deben ser interpretados como cambios en el espesor o en la densidad de la
muestra.

440

AII.12-Foco

La puesta en foco es una de los ms importantes tems en la obtencin de micrografas en TEM y es dependiente de la variacin de
corriente de las lentes objetivas.
AII.12.1-Enfoque a baja magnificacin: (<10,000X)

Hay dos mtodos que pueden recomendarse: Enfocar con la ayuda del wobbler que produce un movimiento cclico del haz incidente
que hace que se vean dos imgenes vibrando cuando la lente objetiva se enfoca por encima o por debajo del plano del espcimen y
con los controles apropiados hay que juntarlas, cuando la imagen permanece quieta la lente objetiva est en foco.

AII.12.2- Enfoque a alta magnificacin:

Un mtodo excelente para lograr un buen foco a altas magnificaciones es enfocar una caracterstica del film de soporte (por ej. un
agujero) y una vez enfocado y corregido astigmatismo moverse a la muestra propiamente dicha.

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Es un paso fundamental para obtener micrografas en foco. Adems cuando no puede corregirse da una seal de que la columna de
microscopio est contaminada.
La imagen astigmtica se observa como una deformacin direccional (en x y/o en y), como se presenta en las siguientes micrografas:

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AII.12.3Correccin de astigmatismo:

Imagen no
Deformacin en x

astigmtica

Deformacin en y

Para corregir se operan los controles de astigmatismo, para lograr si usamos el caso del Halo de Fresnel (ver imgenes siguientes)
que cuando se enfoca y desenfoca el halo se vea del mismo grosor en todo el agujero y sea concntrico. Esta operacin se realiza por
encima de los 50.000x, observando con el microscopio estereoscpico que aumenta 10 x.
El corrector de astigmatismo de la lente objetiva se usa para compensar el astigmatismo en la imagen. Hay dos protocolos comunes
para corregir astigmatismo:

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se va obteniendo una imagen sobre enfocada (over


focus) de un pequeo agujero a 100.000x , pasar de bajo
foco (under focus) a sobre foco, ver el halo de Fresnel y
mover los controles de astigmatismo de manera que el
grosor del halo quede parejo en todo su espesor.(ver
imgenes siguientes)

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1. Con una grilla con un film de carbn micro agujereada,

Correccin de astigmatismo;
a)
b)
c)
d)
e)

Imagen astigmtica (note detalle del fondo)


Corrector de astigmatismo en ON. Desviacin del
Halo de Fresnel en un sentido.
Desviacin en otro sentido.
Imagen sin astigmatismo.

La compensacin por asimetra se transforma en un proceso de prueba y error, requiere experiencia y habilidad.
Los operadores con experiencia corrigen astigmatismo sin la ayuda de una grilla de agujeros a la que se le vaporiz carbn.
Directamente lo hacen observando un detalle de la muestra.
2.- ajustar el corrector de astigmatismo de manera de reducir el contraste de fase en la imagen. Cuando la imagen est astigmtica no
habr un punto con bordes ntidos. Una vez que se obtuvo esa imagen se utilizan los correctores para corregir el foco fino y minimizar el
contraste. Cuando la imagen est en foco el contraste se incrementa en cada condicin cercana al foco. Este mtodo es muy til porque
se puede usar la muestra y no tratar de encontrar un agujero.

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La correccin de astigmatismo es fundamental para obtener un buen foco en la imagen. Se corrige con los controles en X e Y del
corrector de astigmatismo, hasta que cambiando de foco la imagen, a bajo y sobre foco, la misma se salga de foco sin deformarse. Se va
controlando el foco a medida que se aumenta la magnificacin .

443

AII.12.4-Correccin de astigmatismo en el SEM:

AII.13-Alineacin (TEM)

Una mala alineacin de la columna del TEM puede interferir en el poder de resolucin por inestabilidades en el alto voltaje o la corriente de las
lentes produce movimientos en la imagen que se incrementan con la calidad de la alineacin. Que el haz est desalineado significa que no est
centrado alrededor del eje de la lente. Al estar alineadas las lentes formadoras de imagen, el centro ptico de la imagen coincidir con el centro
fsico de la pantalla de observacin. La columna desalineada provoca serios inconvenientes tales como movimientos del campo de visin durante
cambios en la magnificacin o enfoque.
El microscopista deber poder realizar las siguientes operaciones sin problemas:
1 . Cambiar la magnificacin sin que se pierda el centro del campo de visin.
2. Variar la iluminacin del objeto sin que se desve el haz.
3. Enfocar la imagen sin que se salga de la pantalla.
4. Cambiar de un modo de operacin a otro sin que se pierda iluminacin.
Idealmente, los elementos pticos de cualquier microscopio deben ser coaxiales. Esto es, los ejes de simetra de cada lente deben coincidir
exactamente.
El centro de la lente objetiva y el centro de la pantalla constituyen dos puntos que definen el eje ptico. Y si se puede verificar la columna estar
alineada.

AII.13.1-Alineacin SEM:

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444

Si la columna del SEM no est bien alineada no se podr saturar bien el filamento. Las aperturas debern alinearse con el woobler, de
modo que cambiando el foco la imagen no se mueva.

AII.14-Alineacin del can de electrones

La alineacin del can (gun) consiste en centrar una imagen del filamento emitiendo, pero no saturado en la pantalla de observacin. El
agujero en la cpsula de Whenelt es menor que 1mm y por lo tanto un pequeo desplazamiento, movimiento en x o en y o una
inclinacin (tilt) del filamento va a distorsionar la emisin y reducir la intensidad de la iluminacin.

AII.15-Alineacin de la lente condensadora en TEM:

Implica centrar la iluminacin en todos los niveles de corriente de condensador. Cuando est desalineada la iluminacin se escapa del
campo de observacin cuando se cambia la corriente de la lente.
Para que la iluminacin sea pareja tambin habr que alinear la apertura de condensador. Si la apertura esta desalineada, al ir
variando desde la posicin de bajo foco a sobre foco, la imagen del haz de electrones sobre la pantalla se mueve fuera del eje (centro) y
se distorsiona. Una buena alineacin existe cuando el haz est centrado y al expandirse permanece en el centro de la pantalla. Esto se
realiza con ayuda de controles externos que permiten desplazar la apertura hasta centrarla.
Tambin puede estar astigmtica la lente condensadora, se ver elptica cuando el haz se desenfoca y se podr corregir con los
correctores de astigmatismo de la lente condensadora.

Si el sistema formador de imagen no est correctamente alineado, la imagen en el centro de la pantalla se deslizar al ir cambiando la
amplificacin. El procedimiento de alineacin resultar en que el eje ptico del sistema formador de imgenes est en lnea con el eje
mecnico del instrumento. Una vez alineado un objeto puntual en el eje de la lente objetiva se ver como una imagen en el centro de la

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AII.16-Sistema formador de imagen (TEM):

pantalla a cualquier magnificacin. Procedimientos especficos de alineacin son llevados a cabo de acuerdo a las caractersticas del
microscopio.
AII.17-Alineacin de la apertura de objetivo (TEM):

La apertura de objetivo se centra usando los controles finos de x e y. EL borde de la apertura deber contener en forma concntrica al
haz de electrones, el cual incide en el centro de la pantalla.
AII.18.-Campo oscuro

Las alineaciones y procedimientos descriptos valen para campo claro, campo oscuro y difraccin de rea selecta.
Como se estudio en secciones anteriores, una imagen de campo oscuro se forma interceptando los electrones transmitidos con la
apertura de objetivo y dejando pasar los electrones dispersados en determinados ngulos. La imagen de campo oscuro tiene un alto
contraste (en especial en las zonas cristalinas) y su resolucin es comparable con la imagen de campo claro.
Controles especficos del TEM permiten pasar de una imagen de campo claro a campo oscuro en forma relativamente simple.
Dada sus caractersticas de baja luminosidad en la pantalla, el registro de tales imgenes necesita de mayores tiempos de exposicin.

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Para obtener un patrn de difraccin se deber ajustar el sistema de lentes tal que el plano focal imagen de la lente objetivo acte
como plano objeto de las lentes intermedias. Esto se realiza directamente con controles especficos del microscopio.
El procedimiento bsico para obtener el patrn de difraccin por rea selecta es: se selecciona un rea especfica del espcimen, se
inserta una apertura para SAD en el plano imagen de la lente objetivo y se ajusta la lente intermedia para focalizar.

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AII.19-Difraccin de rea selecta

Se debern tener en cuenta parmetros como la longitud de cmara y la magnificacin. La primera se seleccionar de forma tal que
los espaciados en el patrn de difraccin sean discernibles sobre la pantalla. La magnificacin puede cambiarse ajustando las lentes
intermedias con los controles correspondientes.
Un valor tpico de longitud de cmara es 60 cm.
Es de destacar que los modos de observacin anteriormente dados, requieren la calibracin de la magnificacin real y de la longitud
de cmara del microscopio.
AII.20-Mantenimiento de equipos accesorios.

AII.20.1-Mantenimiento de la evaporadora de metales en plasma de Argn

Este equipo requiere estar muy limpio para su buen desempeo. El vaco que se realiza en la campana donde se ubican las muestras
es alcanzado por una bomba mecnica. Observar siempre que la bomba tenga el nivel de aceite requerido. Los o-rings, que sellan para
que haya un buen vaco deben estar escrupulosamente limpios y lubricados con una capa nfima de aceite de vaco. (Marca Apiezon). El
disco del metal que se evaporar debe estar limpio y hacer buen contacto.

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Cmo limpiarlo depender del tipo de equipo, generalmente hay que tener en cuenta que el fluido intermediario, en nuestro caso
CO2, sea de buena calidad, es decir est limpio. La cmara donde va la muestra debe estar inmaculada y las canastitas en donde se coloca
cada espcimen tambin.

447

AII.20.2-El aparato de secado por punto crtico

AII.21-CALIBRACION

La primera calibracin de un TEM es cuando se instala. Calibraciones posteriores deben ser realizadas cada vez que se realiza el
mantenimiento anual del equipo, o se efectan reparaciones.
Estas calibraciones deben hacerse posteriormente a una adecuada alineacin.
AII.21-1Calibracin de la magnificacin (TEM)

Se alinea el TEM.
Para cada magnificacin, se focaliza la imagen del estndar que se seleccione y se toma una imagen del mismo.
Se miden los espaciados y se obtiene la magnificacin real.
Con el set de datos de todas las magnificaciones se realiza un grfico de magnificacin nominal vs magnificacin real.

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448

Las magnificaciones mostradas en el microscopio (magnificaciones nominales), dada por el fabricante, pueden diferir de las reales,
debido a variaciones en la tensin , la localizacin precisa del espcimen y las variaciones de la corriente de lentes debido a corrimientos
del voltaje de referencia.
Para la calibracin de la magnificacin se utilizan estndares. Hay de distintos tipo, dependiendo del rango de magnificaciones que se
quiera calibrar. Uno de los mas comunes son las rplicas de carbn de espaciado conocido (pueden ser de lneas paralelas o
cuadriculado), las cuales tienen 2160 lneas por mm, con un espaciado de lnea de 0.463 micras y permiten calibraciones hasta 50000 x
aprox. para el patrn de lneas paralelas y hasta 200000x para el cuadriculado.
El estndar de cristal de catalasa, contraste negativo, es otro patrn que suele utilizarse para calibraciones entre 50000x a 200000x. El
espaciado entre planos es de 8.75 nm y 6.85nm.
Otros patrones estn disponibles para este tipo de calibraciones. Entre ellos podemos nombrar: carbn grafitizado blanco, cristal de
oro orientado y ferritina.
El procedimiento bsico para realizar la calibracin de la magnificacin es el siguiente:

Mag. real

Mag. nominal

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En la siguiente tabla se presentan valores de magnificaciones calibradas a 100 kV.

449

La calibracin debe ser realizada debido a que el sistema de lentes puede tener variaciones relacionadas con la corriente y vinculadas
a la temperatura ambiente, a la eficiencia del sistema de enfriamiento de las lentes y el ciclo de histresis de las mismas. Si se tienen que
realizar mediciones precisas, es aconsejable calibrar la magnificacin en simultneo con las mediciones a fin de asegurar las mismas
condiciones operativas.
Errores menores del 10% en la medida de la magnificacin son aceptables.

Mag.
Terica
2000
4000
5000
6700
10000
20000
50000
80000
100000
140000
200000
270000

Mag. Real
2040,00
4080,00
5100,00
6834,00
10200,00
20400,00
51000,00
81600,00
102000,00
142800,00
204000,00
275400,00

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La relacin empleada para determinar los espaciados d a partir de una imagen de difraccin electrnica ha sido mostrada es la seccin
de difraccin electrnica. :
R.d = .L
La constante de cmara ( .L) es caracterstica de cada instrumento y debe ser calibrada.
Para esto se utilizan patrones tales como films delgados de oro o aluminio. Los mismos dan un patrn de difraccin electrnica de
anillos. Se mide la distancia R desde cada anillo al punto central y se realiza un grfico. 1/d vs R.
La pendiente de la recta dar el valor de .L. La bondad de este procedimiento depende del mtodo de ajuste de curvas que se emplee.
El ms adecuado para tener buena precisin en la medida es el de cuadrados mnimos.

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AII.21.2-CALIBRACIN DE LA CONSTANTE DE CMARA

AII.21.3-Rotacin de la imagen relativa al patrn de DIFRACCIN

Imgenes en diferentes magnificaciones rotarn en un ngulo con respecto al patrn de difraccin fijo. Para determinar esta
rotacin se emplea una muestra de MoO3 cuyo lado de mayor longitud es paralelo a la direccin 001 en el cristal. Se coloca la apertura
para difraccin de rea selecta (SAD) y se focaliza la imagen. Se pasa a modo difraccin con el haz defocalizado y se focaliza hasta obtener
un patrn bien definido. Se hace una doble exposicin de la imagen y del patrn de difraccin. Se repite el procedimiento para diferentes
magnificaciones. Se aconseja realizar esto con un valor fijo de longitud de cmara (L).
Se realiza un grfico magnificacin vs. Rotacin (en grados).
Es importante tener en cuenta la rotacin de 180 producida en la imagen cuando se incrementa la magnificacin. La imagen directa
y su correspondiente patrn de difraccin estn rotados 180 ms un ngulo y esta rotacin debe ser incluida en la calibracin. Por lo
tanto, para lograr una correspondencia real entre ambos registros es necesario girar el diagrama de difraccin 180 + en el sentido de
las agujas del reloj.
AII.21.4-Calibracin de la magnificacin (SEM)

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Generalmente para calibrar el microscopio de barrido se usan muestras patrones, con tamaos adecuados para calibrar y se constata
que la escala que marca el microscopio coincida con el tamao de la muestra utilizada. Se hace una vez cuando el equipo se instala.

Gua de trabajos prcticos


Para Biologa y Materiales

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452

Dra. Alfonsina Morales, Ing.Mara Julia Yaez y Prof.Viviana Sorrivas

Instrumentacin necesaria

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453

Pinza con punta muy fina, adecuada para manipular grillas.


Pipetas descartables o pipetas Pasteur con bulbo plstico (varias).
Cuchillas de acero sin usar limpiadas con lavadas en alcohol.
Cera dental (para cortar la muestra sobre una gota de buffer).
Recipientes para lavar.
Papel de filtro .
Palillos de madera.
Cpsulas Beem.

Microscopa Electrnica de transmisin


TP1.1-Fijacin: Esquema tpico

Objetivo: Realizar una doble fijacin a tejidos biolgicos frescos con glutaraldehdo y tetrxido de osmio.
Materiales:

Procedimiento:
Coloque todo el material que necesitara durante la fijacin bajo campana. A mano dejar la cera dental y
las hojas de afeitar.
Nota: Recordar que
1. Disecte el rgano que estudiar rpidamente. Trozos de 1 o 2 cm. de tejido se lavarn con buffer.
el OsO4 no debe usarse
2. Transfiera el tejido a una gota de glutaraldehdo al 3 % en buffer fosfato. Fjese que el material quede
en un rea abierta, sino
bien sumergido en la gota.
bajo campana. Para la
3. Usando una cuchilla de acero limpia y nueva, corte el tejido en piezas pequeas (menores a 1 mm2).
preparacin de drogas
4. Prepare con un palillo de madera una esptula, haciendo roma su punta, para poder manipular el tejido
ver Apndice de recetas.
sin estropearlo.
5. Levante rpidamente los pequeos trozos y colquelos en un frasquito que contenga solucin fijadora.
6. Etiquete el frasco con su nombre y la hora en que coloc la muestra en fijador.
7. Deje que se fije el tejido durante dos horas a temperatura ambiente o toda la noche en heladera.
8. Lave el tejido en buffer fosfato en tres cambios de 15 minutos cada uno para remover el glutaraldehdo.
9. Descarte el ltimo cambio y agregue 1 ml de OsO4. Deje actuar una hora bajo campana, tapado. El tejido se pondr negro.

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Pipetas Pasteur, varias.


Glutaraldehido al 2,5 % en buffer fosfato.
Solucin de trabajo de tetrxido de osmio (OsO4) al 1 %.
Hojas de afeitar nuevas, lavadas con acetona.
Cera dental (un trozo).

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10. Cubra de inmediato el tejido con buffer fosfato.


11. Descarte el OsO4 en un frasco con aceite mezcla comestible.

El propsito de la doble fijacin es preservar la estructura del tejido de manera tal que las secciones que
se observen al microscopio sean un reflejo fehaciente de las estructuras vivas. Tan rpido como un
organismo vivo muere, comienza la autolisis. El fijador debe llegar al interior del tejido lo ms rpido posible.
Como sabemos, el glutaraldehdo penetra ms rpido que el osmio, es por eso que se utiliza en la primera
fijacin.
TP1.2-Deshidratacin: Esquema tpico

Frascos de alcohol etlico en las siguientes proporciones: 50 %, 70 %, 95 % y 100 %.


Pipetas Pasteur.
Mezcla de resina.
Cpsulas Beem.

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Materiales:

455

Objetivos: * Extraer el agua libre de los tejidos fijados, ya que la mayora de los medios de infiltracin que se utilizan no son miscibles
en agua.
*Infiltrar el tejido deshidratado con un medio de inclusin plstico.
*Endurecer el espcimen infiltrado con el medio.

Nota:

Durante el tiempo en que le tejido est siendo fijado, conviene preparar el medio de inclusin. Planificar el procedimiento de manera
que sea posible dejar los especmenes en resina al finalizar el da de trabajo.
(Nota: Ver en Apndice de recetas la preparacin de resinas).
Solucin
Duracin
50 % acetona
15 min.
70 % acetona
15 min.
100% acetona
15 min.
2 acetona: 1 resina
30 min.
1 acetona: 1 resina
30 min.
Resina pura
Toda la noche
Polimerizar en estufa a 70
Toda la noche

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1. Extraiga bajo campana la muestra del lquido fijador.


2. Lave la muestra con agua destilada o directamente colquela en el primer medio de deshidratacin (50 % alcohol). Agite y deje
durante 15 min.
3. Realice los cambios sin permitir que la muestra quede sin lquido.

456

Procedimiento:

Nota: este es un protocolo tpico. El alumno puede


haber seleccionado un esquema de acuerdo a la muestra
que va a procesar y seguir su propio protocolo.

2.
3.
4.
5.

Procedimiento:
Sobre una hojita de papel de aluminio, ubique:
Las cpsulas Beem. Coloque el rtulo en cada cpsula que vaya a utilizar, enroscando un papel en un lpiz y colocndolo como
indica la figura. Debe escribirse a mquina o con lpiz.
Una jeringa descartable para colocar la resina.
Un recipiente con resina.
Un trozo de cera dental y un palillo con punta roma.
Extraiga la mezcla resina de la muestra.
Agregue 1-2 ml de mezcla de resina fresca, mezcle el tejido e invierta la cpsula sobre un trozo de cera dental.
Usando el palillo elija el trozo de tejido ptimo para incluir.
Cargue resina en la jeringa y coloque unas gotas en cada cpsula embebiendo y acomodando el rtulo. Con un palillo saque las
burbujas del fondo de la cpsula.

457

1.

Tp1.3-Inclusin en resina y polimerizacin

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Nota: durante el tiempo en que se est


deshidratndola muestra, prepare las cpsulas Beem o
los moldes que vaya a utilizar para incluir.

6.
7.
8.
9.

Tomando el tejido con el palillo coloque un trozo en cada una de las cpsulas.
Agregue con la jeringa ms resina hasta 1 o 2 mm. del borde.
Inspeccione la posicin del tejido.
Coloque el bloque en un horno a 70C. Deje que los bloques se endurezcan por lo menos 24 hs. Pueden dejarse 2 o 3 das porque no
se vern daados.
10. Chequee la dureza del bloque cuando est fro: al clavarle una ua no debera marcarse. En caso contrario deje en estufa por ms
tiempo.

T1.4 Inclusin en resina. (Materiales).

458

Nota: El uso de cuchilla de diamante favorece la obtencin de secciones


delgadas de 60nm aproximadamente.

Pgina

Materiales a utilizar:
Grillas.
Vial o molde plstico.
Estufa.
Hoja de afeitar.
Pinza.
Palillos de naranjo.
Cuchilla de diamante.
Ultramicrtomo.

1- Se sumerge dentro de un vial con resina (araldite o Spurr) parte del


mineral o catalizador en polvo.
2- Se lo deja en este medio entre 6 a 8 h. Es importante no superar este
tiempo ya que la resina puede empezar a polimerizar.
3- Se lo lleva a estufa a 60 C durante toda la noche, para curar la resina,
es decir se transforma en un slido transparente que contiene el
material que se desea seccionar.
4- Se retira de estufa y se talla la pirmide.
5- Se realizan cortes delgados a temperatura ambiente en un
ultramicrtomo.

anotaciones
datos

Tiempos

Fecha
Nombre del experimentador
Espcimen utilizado
Fijador 1
Solucin tampn
Fijador 2
Agente deshidratantes (%)
Resina ( tipo)
Polimerizacin (t)

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Observaciones

459

Rtulos

TP2-Contraste.
TP2.1-Contraste con acetato de uranilo y citrato de plomo. (Biologa).

Objetivo:
Debido a la baja nube de electrones que presentan los tomos de las muestras biolgicas es necesario incrementar el contraste de los
tejidos a ver en el microscopio de transmisin por deposicin de metales
pesados en la ultraestuctura.

Procedimiento:
Colocar sobre una hoja de papel de aluminio todos los elementos necesarios:
1. Centrifugar el citrato de plomo a 600 rpm por 15 min.

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460

Nota:
Materiales:
Solucin 3% de acetato de uranilo (centrifugada).
Existen problemas de precipitacin
Solucin citrato de plomo 0.5%, pH=11,2 (centrifugada).
sobre la muestra si no se tiene los cuidados
2 recipientes de 50 ml con agua destilada, hervida y filtrada.
indicados en la Tcnica.
Cpsula Petri con pellets de OHNa
Pipetas descartables o Pasteur con bulbo.
1 pinza de punta fina.
Reloj con alarma (timer).
Las frmulas para la preparacin de los agentes de contraste figuran en Apndice de Recetas.

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461

Nota: si la solucin no es clara, descartarla.


2. Tomar dos cajas o cpsulas de Petri y colocar un trozo de cera dental en cada caja. En una de las cajas, que se usar para el plomo,
rodear la cera con pellets de NaOH. La caja que contendr acetato de uranilo, debe protegerse de la luz. Tapar las cajas para
saturar la atmsfera.
3. Colocar tantas gotas como grillas se vaya a contrastar. No exponer a la luz en el caso de acetato de uranilo.
4. Tomando las grillas una por una sumergirlas en la gota.
5. Dejar actuando por lo menos 4 a 5 minutos el acetato de uranilo.
6. Una vez pasado ese tiempo, sostenga firmemente la primera grilla por su borde y lave en los recipientes que contienen agua
destilada, sumergindola con movimiento vertical varias veces en cada bao. El motivo de estos baos es extraer el exceso de
acetato de uranilo.
7. Dejar secar las grillas teniendo cuidado de no mezclarlas. Para eso roturar un papel de filtro en una caja de Petri de la siguiente
manera:
8. En la segunda caja coloque gotas de citrato de plomo sobre la plancha de cera. Tape inmediatamente la caja porque el carbonato
del aire precipita el plomo.
9. Agregue las grillas, 1 por gota, como en el caso anterior.
10. Dejar actuar 1 a 10 min.
11. Lave la solucin 0,04 N de NaOH en el primer bao y luego en el segundo varias veces
12. Dejar secar.
13. Observar.

Nota: El OsO4 se
vende en pequeas
ampollas de 0.5g.

Anotaciones
Datos

tiempos

Acetato de uranilo

Citrato de plomo

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462

Observaciones

TP2.2-Contraste de polmeros. (Materiales)

TP2.2.1-Tetrxido de Osmio
Para polmeros en bloque.
Materiales a utilizar:
Grillas.
Recipiente hermtico.
Caja de Petri.
Pinza.
Papel de filtro.
Solucin de OsO4.
Agua destilada.
Tubito de rollo fotogrfico o recipiente opaco a la luz con tapa .

Mtodo I:

1- Se forma una solucin al 2% de tetrxido de osmio disolviendo la ampolla en


agua .
2- El espcimen (bloque) se sumerge en frasco hermticamente cerrado
conteniendo la

3- Se deja alrededor de 1 semana dependiendo este tiempo del tipo de polmero.


4- Se retira cuidadosamente del frasco y se hacen lavados sucesivos en agua
bidestilada.
5- La solucin de OsO4 usada se neutraliza con aceite vegetal y se guarda en depsito.

Pgina

aceptable).

463

solucin. Es importante que el bloque sea del menor tamao posible ( 3mm 3 es

Mtodo II : para polmeros seccionados previamente.

Materiales a utilizar:
Grillas.
Recipiente para contraste.
Caja de Petri.
Pinza.
Papel de filtro.
Solucin de OsO4.
Agua bidestilada.
Tubitos de rollo fotogrfico o envases opacos a la luz con tapa.

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Un procedimiento similar puede realizarse para el teido de partculas ltex o emulsiones diluidas. En este caso, el tiempo de
teido
estimativo es de 30 min para el teido en solucin lquida.

464

1- Se coloca en un recipiente para contraste, una gota de solucin de OsO4 al 2% sobre la grilla conteniendo los cortes. El tiempo de
teido puede variar entre 1-2 h segn el polmero.
2- Se retira cuidadosamente del recipiente y se hacen lavados sucesivos en agua bidestilada.
3- Tambin pueden usarse los vapores de la solucin de OsO4 al 2%. Para esto se siguen el paso 1 pero los tiempos de teido
pueden ser mucho mayores a los empleados con la solucin lquida.

TP2.2.2 Tetrxido de Rutenio ( polmeros seccionados previamente).Materiales a utilizar:

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1. Se colocan, en un recipiente de vidrio (de 10 ml de capacidad ), 0.02g de RuCl3 y las grillas conteniendo los especimenes a
contrastar. Los bordes de las mismas se sujetan a un vidrio portaobjetos con una cinta doble faz.
2. Se cierra el envase. Es importante que el recipiente pueda cerrarse hermticamente y permita la entrada de liquido
mediante una jeringa.
3. Se inyectan 1ml de (NaClO) y se retira la jeringa. Se formar una solucin color marrn. Es importante que el NaClO sea lo
mas recientemente obtenido posible.
4. Se deja actuar durante 1.30 h. Este tiempo puede variar de acuerdo al tipo de polmero que se desee contrastar.
Se abre con cuidado el recipiente, se retiran los especimenes y se vuelve a cerrar .
5. La solucin RuO4 se neutraliza con una solucin de sulfato de sodio (NaSO4) al 10 %. Se deja neutralizar 1 semana.
6. Posteriormente se lava con agua destilada. El agua de lavado se coloca en bidones destinados a residuos de este tipo.
7. Todos los elementos descartables utilizados se guardan como residuo en una recipiente cerrado y se coloca en un rea
especifica para residuos txicos.

465

Grillas.
Recipiente hermtico de vidrio.
Portaobjetos.
Cinta adhesiva doble faz.
Caja de Petri.
Pinza.
Aguja.
Jeringa.
Papel de filtro.
RuCl3.
Agua bidestilada.
Hipoclorito de Sodio (nueva solucin).

Anotaciones
Datos

tiempos

Tetrxido de osmio. Mtodo I

Tetrxido de osmio. Mtodo II

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466

Observaciones

TP3- Film Soporte.


TP3.1-Preparacin de grillas con soporte. (Biologa y materiales).

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Para poder observar el rea total de una


seccin sin que las barras de la grilla
interfieran, pueden utilizarse aquellas que
poseen desde un solo agujero, hasta 200 y
300#. Quedan ms estables al haz de
electrones si se deposita una fina capa de
carbn sobre el colodion.

467

Objetivo:
Cubrir las grillas con un film delgado transparente a la radiacin para sostener los cortes ultrafinos y material particulado.

Mtodo I

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Procedimiento:
1. Coloque agua destilada hasta el borde del cristalizador.
2. Vierta una gota de la solucin de formvar sobre el agua dejando que se forme una pelcula fina.
3. Descarte la primera pelcula y haga una segunda. Observe que sea parejo su espesor, con el reflejo de la lmpara.
4. Deje secar la pelcula unos minutos al calor de la lmpara.
5. No hable encima de la lmina mientras se seca para que no se formen agujeros.
6. Tome las grillas (previamente lavadas con acetona) con la pinza y colquelas sobre el film con su lado opaco hacia abajo.
7. Sumerja un trozo de papel encerado en el cristalizador perpendicular a la superficie, en la mitad del film o bien apyelo
directamente sobre el film con las grillas y retire.
8. Deje secar las grillas.
9. Observe los resultados al microscopio ptico.

468

Materiales:
Grillas de 200 mesh. Realizar un lavado en cloroformo (4 veces) seguido de un lavado en etanol. Colocar las rejillas sobre
papel de filtro para que se sequen.
Formvar o colodion. Solucin 0.25% (entre 0.31-1%) de Formvar en 1,2-dicloro etano o acetato de etilo.
Pipetas descartables.
Cristalizador.
Agua destilada.
Papel encerado.
Vaso de precipitado.
Lmpara.
Pinza.

Mtodo II

1. Sumergir un portaobjeto en la solucin de formvar en el equipo especialmente diseado. ( FIG)

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469

2. Retirar el portaobjeto y dejar secar por 5-10 minutos.


3. Para permitir que se desprenda la pelcula: retirar los bordes del portaobjeto con una hoja de afeitar.
4. Llenar un cristalizador con agua destilada. Introducir muy lentamente el portaobjeto en el agua, en un ngulo de 30-45 (algunos
autoes sugieren un ngulo mucho ms pequeo, casi paralelo a la superficie del agua). El desprendimiento de la pelcula ocurre por
accin capilar.
5. El film debe aparecer gris o gris plata cuando se refleja la luz. Si aparece amarillento o el color es desigual, entonces es inadecuado
y debe prepararse nuevamente.
6. Transferir el film a la grilla apoyando el lado opaco de la misma en el film.
7. Levantar el film con la rejilla con un papel de filtro, o un Parafilm o un portaobjetos de vidrio y ponerlo a secar en un lugar libre de
polvo.

TP3.2-Cast films.

Mtodo I

Materiales a utilizar:
Grillas.
Caja de Petri.
Pinza.
Portaobjetos o parafilm.
Solucin de polmero.

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Se llena una caja de Petri con un lquido que sea inerte con la solucin polimrica .
Se coloca una gota de la misma sobre la superficie lquida y se deja secar a temperatura ambiente.
Se ubican la cara mate de las grillas sin Formvar sobre el film
Se levantan las grillas con la ayuda de un portaobjetos o un parafilm. Es importante destacar que la eleccin del
lquido inerte debe tener en cuenta la total incompatibilidad qumica del mismo con la solucin polimrica.
v. Se guardan las grillas en un portamuestras TEM o en una caja de Petri cerrada.

470

i.
ii.
iii.
iv.

Mtodo II

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i. Se coloca una gota de la solucin polimrica directamente sobre una grilla sin film.
ii. Se inclina la grilla de modo tal que uno de sus bordes contacte un papel de filtro, a fin de eliminar
el excedente de solucin. Este paso debe hacerse con mucho cuidado para evitar que la solucin
sea absorbida totalmente.
iii. Dependiendo de la naturaleza de la solucin polimrica el paso anterior puede obviarse y
directamente dejar secar la gota sobre la grilla sin necesidad de utilizar el papel de filtro.

471

Materiales a utilizar:
Grillas.
Pinza.
Papel de filtro.
Solucin de polmero.

Anotaciones
concentracin
Solucin utilizada
Condiciones del laboratorio
( temperatura, humedad)
Color del film

Mtodo.

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472

Observaciones

TP4:Tallado del taco de resina


Objetivos:
a) Producir una cara trapezoidal para seccionar.
b) Reducir el tamao del frente de la muestra.

bloques de tejido sin tallar.


Cuchillas de acero.
Acetona.
Soporte vertical del taco.
Lupa estereoscpica.

Conocer cmo se realiza el tallado de un


taco de resina es importante para saber
ubicar la muestra cuando se realiza la
inclusin. Para formar una cara trapezoidal,
la cual se seccionar, es necesario tallar
primeramente una pirmide y luego truncar
a su pice.

473

a)
b)
c)
d)
e)

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Materiales:

Procedimiento:

1.
2.
3.
4.

Extraiga el taco de la resina de la cpsula Beem hacindole un corte con cuchilla de acero.
Coloque el taco de resina en el soporte adecuado.
Coloque la lupa e ilumine de manera que pueda observar la punta del taco.
Con una cuchilla de acero nueva lavada con acetona comience a extraer en capas finas la resina de la punta del taco sin tocar el
tejido.
5. A continuacin realice cortes paralelos (lado superior e inferior del trapecio).
6. El prximo paso ser tallar los lados laterales del trapecio.
7. La cara final deber ser ms pequea que 0.5 mm

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474

Es importante que
sean exactamente
paralelos, si no, no
saldrn tiras rectas
de secciones ultrafinas
con el
ultramicrtomo.)

Anotaciones
RTULO DEL TACO
TIPO DE CUCHILLA
GRILLAS (MESH)
RTULO GRILLAS
NOMBRE PORTAMUESTRAS

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475

ARCHIVO DE PORTAMUESTRAS

TP5: Preparacin de polvos TEM. (Materiales)


Tp5.1-Molienda y Suspensin:

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1- El material en polvo se muele en un mortero hasta obtener un polvo de consistencia de talco. A la vista se ver un cambio de color
del mismo.
2- El resultado de la molienda es dispersado en un solvente inerte, escoger teniendo en cuenta la composicin del material
(etanol, agua bidestilada, etc).

476

Materiales a utilizar:
Grillas.
Mortero.
Caja de Petri.
Pinza.
Pipeta.
Papel de filtro.
Frasco de vidrio de 10 ml.
Dispersante lquido.
Bao de ultrasonido.

3- La suspensin resultante se coloca en un bao ultrasnico 15 - 30 minutos aproximadamente para lograr una buena dispersin del
material.
4- Con una pipeta se deposita una gota de la solucin anterior sobre una grilla con film soporte colocada sobre un papel de filtro
para remover el exceso de material.
5- Se deja secar a temperatura ambiente aproximadamente 30 minutos.
6- La grilla conteniendo el material se guarda en portamuestras TEM hasta el momento de observar. Una alternativa es guardarlas
en un Petri cerrado.
Notas:
Polvos muy finos, o materiales que pueden sufrir daos en la microestructura el paso 1 no se realiza y el polvo se coloca en el
solvente. Se lleva a bao ultrasnico mayor tiempo.

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477

Polvos que no pueden suspenderse en ningn dispersante, se puede realizar el mortereado, y colocar una pequea cantidad del
polvo resultante sobre una grilla con film soporte.
Polvos que no pueden morterearse ni suspenderse en dispersantes, se colocan directamente sobre la grilla con film soporte y se
le aplica un corriente de aire dbil ( el empleo de nitrgeno gaseoso seco es recomendable) para sacar el material sobrante.

anotaciones
Concentracin
muestra

Condiciones del laboratorio


( temperatura, humedad)
solvente
Mtodo.

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478

Observaciones

Microscopa Electrnica de Barrido (SEM)


TP6.1- Secado por punto crtico (Biologa)

El aparato de secado por punto crtico consiste en esencia en una cmara fuertemente sellada en la cual se colocan la muestra y el
fluido de transicin (CO2), 1 o 2 hs. La cmara se recalienta, haciendo circular agua, para llevar a la temperatura critica del lquido
transicional. (Este es el punto en que la fase liquida y la fase vapor tiene la misma densidad).

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Notas: Debido a que las muestras biolgicas poseen un gran contenido de agua que se evapora durante el secado al aire o cuando
se colocan en el microscopio de barrido a alto vacio; es necesario prever las disrupciones que se producen en el tejido.
La mayora de estas disrupciones son causadas por la tensin superficial del agua en el interior y en los alrededores de las clulas.
En el secado por punto crtico se coloca la muestra en un ambiente donde el fluido celular pasa a fase gaseosa en un punto, en el
que la tensin superficial es cero. El agua de la muestra se reemplaza gradualmente, primero por alcohol, luego por acetona y
finalmente por el fluido de transicin, que puede ser CO2.

479

Objetivo: Familiarizarse con el principio de secado por punto crtico para muestras biolgicas hmedas que se observarn en el
microscopio electrnico de barrido.
Materiales:
2.5% GA. En buffer fosfato. ( ver apndice de recetas).
Series graduales de alcohol desde 30% hasta absoluto.
Acetona .
Viales de vidrio para manejar las muestras.
Desecador de punto crtico.

La fase del vapor fluido de transicin se extrae por medio de la vlvula de ventilacin del equipo, muy despacio. Luego se
puede extraer la muestra de la cmara, montarla en los porta muestras y metalizarlas.
Algunos de los fluidos de transicin que pueden usarse son:

Fluido de transicin
CO2 liquido
Fren 116
Fren 23
Oxido Nitroso

Punto crtico
31.0 c - 1072 psi.
19.7 c - 432 psi.
25.9 c - 702 psi.
36.5 c 1048 psi.

Se utiliza CO2 por ser


ms ecolgico y econmico
que los dems.

Procedimientos:

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Escoja el tejido que va a preparar.


Lave la superficie con buffer fosfato (para extraer la suciedad que pueda tener).
Haga cortes si quiere observar la estructura interna.
Sumerja el tejido en 2,5% glutaraldehdo en buffer fosfato 0.1M.
Deje fijar el tejido por lo menos 1 hora.
Lave con buffer para extraer el glutaraldehdo (por lo menos 3 veces).
Deshidrate pasando por serie de alcohol desde 25% 50%, 80%, 95% y acetona 100% por 10-*15 min. , cada uno (depende de las
dimensiones de la muestra).
8. Coloque la muestra a 100% de acetona y luego en la cmara del desecador por punto crtico.
9. Coloque la muestra en las canastitas o en cpsulas Beem modificadas (con agujeros pequeos) en el equipo.
10. Nunca deje el tejido al aire. Siempre cubierto con lquido.

480

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

TP6.2-Operacin del Desecador Modelo Polaron. (Modelo manual)( Biologa)

1. Haga circular agua fra para mantener la cmara a 20c.


2. Llene con C0 lquido la cmara, abriendo la vlvula de entrada (debe llenarse rpidamente).
3. Deje la vlvula de entrada abierta y abra la vlvula de ventilacin.
Mantenga un flujo constante sin que baje el nivel del lquido.
4. Abra la vlvula de drenaje para que salga el lquido de sustitucin (etanol o acetona). Esta accin deber llevarse a cabo por 3 a 5
minutos.
5. Llene la cmara y cierre todas las vlvulas.
6. Deje 1 hora para lograr una buena impregnacin de la muestra. (tejidos menores a 1 mm)
7. Repita la operacin.(4 y 5) Siempre asegurndose que la muestra este sumergida en el lquido.
8. Cierre la vlvula de entrada y permita que el lquido llegue al nivel superior.
9. Complete la corrida de secado, calentando despacio hasta 36 o 38C con todas las vlvulas cerradas.
10. Muy lentamente ventile el CO2 (no permita que se produzca condensacin). Mantenga la temperatura a 38 C.
11. Remueva los tejidos con cuidado, mntelos y metalcelos.

Ubicar la muestr de manera de poder observar la superficie de inters sin que haya problemas de carga.
Materiales:
Material seco (al aire o punto crtico).

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481

TP6.3- Montaje de especmenes para su observacin por Microscopio Electrnico de Barrido(SEM).(Biologa y Materiales)- Objetivos:

Porta-muestras.
Cinta adhesiva doble faz.
Pintura de plata
Pinza.
Hoja de afeitar.
Notas: El montaje de las muestras es un paso muy importante para la observacin en el SEM de las mismas. Primero, porque debe
quedar
bien adherida para que luego de metalizarla sea buena conductora, y segundo, debido a que las dimensiones del espcimen varan de
acuerdo a lo que quiere observarse y el tamao de la cmara del espcimen que tiene el microscopio.
Deber seleccionarse el rea de inters con mucho cuidado.
Procedimiento:
1. Rotule los porta muestras pegando en su cara inferior una etiqueta pequea sin que sobresalga.
2. Si elige montar su muestra con cinta doble faz, corte la misma ms pequea que la cara superior del porta muestra.
3. Observe bien su muestra, deber estar limpia y el tamao no exceder el de la porta muestras (altura: 1 o 1,5 cm).
4. Si elige pegarlo con algn adhesivo (depende del tipo de muestra), coloque la cantidad necesaria y apoye la muestra.
5. Lleve a metalizar.

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Objetivos:
Evaporar una capa de carbn y metal (Au, Au/Pd, Pt, etc.) sobre las muestras con el fin de hacerlas conductoras para su futura
observacin
en el microscopio de barrido.
Materiales:

482

TP6.4 -Evaporacin de metales en alto vaco. Evaporadora marca JEOL (Biologa y Materiales)

varilla de carbn.
canasta de tungsteno.
cantidad necesaria de metal (hilo trefilado)
evaporadora de metales en alto vaco.
Nota:
La evaporadora de metales en alto vaco es un accesorio muy til para las tcnicas de preparacin de muestras de microscopia
electrnica.
El instrumento est compuesto de tres secciones: la cmara de evaporacin, el sistema de vaco para obtener las condiciones
necesarias en
la cmara y en el sistema elctrico.
La cmara de evaporacin consta de:
El sistema de vaco:
El instrumento posee una bomba difusora altamente eficiente y una bomba rotativa.
Un alto grado de vacio dentro de la campana (2x

torr aproximadamente); puede obtenerse fcilmente y permanecer estable por

un largo perodo. El sistema de vlvulas es manual y la operacin es relativamente simple. Cuando la presin llega al rango de
, el medidor Penning de vaco enciende la lmpara que indica que ya puede procederse a metalizar.

Torr.

Coloque en ON la llave MAIN.


Cierre la vlvula de admisin.
Ponga en marcha la bomba mecnica y espere 10 segundos hasta que el sonido de la bomba pare.
Abra la vlvula v3 para evacuar la bomba difusora.
Deje abierta refrigeracin mediante el agua fra de la bomba difusora.
Prenda la bomba difusora y el medidor de presin y deje actuar por 20 minutos para calentar la bomba difusora suficientemente.
Para colocar la muestra y preparar la cmara de evaporacin deje entrar aire a la cmara mediante la vlvula de ventilacin y saque
la campana.
8. Coloque el carbn y el metal que se evaporar. Para lo cual ha calculado (#)el peso relacionado con el grosor del film a depositar.

Pgina

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

483

Operacin:

9. Coloque las muestras en el soporte.


10. Coloque en su lugar la campana y cierre la vlvula de ventilacin.
11. Cierre la vlvula V3 y abra la V2 para evacuar la campana.
12. Despus de 2 minutos, la campana, la lmpara del medidor Pirani se enciende, indicando que est en
.
13. Cierre la vlvula V2.
14. Abra la V3 y la vlvula principal. Con este procedimiento las bombas mecnica y difusora se conectan con la campana funcionando
paralelamente y creando un vacio de
Torr.
15. Lea el grado de vaco y si es el correcto comience a evaporar el carbn y luego el metal seleccionado..
Evaporacin :
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Coloque en ON el calentador.
Ponga en posicin 1 para evaporar carbn y 2 para metales.
Haga pasar corriente, calentando despacio, evapore el tiempo necesario.
Espere 1 o 2 minutos, posiciones la perilla en 2 para evaporar metal.
Apague el control de temperatura.
Ya esta lista la muestra para ser observada.

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sen t
w= peso de metal.
p= densidad de metal.
d= distancia entre espcimen y metal.
t= ngulo de espcimen al metal.
x= grosor de la capa de metal sobre la superficie.

484

Nota: La frmula que se utiliza para calcular la cantidad de metal a depositar es:
W sen t = 4 d2 px o w = 4d2 px (#)

TP6.5- Evaporacin de metales en plasma de Argn. (Biologa y Materiales).

Objetivos:
Conocer el sistema ideal para evaporar metales sobre muestras para observar por el Microscopio electrnico de barrido (SEM) con el
fin de
hacerlas conductoras.
Materiales:
6. Sputter Coater.
7. Plaqueta de oro.
NOTA:
El uso de un evaporador de metales por plasma de argn ha simplificado el proceso de recubrimiento en muestras para SEM. El
tiempo de
bombeo es relativamente corto. Este mtodo elimina la necesidad de manipulacin mecnica de las muestras.
La evaporacin se realiza a altas presiones (0.1 Torr). Las colisiones de metal o carbn con el gas hacen que los tomos viajen en todos
sentidos, lo que asegura un recubrimiento parejo.
El metal que se evaporara proviene de una plaqueta de 4 cm de dimetro (Au, Au/Pd, C, Pt, etc.).
El metal se desprende de la plaqueta cuando se aplica un potencial altamente negativo entre el electrodo de la plaqueta, y un segundo
electrodo en la cmara a una presin de 0.05 a 0.6 Torr.
El grosor de la capa a evaporar se determina por la duracin del proceso.

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1. Chequee que la vlvula leak esta cerrada (en el sentido de las agujas del reloj).
2. Coloque el reloj en la posicin mnima (30 segundos).
3. Chequee que el regulador del cilindro de Argn este abierto y que la presin sea alrededor de 5 psi. (si no se usa aire).

485

Procedimiento:

4. Prenda, la bomba mecnica empezara a trabajar de inmediato, despus de 10-15 segundos la aguja del registrador de vacio
marcar la cada de presin en la cmara. Cuando marque 0.2 Torr, la lmpara de nen ready se iluminara. Se debe dejar que
bombee hasta que el vacio sea de 0.03 a 0.04 Torr.
5. Lleve la aguja hasta que indique 0.06 Torr. Esto requiere tres o cuatro vueltas en sentido antihorario. En esta etapa, mientras se
mueve la aguja, se aprieta intermitentemente test, la corriente de plasma debe ajustarse a 18 mA.

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486

6. Presione start (el tiempo en 30 segundos). La descarga ser visible de un tono azul o purpura. La corriente de plasma de aproximadamente
1 pmA puede variar pero se ajustara la corriente con la vlvula leak. La descarga causara la lluvia de oro, (despus de 30 segundos parar),
puede realizarse otra.
7. Despus de evaporar colocar la perilla power en off. La vlvula leak cerrada y se admite aire inclinando vent.

TP7-SECCION MORFOMETRIA
Morfometra : Clculo de tamaos. Errores de medicin e instrumentales. Clculo de ampliacin de una copia y seleccin de
escala.
Preguntas frecuentes:
Qu errores al medir estn involucrados en la medicin de una imagen?
La magnificacin final cmo se relaciona con las magnificaciones de cada lente?
Cmo se calcula la amplificacin de una copia (ya sea en papel o digital)?
Como se define tamao? Qu tipos de definiciones existen?. En qu se basan estas definiciones?.
Cuando se emplea una distribucin de tamaos?. Qu sentido fsico tiene?.
EVALUACION
1-a) La siguiente imagen fue tomada con una magnificacin de 10000x. Calcule el tamao de la partcula sealada.

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487

b) La imagen anterior fue ampliada. Cuntas veces?


2) En la siguiente tabla se presentan las magnificaciones reales y los tamaos correspondientes a cada una de ellas. La imagen
que se muestra , a que magnificacin del TEM fue tomada?.

1 cm =... micras

1954,00
3908,00
6545,90
9770,00
13678,00
19540,00
26379,00
39080,00
48850,00
65459,00
78160,00
97700,00
195400,00

5,12
2,56
1,53
1,02
0,73
0,51
0,38
0,26
0,20
0,15
0,13
0,10
0,05

Pgina

2000
4000
6700
10000
14000
20000
27000
40000
50000
67000
80000
100000
200000

Mag. Real

488

tamaos

Mag.
Terica

Pgina

489

3) Un detalle mide 2 micras a una magnificacin de 10000x. Cuntas micras medir el mismo detalle a 50000x?
4) Si una distribucin de tamaos es muy dispersa, que solucin propone a fin de tener una buena representatividad de tamaos?
5) Una forma circular en una imagen TEM, que posibles geometras espaciales puede sugerir?.

TP8-Interpretacin de imgenes

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490

En esta seccin se profundizar el anlisis de imgenes.


Preguntas frecuentes
Qu es una imagen? .
Cul es la mxima informacin que puede obtenerse de ella?.

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Aberracin: Desviacin en el enfocado de la imagen en un sistema ptico, causado por la imperfeccin en las lentes o por falta de
uniformidad del haz electrnico.
Aberracin cromtica: derivada de la longitud de onda de los electrones y de la velocidad aplicada a los electrones. Longitudes de onda ms
rpidas y de menor amplitud son menos desviadas que las que son lentas y de mayor longitud de onda.
Aberracin esfrica: el defecto se debe a que los electrones perifricos se desvan ms que aquellos que viajan cercanos al eje de la lente.
Angstrom: Unidad de longitud: 1 A =0,1nm. (1nm = millonsima de milmetro) .
nodo: parte del can , con carga positiva, hacia donde son acelerados los electrones emitidos desde la fuente de energa ( filamento).
Aperturas: discos o lminas metlicas que poseen orificios que van desde 20 micrones hasta 100 micrones de dimetro y que permiten el
paso de algunos electrones dependiendo de las necesidades de observacin de la muestra.
Artefactos: Durante los procesos de preparacin de la muestra u observacin se producen errores que pueden llevar a interpretaciones
errneas y se denominan artefactos
Astigmatismo: Aberracin derivada de las lentes que no son absolutamente simtricas. En una direccin, la longitud focal es diferente a la
direccin opuesta ocasionando una distorsin de la imagen en algunos de los ejes (x o y). Efecto: la imagen no puede enfocarse
correctamente.
tomo: formado por un ncleo cargado positivamente (PROTONES) y NEUTRONES (neutros), rodeado de electrones con carga negativa
girando en rbitas discretas. )
Auger: electrones de muy baja energa que dan informacin sobre una capa muy fina superficial de la muestra.
Barrido: relacionado con la microscopa electrnica se refiere al haz de electrones pasando por la superficie de una muestra punto a punto y
obteniendo una imagen de la estructura superficial.
Bomba difusora de aceite: Bombas para obtener vaco en la columna que produce el bombeo por el arrastre de vapor de aceite a travs de
una conexin a la columna.
Bomba Inica de vaco: Bomba para realizar vaco en la que el movimiento de iones en un fuerte campo magntico arrastra las molculas de
gas y las introduce en el ctodo de la bomba.
Bomba rotativa: Bomba para hacer vaco en que la accin de bombeo se produce por el movimiento de volmenes de aire de un lado a otro
de un cilindro rotatorio mediante un tambor exntrico.
Bomba turbomolecular: El alto vaco que genera se produce por la accin de discos que giran a altas velocidades y fuerzan el movimiento de
las molculas del eje hacia la periferia.

491

GLOSARIO

492
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Catodoluminiscencia: Emisin de fotones desde un material que es bombardeado por electrones.


Cpsula BEEM : son cpsulas comerciales de PVC cuyo nombre es BEEM y se utilizan como moldes para incluir muestras o se pueden
transformar en cpsulas para realizar secado por punto crtico.
Cpsula de Wehnelt: En la cpsula se produce la diferencia de potencial entre el ctodo (filamento) y el nodo (tierra) dando lugar a la
emisin primaria del haz de electrones.
Carga: efecto que se produce al no ser la muestra conductora observndola en un microscopio electrnico convencional de barrido. En el
Microscopio electrnico de Presin variable o ambiental las cargas se compensan y no es necesario metalizar.
Cinta doble faz adhesiva: cinta que puede ser conductora o no, adhesiva por dos de sus caras, muy prctica para adherir las muestras para
microscopa electrnica de barrido.
Citoqumica: mtodo utilizado para estudiar la actividad enzimtica por microscopa electrnica.
Columna: Parte del microscopio electrnico que contiene las lentes electromagnticas, el espcimen y las aperturas.
Contraste por amplitud: debido a la absorcin de determinadas longitudes de onda, este proceso fsico contribuye al contraste de la imagen.
Contraste por difraccin:
Contraste de fase: se debe a fenmenos de interferencia en la formacin de la imagen.
Deshidratacin: Extraccin del agua que contienen las muestras hmedas.
Detector: Dispositivo para detectar seales, en el caso de los microscopios electrnicos electrones de distintas energas, fotones y rayos x.
Difraccin: Dispersin peridica de un objeto que se mueve cuando choca con un patrn ordenado de objetos fijos. La difraccin siempre
sigue la
Ley de Bragg: En Microscopa Electrnica el espaciado se determina entre los tomos de un cristal punto a punto.
Distancia de trabajo: Distancia que se mide entre la superficie del espcimen y la lente objetiva. Menor distancia de trabajo, mayor
resolucin.
Distancia focal de una lente: distancia medida desde el centro de la lente en la que un haz incidente paralelo es enfocado.
EDX: espectrometra dispersiva por rayos X en el que se genera un espectro de los rayos x emitidos por la muestra en funcin de su energa
pudiendo analizarse los elementos qumicos que la componen en un punto, rea o lnea.
Electrn: Partcula atmica fundamenta que gira alrededor del ncleo del tomo y tiene carga elctrica negativa.
Electrones retrodispersados: electrones que han sido desviados por el espcimen en un ngulo mayor a 180 con poca o ninguna prdida de
energa.
Electrones secundarios: Se originan en el espcimen y dan informacin sobre la topografa de la muestra.
Enfoque: Ajustando la lente objetiva y corrigiendo astigmatismo se logra una imagen enfocada.
ESEM: Microscopa electrnica ambiental.
Evaporadora de metales en plasma de Argn: Instrumento que sirve para recubrir el espcimen que no es conductor con una capa uniforme
muy

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fina de un elemento conductor, que puede ser oro, oro / paladio, plata. Platino, etc.
FEG: El can de emisin de campo. (sigla :Field Emission Gun)
FIB: Haz de iones focalizados (galio u otro gas) que sustituye al haz de electrones.
Fijacin: se realiza mediante un proceso fsico o qumico con el objeto de preservar las estructuras lo ms parecido posible al estado natural.
Filamento: hilo en forma de v que al calentarse en vaco emite electrones constituyndose en una fuente de electrones del microscopio.
Fotomultiplicador: Dispositivo electrnico en el que la luz es amplificada sin interferencias para producir una seal elctrica.
Fractura en fro: se utiliza para observar el medio interno o externo de superficies.
Gonimetro: Platina del espcimen que permite movimientos en varias direcciones dependiendo del instrumento.
Interaccin elstica:
Interaccin inelstica:
In: Un tomo en su estado cargado. Puede tener carga positiva o negativa.
Lente: Una pieza metlica rodeada de un alambre de cobre que al hacer pasar energa por ella se transforma en un campo magntico capaz
de desviar la trayectoria de lo s electrones.
Lente condensadora: Lente diseada para concentrar el haz de electrones.
Lente objetiva: Es la lente ms importante del microscopio. La que forma la imagen.
Longitud de onda: La distancia entre dos puntos de una onda peridica que estn en fase.
Material Mesoporoso: Material que posee poros regularmente acomodados que varan entre 2 y 50mm de dimetro.
Microencapsulacin: Pequeas partculas encapsuladas individualmente.
Micrmetro: Unidad de longitud que es la milsima parte del milmetro o 1.000nm.
Microscopa correlativa: se utiliza para observar la misma clula por microscopa ptica (generalmente por fluorescencia) y electrnica.
Nanocompuestos: los compuestos inorgnicos o polmeros formados por dos o ms componentes fsicamente distintos, con dimensiones
promedio diferentes y ms pequeas que 100nm.
Nanocristal: slido compuesto por estructura molecular o atmica repetitiva con un patrn 3D .
Nanmetro: Unidad de longitud que es igual a la millonsima de milmetro.
1x10-9metros.
Plaqueta de oro: Es una plancha de pocos milmetros de espesor de oro y del dimetro del accesorio del instrumento, que se coloca en el
aparato de evaporacin de metales para evaporar el metal sobre la superficie de las muestras.
Poder de resolucin: La capacidad de distinguir dos puntos que se encuentran a una mnima distancia entre s. (Vara segn el instrumento
que se utilice).
Rayos X caractersticos: Un rayo X que tiene una energa nica emitida por un tomo durante la ionizacin de uno de sus electrones.
Secador por punto crtico: Equipo que se utiliza para secar muestras biolgicas a ser observadas por microscopa electrnica de barrido.
Tomografa Electrnica: Se utilizan secciones de 1 m para obtener imgenes tridimensionales y realizar reconstruccin tridimensional
usando un software de computacin.

Torr: unidad de medida de presin: 760Torr es la presin estndar a nivel del mar.
Vaco: espacio en el que se han eliminado la mayor parte de los gases y vapores.
Voltaje de aceleracin: Es la diferencia de potencial entre el nodo y el ctodo de un can de electrones mediante el cual los electrones son
acelerados. A mayor aceleracin mayor velocidad de los electrones, menor long. de onda y mayor resolucin.

Bibliografa
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New York. (1996).
2. Scanning Electron Microscopy and x-ray microanalysis. J-Goldstein et all. Plenum Press. New York. 2nd.ed. (1992).
3. Electron microscopy and Analysis. P. J. Goodhew , F.J.Humphreys, R. Beanland . Taylor & Francis.. London. 2 ND Ed. (1988).
4. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. M.Hayat. Van Nostrand Ed. (1978).

7. Practical Electron Microscopy for biologist. G. Meek. 2nd Ed. John Wiley (1977).
8. Inmunogold-silver stainingM.Hayat CRC Press, Inc. (1995).

Pgina

6. Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. J. J. Bozzola and L. D. Russel. Jones and Bartlett Publishers Inc.
2ndEd. (1999).

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5. Sample Preparation Handbook for Transmission Electron Microscopy:Techniques. J. Ayache,L.Beaunier,J.Boumendil,G.Ehret,


D.Laub. Springer, NY. (2010).

9. Fixation, dehydration and embedding for biological specimens. Glauert Ed. (1981).
10. Stained methods for sectioned material. P.R.Lewis, D.P.Knight. Glauert Ed. (1982).
11. Ultramicrotomy. N.Reid. Glauert Ed. (1982).
12. Polymer Microscopy. L.Sawyer, D. Grubb. 2nd. Ed. Chapman&Hall (1996).
13. Electron Microscopy of polymers. G.H.Michler. Springer. Berlin.(2008).
14. Principles and practice of Electron microscope operation. A. Agar, R.Alderson and D.Chescoe. North-Holland Publishing Co.
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15. Scanning Electron Microscopy. M Postek. Ladd Research Ind. (1980).

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16. Introduccin a la Microscopa Electrnica. A.Morales, V.Sorrivas. ISBN 950-43-2205-0.CRIBABB (1986).

Algunos sitios sobre Microscopia Electronica disponibles en la web:


1. http://www.microscopy.ethz.ch/elmi-home.htm
2. http://www.microscopy.ethz.ch/methods.htm
3. http://em-outreach.ucsd.edu/web-course/toc.html
4. http://www.matter.org.uk/tem

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496

5. http://ammrf.org.au/myscope

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Este libro se termin de editar el 24 de Septiembre de 2014 en Baha Blanca.

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