DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE NITRGENO

POR EL MTODO DE MICROKJELDAHL

Jennifer Maca (1425743), Lina Molano (1338221)
jennifer.maca@correounivalle.edu.co , lina.molano@correounivalle.edu.co
Facultad de ciencias naturales y exactas, Departamento de Qumica, Universidad del Valle.
Fecha de Realizacin de laboratorio: 21 de Marzo de 2015.
Fecha de entrega del informe: 6 de Abril del 2015
Presentado a: Harold Daz

Resumen
El desarrollo de la prctica tiene como objetivo principal aplicar el mtodo de microkjeldahl
para la determinacin cuantitativa de nitrgeno y protena en una muestra del suplemento
vitamnico Soy Plus. Esto se realiz mediante el pesaje de una cantidad determinada de
muestra (0,0626 g), CuSO4-MgO (0,1783 g) y K2SO4 al 99% (2,0232 g) en el matraz
microkjeldahl, seguido por la adicin de 2,5 ml H 2SO4 concentrado, posteriormente esta
solucin se digesto hasta obtener una coloracin transparente-azul, este resultante se
trasvaso al equipo de microdestilacion y se adiciono 15 mL de solucin alcalina, el
amoniaco destilado se recibi en ~20 mL de solucin H 3BO3 al 4%, formando ion amonio y
ion borato, finalmente se titulo el ion borato con 30,7 mL HCl 0,02M. De esta forma,
mediante el volumen de titulante, se obtuvieron el porcentaje de nitrgeno (13.73%) y
protena (85,81%) de la muestra del suplemento vitamnico Soy Plus.

1. Datos clculos y resultados

Calibracin de la balanza
La balanza analtica Explorer Pro Ohaus modelo ep214c tiene una incertidumbre +0.2
mg, esta se calibro con un patrn de 200.0000g + 0.0003g.
Determinacin de Nitrgeno en la muestra
A partir del volumen de HCl 0,02 M utilizado en la titulacin del ion borato, se pretende
calcular la cantidad de nitrgeno presente en la muestra:

+ H 3 BO 3
HCl
+ H
H 2 BO 3

1 mmol H + =0,614 mmoles H 2 BO 3

BO
1 mmol H 2 3
H +
1 mmol

1 mmol HCl
HCl0,02 mmoles
30,7 mL
HCl
1 mL

(1)


++H

NH 42 BO 3
(2)
N H 3+ H 3 BO3
N 3+1 g
1 mmol
=8,596 x 1 03 g N
1000 mg
3+
N
14 mg
N 3+
1 mmol

1 mmol N H 3

1 mmol H 2 BO 3
1 mmol N H 3

0,614 mmoles H 2 BO 3
Para determinar el porcentaje de nitrgeno aplicamos la siguiente frmula:

A=

WA
100
W muestra

(3)

N=

8,596 x 1 0 g N
100=13,73
0,0626 g muestra

Determinacin de Protena en la muestra

Para la determinacin de la protena a partir del porcentaje de nitrgeno es necesario
conocer el factor de conversin que para la protena aislada de soya es 6,25 y aplicar la
siguiente frmula: 1

Proteina=%NF

(4)

Proteina=13,73 6,25=85,81
2. Discusin de Resultados
Dentro de la prctica se busc la determinacin del porcentaje de nitrgeno presente en
una muestra, por medio del mtodo de Kjeldahl; esta determinacin del nitrgeno se
realiza en alimentos, bebidas, carnes, cereales, fertilizantes, entre otros, para el clculo
del contenido en protena. Tambin se utiliza el mtodo Kjeldahl para la determinacin de
nitrgeno en aguas residuales, suelos y otras muestras.2
En esta tcnica se digieren las protenas y otros componentes orgnicos de los alimentos
en una mezcla con cido sulfrico concentrado en presencia de catalizadores en este
caso durante la prctica se utiliz CuSO 4-MgO ya que si se utiliza xidos de selenio o/y

mercurio se produce toxicidad y contaminacin del medio ambiente, adems si se usa

demasiado selenio o la temperatura de la digestin no se controla cuidadosamente; las
condiciones son an ms crticas que con el cobre cuando se usa como catalizador.
Con la intencin de disminuir el tiempo de la digestin se agrega sulfato de potasio, el
cual aumenta el punto de ebullicin de la solucin de acido sulfrico y por lo tanto
aumenta la temperatura para que se lleve a cabo la descomposicin.
La digestin se lleva a cabo en matraces Kjeldahl; las reacciones que tienen lugar en esta
etapa son la carbonizacin de compuestos orgnicos, la oxidacin del carbono a dixido
de carbono, la reduccin del acido sulfrico a dixido de azufre y la ms importante la
conversin del nitrgeno orgnico total en sulfato de amonio.3
Catalizadores

N H 4 2 SO 4 + SO 2+ H 2 O
ncN H 2+ m H 2 SO 4 C O 2+
Protena

(5)

calor

Despus de enfriar, la muestra se trasvasa al equipo de microdestilacion y se adiciona

solucin alcalina (250 g NaOH y 50 g Na 2S2O3 por litro) en cantidad suficiente para
alcalinizar fuertemente el medio y as desplazar el amoniaco de las sales amnicas para
que pueda ser arrastrado por el vapor de agua, el destilado se recoge en un volumen, en
exceso, de una solucin de acido brico al 4% para fijar el amoniaco.4

N H 4 2 SO 4 +2 NaOH 2 N H 3 + N a 2 SO 4 +2 H 2 O

(6)

En la reaccin se forma borato de amonio, NH4H2BO3; el borato es una base conjugada

del acido brico y tiene un pKb de 5.

++ H 2 BO 3

N H 3+ H 3 BO3 N H 4
cido brico

(7)

in borato

La cuantificacin del nitrgeno amoniacal se realiza por medio de una volumetra acidobase usando un indicador mixto (rojo de metilo y verde de bromocresol). Se titula el ion
borato con acido clorhdrico estndar, sin que el exceso del acido brico interfiera, el acido
consumido en esta valoracin es equivalente al amoniaco obtenido y al contenido de
nitrgeno en la muestra.5

+ H 3 BO 3
+ H
H 2 BO 3

(8)

El resultado del anlisis representa el contenido de protena cruda del alimento ya que
segn la naturaleza del producto estudiado, una fraccin considerable del nitrgeno
procede de otros compuestos nitrogenados (bases pricas y pirimdicas, creatina y
creatinina, urea, amoniaco, etc.).6
Dentro de la prctica se utiliz una mayor cantidad de catalizador y el matraz de Kjeldahl
digesto por ms de 90 minutos, estos factores contribuyeron a una mejor mineralizacin y
por lo tanto a mayor extraccin de nitrgeno de la muestra.
Como factor de conversin de nitrgeno total a protena en la muestra tomamos 6,25 ya
que el suplemento vitamnico Soy Plus se basa en el aislado protenico de soja y de
acuerdo al Codex Alimetarius CODEX STAN 175-1989 los productos protenicos
vegetales preparados con granos de soja usan este factor para la determinacin de
protena cruda.
De acuerdo con esta norma el contenido protenico de los aislados protenicos de soja
debe ser del 90% o ms, este valor se calcula sobre la base de peso en seco excluidas
las vitaminas, minerales y aminocidos aadidos, as como los aditivos alimentarios.
Por lo tanto el porcentaje de protena cruda obtenido en la prctica (85,81%) se encuentra
por debajo del valor reglamentario, y es importante recordar que en este porcentaje se
encuentra incluido el contenido de nitrgeno de origen no proteico. Este defecto se puede
deber a perdidas del amoniaco por volatilizacin durante la etapa de digestin.
Desde otra perspectiva, analizando de acuerdo a la tabla de informacin nutricional del
suplemento vitamnico Soy Plus, por cada 33 g de muestra hay 9 g de protena aislada de
soja o 18% del valor diario. Aplicando la formula (3):

Proteina Aislada de soya=

9 g PAS
100=27,27
33 g soy plus

Comparando el resultado obtenido en la prctica con el calculado a partir de la

informacin nutricional del producto, encontramos que hay un exceso del valor obtenido
con respecto a 27,27%. Este exceso se debe a la inclusin del nitrgeno de origen no
proteico, que de acuerdo a los ingredientes seria aportado por la lecitina, las vitaminas B1,
B2, B3, B6, B12 y los productos lcteos incluidos.
De acuerdo a esto la etapa de digestin permiti que todas las sustancias que contenan
nitrgeno, de origen proteico y no proteico, se convirtieran cuantitativamente en amonio y
por lo tanto se determinara una mayor cantidad de nitrgeno que el esperado segn la
informacin nutricional del suplemento vitamnico Soy Plus.
Por otro lado se tiene la hiptesis de que durante la etapa de destilacin se hubiera
recibido solucin alcalina junto con amoniaco en la solucin de acido brico, por error del
analista al momento de la adicin de esta en el equipo de microdestilacion. Justificando
as los altos porcentajes obtenidos tanto para el nitrgeno como para la protena cruda.
3. Conclusiones

El anlisis de Kjeldahl es fundamental para la determinacin del nitrgeno en una

amplia gama de muestras por ejemplo alimentos, bebidas, carne, cereales, y
forrajes y para el clculo del contenido de la protena.

El mtodo Kjeldahl no solo sirve para la determinacin de nitrgeno en los

alimentos, tambin para la determinacin del mismo en aguas residuales, suelos y
otras muestras.

Este mtodo se divide esencialmente en tres pasos: la digestin, la destilacin y la

valoracin.

El principal inconveniente de este mtodo consiste en la posible valoracin

de nitrgeno no proteico (NNP), e incluso de sustancias txicas y sin ningn valor
nutritivo.

El mtodo de Kjeldahl es un proceso esencialmente de oxidacin hmeda que

consiste en la oxidacin de los contaminantes orgnicos e inorgnicos, que se
encuentran en suspensin o disueltos en agua y ocurre a altas temperaturas.

Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que se aaden al cido

(para elevar el punto de ebullicin) pueden resultar en una descomposicin por
calor y la consecuente prdida de amonaco.

La creacin de nitratos durante la digestin varia el porcentaje final, ello

definitivamente se pudo ver por el tiempo que estuvo el matraz de microkjeldahl en
la estufa y la cantidad de catalizador utilizado.

La aplicacin de un blanco puede mejorar el resultado. Porque si ocurre un exceso

de amoniaco dado que los reactivos pueden contener trazar de amoniaco, se
puede soslayar haciendo un blanco de reactivos igual que las muestras.

Los indicadores mixtos aumentan el rango de viraje y facilitan la determinacin

visual al cambio de color.

4. Solucin a preguntas
1. Cules pueden ser los objetivos de la cuantificacin de nitrgeno en los sistemas
biolgicos destinados al consumo humano y animal?7
R//La cuantificacin del nitrgeno es fundamental ello se debe a que las protenas
constituyen el principal componente de las sustancias nitrogenadas, ellas ocupan una
posicin de primea importancia en las producciones agroalimentarias por que condicionan
las propiedades funcionales de numerosos usuarios aunque, paradjicamente, se
cuantifican de manera indirecta y aproximada porque primeramente se debe realizar la
estimacin de la cantidad de protena a partir del nitrgeno contenido en la muestra.
2. Cmo se obtiene el factor de conversin de nitrgeno en protena y de que depende?8
R// El contenido de nitrgeno se convierte en protena bruta considerando que la totalidad
del nitrgeno esta en forma proteica. La conversin del nitrgeno en protena se realiza
multiplicando por un coeficiente basado en el porcentaje de nitrgeno en la protena.
Depende de la relacin peso a peso del nitrgeno contenido en la protena y la protena.

3. Porque el factor de conversin de nitrgeno en protena vara entre determinados

grupos de sistemas biolgicos?9
R// Existen casos particulares, se usa el factor de 6,25 por que muchas de las protenas
contienen un 16% de nitrgeno (16 g x 6,25=100).Si el porcentaje de nitrgeno excede el
16% (abundancia de aminocidos o amidas) el factor es inferior a 6,25 y viceversa.
4. Cul es el criterio para presentar los resultados de la cuantificacin del nitrgeno
como % de nitrgeno total o como % de protena?10
R// El criterio que se toma es porque los coeficientes de conversin de nitrgeno a
protena en las tabulaciones estn basados en el porcentaje de nitrgeno en la protena y
tambin que en las tablas de composicin nutricional encontramos que los valores
tabulados se basan sobre 100g de muestra y se dan en %p/p de acuerdo a la norma de
etiquetado Codex alimentarius CAC/GL 2-1985, 3.4.3, pp. 33.
5. Explicar los trminos:
a) % de protena cruda11
Se refiere al contenido de protena obtenido a travs de la multiplicacin del contenido
total de nitrgeno por un factor de conversin. El contenido total del nitrgeno del alimento
incluye el nitrgeno proveniente de las protenas y el nitrgeno proveniente de sustancias
como el nitrgeno inorgnico, urea, cidos nucleicos, aminas, amidas y otras.
b) % de protena12
Se refiere al contenido de protena determinado a partir de uno o dos aminocidos
particulares.
c) % de nitrgeno proteico13
Se refiere al contenido de nitrgeno de origen proteico contenido en el alimento.
6. Explique al menos 6 mtodos de anlisis para determinar el contenido de protenas en
alimentos a parte del mtodo de Kjeldahl.14

El mtodo de Lowry (1951) es una aplicacin directa de la cuantificacin de los

fenoles con el reactivo Folin y Denis, que es una mezcla del acido fosfotngstatico
y acido fosfomolbdico. A 700 ml de agua se le adiciona 100 gramos de tungstato
sdico, 20 g de acido fosfomolbdico y 100 g de acido fosfrico. La mezcla se lleva
a ebullicin de una a dos horas, en reflujo. Se filtra y se enraza a un litro.
Reacciona con la tirosina, nico aminocido fenlico de las protenas.
La reaccin se realiza en medio sulfrico y en caliente, desarrollndose en color al
cabo de 30 minutos a temperatura ambiente. La lectura se efecta a 725 nm.

El reactivo de Millon reacciona de la misma manera con la tirosina, midiendo

indirectamente la cantidad de protena de una suspensin. El nitrato
mercurioso/mercrico desarrolla, en caliente, una reaccin coloreada rosa/rojo con
los fenoles (tirosina) y un precipitado insoluble rojo con las protenas.

La reaccin xantoproteica es una forma de cuantificar las protenas. El acido

ntrico diluido produce una reaccin de nitracin de los aminocidos aromticos
(tirosina y fenilalanina). En caliente, la reaccin da lugar a una coloracin amarillo

limn y al enfriar, en medio ligeramente alcalino, la coloracin adquiere un tinte

rojo oscuro.

El mtodo de Bradford (1976) aprovecha la propiedad del azul de coomassie de

fijarse a los aminocidos bsicos-particularmente la arginina- y aromticos;
modificndose las propiedades espectrales del azul de coomassie que, una vez
fijado, presenta una mximo de absorbancia a 590 nm. E mtodo tolera la
presencia de azucares reductores, iones metlicos y quelantes. Esta tcnica,
llamada promatest, es la recomendada desde 1991 para medir la alteracin por el
calor de las protenas de los graos de maz despus de su secado.

El mtodo de Biuret se basa enuna reaccin colorada caracterstica del enlace

peptidico y, por lo tanto, mas especifica de una estructura proteica o peptidica,
mientras que las tcnicas precedentes cuantifican unos o varios aminocidos
particulares. No obstante, un cierto numero de grupos funcionales de las protenas
intervienen en la intensidad final del color azul. El valor absoluto de protena no se
obtiene directamente es necesaria una calibracin previa del mtodo con una
protena de la misma naturaleza.
El reactivo es una solucin diluida de sulfato cprico en medio fuertemente
alcalino. Al cabo de 15 a 20minutos se desarrolla una coloracin de purpura a
violcea, al reaccionar con los enlaces peptidicos, aminas, grupos ureicos y
amidas. Las protenas se determinan a una longitud de onda de 550 nm en
presencia de una detergente para la leche, queso y carne o de Isopropanol, para
los cereales. Los azucares reductores interfieren en la cuantificacin de las
protenas.

El mtodo del acido bicinconnico se lleva a cabo en medio alcalino y en presencia

de iones cpricos. Las protenas reducen los iones cpricos a cuprosos y estos,
con el acido bicinconnico, forman un complejo coloreado detectable a 562 nm. Es
un mtodo mucho mas sensible que el de Biuret pero, al igual que este no es
aconsejable presencia de sustancias reductoras.

7. Explique claramente por que la titulacin final se realiza con HCl y no con NaOH?15
R// En la prctica se utiliza la modificacin del mtodo que se realiza con acido brico y
una solucin estndar de HCl; se obtiene de la destilacin en el mtodo de Kjeldahl
H2BO3-, que es la base conjugada del acido brico, y debe titularse con un cido fuerte
capaz de disociarse completamente para obtener resultados ptimos y directos para la
determinacin del nitrgeno.
8. Si el amoniaco proveniente de 1.50 g de muestra que contiene 8,5%p/p de N, se recibe
en HCl 0,1 M Cul debe ser el mnimo volumen del cido a utilizarse para garantizar que
el anlisis es correcto.
R//El volumen necesario para garantizar el anlisis es 91,07 mL HCl.

W A=

1 mmol

1,5 g muestra8,5 g N
=0,1275 g N
100 g muestra

N 3+1 mmol H 2 B O3
=9,10 mmol es H 2 B O3
1 mmolN H 3
N 3 +1mmol NH 3
14 mg

N 3+
1 mmol
3+
1000mg
3+
N
1g
0,1275 g N

H +1 mL HCl
=91,07 mL HCl
0,1 mmolHCl
H +
1mmol HCl
1 mmoles H 2 B O3
1 mmol

9,10 mmoles H 2 B O3
1 mmol

5. Bibliografa
(1), (8) FRITZ, J. S; SCHENK, G. H. Qumica Analtica Cuantitativa. 3a ed. Editorial Limusa, Mxico, 1986,
pp.230, 232.
[1] OMS, FAO; CODEX ALIMENTARIUS Cereales, Legumbres, Leguminosas y Productos Protenicos
Vegetales. 1a ed. Recurso Digital, Roma, 2007, pp.98-99. CODEX STAN 175-1989.
[2] SKOOG, D.; WEST, D.; HOLLER, F. Qumica Analtica. 6a ed. McGraw Hill, Mxico, D.F., 1995, pp.
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[3] AYRES, G. H. Anlisis Qumico Cuantitativo. 2a ed. Oxford, Mxico, D.F., 1968, pp. 342.
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Acribia, Espaa, 1968, pp. 42.
[5] FRITZ, J. S; SCHENK, G. H. Qumica Analtica Cuantitativa. 3a ed. Editorial Limusa, Mxico, 1986, pp.
230,232.
[6], [7], [12] ADRIAN, J.; POTUS, J.; POIFFAIT, A.; DAUVILLIER, P. Anlisis Nutricional de los Alimentos. 1a ed.
Editorial Acribia, Espaa, 1968, pp. 41.
[8], [9], [11] ADRIAN, J.; POTUS, J.; POIFFAIT, A.; DAUVILLIER, P. Anlisis Nutricional de los Alimentos. 1a
ed. Editorial Acribia, Espaa, 1968, pp. 43,44.
[10] OMS, FAO; CODEX ALIMENTARIUS Programa de Etiquetado de Alimentos. 1 a ed. Recurso Digital, 2001,
pp.33. CAC/GL 2-1985.
[13] CHVEZ, M.M. Composicin de Alimentos. 2a ed. McGraw Hill, Mxico, 2010, pp. 315.

[14] ADRIAN, J.; POTUS, J.; POIFFAIT, A.; DAUVILLIER, P. Anlisis Nutricional de los Alimentos. 1a ed.
Editorial Acribia, Espaa, 1968, pp. 44,46.
[15] FRITZ, J. S; SCHENK, G. H. Qumica Analtica Cuantitativa. 3a ed. Editorial Limusa, Mxico, 1986, pp.
232.