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Instituto de Bioqumica y Microbiologa

Facultad de Ciencias
Escuela de bioqumica.

Mtodos generales de determinacin


de las propiedades de las protenas.

Integrantes:

Valdivia, Chile 6 de Abril del 2015.

OBJETIVOS

Instituto de Bioqumica y Microbiologa


Facultad de Ciencias
Escuela de bioqumica.

Estudiar la propiedad amortiguadora del pH de las protenas, con una


solucin de suero sanguneo proveniente de un bovino.

Determinar el Punto Isoelctrico de una protena, mediante el estudio de la


solubilidad de la casena a distintos pH.
Estudiar la propiedad de precipitacin de las protenas por la presencia en
altas concentraciones de sales neutras en la solucin.
Estudiar la precipitacin de las protenas en presencia de solventes orgnicos
tales como etanol 95.
Estudiar el efecto de la temperatura sobre la desnaturalizacin de las
protenas en presencia de solventes orgnicos.

Resultados:
Propiedades de las protenas.

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Escuela de bioqumica.

Propiedad amortiguadora de las protenas


Preparamos y comparamos tres soluciones diferentes, una de suero sanguneo diluido en 1,5
ml de NaCl 0,15M, otra de suero desproteinizado tambin diluida en NaCl 015M, y una de
agua. Cada solucin presentaba un volumen de 2 ml.
La obtencin del suero desproteinizado se consigui a travs de la toma de un 1mL de
suero sanguneo, el cual se calent a bao a ebullicin posteriormente de 2 minutos.
Seguido se le agreg a la muestra el NaCl 015 M necesario para tener igual dilucin en el
suero. Se homogeniz la solucin, para luego proceder a centrifugar y as separar las dos
fases de la solucin.
Al tener las tres soluciones ya preparadas se procedi a titular cada una de ellas con HCl
0,01 N, utilizando para ello una pipeta de 5 ml.

Determinacin de los miliequivalentes (meq) del cido gastado:


meq de cido gastado en la titulacin del suero proteinizado:
Meq = N x V(mL) = 0,01 N x 4,5 mL= 0,045 Meq
Meq de cido gastado en la titulacin del suero desproteinizado:
Meq = N x V(ml) = 0,01 N x 2,5 ml = 0,025 Meq

Meq de cido gastado en la titulacin del agua:


Meq = N x V(ml) = 0,01 N x 0,3 ml = 0,003 Meq

Solucin

Volumen de HCl
gastado (ml)

Meq de HCl
gastado

Suero sanguneo diluido con


1,5 mL de NaCl 0,15 M

4,5

0,045

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Suero desproteinizado ms
NaCl 0,15 M

2,5

0,025

Agua

0,03

0,0003

Tabla 1.1 Las protenas actan como amortiguadores de pH. En el suero


sanguneo se requiere una mayor cantidad de volumen de cido para cambiar el pH.

Al hacer la comparacin del volumen gastado durante la titulacin con HCl en las diferentes
soluciones, se pudo observar que el suero proteinizado necesito una mayor cantidad de HCl, dada la
capacidad amortiguadora de las protenas.

Determinacin del pI de la casena.Se determin el punto isoelctrico de la casena, utilizando diferentes volmenes y concentraciones
de cido actico (0,01 M; 0,10 M; 1,00 M ) y una solucin de casena 6 mg/ml en 0,1 M acetato de
Sodio, todos ellos distribuidos en 9 tubos de ensayo, enumerados segn las indicaciones entregadas
en la gua de laboratorio.
Mediante una medicin cualitativa se pudo observar el efecto del pH sobre las protenas, cada
muestra detall diferencias claras, en unas se pudo ver una turbidez latente, en otras la protena
haba precipitado y en las restantes pareciera no haberse presentado mayor cambio al verse una
solucin translucida.
El pH para cada tubo se determin por la siguiente frmula:

pH pK a log

Sal

cido

(Ecuacin 1)

pK a
del cido actico: 4,745
Para poder realizar los clculos correspondientes, se reemplazan los valores en la ecuacin
anteriormente presentada.

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Se remplazan los valores en la ecuacin anterior (Ecuacin 1), habiendo calculado previamente las
concentraciones respectivas tanto de la sal como del cido a partir de la tabla de volmenes
entregada en la gua de procedimientos.
Utilizando la siguiente ecuacin:

C1 x V1 =C2 x V2 (Ecuacin 2)
Ejemplo de clculo de dilucin del cido utilizando a ecuacin 2 para el tubo 1:

0,01 M Ac. Actico x 0,30 ml Ac. Actico =C2 x 5ml


C2=0,01 M Ac. Actico x 0,30 ml Ac. Actico
5ml
[Ac. actico] = 6,0exp-4
Reemplazando los valores de las concentraciones obtenidas, se obtiene el pH, tal como se muestra
en el siguiente ejemplo

pH 4,745 log
pH 5,97

0,01

6 10
4

El pH de cada fraccin, as como su solubilidad se encuentran expresados en la tabla 1.2.


Se observa que se produjo precipitacin en los tubos 5 y 6, dando a conocer que la casena presenta
carga neta cero (punto isoelctrico) entre los pH 4,74 y 4,44 respectivamente.
Tubos

5,97

5,67

5,443

5,143

4,745

4,443

4,143

3,842

3,541

10 min

20 min

pH

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Tabla 1.2 Solubilidad de la casena a diferente pH. O=sin cambio, += turbidez y
x=precipitado. En los tubos 5 y 6 si hay precipitado lo que indica que la casena se encuentra en
su punto isoelctrico.

Separacin por salazn de las protenas del suero sanguneo.Las protenas presentan una capacidad de precipitacin en presencia de sales neutras en
altas concentraciones, provocadas por la deshidratacin de la protena. Es esta misma
propiedad la que se ha aprovechado para producir la separacin de la seroglobulina del
suero sanguneo con la presencia de la sal de sulfato de amonio.
Para este procedimiento se tom 1 ml de suero sanguneo, al cual se le agreg otro ml de
sulfato de amonio. Dejando a as la solucin a media saturacin. Parte de la solucin tendi
a la precipitacin, por lo cual mediante la centrifugacin a 2500 rpm durante 10 minutos se
separ el precipitado del sobrenadante. Posteriormente se procedi a la comprobacin de la
presencia de protenas en el sobrenadante separado y el precipitado al agregar 0,5 ml
aprox., de cido tricloro actico (TCA) al 10 %. Al final ambas soluciones precipitaron.
Tal como se presentan los resultados en la Tabla 1.3:
Fraccin

Presencia de protena
coagulable por cido

Sobrenadante

Precipitado(solubilizado
)

Tabla 1.3 Precipitacin de la seroglobulina del suero sanguneo bovino con sulfato de
amonio. + = Presencia de protena coagulable. Despus de la precipitacin se separ el
sobrenadante del precipitado y este se disolvi. Verificando la presencia de protena coagulable
al agregar TCA al 10%, observando en ambos casos precipitacin.

La protena que est presente en el precipitado corresponde a la seroglobulina y la del


sobrenadante a la seroalbmina, ya que con sulfato de amonio a media saturacin produce
la precipitacin de las seroglobulinas pudindose de esta manera separar dichas protenas a
travs de una sal neutra.

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Accin del alcohol a diferentes temperaturas sobre las protenas del suero sanguneo
Se tomaron dos muestras de suero sanguneo cada una de 0,5 ml, seguidamente se le
adicionaron 1,5 ml etanol de 95. Una de las mezclas se le fue agregada etanol dejado a
la temperatura de la habitacin, mientras que a la otra muestra se le fue aadida etanol
previamente enfriado a -10C. Posteriormente se deja en un periodo de espera de 30
minutos cada muestra a la temperatura del alcohol usado.
Pasado el tiempo de espera se diluyeron las soluciones en la razn 1:4, mediante la
agregacin de NaCl 0,15 M. Cada muestra a su temperatura correspondiente a la que
tenan previamente.
La muestra que se encontraba a temperatura ambiente no se diluy, debido a que las
protenas se denaturaron por accin de la temperatura, permaneciendo precipitadas.
Los resultados se exponen en la siguiente tabla.

Temperatura

Precipitacin

Resoluci
n

Ambiente
(20C)

No

Frigorfica

(-10C)

Tabla 1.4 Accin de solventes orgnicos a diferentes temperaturas. Los solventes


orgnicos disminuyen la constante dielctrica favoreciendo la precipitacin y a menor
temperatura la constante dielctrica aumenta manteniendo la naturaleza de la protena.

El tubo que se hallaba con el etanol a temperatura ambiente present una mayor
densidad de precipitado, caracterstica que la mezcla frigorfica no present, debido
a que el fro acta como una medida para la protena, evitando la denaturacin.

Discusin:

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Al realizar la titulacin se pudo vislumbrar la accin amortiguadora de las
protenas, mediante el mayor gasto de HCl en la muestra de suero sanguneo
proteinizado (0,045 Meq), mientras que en el suero desproteinizado se gast un
volumen an menor (0,025 Meq) y en el agua el gasto apenas fue visible,
siendo solo aproximadamente de una gota (0,0003 Meq). Esto posible gracias a
la presencia de los grupos terminales (amino y carboxilo) en la protena,
otorgndole la propiedad de amortiguacin del pH, haciendo que stas se
comporten como cidos dbiles, dependiendo del pK que presenten.
El punto isoelctrico es aquel punto en donde la protenas como molculas
presentan una carga neta cero, debido a una ionizacin provocada en funcin del
pH del medio. Al pH correspondiente al PI la solubilidad de las protenas es
mnima, por lo cual ests tienden a precipitar. En este caso se trabaj con
casena, y se obtuvieron resultados que ubicaron el PI isoelctrico de esta
protena entre los pH 4,745 y 4,443, valores similares a los citados a la literatura
(rango de pH 3,5 y 6,2).

En la separacin de protenas del suero sanguneo por salazn, se pudo ver que
la seroglobulina precipit por medio de la adicin de la sal de sulfato de amonio
que provoc media saturacin al interior de la solucin. Como consecuencia la
seroalbmina que tambin estaba presente la mezcla quedo rezagada en el
sobrenadante, lo que demuestra que las protenas poseen solubilidades
caractersticas con cada tipo o concentracin de sal. Lo que nos permite separar
mezclas de protenas. Est experimento en especfico corresponde a una
precipitacin reversible, lo que da como caracterstica de que la protena no
sufre una denaturacin. Estos tipos de precipitaciones se dan gracias a las
fuerzas inicas a las cuales precipitan las protenas es caracterstica para cada
una de ellas, en iguales condiciones de pH y temperatura.
El agua posee una alta constate dielctrica, por lo cual hace que disminuya la
interaccin entre las molculas proteicas del medio. Favoreciendo la solubilidad
de stas. En cambio los solventes orgnicos tales como el etanol, el cual
utilizamos en el experimento, tiene constantes dielctricas bajas, por lo cual al
momento de ingresarlas al medio acuoso baja la constante dielctrica del medio,

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de paso disminuyendo la actividad del agua, lo que favorece la interaccin de
los iones entre las protenas, promoviendo la precipitacin. Este fenmeno
ocurre a una temperatura ambiente de 20C, pero al bajar las temperaturas el
fenmeno disminuye, dado que la temperatura es un efector propio que impulsa
a la denaturacin de las molculas proteicas.
En este caso el proceso de la denaturacin es una reaccin irreversible, por lo
tanto es importante saber escoger la temperatura adecuada a la que deben
trabajar las protenas en las que se est interesado.