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PRÁCTICA 1: ELISA

Inmunodetección de insulina
en suero humano
Carmen Ramírez Moncayo

Resumen
A partir de muestras sanguíneas de dos individuos humanos, se llevó a cabo la
determinación cuantitativa de insulina en suero mediante la técnica inmunométrica ELISA. Para
ello se utilizó el kit comercial “Mercodia Insulin ELISA”, siendo éste un inmunoensayo de tipo
sandwich directo según el cual dos anticuerpos monoclonales se dirigen contra determinantes
antigénicos separados de la molécula de insulina.
Introducción
La insulina es una hormona
hipoglucemiante que actúa estimulando la
entrada
de
glucosa
en
tejidos,
fundamentalmente adiposo y muscular. Por
este motivo decimos que, junto con el
glucagón, es la principal hormona encargada
del control del metabolismo de la glucosa.
Sintetizada por las células ß-pancreáticas de
islotes
de
Langerhans,
inhibe
la
gluconeogénesis, la degradación lipídica y la
glucogenolisis. Altas concentraciones de
glucosa en sangre producen el incremento en
los niveles de insulina así como el decremento
de las concentraciones de glucagón. Las células
ß-pancreáticas comienzan a liberar insulina a
partir de los 100 mg/dl (6 mM) de glucosa en
sangre.
Se sintetiza en forma de un precursor
proinsulina con tres dominios diferenciados
que son procesados dando lugar al dipéptido
insulina más el péptido C, responsable de la
especificidad de la hormona a nivel de la
especie productora de la misma. Es por ello
que las personas diabéticas tratadas con

insulina porcina -por ejemplo- pueden acabar
desarrollando anticuerpos en contra de dicha
hormona. El péptido C no tiene una función
biológica determinada pero tiene usos a nivel
clínico para el diagnóstico de enfermedades
como la diabetes mellitus.

Figura 1. Estructura hexamérica de la insulina

De esta forma, la estructura madura de
la insulina está formada por dos cadenas
polipeptídicas, A y B, de 21 y 30 aminoácidos
respectivamente, ambas unidas por dos
puentes disulfuro intercatenarios. La hormona
se almacena en el aparato de Golgi en forma
de hexámeros unidos en sus cadenas B
mediante dos átomos de zinc (ver figura 1).

El kit utilizado posee patrones de concentraciones conocidas en insulina mediante los cuales se calculó una recta patrón midiendo absorbancia a 450 nm (ver figura 4). Patologías como la diabetes insulinodependiente o diabetes tipo I -destrucción de las células productoras de la hormona. unido a una enzima peroxidasa para el relevado de la reacción. . Tras la incubación se lavaron los pocillos manualmente 5 veces con 350 µL de tampón de lavado 1x y se llevó a cabo el procedimiento de revelado añadiendo 200 µL de sustrato TMB en casa pocillo para la reacción con la peroxidasa (ver figura 3). Los elementos formes de la sangre fueron retirados por centrifugación. también se observan incrementos por encima de lo normal en los niveles de glucosa en individuos con obesidad. guardarlas en tubos éppendorf con EDTA como anticoagulante.5'Tetrametilbenzidina. No obstante. Ambos anticuerpos reconocen diferentes epítopos de la insulina siendo el primero (anticuerpo de captura) de mayor afinidad que el segundo. Su acción hipoglucémica está contrarrestada por las hormonas hiperglucémicas glucagón. Así mismo. Figura 3. Se añadió 100 µL del anticuerpo anti-insulina conjugado en peroxidasa 1x y se incubó durante una hora a 25 ºC en un plato agitador a 700 rpm. Por el contrario. las concentraciones de insulina se ven notoriamente afectadas por diversas enfermedades. Revelado Ag (insulina) Ac de captura Ac conjugado Figura 2. adrenalina. Mecanismo sándwich ELISA Para llevar a cabo la inmunodetección mediante el kit Mercodia Insulin ELISA. Dicha técnica consta de un anticuerpo anti-insulina monoclonal fijado al pocillo previamente saturado con una solución bloqueadora para evitar uniones inespecíficas (anticuerpo de captura) y de un segundo anticuerpo monoclonal.5. a continuación. conjugado enzimático. se pipetearon por duplicado 25 µL de cada uno de los calibradores así como de ambas muestras de suero en los pocillos con el anticuerpo de captura fijado. Por último se midió absorbancia a 450 nm en un lector de placa. Material y métodos Se tomaron muestras de sangre a partir de dos sujetos humanos en ayunas para. altas concentraciones de glucosa producen la modificación de diversas estructuras lipídicas y proteicas.Ésto permite el almacenamiento estable de la hormona así como su rápida liberación ante altas concentraciones de glucosa en sangre para controlar la captación y utilización de glucosa en los tejidos periféricos. En última instancia. hormona del crecimiento y cortisol. Reacción de la peroxidasa sobre 3. Ésta técnica es una detección directa por peroxidasa en la que la cantidad de color es directamente proporcional a la cantidad de insulina.y el hipopituitarismo producen la reducción de los niveles de insulina en plasma. La técnica empleada en el inmunoanálisis fue ELISA-sanwich o de captura. insulinoma y algunas disfunciones endocrinas como el síndrome de Cushing y la acromegalia. Se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente y se paró la reacción añadiendo 50 µL de solución de parada (ácido sulfúrico) en cada pocillo.3'. conjugado enzimático (ver figura 2). los niveles de insulina están aumentados en individuos que padecen diabetes mellitus no insulinodependiente (tipo II) en la que los tejidos adiposo y muscular no responden a la hormona.

098 Tabla 2. Se emplearon los calibradores para construir una recta patrón a partir de la cual se calculó la concentración de insulina en las muestras de suero humano extraídas con anterioridad.198 0.504 0. Absorbancia 450 nm [insulina](µU/mL) Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Media ± SD Calibrador 0 0 0.1 0.491±0.006 Calibrador 1 3.021 Calibrador 4 103 1.207 0.098 Figura 4. [insulina](µU/mL) Media Abs 450 nm ± SD 3.487 0.416 ± 0.205±0. El calibrador 0 corresponde al blanco.137 0.072 0. se realizaron tres réplicas.276 1.292 1.428 1.526 0.142 0.075 0.1 0.287 2.205 0.009 Calibrador 3 31.218 0.134 0.043 2.255 2. Construcción de la recta patrón. Recta patrón calculada a partir de las concentraciones conocidas de los calibradores del kit comercial.127 0.077 Calibrador 5 204 2.067 0.204±0.007 10.134 0.487 0. .130 ± 0.470 0.471 0.18 0.218 2.5 0.428 1.129 ± 0.148 0. y el valor medio de absorbancia obtenido en el mismo deberá ser sustraído al resto de valores de absorbancia. Medidas de absorbancia a 450 nm por duplicado para los distintos calibradores con concentraciones conocidas de insulina.073 0.062 ± 0.137±0.18 0.007 Calibrador 2 10. una por cada grupo de trabajo.365 1.086 0.192 0.075 0.266 ± 0.Resultados El ensayo se llevó a cabo por duplicado para cada medida y además.130 2. Tabla 1.077 204 2.255 1.210 0.021 103 1.290 2.009 31.5 0.341±0.075±0.

con coeficiente de regresión de 0.177 0. el emplear una enzima como sistema de marcaje puede suponer una desventaja dado que cualquier característica que afecte al desarrollo de la actividad enzimática afectará a la calidad del ensayo. Además. una mediana de 6.Tabla 3. dieron una media de 9.230 0.136 ± 0.0104 · [insulina] + 0.211 0. encontramos métodos alternativos de inmunodetección tales como el radioinmunoensayo (RIA) dónde los anticuerpos se marcan con radiactividad en lugar de usar una enzima conjugada. Esta técnica se usa para la detección y cuantificación de sustancias que se encuentran en cantidades ínfimas y mezcladas entre otras muchas otras por su gran sensibilidad y especificidad. Por este motivo no es recomendable su uso con muestras poco purificadas que posean moléculas que puedan reaccionar con la misma. debe unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos.223 0. asemejándose a los mismos. metabolitos.096 Discusión El kit comercial utilizado en el desarrollo de la práctica aporta el siguiente dato: “Los niveles en ayunas de 137 individuos estudiados.577 Muestra 2 0. podemos concluir que ambos individuos se encuentran en buen estado de salud.9 µU/mL y un rango . etc.222 0.208 0.131 ± 0.0676. . aparentemente sanos.9923. etc) y la peroxidasa endógena así como algunos metales interfieren en su actividad. agentes infecciosos. toxinas. El marcador empleado es incompatible con bastantes estabilizantes (azida sódica. proteínas.217 0. RIA ha sido prácticamente reemplazada por el método ELISA el cual mide la unión Ag-Ac mediante colorimetrías en lugar de radiometrías por lo que no se requieren compuestos radiactivos y las consiguientes infraestructuras adicionales y métodos de protección. El ELISA es una técnica robusta y de alta sensibilidad que permite procesar un gran número de muestras de manera simultánea arrojando resultados en cortos periodos de tiempo (la realización de la práctica aquí expuesta no llegó a las dos horas).250 0. citoquininas. encontrase en estado puro a un precio razonable y tener un substrato cromogénico o fluorogénico conveniente y de fácil preparación.015 6. fármacos. La enzima escogida como marcador. Los reactivos utilizados son de baja o nula toxicidad. en este caso peroxidasa.213 0. mediadores de inflamación.correspondiente al 95% central de las observaciones – de 2-25 µU/mL. Concentraciones de insulina en plasma obtenidas a partir de interpolar los valores de absorbancia a 450 nm medidos en ambas muestras en la recta patrón anteriormente calculada de ecuación Abs= 0. Actualmente existe la posibilidad de sustituir el conjugado anti-especie para la detección de IgGs utilizando proteína A o G marcadas con peroxidasa.218 0. tienen un bajo costo y permiten la cuantificación de sustancias muy diversas tales como hormonas.244 0.036 6. Absorbancia 450 nm Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Media ± [insulina] SD (µU/mL) Muestra 1 0. Sin embargo.2 µU/mL.” Dado que las valores de insulina en sangre de nuestros dos sujetos entran en el rango anteriormente descrito. No obstante.149 0.

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Las características histológicas que distinguen a los glioblastomas de todos los demás grados son la presencia de necrosis y el aumento de vasos sanguíneos alrededor del tumor. De esta forma. Estudios sobre la relevancia del metabolismo de glutamina en el crecimiento y proliferación tumoral sugieren que la inhibición de la enzima glutaminasa tipo K (KGA) mediante tecnología antisentido induce reversión del fenotipo transformado in vitro. Nos ocupa su acción en el cerebro.PRÁCTICA 3: WESTERN BLOT Inmunodetección de la isoforma glutaminasa K Carmen Ramírez Moncayo Resumen Se llevó a cabo una extracción de proteínas de células de glioblastoma humano para la inmunodetección de glutaminasa K mediante la técnica de Western Blot así como el posterior análisis de los niveles de la misma en células tumorales mediante densitometría. El glioblastoma o glioma de grado IV es el grado más alto de tumor -forma más maligna. jugando un papel esencial en el mantenimiento de la homeostasis ácidobase. Además de prosperar en un metabolismo de la glucosa alterado. dónde cataliza la síntesis del neurotransmisor glutamato. las células cancerígenas llevan a cabo la glutaminolisis por KGA para suplir sus altas demandas energéticas. Introducción Cualquier tumor que se forme en las células gliales o en un tejido de sostén del cerebro se denomina “glioma”.del tipo glioma. la aparición de distintos tipos de neoplasias está asociada a la sobreexpresión de la isoforma K de glutaminasa. Unidad asimétrica de KGA . L-glutamina + H2O → L-glutamato + NH3 KGA es una proteína de tipo alpha/betta con 669 residuos aminoacídicos y Figura 1. En el riñón cataliza la primera reacción de la vía catabólica de la glutamina. responsable de la catálisis de la desaminación de L-glutamina para formar L-glutamato con la correspondiente liberación de un grupo amino según la reacción: un peso molecular 73 kDa (ver figura 1) que se encuentra formando un complejo homodimérico (ver figura 2). Éste mismo aminoácido es empleado en otros tejidos como metabolito energético.

Resultados La extracción y cuantificación de proteínas mediante el método de Bradford arrojó una concentración del extracto de 3'5 mg/mL de proteínas.90 0.Se llevó a cabo una extracción de proteínas a partir de células de glioblastoma humano LN-229 para realizar una inmunodetección de KGA mediante western blot utilizando un anticuerpo primario policlonal de conejo anti-KGA así como un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo.15 0. ideal para ser utilizada como proteína de referencia o housekeeping.58 tiene un PM de 49.05 kDa respectivamente por lo que se concluye que la banda superior (Rf = 0.31 Piruvato kinasa de músculo de conejo 58 1.06 0. Molécula biológica dimérica de KGA Material y métodos Se realizó una extracción de proteínas a partir de un extracto de células de glioblastoma humano para a continuación llevar a cabo la separación electroforética de las mismas mediante un gel SDS-PAGE previo cálculo de la concentración total de proteínas mediante el método Bradford. Tras la electroforesis se transfirió el pull proteico a una membrana de nitrocelulosa para realizar el proceso de inmunodetección.76 0. Para ello se realizó una recta patrón (ver figura 3) a partir de los marcadores preteñidos en el que se interpoló el valor de Rf de las bandas en cuestión (ver tabla 1).43 tiene un PM de 38. Figura 2. Proteína PM (kDa) log(PM) Distancia Rf α2-Macroglobulina de suero equino 180 2. Así mismo y para conocer los niveles relativos de la proteína anterior. Tras llevar a cabo la electroforesis y electrotransferencia a membrana de nitrocelulosa se calcularon los pesos moleculares de las dos bandas de interés para identificar la correspondencia de las mismas con las proteínas KGA y GADPH.62 0.5 1. Según fuentes bibliográficas KGA y GADPH tienen pesos moleculares de 73 y 36.21 Lactoferrina de leche humana 90 1.coli 116 2.56 1. La visualización de los inmunocomplejos se llevó a cabo mediante un revelado luminiscendre (kit BioRad 170-5041).6 1.06 0.9 kDa y la banda de Rf 1.95 0.58) corresponde a KGA mientras que la inferior (Rf = 1.7 kDa. Marcadores preteñidos junto con sus respectivos pesos moleculares para la realización del patrón de movilidad electroforética relativa.07 Β-Galactosidasa de E.62 0.26 0.42 1. Tabla 1.52 Lactato Deshidrogenasa de músculo de conejo 36. De este modo se obtuvo que la banda cuyo Rf es de 0.69 1.80 Triosafosfato Isomerasa de músculo de conejo 26.87 .5 1.45 Fumarasa de corazón de cerdo 48. se llevó a cabo la inmunodetección de la proteína GADPH (gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa) de expresión constitutiva y por tanto.43 0.43) se trata de GADPH (ver figura 4).76 0.

. Las fila superior e inferior corresponden a las proteínas KGA y GAPDH respectivamente. Gráfica obtenida mediante el programa ImageJ para el cálculo de densitometría de las bandas KGA Las distintas áreas seleccionadas son proporcionales a la densidad de las bandas. Las distintas áreas seleccionadas son proporcionales a la densidad de las bandas. Visualización en el lector de gel BioRad del patrón de pesos moleculares (columna clara) junto con la formación de inmunocomplejos.Figura 3. Figura 5. Gráfica obtenida mediante el programa ImageJ para el cálculo de densitometría de las bandas GAPDH. Figura 6. Gráfica movilidad electroforética relativa. representación del Rf en función del logaritmo del peso molecular. Figura 4.

3 Masa (μg) 20 30 40 Área 128.org/resources/spanish-language-publications/glioblastoma-yastrocitoma-maligno.598 1542. Al relativizar la cantidad de KGA frente a GADPH observamos como la concentración de la primera es unas 7 veces mayor que la de la segunda.652 35.es/LinkClick.do?structureId=3CZD • http://www.59 9. Bibliografía • http://www. Observamos que tanto en el caso de GAPDH como en el de KGA.52 KGA/GAPDH Discusión Se cargaron tres carriles con distinta cantidad de proteína para verificar si el proceso de carga se había llevado de forma satisfactoria.rcsb.org/pdb/explore/explore. utilizada como housekeeping.57 7. el área debería ser proporcional a la cantidad total de proteínas cargadas. Density 1 1.846 44. Density 1 1.pdf . Carril Proteínas totales GAPDH KGA 1 2 3 Volumen (μL) 5. cuyos valores se mantienen relativamente constantes a lo largo del ciclo celular y en las distintas distribuciones tisulares.615 46. el área -y por tanto el porcentaje y densidad relativa.96 Área 845.rcsb. De esta forma.8 2. Además. Concluimos por tanto que KGA se encuentra sobreexpresada contribuyendo al metabolismo energético de las células tumorales . habiéndose cargado el mismo de forma adecuada.376 1914.abta.26 6. Tabla 2. Resultado obtenido mediante el análisis por densitometría.092 254.7 8.555 29.hospitalregionaldemalaga.281 Rel.761 Percent (%) 19.501 Rel.sufre un incremento parejo al de la cantidad de proteína en el gel.129 161.Una vez localizadas las filas correspondientes a ambas proteínas se llevó a cabo el análisis por densitometría mediante el programa ImageJ (ver figuras 5 y 6) obteniendo los datos reflejados en la tabla 2. esto sirve para poder relacionar ambas proteínas asegurándonos de que se encuentran en la misma proporción.26 1. Se representan los valores para carril por separado.aspx?fileticket=23XFgl6lGBc %3D&tabid=537 • http://www.749 Percent (%) 23.org/pdb/protein/O94925 • http://www.6 11.