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ANALISIS INSTRUMENTAL

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION


INTRODUCCION
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin
de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o
estacionaria y otra mvil. En cromatografa liquida, la fase mvil es un lquido
que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija.
La cromatografa liquida clsica se lleva a cabo en una columna
generalmente de vidrio, la cual esta rellena con la fase fija. Luego de sembrar
la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase mvil a travs de la
columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en
las separaciones, el tamao de las partculas de fase fija se fue disminuyendo
hasta el tamao de los micrones, lo cual genero la necesidad de utilizar altas
presiones para lograr que fluya la fase mvil.
De esta manera, naci la tcnica de cromatografa liquida de alta resolucin
(HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las
altas presiones requeridas.
Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenmeno fsico que provoca la
separacin, la Cromatografa liquida de alta resolucin puede ser:
1. Cromatografa de adsorcin.
La fase fija es un slido y se utiliza casi exclusivamente slice (slica) y en
mucha menor medida almina.
2. Cromatografa de reparto.
En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos
qumicamente a un soporte solido de slica. Se la subdivide en cromatografa
en fase normal y fase reversa.
En la cromatografa en fase normal, la fase fija es polar (como por ejemplo
agua o trietilenglicol) y los compuestos menos polares e luyen primero.
En la cromatografa en fase reversa, el compuesto unido qumicamente es un
hidrocarburo Aliftico y se emplean fases mviles polares. En este caso, las
sustancias ms polares e luyen primero.
3. Cromatografa inica.
Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio inico para separar y
determinar iones.
4. Cromatografa de exclusin por tamao.
La fase fija est formada por partculas polimricas o de slice que contienen
una red uniforme de poros y llevan a cabo un fraccionamiento relacionado con
el tamao molecular. Las molculas de tamao mayor son excluidas y e luyen
primero, mientras que las ms pequeas que penetran en los poros son
retenidas ms tiempo.

INSTRUMENTAL
Un equipo para cromatografa liquida de alta resolucin puede representarse
por el siguiente esquema:

La fase mvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando
se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes
de diferentes botellas en una Proporcin determinada y realice la mezcla en
una cmara de mezclado. Cuando durante toda la separacin se utiliza siempre
el mismo solvente, se denomina isocrtica, sin embargo es normal realizar un
gradiente de composicin del solvente a lo largo de la cromatografa para
mejorar la eficiencia y acortar la duracin del proceso. Estos gradientes de
solvente tambin son realizados en forma automtica por las bombas.
La bomba enva al solvente a travs de caos de dimetro pequeo,
generalmente de acero inoxidable, hacia la vlvula inyectora. Esta consiste en
una vlvula de seis vas que permite introducir en el flujo de solvente, la
muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Luego de que se
produzca la separacin en la columna, los componentes de la mezcla pasan
por el detector. Este produce una seal elctrica proporcional a la cantidad de
materia y esa seal es enviada al registrador que realiza un grfico de
intensidad en funcin del tiempo (cronograma) del tipo:

Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un


componente de la muestra original. El integrador calcula adems el rea
correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la cantidad de sustancia.
Dado que los detectores de HPLC son no destructivos, es posible recuperar los
productos que salen de l. De esta manera, dependiendo del tamao del loop
de inyeccin y de la columna, y del tipo de bomba, es posible realizar adems
de separaciones analticas, cromatografas preparativas.

PARMETROS RELEVANTES
Los parmetros tericos que caracterizan las separaciones cromatografas por
HPLC son idnticos a los descriptos en cromatografa gaseosa.
En HPLC, en lugar de variar la temperatura de la columna para mejorar la
resolucin del cronograma, se cambia la composicin de la fase mvil a lo largo
de la separacin utilizando mezclas de entre dos y cuatro solventes.
ETAPAS DEL ANALISIS DE UNA MUESTRA
Son idnticas a las puntualizadas para cromatografa gaseosa.
En lo que respecta a la optimizacin de las condiciones experimentales, en
este caso es posible realizar ensayos preliminares orientativos utilizando
cromatografa en capa delgada con la misma fase fija que contiene la columna.
Por otra parte es necesario tener en cuenta que dado que se utilizan altas
presiones, es imprescindible evitar la presencia de partculas que puedan
obstruir los caos y la formacin de burbujas que puedan deteriorar el relleno
de las columnas y que produzcan inestabilidad en la seal del detector.
Para evitar las obstrucciones, los solventes y las muestras a inyectar se filtran
con membranas de 0,45 a 0,22 m. Para evitar la formacin de burbujas, los
equipos de HPLC cuentan con desgas adores de solvente por vaco o por
burbujeo con He y, en el caso de no contar con los mismos, se deben desgasar
los solventes por medio de ultrasonido o agitacin bajo vaco antes de
utilizarlos como fase mvil.
PARTE EXPERIMENTAL
Objetivos
Realizar curvas de calibracin para distintos analitos.
Cuantificar el contenido de los mismos en muestras sintticas y comerciales.
Materiales a emplear
Equipo para HPLC marca Thermo Separations compuesto por una
bomba binaria modelo Spectra System P2000, una vlvula inyectora
Reodyne provista de un loop de inyeccin de 10 l, un detector de
absorcin UV-visible de longitud de onda variable modelo Spectra 100 y
un integrador registrador modelo Datajet.
Columna analtica marca Alltech econosphere C18 (fase reversa unida
qumicamente formada por cadenas de hidrocarburo lineal de 18 tomos
de carbono) de 150 mm de longitud por 4,6 mm de dimetro interno.
Buffer fosfato 0,025 M; pH=3; calidad HPLC.
Metanol calidad HPLC.
Patrones de aspartamo, cafena y acido benzoico en agua, de diferentes
concentraciones.

Muestra incgnita sinttica que contiene los tres analitos.


Muestras comerciales que contengan uno o varios de los analitos
mencionados (!mejor los tres!).
Procedimiento
Cuando se desarrolla una tcnica analtica por HPLC, normalmente se elige en
primer lugar una fase fija adecuada y una fase mvil con una composicin tal
que sea compatible con la fase fija, que disuelva los componentes a analizar y
que permita una buena separacin. Luego se optimizan las condiciones de flujo
de solvente, cantidad de muestra a inyectar y, en el caso de un detector de
absorcin como el que se empleara en este caso, se determinara la/s
longitud/es de onda de deteccin.
Para el anlisis de la mezcla de aspartamo, acido benzoico y cafena se
utilizara una columna de fase reversa C18 y, como fase mvil, una mezcla
formada por 45% de metanol y 55% de buffer fosfato (acuoso) 0,025M de
pH=3. Se inyectaran 10 l de cada solucin.
Buscar en bibliografa los valores de pKa para los tres compuestos y, en base
al estado de ionizacin de los mismos al pH de trabajo, predecir el orden de
elucin. A continuacin se presentan los espectros de absorcin de soluciones
acidas (pH=2) de aspartamo (18,7 mg/L); acido benzoico (6,55 mg/L) y cafena
(7,83 mg/L).

Teniendo en cuenta los espectros, elegir la longitud de onda a utilizar en el


anlisis.
Curva de Calibracin y anlisis de muestras
1. Una vez elegidas las condiciones, se realizara la curva de calibracin
para cada analito inyectando 1 mL de cada solucin patrn mezcla de
modo de saturar y limpiar el loop del inyector. Ajustar los valores de
velocidad de papel y atenuacin adecuados en el integrador y registrar
los cronogramas. Graficar luego el rea de pico en funcin de la
concentracin y verificar que se est trabajando dentro del mbito lineal.
Idealmente cada punto de la curva de calibracin se realizara por
triplicado.
2. Realizar el anlisis cromatografico de la muestra sinttica y de las
muestras comerciales. La muestra sinttica no requiere tratamiento
previo mientras que las comerciales deben desgastarse al vaco
(especialmente las de bebidas gaseosas) y filtrarse antes de ser
inyectadas. El filtrado se lleva a cabo con una jeringa de 5 ml unida a un
soporte conteniendo un filtro de nylon de 0,45 o 0,22 micrones; se
descarta el primer ml de filtrado y luego se recoge el lquido en un
recipiente limpio.
3. Si fuera necesario, diluir la muestra para obtener valores dentro del
intervalo de calibracin. Para el caso de muestras slidas, preparar
soluciones de concentracin adecuada y verificar que el material se
disuelva por completo.
4. Para uno de los patrones mezcla utilizados en la curva de calibracion,
realizar variaciones en la longitud de onda del detector. Discutir la
longitud de onda de trabajo.

5. Por ltimo, realizar variaciones en el flujo de anlisis


Anlisis de los resultados
Una vez obtenidas las curvas de calibracin, comparar la sensibilidad
del mtodo para la determinacin de cada compuesto en las condiciones
de trabajo. Relacionar la misma con los espectros de absorcin y
proponer mejoras en las condiciones experimentales para hacer ms
eficiente el anlisis.
Informar las concentraciones de las muestras-problema con su error.
Comparar con los valores informados en literatura y con los declarados
por los fabricantes de las muestras comerciales.
Proponer un mtodo para evaluar el lmite de deteccin.
Discutir la necesidad de utilizar otros mtodos (estndar interno,
agregado patrn) para realizar la cuantificacin.
Calcular los parmetros cromatograficos de relevancia y realizar los
grficos de Van Demter.

EJEMPLO DE UNA ANALISIS DE


CONTAMINACION
Anlisis de residuo de plaguicida
organofosforado (Methamidophos) en
muestras de papa de mercados de Lima
Metropolitana
RESUMEN
Se realiz el anlisis toxicolgico de identificacin y cuantificacin del residuo de
plaguicida organofosforado METHAMIDOPHOS en 20 muestras de papa en
diferentes puestos de venta en el Departamento de Lima. El anlisis cualitativo se
realiz por cromatografa en capa fina (CCF) y el cuantitativo por cromatografa
lquida de alta resolucin (HPLC). Se determin presencia de Methamidophos en
la totalidad de muestras analizadas. De los 10 muestreos realizados en mercados
mayoristas: 7 muestreos (70%) exceden el Lmite Mximo Residual (LMR)
mostrando una concentracin mxima de 2,7055 ppm de Methamidophos. De los
10 muestreos realizados en mercados minoristas: 2 muestreos (20%) exceden el
LMR mostrando una concentracin mxima de 0,1753 ppm de Methamidophos. Se
concluy que dichas concentraciones exceden el LMR establecido por el Codex
Alimentarius (LMR = 0,05 ppm).

Palabras clave: Residuo Methamidophos, plaguicida, organofosforado,


LMR, CCF, HPLC.
BIBLIOGRAFA
General de cromatografa:
Anlisis Instrumental. Skoog y Leary.
"Principios de Anlisis Instrumental", Skoog, Holler, Nieman.
Mtodos Instrumentales de Analisis. Willard, Merritt y otros.
Cromatografa liquida de alta presion. H. M. McNair y B.
Esquivel. Monografia cientifica de la OEA.