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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL Escuela Nacional de Ciencias de Biológicas “Laboratorio de Bioquímica y Bilogía Molecular” Profesora:

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias de Biológicas “Laboratorio de Bioquímica y Bilogía Molecular”

Profesora: Gabriela Edith Olguín Ruiz

3IM1

Sección III

Córdova Félix Juan Manuel,

Espejel Rivera Sergio Arturo, Karla Mitzy Pérez Sndoval

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL Escuela Nacional de Ciencias de Biológicas “Laboratorio de Bioquímica y Bilogía Molecular” Profesora:

Práctica 5.5 y 5.6: Efecto de la Concentración del Sustrato sobre la Velocidad de Reacción e Inhibición Enzimática.

Introducción:

El término cinética enzimática implica el estudio de la velocidad de una reacción catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener factores como los inhibidores. En las reacciones no catalizadas por enzimas la formación de producto depende linealmente de la concentración de sustrato añadido. A concentraciones relativamente bajas de sustrato, la velocidad de la reacción aumenta en forma proporcional a la concentración de sustrato, obteniéndose una relación de tipo lineal. Sin embargo, a concentraciones más altas de sustrato, la relación proporcional no se cumple ya que al aumentar la concentración de sustrato, la velocidad no aumenta considerablemente.

Una de las formas de regulación de la actividad de una enzima es a través de moléculas que disminuyen su velocidad de reacción, llamadas inhibidores. Los inhibidores pueden encontrarse de manera natural en las células para controlar la velocidad de una reacción metabólica, o bien pueden ser compuestos sintéticos que se utilizan como herramientas experimentales para el estudio de las reacciones enzimáticas.

Objetivos:

Observar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática y determinará la constante de Michaelis-Menten por los métodos conocidos, así como su aplicación.

Determinar el tipo de inhibición producido por la anilina sobre la actividad de la invertasa.

Resultados:

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1.- Efecto de Concentración del Sustrato:

Lecturas de Absorbancia obtenidas en el espectrofotómetro a 540 nm con diferentes concentraciones de sacarosa 0.2 M en presencia de enzima: Invertasa 10 ug/mL.

Con las lecturas de absorbancia obtenidas en efecto de [sustrato] interpolando y usando la ecuación de la recta:

Abs = 0.0645 [Az. Red.] + 0.0031, estos valores en la curva tipo de azucares reductores para tener la [Azúcares Reductores] en cada tubo.

Curva Tipo Azucares Reductores

Absorbancia

0.8 0.6 f(x) = 0.06x + 0 0.4 R² = 0.99 0.2 0 0 2 4
0.8
0.6
f(x) = 0.06x + 0
0.4
R² = 0.99
0.2
0
0
2
4
6
8
10
12

[Azucar Reductor] (μmoles)/2.0 mL

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Reacción del 3,5 Dinitrosalicílico (DNS) con Azúcares Reductores

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Bl

Problemas

 
 

Tubo No.

an

 

co

   

T

1

2

3

4

5

6

 

Sacarosa 0.2 M (ml)

0.5

0.1

0.2

0.3

0.5

0.8

1.0

 

Absorban-

cia

0

0.323

0.585

0.637

0.655

0.680

0.707

 

Azúcar

Reductor

0

4.959

9.021

9.827

10.10

10.49

10.913

(μmoles)/2.

6

7

9

69

45

1

0 mL

 

Velocidad

(unidades

0

0.495

0.902

0.982

1.010

1.049

1.0913

de

9

1

7

7

4

invertasa)

 

Concentraci

ón de

Sustrato

0

0.01

0.02

0.03

0.05

0.08

0.1

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Córdova Félix Juan Manuel,

Espejel Rivera Sergio Arturo, Karla Mitzy Pérez Sndoval

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(moles/L) =

M)

Gráfica de Dobles Reciprocos

De esta forma la ecuación de Michaelis- Menten:

V

0

¿ Vmax[ S]

[S]+ Km

1

, tomando los recíprocos de ambos miembros

/

se transforma a

la

ecuación de

1

Km

1

Vmax

1

=

+

V 0

S

Vmax

Lineweaver-Burk, la cual es

V

4 3 f(x) = 0.03x + 0.8 R² = 1 2 1 f(x) = 0.01x +
4
3
f(x) = 0.03x + 0.8
R² = 1
2
1
f(x) = 0.01x + 0.36
R² = 0.91
0
0
20
40
60
80
100
120

1/[S]

Que es la ecuación que representa la tendencia lineal de la

Gráfica de Dobles Recíprocos, que al ser de la forma:

y= mx + b nos permite calcular el valor de la “Km” (Constante de Michaelis) y la Vmax.

Siendo:

y = 1/Vo, m = Km/Vmax, x=1/ [S] y b= 1/Vmax

De esta forma pudimos calcular la Vmax:

1/Vmax= 0.3604,

Entonces Vmax= 1/0.3604= Vmax= 2.7746 U.I

Con este valor de Vmax calculamos la Km:

Gráfica V vs [S]

Km/Vmax =0.0059

3

2

  • V 1
    0

Entonces sustituyendo: Km= 0.0059* 2.7746

Entonces sustituyendo: Km= 0.0059* 2.7746

 

Km= 0.0163

 

Gg2.- Inhibición Enzimática: Resultados con Inhibidor

 
 

Blan

Problemas

 
 

Tubo No.

co

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

 

T

1

2

3

4

5

6

 

[S]

Sacarosa 0.2 M (ml)

0.5

0.1

0.2

0.3

0.5

0.8

1.0

 

Absorban-

cia

0

0.192

0.321

0.401

0.435

0.552

0.211

Azúcar

Reductor

0

2.928

4.928

6.168

6.696

8.510

3.22

(μmoles)/2.

6

6

9

1

32

0 mL

Velocidad

(unidades

0

0.292

0.492

0.616

0.669

0.851

0.32

de

8

8

9

6

0

23

invertasa)

Concentraci

ón de

Sustrato

0

0.01

0.02

0.03

0.05

0.08

0.1

(moles/L) =

M)

Así mediante la obtención de las dos ecuaciones de tendencia lineal de la forma:

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Km

1

  • 1 Vmax

=

  • 1 ó

+

V 0

S

Vmax

y= mx + b

Calculamos la ordenada al origen “y”, y la abscisa al origen “x”

Por otro

lado

al

elaborar

la

gráfica

de

Doble

Recíprocos o Lineweaver-Burk logramos obtener la

constante de Michaelis-Menten “Km” con un valor

de

0.0163

la

cual

relaciona

la

[sustrato]

con

la

velocidad de reacción y la velocidad máxima que se

alcanza, del mismo modo con la ecuación de Lineweaver-Burk obtuvimos la Vmax=2.7746 U.I

Para así conocer el tipo de Inhibidor que era la ANILINA con la actividad de la INVERTASA.

X CI = -0.8017/0.0258 =-31.0736

X SI =-0.3604/0.0059 = -61.0847

Y SI = 0.3604, Y CI = 0.8017

De esta forma al observar que las rectas no son paralelas (Inhibidor Acompetitivo), y que tampoco se cortan entre sí en el eje de las ordenadas “1/V” (Inhibidor Competitiva), entonces observamos que las rectas si se cortan entre sí pero en un punto en el segundo cuadrante pero que no es sobre ninguno de los ejes por lo que la Anilina es un Inhibidor No Competitivo.

Discusión:

Como en la práctica de Inhibidores el ultimo valor de absorbancia obtenida fue menor que el anterior a este, los valores calculados a partir de este fueron mucho menores debido a esto concluimos que la enzima se saturo en este caso de glucosa al tener demasiada cantidad de este azúcar reductor por lo cual en ese momento ya no dejo que la Invertasa trabajara. Por lo que decidimos descartar el último valor, en la Gráfica de Dobles Recíprocos.

Respecto a la práctica de Inhibidores en esta práctica utilizamos como Inhibidor a la Anilina realizando el mismo proceso de hidrólisis de la Sacarosa con la enzima Invertasa obteniendo Glucosa y Fructosa, que al dar color reaccionando con el 3,5 DNS deteniendo la Act. Enzimática por el medio Básico. Logramos observar como es que los Inhibidores disminuyen la Actividad Enzimática al unirse ya sea a la enzima en su sitio activo, al complejo ES, o a la enzima pero en un lugar que no es su sitio activo, teniendo como función “retrasar” la velocidad de reacción enzimática, al graficar los dobles recíprocos con y sin inhibidor llegamos a la conclusión de que la Anilina es un Inhibidor No Competitivo por el comportamiento observado al graficar.

A partir de estas dos prácticas logramos observar cual es el efecto que tiene la concentración del sustrato y la acción de los inhibidores en la Velocidad de Reacción a la que llamamos Actividad Enzimática

De los cuales observamos que al cambiar la concentración del sustrato la enzima (Invertasa) actúa cada vez más rápido mientras más sustrato tenga para trabajar en este caso Sacarosa y que si graficamos Velocidad de la enzima en U.I contra [sustrato] se observa un comportamiento lineal solo al inicio de la gráfica por lo cual se podría a decir que este comportamiento solo se da en un inicio a bajas concentraciones de sustrato ya que conforme aumenta la [sustrato] la grafica de velocidad adquiere el comportamiento de una parábola rectangular es decir cada vez la velocidad se incrementa menos, llegando incluso a ser independiente en cierto punto al aumento de [sustrato], debido a que la enzima tiene mucho sustrato (sacarosa) con el cual trabajar teniendo alrededor de 5 millones más de moléculas de sacarosa que de Invertasa por lo cual incluso puede llegar a saturarse la enzima de la glucosa obtenida por la ruptura de sacarosa y bloquear su sitio activo y hacer que la gráfica se caiga como sucedió en nuestro caso.

Conclusión:

Comprobamos que al aumentar la

concentración del sustrato la velocidad aumenta hasta llegar a un valor máximo Calculamos la Vmax y encontramos su valor

que es de 2.7 U.I. Encontramos el valor de la Km (constante de

michaelis) el cual es de 0.0163 en este caso Comprobamos que los inhibidores reducen

la actividad enzimática al comparar las graficas de velocidad vs concentración. Identificamos que el inhibidor que usamos (anilina) es un inhibidor no competitivo debido a la grafica realizada.

Bibliografía

 

Nelson

D.L

y

Cox

M.M,

Lehninger:

Principios de

Bioquímica, 4 ta Edición, Ed.: Omega, 2006, págs.: 202-

211

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