INMUNOHISTOQUIMICA

INTRODUCCIN
En las ltimas dcadas la utilizacin de la Inmunohistoqumica ha sido
progresivamente creciente y se ha consolidado como tecnologa esencial en el
diagnstico patolgico de rutina. En general y muy especialmente en patologa
oncolgica, son cada vez ms las patologas cuyo diagnstico y clasificacin
requiere la Inmunohistoqumica. La incorporacin de nuevos protocolos de
recuperacin antignica y la afluencia constante de nuevos anticuerpos estn
ampliando notablemente el mbito de aplicacin con nuevas utilidades en
diagnstico y pronstico.
DEFINICIN
La inmunohistoqumica se refiere al proceso en el que se usan anticuerpos
para detectar antgenos en un corte o seccin de tejido biolgico. Utilizando la
unin especfica de los anticuerpos con los antgenos, es posible localizar y
visualizar dichos antgenos diana en cortes histolgicos gracias a los
anticuerpos especficos marcados con fluorforos o enzimas (sustancia que
absorbe o emite luz o produce coloracin), siendo estas ltimas las ms
utilizadas en inmunohistoqumica.
La inmunohistoqumica, tambin llamado marcaje inmunohistoqumico, se
utiliza comnmente en diferentes tipos de aplicaciones tales como:
- Diagnstico de clulas anormales presentes por ejemplo, en diferentes
estadios de enfermedades (cncer, entre otras)
- Desarrollo de frmacos, para evaluar la eficacia del frmaco, la
deteccin de la variacin de la actividad de las dianas de cada
enfermedad.
- Investigacin biolgica, para conocer la ubicacin y la colocalizacin de
una protena dentro de las diferentes partes de una clula (ncleo,
citoplasma o membrana, etc.)
Los biomarcadores especficos son caractersticos de cada evento celular, tal
como la proliferacin o la apoptosis, que son las causas de la anormalidad
celular.
Estas tcnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos de unirse
especficamente a los correspondientes antgenos.

IMPORTANCIA DE LA INMUNOHISTOQUMICA

Como tcnica de laboratorio la Inmunohistoqumica es de vital

importancia para el marcaje selectivo de protenas y otros elementos
que pueden estar presentes, tanto en las membranas celulares,
citoplasma, y dems compartimientos citoplsmicos, as como tambin
en la matriz extracelular.
Es de gran utilidad en la identificacin de las estirpes celulares de los
tejidos bsicos, de receptores de membranas, protenas citoslicas, y de
cualquier otra estructura para la cual se halla desarrollado un anticuerpo
especfico. Su aplicacin es de indiscutible valor en anatoma patolgica
en el diagnstico de lesiones tumorales y su pronstico y en la
investigacin en general, sobre todo en la definicin del inmunofenotipo
de las clulas de los tejidos.

FUNDAMENTO
La tcnica de Inmunohistoqumica se fundamenta en la reaccin Antgeno Anticuerpo.
El anticuerpo es el reactivo fundamental y la disponibilidad de antisueros,
fracciones de inmunoglobulinas y anticuerpos monoclonales que permiten
marcar antgenos celulares y tisulares es cada vez mayor.
Los anticuerpos pertenecen a un grupo de protenas denominadas
Inmunoglobulinas, presentes en cinco clases y sintetizadas por clulas
conocidas como Plasmocitos, que no son mas que un ltimo grado de
diferenciacin de los linfocitos B.
Loa anticuerpos monoclonales son producidos por un clon indiccidual de
plasmocitos, mientras que los anticuerpos policlonales son producidos por
diferentes plasmocitos y en consecuencia pueden reaccionar con varios
fragmentos del antgeno para el que fueron creados. El animal ms utilizado
para la produccin de anticuerpos policlonales es el conejo, seguido por la
cabra, oveja, caballo, entre otros. Para los anticuerpos monoclonales, el animal
de eleccin es el ratn, tal vez por motivos econmicos.
La reaccin antgeno - anticuerpo en la tcnica inmunohistoqumica es incolora
y para hacerla evidente, se utilizan algunos mtodos como la fluorescencia, las

reacciones enzima-sustrato que convierte al cromgenosin color en un

compuesto coloreado que permite identificar el lugar donde se depositaron los
anticuerpos utilizados.

En las tcnicas de inmunofluorescencia se utilizan como marcadores

compuestos de fluorescena que bajo luz ultravioleta emiten luz de longitud de
onda visible, que depende de la naturaleza del compuesto. El isotiocianato de
fluorescena emite luz verde amarillenta intensa. Estas tcnicas necesitan
muestras en fresco y congeladas, sin fijacin convencional, pues los antgenos
estn presentes en superficies celulares o son muy lbiles a la fijacin en
formalina.
ANTICUERPOS MONOCLONALES Y POLICLONALES
Los anticuerpos monoclonales son producidos por un clon individual de
plasmocitos, mientras que los anticuerpos policlonales son producidos por
diferentes plasmocitos y en consecuencia pueden reaccionar con varios
fragmentos del antgeno para el que fueron creados. El animal ms utilizado
para la produccin de anticuerpos policlonales es el conejo, seguido por la
cabra, oveja, caballo, entre otros. Para los anticuerpos monoclonales, el animal
de eleccin es el ratn, tal vez por motivos econmicos.

METODOS
DE
VISUALIZACIN
DEL
COMPLEJO
ANTGENO/ANTICUERPO
Hay varias opciones disponibles para visualizar el complejo anticuerpoantgeno en inmunohistoqumica:
1. MTODO DIRECTO:
Un marcador visual, ya sea
fluorescente o enzimtico, se
adhiere
qumicamente
al
anticuerpo
primario.
El
anticuerpo primario es el
anticuerpo dirigido contra el
antgeno
que
se
quiere
demostrar.
El
mtodo
de
deteccin
directo, slo requiere una
nica etapa de incubacin con
el antgeno y una sola etapa
de lavado. El marcador generalmente resulta en la produccin de una sustancia
colorada o en un aumento en la cantidad de luz emitida a una longitud de onda
determinada, si el antgeno est presente. En el caso de ausencia de antgeno
no hay unin del anticuerpo primario marcado y por lo tanto no hay seal.
La inmunofluorescencia directa, es decir con anticuerpos conjugados con
fluorescena, se aplica corrientemente en el diagnstico de las enfermedades
cutneas en donde tiene indicacin y utilidad muy precisas como en
enfermedades ampollares, vasculitis y mesenquimopatas . Esta tcnica pese a
ser muy sensible, presenta inconvenientes como la falta de permanencia de la
fluorescencia, requiere de microscopa especializada y el detalle morfolgico es
pobre. Para documentar cada caso, es necesario fotografiar la reaccin.

2. MTODO INDIRECTO
Usando un anticuerpo
secundario conjugado
ya sea a una enzima o
a
un
marcador
fluorescente.
El
marcador visual est
unido al anticuerpo
secundario. El tejido es
expuesto previamente
al anticuerpo primario
que no es marcado y
luego al anticuerpo
secundario, el cual es
dirigido
contra
el
anticuerpo primario y
se unir con .
El
mtodo
de
deteccin indirecto es
un proceso ms largo que el directo, ya que se compone de dos etapas de
incubacin y de lavado en lugar de una sola etapa con la deteccin directa.
Comprende:

Un primer perodo de incubacin (aproximadamente 1 h) con el

anticuerpo primario no marcado (primera capa), durante el cual una
pequea fraccin del anticuerpo se une al antgeno diana en el tejido.
Por consiguiente, el exceso de anticuerpo primario no unido se elimina
mediante un lavado y se aade un anticuerpo secundario marcado
(segunda capa).
Un segundo perodo de incubacin (de nuevo 1h), durante el cual el
exceso de anticuerpo secundario marcado se elimina por lavado y la
cantidad de marcador asociado con el anticuerpo primario se cuantifica.
En la ausencia de antgeno no hay unin del anticuerpo primario y por
consiguiente no hay unin del anticuerpo secundario, y por lo tanto no
se obtiene seal.

Ambos mtodos son vlidos y presentan cada uno pros y contras en

comparacin con el otro. Te proponemos un estudio de los pros y los contras de
cada mtodo en la siguiente tabla:
METODO DIRECTO
VENTAJA
DESVENTAJA

Rpido porque
slo se usa un
anticuerpo y se

Falta
de
sensibilidad
para
detector

METODO INDIRECTO
VENTAJA
DESVENTAJA

Mayor nivel de
sensibilidad
y
genera
una

Unin
especfica
anticuerpo

no
del

necesitan
menos etapas.
Unin
especfica del
anticuerpo
secundario (no
hay reactividad
cruzada).
Disminucin de
la variabilidad
del ensayo y
mejora de la
calidad de los
datos.

bajos
niveles
de
expresin
del antgeno.
Necesidad
de
marcar
cada
anticuerpo
primario
para
cada antgeno
de
inters:
consume
tiempo y es
costoso.
La
inmunoreactivi
dad
del
anticuerpo
primario puede
verse afectada
adversamente
por el marcaje.

No
hay
flexibilidad en
la
eleccin
marcador
del
anticuerpo
primario de un
experimento a
otro.

Amplificacin
de
seal
mnima.

Altos
conocimientos
cientficos
especializados
requeridos.

seal
ms
intensa.
Una
amplia
variedad
de
anticuerpos
secundarios
marcados
disponibles
comercialment
e.

Mxima
inmunoreactivi
dad
del
anticuerpo
primario
se
mantiene,
ya
que no est
etiquetado.

Mayor
amplificacin
de
la
seal
debido
a
la
unin de varios
anticuerpos
secundarios a
cada
anticuerpo
primario.

3. METODO DE LA PEROXIDASA-ANTIPEROXIDASA

secundario
y
alto ruido de
fondo.
El uso de un
anticuerpo
secundario
requiere pasos
adicionales de
bloqueo y de
control.

Este mtodo usa un anticuerpo primario, un anticuerpo secundario y un

anticuerpo producido en contra, conjugado con la enzima peroxidasa (complejo
PAP). El anticuerpo secundario es producido en una especie animal diferente
del anticuerpo primario y del complejo peroxidasa-antiperoxidasa y el
anticuerpo primario y el complejo peroxidasa-antiperoxidasa provienen de la
misma especie animal. Consecuentemente, el anticuerpo secundario acta
como puente o anticuerpo eslabn.

4. METODO EL COMPLEJO AVIDINA-BIOTINA

Esta tcnica usa tres reactivos; un anticuerpo primario, un anticuerpo
secundario que esta qumicamente ligado a la vitamina biotina, y un complejo
de la glicoprotena avidina que esta ligado a la biotina y peroxidasa. La avidina
tiene la habilidad de ligarse con cuatro molculas de biotina, en forma no
inmunolgica. Esta fuerte afinidad le da al mtodo excelente sensibilidad.

ANTICUERPOS ESPECIFICOS PARA LA DETERMINACION DE LAS

DIFERENTES PATOLOGIAS, DE DIVERSAS AREAS
1. LINFOMAS
Diagnstico de tipo de linfoma, linaje
B o T, factores pronsticos,
determinacin de CD20 para terapias
TARGET.

2. TUMORES DE ORIGEN
DESCONOCIDO
Diagnstico certero o aproximado de
origen de metstasis de tumor oculto,
en hgado, pulmn, piel, hueso,
ganglio, etc

3. CANCER DE MAMA
Es muy importante la determinacin
del estatus hormonal del tumor para
su tratamiento con identificacin de
receptores de Estrgeno,
Progesterona. As tambin el HER2
como factor pronstico y tratamiento
que actan especialmente sobre las
clulas positivas con este marcador. El
Ki67 es determinado recientemente
para estratificar los tumores de
acuerdo al factor de proliferacin.
4. NEOPLASIAS MALIGNAS

CD3
CYCLIN D1
CD5
CD8
CD10
CD15
CD56
CD20
CD22
CD30
CD23
DBA44
CD43
CK7
CK20
CD45
VIM
AE1/AE3
CEA
TTF1
CA19.9
GCDFP15
CK 34BE12
CHR A
TIROGLOBULINA
MELAN A
CALRETININA
SYN
ER
PR
HER2
KI 67
P53

CD45

BCL2
BCL6
KI67

TdT

S100
WT1
PSA

BERP4
EMA
GFAP
CEA
NSE

INDIFERENCIADAS
Diagnstico de origen linfoide,
sarcomatoso, melanoctico o epitelial.
5. MESOTELIOMA
Permite diferenciar origen mesotelial
de adenocarcinoma metasttico en
mesotelio, pleura, pericardio,
peritoneo.
6. TIPIFICACION DE TUMORES
GERMINALES
Diagnstico de distintas lneas de
diferenciacin en tumores germinales
de ovario y testculo
7. SARCOMAS (TUMORES DE
PARTES BLANDAS)
Permite diagnstico de origen, Ej.
msculo liso, estriado, neural, GIST,
vasculares, etc.

8. DIFERENCIACION
NEUROENDCRINA
Diagnstico de tumores
neuroendcrinos y su estratificacin
de acuerdo a su malignidad.
9. MEDULA SEA
Diagnstico de infiltraciones por
linfomas, metstasis, leucemias.
10. CLULAS PLASMTICA
Determinacin de
Mielomas/Plasmocitomas.
Monoclonalidad.
11. CLULAS REDONDAS Y
AZULES EN NIOS
Son tumores que morfolgicamente
pueden ser idnticos pero que
perteneces a distintas lneas celulares
de origen, por lo que el tratamiento es
muy distinto entre ellos, por lo que la
IHQ permite su diagnstico.
12. TUMORES DE PIEL
Permite subclasificar especialmente

CK34BE12
MELAN A
VIM
CALRETININA
CK7
WT1
BEREP4
CEA
PLAP
AFP
HCG
CD30
VIM
VIM
ASMA
MYOD1
S100
CD117
CD34
CD31
CD68
DESMINA
NSE
CROMOGRANINA A
SYNAPTOFISINA

CD138
AE1/AE3
MIELOPEROXIDASA
CD34
CD138
KAPPA
LAMBDA
CD45
NSE
S100
CK AE1/AE3
CD99
WT1
MYOD1
MELAN A
CD34

los tumores de clulas fusadas

drmicas, como el Dermatofibroma
Protuberans clsicamente positivo
para CD34, o diferenciar un
melanoma fusocelular de otro tumor
fusado.
13. CLASIFICACIN DE TUMORES
RENALES
Existen tumores renales con
caractersticas oncocticas de
diferentes pronsticos segn su tipo
histolgico en los cuales la IHQ resulta
de mucha utilidad. As como tumores
con diferenciacin sarcomatoide, de
distinto origen tubular, urotelial, etc.

S100
ASMA
CD68
CK7
CK34BE12
BERP4
VIM
AE1/AE3
CD10
CK7
CK34BE12

VENTAJAS:
Las tcnicas inmunohistoqumicas enzimticas permiten una localizacin ms
precisa de las reacciones, ya que la tincin es permanente, estable, puede
contrastarse y puede ser evaluada con microscopio de luz. El material as
estudiado puede archivarse por aos sin prdida de la intensidad de la
reaccin. Los anticuerpos monoclonales ha permitido aumentar la
especificidad, sensibilidad y gama de esta tcnica.

DESVENTAJAS:
Existe presencia de reaccin inespecfica, especialmente cuando se utilizan
anticuerpos policlonales, algunos reactivos son potencialmente carcingenos y
su manipulacin debe ser cuidadosa, requieren estandarizacin precisa y
estricto control de calidad.
Existen diversos tipos de tcnicas, cuya indicacin depender del anticuerpo a
utilizar (monoclonal o policlonal), material disponible (fresco, congelado o fijado
en formalina) y antgenos a estudiar (de superficie o membrana,
citoplasmticos o nucleares).
Estas tcnicas necesitan de controles internos o paralelos, usualmente
positivos y negativos. El control negativo se obtiene realizando la misma
tcnica, pero con omisin del paso de incubacin con anticuerpo primario.
Existen sistemas automatizados que permiten la tincin de un gran nmero de
casos simultneamente con la ventaja de pasos definidos y estandarizacin de
las variable usuales con costo relativamente bajo y en mucho menor tiempo.
Un elemento importante a considerar es la ptima preservacin del tejido y por
ende de los antgenos. La mayora de los antgenos se conservan
adecuadamente despus de la fijacin en formalina e inclusin en parafina.
Algunos son ms lbiles y slo se detectan en cortes de congelacin.
Uno de los problemas actuales con estas tcnicas no es la tcnica en s,
manual o automatizada, o la posibilidad de acceder a los numerosos
anticuerpos existentes, sino la interpretacin de los resultados. Los errores de
interpretacin disminuyen a nivel aceptable cuando el patlogo y sus
colaboradores tienen experiencia en estas tcnicas y los resultados se analizan
a la luz de los dems hallazgos clnico-patolgicos.
INMUNOHISTOQUMICA, UN PROCESO TODAVA LIMITADO POR LA
DISPONIBILIDAD DE PRODUCTOS
Hoy en da, una gran variedad de anticuerpos est disponible comercialmente,
pero slo unos pocos se comercializan directamente con un marcador. Ese es
uno de los problemas a los que los cientficos se tienen que enfrentar cuando
realizan ensayos de inmunohistoqumica.
Como los mtodos de deteccin directos e indirectos son procesos complejos y
costosos para los usuarios finales para marcar un anticuerpo, algunos kits de
marcaje han sido desarrollados por varias empresas. Sin embargo, esta
solucin todava tiene algunas limitaciones, ya que slo ofrecen la posibilidad
de marcar un nmero limitado de anticuerpos con un nmero limitado de
marcadores y por tanto, no siempre se ajustan a las necesidades de los
usuarios finales para la deteccin de una diana especfica, o requieren el uso
de equipos de deteccin, que por consiguiente les convierte en una solucin
cara.
Por lo tanto, los cientficos todava estn limitados en sus avances en este
mbito de investigacin, ya que no tienen una solucin eficaz, universal y

econmica que les permita realizar sus inmunoensayos con cualquier tipo de
anticuerpos y cualquier tipo de marcador, superando las dificultades de
marcaje convencional como la prdida de anticuerpos, la orientacin, etc.

BIBLIOGRAFIA
http://escuela.med.puc.cl/publ/patologiageneral/Patol_125.html
http://www.medic.ula.ve/histologia/laboratorios/inmuno.htm
http://nitzipper.com/es/nitzipper-aplicacionesbioconjugacion/inmunohistoquimica.html