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Ensayo de toxicidad aguda con bulbos de cebolla Allium cepa L

mediante la evaluacion de la inhibicion del crecimiento


promedio de raices
Principio de la prueba
Cuando un bulbo de cebolla (Allium sp.) se rehidrata se produce una estimulacin del
crecimiento de las clulas, lo cual permite la elongacin de las races de la planta. Sin
embargo, cuando la hidratacin se lleva a cabo en presencia de sustancias toxicas, la
divisin celular de los meristemos radiculares puede inhibirse, ya sea retardando el proceso
de mitosis o destruyendo las clulas.
Este tipo de alteraciones generalmente impide el crecimiento normal de la raz, y por tanto
su elongacin (Fiskesjo 1985, 1993, 1997).
El efecto puede determinarse en forma indirecta, mediante la comparacin de la elongacin
de las races de cebollas expuestas al compuesto toxico contra la de cebollas no expuestas,
luego de un periodo de 72 horas de prueba. La cuantificacin del efecto se realiza
estableciendo el porcentaje de inhibicin del crecimiento de las races respecto a la longitud
promedio de las races del control.

Material
Tubos de ensayo de vidrio de 10 cm de largo y 1.5 cm de dimetro (o recipientes de mayor
tamano, dependiendo del tipo de bulbos a utilizar), gradillas o soportes para tubos, bistur y
reglilla para hacer mediciones en cm o mm.

Reactivos y soluciones
Organismos de prueba
Para la elaboracin de las pruebas se deben seleccionar bulbos de Allium sp.(cebolla roja)
de 5 cm de dimetro, secos y sin formacin de hojas o raz. Estos pueden ser obtenidos del
mercado local o adquiridos a travs de algn proveedor.
Previo al montaje de la prueba, los bulbos deben limpiarse eliminando la epidermis seca y
removiendo, con un bistur o instrumento punzante, los restos de tejido y races del rea
radicular . No se deben daar las races primordiales. Con el fin de eliminar los restos de
tejido, es conveniente colocar los bulbos en agua destilada por 2 horas y dejar secar.
Esquema grafico de los pasos a seguir en la prueba con Allium cepa L.
1) limpieza y pelado de bulbos; 2) ubicacin de bulbos en tubos para exposicin a las
soluciones de ensayo; 3) colocacin de tubos en soporte; 4) agregado de soluciones en los
tubos durante el ensayo; 5) medicin de longitud del haz de races al finalizar el tiempo de
exposicin de los bulbos

Control de calidad en las pruebas con A. cepa


Un elemento importante en la elaboracin de las pruebas es el proceso de pelado de los
bulbos. Durante este procedimiento debe evitarse el dao del anillo radicular. Igualmente, se
debe trabajar con un alto nmero de rplicas para controlar la variabilidad de las pruebas.
Se recomienda utilizar 5 rplicas por concentracin, con el fin de descartar por lo menos 2
de los valores ms extremos. En el caso que exista un bajo desarrollo radicular en ms de 2
bulbos del control, se considera que el lote de bulbos tiene problemas, por tanto los
resultados no sern vlidos.
Generalmente, se sugiere el empleo de una serie de 5 concentraciones, un control negativo;
este ltimo contiene el compuesto de referencia mencionado en el parrafo anterior.
Para su preparacin se emplea el mtodo de dilucin en forma secuencial aplicando un
factor de 0.2 o 0.3. Cuando se va a llevar a cabo una evaluacin exploratoria, puede
emplearse una serie de diluciones logartmicas (por ejemplo: 100; 10; 1; 0.1; 0.01), lo cual
permitir establecer el intervalo de concentracin conveniente para la determinacin de la
Concentracin Inhibitoria Media (CI50).

Expresin de resultados
Medicin
Al trmino del periodo de exposicin se registra la longitud promedio de las races, medicin
que se lleva a cabo con ayuda de una regla comn con escala en milmetros . La medicin
se lleva a cabo colocando la escala en el margen del tubo, se ubica el valor de longitud
mnimo y mximo donde incide la mayora de las races y el punto medio se define como el
promedio.
Se efecta la estimacin en cada tubo y se obtiene el promedio matemtico de cinco
replicas (los dos valores mas extremos se descartan). Para obtener el porcentaje de efecto
de inhibicin se debe realizar la siguiente operacin:

(longitud del control longitud de la muestra) x 100/longitud del control


Con estos valores se construye una grafica de concentracin en funcin del porcentaje de
inhibicin y se calcula la CI50 mediante cualquiera de los siguientes mtodos: Probit,
promedios moviles o Sperman y Karber.