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QUÍMIC

CA BIOLÓG
GICA. Año 2013

Trabajo Práctico Nº 1: PUR
RIFICACIO
ON DE LA
A ENZIMA LISOZIMA
A DE CLA
ARA DE
HUEVO
O
E trabajo prráctico consiiste en 4 sesiiones (días 1-4) donde se
El
s purificaráá la enzima liisozima a
partir dee clara de hu
uevo y se evvaluará la puureza y el renndimiento alcanzados. Además,
A
se estudiará
la depenndencia de laa actividad y la estabiliddad de la lisoozima en funnción del pH.

RMACIÓN GENERAL
L:
INFOR
L lisozima es una enziima abundannte en las lágrimas y la saliva en doonde actúa como
La
c
una
barrera frente a las infecciones.. La deficienncia en lisoziima, debida a mutacionees en el gen LYZ , ha
sido asoociada a un aumento enn la propensiión a las inffecciones. Addemás, se coomercializann algunos
producttos con lisozzima para laa higiene buccal que tieneen eficacia como
c
antimicrobianos orales.
o
La
medida de la activ
vidad de estta enzima en
e sangre y orina contrribuye al diiagnóstico de
d ciertas
enfermeedades.
L lisozima también es muy
La
m abundaante en la claara del huevo, de donde se extrae paara su uso
industriial, en particu
ular para el control
c
de laas bacterias lácticas
l
en loos vinos y quuesos.
E nombre de lisozima o muramiddasa (EC 3.22.1.17) incluuye a un grrupo de enzzimas que
El
catalizaan la hidróliisis de enlacces glicosídicos β(1→ 4) de los polisacáridos
p
s de la pareed celular
bacteriaana (peptido
oglicano) cuuyo disacáriido constituttivo es N-aacetilglucosaamina(NAG))-N-acetil
murámiico (NAM, Figura
F
1).

F
Figura
1


 

Son proteínas globulares constituidas por una sola cadena polipeptídica (129 residuos
aminoácidicos para la lisozima de Gallus gallus) y de peso molecular comprendido en el rango de
14 a 30 kDa. Estas proteínas contienen puentes disulfuro que contribuyen a su elevada estabilidad.
La lisozima fue la primera proteína secuenciada, la primera enzima de la que se dispuso de un
modelo tridimensional (usando cristalografía de rayos x) y la primera para la que se propuso un
mecanismo de acción detallado.

MATERIAL PROVISTO POR EL ALUMNO:
Guardapolvo.
Guantes.
Lavandina (1 litro por comisión).
Papel absorbente (por grupo).
Marcador indeleble.
2 Huevos (por comisión).
2 Tubos cónicos de plástico con tapa a rosca de 15 ml tipo Falcon (por grupo).
Cronómetro.

ATENCIÓN:
Una vez finalizada cada sesión cada grupo deberá dejar su lugar de trabajo ordenado y los tubos de
vidrio utilizados lavados y desrotulados.


 

siempre verticalmente. Ajustar el volumen girando la rueda hasta que en la escala aparezca el volumen deseado y colocar una punta de plástico (adecuada) en la punta de la pipeta haciendo una leve presión para lograr un buen ajuste.Manipulación de las micropipetas Las micropipetas son dispositivos que se utilizan para medir o transvasar pequeños volúmenes de líquido de un recipiente a otro con gran exactitud. 2. y sin soltar el pistón. A.Día 1: TÉCNICA DE PIPETEO Y CURVA DE CALIBRACIÓN DEL MÉTODO DE BRADFORD Objetivos: Comprender la correcta manipulación de las micropipetas y realizar una curva de calibración del método de Bradford para su posterior utilización en el dosaje de proteínas. Liberar lentamente la presión sobre el pistón. Para facilitar el uso del tipo de punta adecuado los fabricantes han adoptado un código de color según el volumen a dispensar (Figura 2). terminar de vaciar la pipeta presionando hasta el segundo tope. 3. 2‐200 µl Hasta 10 µl 100‐1000 µl Figura 2 Instrucciones para el manejo de una micropipeta (Figura 3): 0. 1. la pipeta del líquido deslizando la punta contra la pared del recipiente. 3    . Oprimir pistón con el dedo pulgar. Después de un segundo. Después de 2–3 segundos retirar. 4 y 5. Apoyando la punta contra la pared del recipiente donde se quiere colocar el líquido. presionar lentamente el pistón hasta el primer tope. hasta que la punta se sumerja de 2 a 5 mm dentro del líquido. hasta el primer tope y sin soltarlo introducir verticalmente la pipeta. Todas las micropipetas de pistón disponen de puntas desechables para minimizar los riesgos de contaminación.

- Nunca ajuste el volumen fuera del rango de la micropipeta. - Nunca posicione la micropipeta cargada con la punta hacia arriba. 4    . se puede cargar aire con las consiguientes burbujas y volumen inadecuado. Profundidad de inmersión de la punta La profundidad de inmersión de la punta es especialmente importante en el uso de volúmenes pequeños (Figura 4).   Figura 3 PARA NO DAÑAR EL SISTEMA INTERNO DE PISTONES QUE POSEE LA MICROPIPETA: - El líquido nunca debe entrar en contacto con el cono de la micropipeta.6. Retirar la pipeta deslizando la punta contra la pared del recipiente y descartar la punta de plástico. Si por el contrario. se aspirará más líquido debido al aumento de la presión. Sumergir la punta a una profundidad adecuada puede mejorar la precisión hasta un 5%. la punta no se sumerge lo suficiente. - Nunca coloque la micropipeta en forma horizontal si la punta tiene líquido. Si la punta se sumerge demasiado.

la columna vertical de líquido será más pequeña y se aspirará demasiada muestra. Retirar la pipeta deslizando el extremo de la punta hacia arriba por la pared lateral para liberar cualquier gotícula restante en el orificio de la punta. Esta técnica puede mejorar la precisión hasta en un 1%. Una aspiración demasiado rápida e incontrolada puede llevar a la formación de aerosoles.Figura 4 Uniformidad al pipetear Es fundamental mantener un ritmo. Se estima que pipetear de forma vertical o como máximo dentro de un ángulo menor de 20º de ésta. al dispensar el líquido. Una velocidad de pipeteo uniforme puede mejorar la precisión también hasta un 5%. velocidad y técnica adecuada al mover el émbolo. Así se reduce o elimina el hecho de que se quede algo de muestra en el interior de la punta después de acabar la dispensación. Otra técnica consiste en emitir directamente en la superficie del líquido. De otra forma. 5    . la punta se ha de mantener en un ligero ángulo frente a la pared del vaso para asegurar un correcto vaciado. puede mejorar la precisión hasta en un 2. Por el contrario. pudiéndose producir incluso pérdida de volumen de la muestra. Si se dispensa directamente dentro del líquido tendremos que sacar la pipeta manteniéndola en el segundo tope para evitar una toma de muestra después de la dispensación. salpicaduras y posible contaminación del eje y del pistón. Ángulo de inmersión vertical Se ha de procurar mantener el ángulo de inmersión de la pipeta lo más cercano a la vertical posible. Técnica de dispensación Para la mayoría de aplicaciones se recomienda dispensar con el extremo de la punta apoyado contra la pared del recipiente.5%.

Enjuague previo de puntas Se recomienda enjuagar previamente las puntas como mínimo dos veces con el líquido a pipetear para compensar la película de líquido en el interior de la punta. Todo esto puede suponer una mejora de hasta el 0. Absorción Ultravioleta de las Proteínas. Reconocimiento del rango de volumen permitido por cada micropipeta. Todas las proteínas son capaces de absorber fuertemente debajo de los 230 nm debido al enlace peptídico. triptofano y fenilalanina) absorben significativamente en la región del UV cercano. 2. sin embargo. Seguir este consejo puede hacernos mejorar los resultados hasta en un 1%. 10 µl. Muchos de estos métodos se basan en la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV o en la capacidad que tienen de unir determinados colorantes. a esta longitud de onda también absorben otros compuestos que pueden interferir en la utilización de esta medida en la determinación de la concentración de proteína (por ejemplo. Pipetear los siguientes volúmenes de agua utilizando las micropipetas adecuadas: 625. B. Sin embargo. Dado que la mayoría de las proteínas poseen residuos de aminoácidos aromáticos. El enjuague previo también tiene otras ventajas: ayuda a neutralizar los efectos de capilaridad e iguala la temperatura y humedad del aire del interior de la pipeta con la temperatura y humedad de la muestra.2% de la precisión. Cometemos mucho mayor error trabajando por debajo del 10% del volumen máximo de la pipeta que estamos utilizando. 55. tres de ellos (tirosina. Utilización de una pipeta adecuada para el volumen que se aspira Se recomienda trabajar entre el 35% y el 100% del volumen máximo de la pipeta. altas concentraciones de ciertos buffers). PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: 1.Determinación de la concentración de proteínas Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. 6    . Ninguno de los 20 aminoácidos hallados en las proteínas absorbe luz en la región visible del espectro electromagnético. 170.

2. simple y rápido que el Método de Gornall.1 μg/μl Sensibilidad: 1 . 7    . No es necesario que esté con formato de informe.7 ml con H2O. NOTA: El alumno deberá concurrir a la siguiente clase de laboratorio con la curva de calibración en Abs vs µg proteína para que el docente la evalue. 6. Trabajar en tubos eppendorfs y realizar el experimento por duplicado. MEZCLAR y leer absorbancia a 595 nm en un lapso de tiempo de entre 2 minutos y 1 hora. Testigo: BSA 0. 4. 10 y 12 μg del testigo. PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: Agregar distintos volúmenes del testigo. Este método constituye una forma rápida y confiable para la determinación de proteínas. En este trabajo práctico se realizará la curva de calibración del método de Bradford para posteriormente (Día 3) cuantificar la concentración de proteínas en las distintas fracciones de la purificación de la lisozima.proteína presenta un máximo de absorción a 595 nm. Conservar a 4°C. Método de Bradford. El complejo colorante . MATERIALES: -Solución de Azul brillante de Coomassie: 70 mg de Azul Brillante de Coomassie G-250 + 50 ml de etanol al 95% + 100 ml de ácido fosfórico al 85%. Filtrar con papel Whatman N° 1. Este método es más sensible.12 μg de proteína en el volumen final de la determinación. completando a 0. Curva de calibración sugerida: 1. Se basa en la cuantificación de la unión del colorante Azul Brillante de Coomassie a una proteína desconocida y la comparación de esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína standard. 8.las medidas de absorción a 280 nm constituyen un método rápido para la determinación del contenido de proteína de una solución. Respetar el orden del agregado de los reactivos.7 ml de Azul Brillante de Coomassie. Llevar a 1 litro con H2O. mezclar y adicionar 0.

Figura 5) y en el segundo a una resina con carga positiva (por ejemplo. Ello permite separar esta enzima del resto de proteínas de la clara mediante la utilización de resinas intercambiadoras de cationes. Por lo que. DEAE-celulosa. Figura 5). a un pH de 10 la lisozima es prácticamente la única proteína con carga positiva neta.Purificación de la lisozima Cromatografía de intercambio iónico. 8    . se unirá a una resina con carga negativa (por ejemplo. Dado que el pI de la lisozima es de 11. Una proteína. tendrá carga positiva y a pH mayor de su pI presentará carga negativa.Día 2: PURIFICACIÓN DE LA LISOZIMA Objetivos: Purificar la enzima lisozima a partir de la clara del huevo mediante cromatografía de intercambio catiónico utilizando Carboximetilcelulosa. CM-celulosa. dos unidades de pH superior al del resto de las proteínas de la clara del huevo. La cromatografía de intercambio iónico se fundamenta en las propiedades ácido-base de las proteínas. Celulosa o Agarosa Celulosa o Agarosa Grupo Carboximetilo (CM) Forma desprotonada Grupo Dietilaminoetilo (DEAE) Forma protonada Figura 5 Una vez unida la proteína a la resina. a pH menor de su pI (punto isoeléctrico). Carboximetil-celulosa. esta se puede eluir de dos formas: variando el pH del medio hasta alcanzar y/o sobrepasar el pI o bien mediante un gradiente iónico. en el primer caso. A. Dietilaminoetil-celulosa.

Carboximetil-Celulosa (CM): Suspensión de resina previamente activada Activación de la CM: Inicialmente el polvo comercial de carboximetilcelulosa se hidrata toda la noche en agua destilada. conteniendo 300 mM NaCl .Buffer A: glicina/NaOH 100 mM. A este pH la enzima quedará unida a la columna mediante una interacción electroestática y el resto de las proteínas de la clara no serán retenidas. conteniendo 100 mM NaCl . Posteriormente. Agitar suavemente durante 15 min. FT) y descartar el resto. 2 veces con H2O (o hasta pH neutro). Centrifugar a 2000 rpm durante 5 min suficiente cantidad suspensión de CM-celulosa previamente activada y equilibrada para obtener de 2 a 4 ml de resina.En este trabajo práctico utilizaremos la CM-celulosa a pH 10 (cargada negativamente debido a la presencia de restos carboxilo ionizados a ese pH.Buffer C: glicina/NaOH 100 mM. 4. salvo luego del tratamiento con NaOH que es de 20 minutos. resina intercambiadora de cationes) para la purificación de la lisozima a partir de clara de huevo. . Se reparten 10 ml a cada grupo.5 M (5 minutos) y finalmente dos veces con H2O (o hasta pH neutro). Luego la resina se lava con HCl 0. puede disociarse la lisozima de la resina mediante un lavado con un buffer de alta fuerza iónica. pH 10 . MATERIALES: .Extracto Crudo: 50 ml de una dilución 1/5 (vol/vol) en buffer A de la clara procedente de un huevo. Al finalizar la incubación. centrifugar la muestra a 2000 rpm durante 5 min. Por último se hace una suspensión 1/1 (vol/vol) en buffer A. para que la lisozima se adsorba a la resina. pH 10. pH 10. NaOH 0.5 M (5 minutos). PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: 1. Luego. Separar una alícuota de 1 ml (EC). 9    . ATENCION: en este y en los siguientes pasos el pipeteo debe realizarse con sumo cuidado para evitar la resuspensión de la resina. Descartar el sobrenadante. guardar una alícuota de 1 ml del mismo en un eppendorf en hielo (Flow through o fracción no retenida de la siembra. medir el volumen del sobrenadante. Las centrifugaciones son de 5 minutos a máxima velocidad. Sobre la resina de CM-celulosa agregar los 9 ml restantes de Extracto crudo. 2.Buffer B: glicina/NaOH 100 mM.

agitando suavemente.5. β-ME 0.5 µl de la solución de siembra. SDS 2% p/v. 7. Hervir 5 minutos. Para el caso del eluído (E) mezclar 2. L1 y L2 obtenidas durante la purificación. 3. E). Repetir el paso anterior con 10 ml buffer B (Lavado 2.Preparación de las muestras para SDS-PAGE MATERIALES: . PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: 1. Guardar a -20°C hasta su análisis por SDS-PAGE. B. Añadir a la resina (precipitado) 10 ml de buffer A.1 mg/mL. Medir el volumen del sobrenadante y guardar una alícuota de 1 ml del mismo en un eppendorf en hielo (Lavado 1.8. debidamente rotuladas (comisión y grupo). L1) y descartar el resto. 2. NOTA: Medir el volumen de cada una de las fracciones obtenidas y guardarlas. durante 10 minutos. 5µl de H2O y 5 µl del eluído. Centrifugar y recoger TODO el eluído en un tubo falcon de 15 ml (Elución. Mezclar en eppendorfs 2. Agitar suavemente y centrifugar de nuevo. Las mismas serán utilizadas para determinar la concentración proteica (Día 3) y para medir su actividad enzimática (Día 4). L2). 6. Resuspender la CM-celulosa con 5 ml de buffer C e incubar. 10    . FT.5 µl de solución de siembra para proteínas con 10 µl de cada una de las fracciones: EC. glicerol 5% v/v. a -20°C.1% v/v y azul de bromofenol 0.Solución de siembra para muestras de proteínas 5X: Tris-HCl 20 mM pH 6.

11    . en cuanto a la composición proteica de las distintas fracciones y el grado de pureza alcanzado de la lisozima. vitaminas. Esto se debe a que este detergente se une a las proteínas desnaturalizándolas y confiriéndoles carga negativa en forma proporcional a su tamaño y que enmascara la carga intrínseca de cada proteína. por eso. la movilidad de una molécula en una electroforesis dependerá de su tamaño (su capacidad de atravesar el tamizado molecular) así como también de la carga neta que posea. De esta manera. En la electroforesis. Objetivos: Utilizar la técnica de la electroforesis en gel para analizar la purificación de la lisozima. Figura 6). En este tipo de electroforesis. la separación de las proteínas se verá condicionada sólo por su tamaño y no por su carga. todas las proteínas tratadas con SDS presentan la misma relación carga/masa. es decir depende únicamente de la masa molecular de la proteína (Figura 7). realizaremos una electroforesis en condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS (Dodecilsulfato sódico. proteínas.Separación de proteínas en geles de poliacrilamida Electroforesis La electroforesis es una de las técnicas analíticas más importantes dentro de la Bioquímica y consiste en la migración de moléculas biológicas (ADN. En este trabajo práctico. participando así en el proceso de separación.) en un campo eléctrico. La movilidad dependerá de la carga que presentan al pH de trabajo. La electroforesis en gel es el método más conveniente para realizar separaciones de macromoléculas (ADN y Proteínas). Entre los más restrictivos están los geles de acrilamida-bisacrilamida. la separación será debida sólo a la diferente retención por el soporte. De esta manera. en el cual un entramado tridimensional impide o reduce la movilidad de las moléculas. el gel retarda en mayor medida a las moléculas mayores respecto a las de menor tamaño. A. y entre los menos restrictivos está la agarosa. Cuantificar la concentración de proteínas en cada una de las fracciones. Los soportes pueden ser más o menos restrictivos según el tamaño del poro.Día 3: ANÁLISIS POR SDS-PAGE DE LA PURIFICACIÓN DE LA LISOZIMA Y CUANTIFICACIÓN PROTEICA. etc.

entre los que se establece la diferencia de potencial (Figura 8). Figura 8 C) el buffer: durante la electroforesis se produce electrolisis del agua. B) una cuba o recipiente. mediante dos electrodos. positivo (ánodo) y negativo (cátodo). el buffer evitará que el 12    .Parte hidrofóbica Parte hidrofílica Confiere la carga negativa Dodecilsulfato sódico (SDS)  Figura 6 Mezcla de macromoléculas Electroforesis Gel poroso Figura 7 Para llevar a cabo la electroforesis se necesita: A) una fuente de tensión que proporciona el campo eléctrico. generándose protones en la proximidad del ánodo e iones hidroxilos en la proximidad del cátodo. en cuyos extremos se sitúan los electrodos (Figura 8).

Acrilamida Bis-acrilamida Radical sulfato inicia la polimerización Figura 9 La preparación de los geles de poliacrilamida se llevará a cabo según el método descrito por Laemmli: Gel de separación: poliacrilamida 15% (vol.8%): 5 ml .3 ml . D) un gel: el polímero utilizado para la formación del gel es la acrilamida y la bisacrilamida.SDS: 10% 0. Figura 9).1 ml .entorno anódico se acidifique y el catódico se haga más básico a lo largo de la corrida electroforética. TEMED.Persulfato de amonio 10%: 100 μl 13    . los cuales se polimerizan mediante la adición de catalizadores (persulfato de amonio.TEMED: 10 μl .Bis-acrilamida (0.Tris 1.Acrilamida (30%).8: 2. final para 2 geles 10 ml) .5 ml .H20: 2.5M pH8.

Colocar el peine y esperar a que polimerice. la mezcla entre los cristales.Tris 1. Al manipular estas soluciones usar siempre guantes y tener cuidado con el material contaminado. Gel concentrador: poliacrilamida 6% (vol.TEMED: 6 μl . PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: 1.Persulfato de amonio 10%: 60 μl Verter.8: 1.2 ml . Cubrir.5 ml . cuidadosamente. Una vez gelificado retirar el agua.H20: 3.Bis-acrilamida (0. cuidadosamente.2 ml .Acrilamida (30%). Sembrar según se detalla a continuación. El marcador de peso Molecular está compuesto por una mezcla de BSA (66 KDa). ATENCIÓN: La acrilamida y el TEMED son agentes extremadamente tóxicos que pueden ser absorbidos por la piel.2 KDa). ovoalbúmina (45 KDa).Verter. final para 2 geles 6 ml) . la mezcla entre los cristales.SDS 10%: 60 μl . Inhibidor de tripsina (20.0M pH 6. Esperar a que el gel polimerice.8%): 1. Retirar el peine.1 KDa) y alfalactoalbúmina (14. cuidadosamente con alcohol 96% (utilizar una pipeta Pasteur) para delimitar el frente. 14    .

Llevar a 1 litro con H2O. a intensidad de corriente constante de 30 mA hasta que el azul de bromofenol esté.5 μl L1 Grupo2 9: 12.5 cm del extremo inferior del gel.5 μl E Grupo2 1: 15 μl Marcador de Peso Molecular 2: 3 μl EC Grupo 3 o 4 3: 3 μl FT Grupo3 4: 12.192 M y SDS 0. Trabajar en tubos eppendorfs y realizar el experimento por duplicado.5 μl L1 Grupo1 5: 12.Cuantificación de proteínas por método de Bradford MATERIALES: -Solución de Azul brillante de Coomassie: 70 mg de Azul Brillante de Coomassie G-250 + 50 ml de etanol al 95% + 100 ml de ácido fosfórico al 85%.5 μl L1 Grupo3 5: 12.Gel 1: Calles Gel 2: Calles 1: 15 μl Marcador de Peso Molecular 2: 12. pH 8. 3.5 μl E Grupo1 7: 12. B. aproximadamente.5 μl EC Grupo 1 o 2 3: 12.5 μl L1 Grupo4 9: 12. PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: Cada grupo deberá determinar la cantidad de proteínas presente en cada una de las fracciones de la purificación utilizando la siguiente tabla y la curva de calibración realizada el Día1.5 μl FT Grupo1 4: 12.5 μl FT Grupo2 8: 12.5 μl L2 Grupo3 6: 12. Filtrar con papel Whatman N° 1.5 μl L2 Grupo1 6: 12. Desmontar el gel y teñirlo con metanol/acético/H20 (5/1/5) con azul de Coomassie (1 g/l).8. glicina 0.5 μl E Grupo3 7: 3 μl FT Grupo4 8: 12. a 0.5 μl E Grupo4 2.025 M.5 μl L2 Grupo4 10: 12. Fracción Blanco EC (dil 1/50) FT (dil1/50) L1 L2 E Volumen (µl) 0 20 20 5 20 20 Volumen de H2O (µl) csp.5 μl L2 Grupo2 10: 12. 700 µl 700 680 680 695 680 680 Volumen de Bradford (µl) 700 700 700 700 700 700 Abs1 Abs2 15    . Correr la electroforesis en buffer Tris-HCl 0.1%. Conservar a 4°C.

940 cm-1 mM-1 PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: Colocar 700 µl de la fracción E en una cubeta especial para UV y medir absorbancia a 280 nm.Respetar el orden de los agregados. Considerar que los valores de absorbancia medidos deben caer dentro del rango de determinado en la curva de calibración. deben realizarse nuevas medidas utilizando cantidades mayores o menores de las fracciones correspondientes. C. 16    .Cuantificación de proteínas por Absorbancia a 280 nm La concentración proteica en la fracción E también será determinada por absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción teórico de la lisozima: Coeficiente de extinción (Ɛ280nm): 38. De lo contrario.

Día 4: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA LISOZIMA Objetivos: Determinar la actividad de la lisozima en las diferentes fracciones de purificación  y su dependencia con el pH del medio. 8 P 6 4 2 0 2 4 6 Tiempo 8 10 Figura 10 La medida adecuada de la actividad de una enzima requiere que se determine la velocidad inicial. Medida de la actividad enzimática Exceptuando unas pocas proteínas que pueden ser detectadas por medidas espectroscópicas directas. esto es. las diferentes causas que producen la disminución de la actividad con el tiempo son eliminadas. Por esto. 17    . Además. La figura 10 muestra una curva típica de formación de un producto (P) en función del tiempo para una reacción catalizada enzimáticamente. la medida de actividad enzimática es de importancia para la investigación y análisis de proteínas. Se observa que la velocidad disminuye con el tiempo. pudiéndose estimar la cantidad de enzima por la velocidad de la reacción. la presencia de una enzima es determinada por la medida de la reacción que cataliza. hecho que puede deberse a las siguientes causas: - El transcurso de la reacción produce una disminución significativa de la concentración de sustrato (S) - La reacción inversa puede comenzar a cursar y hacerse relativamente importante al aumentar la concentración de P - Algunos de los productos pueden inhibir a la enzima. obtener la tangente al origen del gráfico mostrado en la figura 10. la caracterización de una enzima implica la determinación de su actividad en diferentes condiciones. De esta manera.

potenciométricos. la v obtenida sería distinta según el intervalo escogido. radioquímicos. volumétricos. La determinación cuantitativa de S o de P puede hacerse por diferentes métodos analíticos según el caso: espectrofotométricos (los más comunes). la cantidad de enzima en el medio de medida. Además de considerar la variación de la velocidad con el tiempo. la concentración de S. obtendríamos el mismo valor. determinadas a tres concentraciones diferentes de S. 18    . donde la formación de P es función lineal con el tiempo. si medimos v para cuando S=S3. el pH. cuando S=S1. independientemente del intervalo de tiempo elegido. hay que tener en cuenta que la actividad de una enzima es afectada por otros factores como la temperatura. Figura 11 En este ejemplo.La figura 11 ejemplifica medidas experimentales de la formación de P en función del tiempo (como en la figura 10). espectrofluorométricos. Para estos dos casos. En cambio para S=S2. la fuerza iónica. Puede observarse que la velocidad (v) que se obtendría en cada caso dependería del intervalo de tiempo que se tomara para medirla. La medida de la actividad de una enzima requiere determinar el consumo de S o la aparición de un P de la reacción en función del tiempo. la determinación de v usando el intervalo 0-1 no es enteramente confiable ya que se necesitan más puntos experimentales que verifiquen la condición de linealidad en la estimación de v realizada. Para el ejemplo de la figura 11. la v podría calcularse adecuadamente eligiendo el intervalo 0-1. Todos estos factores deben ser convenientemente conocidos y fijados al realizar medidas de actividad enzimática.

Esto es lo que se denomina método continuo de medida de la actividad enzimática.Independientemente del método utilizado. Por ejemplo. En consecuencia. a partir de un único medio de reacción. podrían obtenerse numerosos puntos experimentales (o trazos continuos si disponemos de un registrador automático) de la producción de Q en función del tiempo. aún puede medirse la actividad de una enzima por un método continuo si se acopla otra reacción enzimática a la de la enzima en cuestión. la reacción enzimática podría seguirse continuamente en función del tiempo. absorbe a 340nm. la actividad de la enzima Ureasa puede medirse en forma continua por un método que utilice a la Glutamato Deshidrogenasa como enzima acoplada de forma que se cuantifique el Amonio producido por acción de la Ureasa: 19    . pueda medirse Q en presencia de los otros componentes de la mezcla de reacción. Los ejemplos típicos de métodos continuos empleados para medir actividad los constituyen las deshidrogenasas que usan NAD(P)/NAD(P)H como coenzima. por ejemplo. En este caso. con lo que se obtendría la curva mostrada en la figura 12. pero no la forma oxidada (NAD(P)). puede suceder que para. aunque no haya una propiedad analítica diferencial de un S o de un P que permita su dosaje continuo. la actividad de la Glutamato deshidrogenasa (GluDH): NH4+ + 2-oxoglutarato + NADH + H+  Glutamato + NAD+ podría seguirse por un método continuo midiendo la disminución de absorbancia a 340 nm. Figura 12 En ciertos casos. una reacción enzimática: Sa + Sb  P + Q. Estos métodos se basan en que la forma reducida de la coenzima (NAD(P)H). Así.

en general. la actividad de la Fosfoglucosa isomerasa (Glc6P  Fructosa6P) podría medirse cuantificando Fru6P por el método de Roe. Por ejemplo. es necesario preparar tantos tubos de reacción como puntos experimentales se deseen. para lo cual se requiere detener la reacción enzimática. la disminución de la absorbancia a 340 nm va a ser equivalente a la velocidad de producción de NH4+ por parte de la Ureasa. Por esto. sino su reacción química en condiciones que afectan la actividad de la enzima. Si no se separa el ATP formado del PPi que no reaccionó no se observa cambio de la radioactividad en el medio de reacción. Para determinar cuánta radioactividad está en forma de ATP es necesario detener la reacción enzimática y separar el ATP del PPi. la medida de la actividad de una enzima no puede hacerse determinando continuamente un dado S o P en presencia de los demás componentes del medio de medida y es necesario separar el compuesto a cuantificar. Nótese que. Se requiere nuevamente de un medio de medida de actividad por punto experimental de cantidad de Fru6P producida. En este trabajo práctico se utilizará un método continuo para la medida de actividad de la enzima lisozima. Pero las condiciones del método de determinación hacen que necesariamente se detenga la reacción enzimática con cada medida de Fru6P. Por ejemplo. En estos casos se utilizan métodos discontinuos. en los que la medida de S o de P requiere partir de un medio de reacción diferente. la actividad de la ADPglucosa pirofosforilasa (ADPGlc + PPi  Glc1P + ATP) puede medirse usando PPi marcado con [32P] y midiendo la formación de ATP radioactivo. En otros casos. al usar un método discontinuo para medir actividad enzimática hay que ser particularmente cuidadoso para estar seguro de medir velocidades iniciales. para tener una curva de ATP formado en función del tiempo. en cada uno de los cuales se cortará la reacción en el tiempo adecuado. Un método discontinuo puede comprender también aquel en el que el dosaje de un S o P no implique su separación del medio de reacción.(CO(NH2)2 + 2 H2O  2 NH4 + + CO2) (Ureasa) NH4+ + 2-oxoglutarato + NADH + H+ Glutamato + NAD+ (GluDH) Si las cantidades de GluDH y de NADH agregadas al medio de reacción son lo suficientemente elevadas. y teniendo en cuenta lo antes mencionado sobre la variación de v en función del tiempo. el uso de un método continuo brinda con mayor facilidad un número elevado de medidas de variación de S o P en función del tempo (inclusive puede tenerse un trazo continuo) que un método discontinuo. De esta forma. 20    .

la transmisión de luz monocromática a través de la cubeta de un espectrofotómetro. El descarte del material sólido (por ejemplo tips.Buffer citrato-fosfato 100 mM. pH 5 . ATENCIÓN: Tener precaución a lo largo de todo el trabajo práctico en la manipulación de las células bacterianas. A pesar de que se trate de una cepa no patogénica se considera residuo peligroso por tratarse de material biológico.2 y 0. lo que reduce la dispersión de la luz. guantes. 21    . mientras que las soluciones deben tratarse con lavandina en una concentración final del 10% V/V. pH 4 .Buffer fosfato sódico 100 mM pH 7 .2 a una DO de 2 a 600 nm. en condiciones estándar (25ºC. la pared celular de las bacterias se hidroliza. pH 6. Las bacterias se crecen ON en medio Luria Bertani a 37°C.Buffer citrato-fosfato 100 mM. se considera que 1 unidad de actividad enzimática de lisozima (U) produce una disminución en la absorbancia de 0. que se manifiesta en una reducción en la absorbancia a una longitud de onda fija de 600 nm.1 M fosfato). pH 6. y en un medio hipotónico produce la lisis de las mismas.Suspensión de la bacteria Bacillus subtilis. etc) debe realizarse en bolsas rojas.Buffer fosfato sódico 100 mM pH 8 . por dispersión. La actividad enzimática es proporcional a la disminución de la absorbancia a 600 nm.001 en 1 minuto. MATERIALES: .Buffer fosfato sódico 100 mM. Al incubar esta suspensión con lisozima.Medida de la actividad lisozima La medida de la actividad lisozima se realiza utilizando una suspensión del microorganismo Bacillus subtilis en concentración suficientemente elevada para atenuar. Por definición.2 . se centrifuga el cultivo y se resuspende en buffer fosfato sódico pH 6.

En una cubeta. pH 7 y pH 8. 1310 µl del buffer que corresponda en cada caso y por último. C.Medida de la actividad en función del pH PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: 1.2.2 y por último. 2. pH 6. Medir en forma continua el descenso de la absorbancia a 600 nm registrando los valores de absorbancia cada 20 segundos por un período de 4 minutos. Se deben realizar las medidas a pH 4. B. 2. Calcular la variación de absorbancia por minuto (ΔA/min) y la actividad en U/mg. Incubar en un eppendorf 90 µl de la fracción E con 210 µl del buffer que corresponda en cada caso por 20 minutos. pH 5. 90 µl de la fracción E. 1100 µl el buffer fosfato sódico 100 mM pH 6. agregar el contenido del eppendorf. añadir en una cubeta 100 µl de la suspensión bacteriana.Estabilidad en función del pH PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: 1.2 (µl) fracción (µl) 100 1310 EC 90 100 1100 FT 300 100 1100 L1 300 100 1100 L2 300 100 1310 E 90 2. 22    . pH 7 y pH 8. pH 5. Medir en forma continua el descenso de la absorbancia a 600 nm registrando los valores de absorbancia cada 20 segundos por un período de 4 minutos.A.Medida de la actividad de las distintas fracciones de la purificación PROCEDIMIENTO A REALIZAR POR LOS ALUMNOS: 1. Calcular la variación de absorbancia por minuto (ΔA/min) y la actividad en U/mg. En una cubeta. el buffer fosfato sódico 100 mM pH 6.2 y por último. la fracción que corresponde siguiendo el siguiente esquema: Volumen de suspensión Volumen de buffer Volumen de cada Fracción de bacterias (µl) fosfato pH 6. añadir 100 µl de la suspensión bacteriana. añadir la suspensión bacteriana. Luego de los 20 minutos. Se deben realizar las incubaciones a pH 4.2. pH 6.

Medir en forma continua el descenso de la absorbancia a 600 nm registrando los valores de absorbancia cada 20 segundos por un período de 4 minutos. 23    . Calcular la variación de absorbancia por minuto (ΔA/min) y la actividad en U/mg.3.

Cuantificación de proteínas (curva de calibración y el ejemplo del cálculo de la concentración de al menos una de las fracciones) I.a.Purificación de la lisozima I.Medidas de actividad de cada fracción (al menos el ejemplo del cálculo de la Aesp en 1 de las fracciones) I.d.c.Complete la siguiente tabla: Fracción Vol (ml) 10 [Prot] (mg/ml) ProtT (mg) A (U/ml) AT (U) Aesp (U/mg) EC FT L1 L2 E A partir de esos datos construya la tabla de purificación.Método de cuantificación de proteínas: a. 24    .La medida de absorbancia a 280 nm: ¿Es un método confiable para la determinación de la concentración de proteínas? ¿Se puede aplicar a cualquier proteína? ¿Qué se usa como patrón para la construcción de las curvas de calibración? b.b.SDS-PAGE (foto/ esquema y descripción) I.INFORME DE LABORATORIO: INTEGRANTES DEL GRUPO COMISIÓN OBJETIVOS GENERALES RESULTADOS I. II.Estabilidad y actividad de la lisozima vs pH (gráficas de U/mg vs pH de medida o pH de preincubación) DISCUSIÓN .Calcular la concentración de proteínas totales en la clara de huevo y comparar con la bibliografía.

d con el gel.Determinar e informar rango de estabilidad y pH ópimo 25    . b.Comparar la tabla del ítem I.- Método de medida de actividad: a.Actividad y estabilidad en función del pH a. Discutir sobre la eficiencia del proceso de purificación.Continuo vs Discontinuo.Completar la siguiente tabla y comparar con lo observado en el gel: Abundancia en clara de huevo (%) Proteína Peso Molecular (kDa) Función/Características pI Ovoalbúmina Ovotransferrina Lisozima Ovomucina Ovomucoide Avidina . - Purificación: a. Discutir porque el método que usamos es continuo a pesar de que los datos se midan en forma discontinua.