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TEORA DE LA FLUORESCENCIA
Las molculas tienen diferentes estados llamados niveles de energa. La
espectrometra de fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y
electrnicos. En general, las especies objeto de examen tendrn un estado
electrnico basal (un estado de baja energa) de inters, y un estado electrnico
excitado de mayor energa. Dentro de cada uno de estos estados electrnicos hay
diferentes estados vibracionales.
En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la
absorcin de un fotn de luz, desde su estado electrnico basal a uno de los distintos
estados vibracionales del estado electrnico excitado. Las colisiones con otras
molculas causan que la molcula excitada pierda energa vibracional hasta que
alcanza el estado vibracional ms bajo del estado electrnico excitado.
La molcula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibracin del estado
electrnico basal, emitiendo un fotn en el proceso. Como las molculas pueden
caer a cualquiera de los diferentes niveles de vibracin en el estado basal, los
fotones emitidos tendrn diferentes energas y, por lo tanto, frecuencias. As pues,
mediante el anlisis de las diferentes frecuencias de luz emitida por espectrometra
de fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la
estructura de los diferentes niveles de vibracin.
En un experimento tpico, se miden las diferentes frecuencias de luz fluorescente
emitida por una muestra, manteniendo la luz de excitacin a una longitud de onda
constante. A esto se le llama espectro de emisin. Un espectro de excitacin se mide
mediante el registro de una serie de espectros de emisin utilizando luz de
diferentes longitudes de onda.
INSTRUMENTOS
En la espectrometra de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de
instrumentos:
nico canal slo puede detectar la intensidad de una longitud de onda en cada
momento, mientras que el de mltiples canales detecta la intensidad en todas las
longitudes de onda simultneamente, con lo que el monocromador de emisin o
filtro es innecesario. Los diferentes tipos de detectores tienen sus ventajas y
desventajas.
El fluormetro ms verstil, con monocromadores dobles y una fuente de luz de
excitacin continua, puede registrar tanto un espectro de excitacin como un
espectro de fluorescencia. Al medir los espectros de fluorescencia, la longitud de
onda de la luz de excitacin se mantiene constante, de preferencia en una longitud
de onda de alta absorcin, y el monocromador de emisin escanea el espectro. Para
medir los espectros de excitacin, la longitud de onda que pasa a travs del filtro o
monocromador de emisin se mantiene constante y el monocromador de excitacin
va escaneando. El espectro de excitacin generalmente es idntico al espectro de
absorcin, ya que la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la absorcin.
ejemplo.
Como se mencion anteriormente, tambin surgen distorsiones de la muestra. Por lo
tanto, algunos aspectos de la muestra deben tenerse en cuenta tambin. En primer
lugar, la fotodescomposicin puede disminuir la intensidad de fluorescencia con el
tiempo. La dispersin de la luz tambin debe tenerse en cuenta. Los tipos ms
importantes de dispersin en este contexto son la dispersin de Rayleigh y la de
Raman. La luz dispersa por dispersin de Rayleigh tiene la misma longitud de onda
que la luz incidente, mientras que en la dispersin Raman la luz cambia a longitudes
de onda ms largas. La dispersin de Raman es el resultado de un estado electrnico
virtual inducido por la luz de excitacin. A partir de este estado virtual, las
molculas pueden volver a un nivel vibracional distinto del estado basal. En los
espectros de fluorescencia siempre se observa una diferencia de nmero de onda
constante en relacin con la excitacin; por ejemplo, en el agua el pico aparece a
un nmero de onda 3600 cm-1 inferior a la luz de excitacin.
Otros aspectos a considerar son los efectos del filtro interior. Estos incluyen la
reabsorcin, que ocurre porque otra molcula o parte de una macromolcula
absorbe las longitudes de onda en la que el fluorforo emite radiacin. Si este es el
caso, una parte o la totalidad de los fotones emitidos por el fluorforo pueden ser
absorbidos de nuevo. Otro efecto del filtro interno se produce a causa de las altas
concentraciones de absorcin de las molculas, incluyendo el fluorforo. El
resultado es que la intensidad de excitacin de la luz no es constante a lo largo de la
solucin. Como resultado, slo un pequeo porcentaje de la luz de excitacin llega a
los fluorforos que son visibles para el sistema de deteccin. Los efectos del filtro
interior cambian el espectro y la intensidad de la luz emitida y, por tanto, deben ser
considerados al analizar el espectro de emisin de luz fluorescente.
APLICACIONES
La espectrometra de fluorescencia se utiliza en anlisis bioqumicos, mdicos,
qumicos y de investigacin de compuestos orgnicos. Tambin se ha utilizado para
diferenciar los tumores malignos de piel de los benignos.
La fluorescencia tambin puede utilizarse para reorientar los fotones.