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UNESP

INSTITUTO DE BIOCINCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

MEDICINA
Disciplina de Microbiologia Humana

AULAS PRTICAS DE BACTERIOLOGIA

2015

NDICE

LEMBRETES IMPORTANTES.........................................................................................3
RELATRIO DE AULAS PRTICAS..............................................................................3
MORFOLOGIA E COLORAO DA CLULA BACTERIANA..................................5
MEIOS DE CULTURA E CONDIES FSICAS DE CULTIVO BACTERIANO.....8
CONTROLE DE POPULAES BACTERIANAS.....................................................10
GENTICA BACTERIANA (CONJUGAO)...............Erro! Indicador no definido.
DETERMINAO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS.....................16
STREPTOCOCCUS..........................................................................................................17
STAPHYLOCOCCUS.......................................................................................................20
PSEUDOMONAS..............................................................................................................24
ENTEROBACTRIAS......................................................................................................26

LEMBRETES IMPORTANTES
1. Durante a permanncia no laboratrio de aulas prticas, necessrio o
uso de avental. Encerradas as atividades, o mesmo deve ser guardado em
uma sacola ou saco plstico, de modo a evitar possvel contaminao do
ambiente fora do laboratrio.
2. No deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos prticos so
realizados.
3. Comunique

imediatamente

aos

instrutores

qualquer

acidente

(derramamento de culturas sobre a bancada ou cho, ferimentos de


qualquer espcie, aspiraes de culturas na boca, etc).
4. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado.
5. Lave bem as mos com desinfetante antes de deixar o laboratrio.
6. No permitido o uso de chinelo, sandlia ou qualquer outro calado que
deixe os ps expostos.

RELATRIO DE AULAS PRTICAS


Aps o trmino de cada aula prtica, o aluno dever entregar relatrio
da(s) atividade(s) do dia ao docente responsvel pela mesma. No caso da
atividade ocupar o tempo de mais de uma aula, o relatrio correspondente dever
ser entregue ao final da ltima aula, sendo que o aluno que faltar em pelo menos
uma das aulas necessrias para sua concluso, ter nota igual a zero em seu
relatrio, mesmo que o entregue.
Os relatrios devero ser simples e objetivos. Devem ser apresentados de
forma resumida, contendo o (s) objetivo (s), os procedimentos e os resultados dos
experimentos. Devem ser manuscritos e preferencialmente no ocuparem mais
que duas folhas.

Docentes:
Bacteriologia
Prof. Dr. Augusto Cezar Montelli
Prof. Dr. Josias Rodrigues
Prof. Dr. Rodrigo Tavanelli Hernandes
Profa. Dra. Vera Lcia Mores Rall

MORFOLOGIA E COLORAO DA CLULA BACTERIANA


Nesta aula, ser feita a observao de bactrias ao microscpio. Uma das
lminas ser corada pelos alunos, conforme roteiro abaixo. As demais j foram
coradas e esto prontas para a observao. Na observao das lminas coradas
pelo mtodo de Gram, as bactrias devero ser classificadas quanto colorao
(como Gram positiva ou negativa), o arranjo (agrupamento) e a morfologia (coco
ou bacilo). Alm das lminas coradas pelo mtodo de Gram, ser feita a
observao de uma lmina contendo um esfregao de escarro apresentando
bacilos lcool-cido resistentes (que no se coram pelo mtodo de Gram) e
corada pelo mtodo de Ziehl-Neelsen.
A) Colorao de Bactrias pelo Mtodo de Gram

Material:
- Lminas contendo o esfregao de bactrias
- Bateria de Gram: violeta genciana (ou cristal violeta), lugol, lcool 95%
e fucsina.
Procedimento:
a) Cobrir os esfregaos com a soluo de violeta genciana. Esperar 1
minuto.
b) Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaos com lugol.
Esperar 1 minuto.
c) Escorrer o lugol e descorar os esfregaos pelo lcool. Para isto,
deixe o lcool cair, gota a gota, sobre a lmina, mantendo-a
inclinada.

Considerar os esfregaos suficientemente descorados

quando o lcool no mais retirar o corante dos mesmos.


d) Lavar a lmina em gua corrente.
e) Cobrir os esfregaos com a soluo de fucsina, esperar de 30
segundos a 1 minuto.
f) Lavar a lmina em gua corrente. Secar com auxlio de papel de
filtro.
g) Observar ao microscpio e desenhar.

Observar e Desenhar:

Lmina A(Escherichia coli)


Forma:________________
Arramjo:________________
Gram:_________________

Lmina B (Staphylococcus aureus)


Forma:________________
Arranjo:________________
Gram: ________________

Lmina C (Streptococcus agalactiae)


Forma:________________
Arranjo:________________
Gram: ________________

Lmina E(Neisseriasp.)
Forma:________________
Arranjo:_________________
Gram:_________________

Bacilos lcool-cido Resistentes (BAAR)


(Mycobacteriumtuberculosis)

Lmina contendo um esfregao de


escarro

de

um

paciente

com

tuberculose, corada pelo mtodo de


Ziehl-Neelsen, apresentando bacilos
lcool-cido resistentes (BAAR).

Lmina D (Bacillus cereus)

MEIOS DE CULTURA E CONDIES FSICAS DE CULTIVO

Forma:________________

Arranjo:________________

BACTERIANO

Gram: ________________

A) Necessidades nutritivas de algumas bactrias

Material:
- Cultura A (Escherichia coli)
- Cultura B (Staphylococcus aureus)
- Cultura C (Streptococcus agalactiae)
- Caldo sinttico
- Caldo comum
- Caldo glicosado (caldo comum mais glicose)
- Ala de nquel cromo
Procedimento:
1. Semear cada uma das 3 culturas bacterianas nos diferentes meios.
2. Deixar na estufa a 37C at o dia seguinte.
3. Verificar a presena de crescimento (turvao do meio).
4. Anotar os resultados.

Cultura
caldo

Crescimento em:
Caldo

caldo

sinttico

comum

glicosado

A (Escherichia coli)
B (Staphylococcus aureus)
C (Streptococcus
agalactiae)

B) Dependncia do oxignio para o crescimento bacteriano


Material:

- Meio de Tiogel
- Cultura A (Escherichia coli)
- Cultura D (Pseudomonas aeruginosa)
- Cultura F (Clostridiumsp.)
- Agulha de nquel cromo
Procedimento:
Com a agulha de nquel cromo, semear as culturas A e D em tubos
de tiogel. Colocar todos os tubos na estufa a 37C por aproximadamente 18
horas. No dia seguinte, observar os tubos, verificando, no meio de tiogel, a
localizao do crescimento. A cultura F ser semeada no Laboratrio de
aula prtica do Departamento de Microbiologia e Imunologia, e observada
juntamente com as culturas A e D.
Local de crescimento no meio de Tiogel:
Culturas

Classifica
o

Superfci

Toda

Base do

extenso

Meio

A (Escherichia coli)
D (Pseudomonas
aeruginosa)
F (Clostridium sp.)

CONTROLE DE POPULAES BACTERIANAS


A) Efeito de agentes fsicos sobre as bactrias
Ao da temperatura, em funo do tempo, sobre cultura bacteriana esporulada
ou no.
Material:
- Cultura A em salina (Escherichia coli, bactria no esporulada)
- Cultura E em salina (Bacillus cereus, bactria esporulada)
- Tubo contendo 1 ml da soluo salina esterilizada
- Placas de Petri contendo gar nutriente
- Banho-Maria a 60 C
- Ala de Nquel cromo
Procedimento:
1. Inocule (com a ala de nquel cromo) as suspenses bacterianas A e E no
quadrante correspondente ao tempo 0.
2. Coloque o tubo com a suspenso em banho-maria a 60 C e, aos 5', 10' e 15',
retire amostras, inoculando-as nos respectivos quadrantes da placa de Petri
(proceda exatamente como no item 1).
3. Deixe a placa na estufa a 37 C at o dia seguinte.
4. Observe a variao quantitativa de crescimento nos quadrantes em funo do
tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++,
conforme a intensidade de crescimento).
Resultados:
Observe a variao quantitativa de crescimento nos quadrantes em funo
do tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++) na
tabela abaixo.
Cultura
0

Tempo de aquecimento
5
10

15

A (Escherichia coli)
E (Bacillus cereus)

10

B) Efeito de agentes qumicos sobre as bactrias: antissptico para enxague


bucal

Material:

03 zaragatoas estreis

Anti-sptico bucal de uso comercial

01 placa de gar-nutriente

Procedimento:
1. Divida uma placa de gar nutriente em 3 quadrantes, marcando A (antes do
tratamento), B (depois do primeiro tratamento) e C (depois do segundo
tratamento).
2. Friccionar uma zaragatoa estril na mucosa da bochecha e semear no
quadrante A em ziguezague.
3. Bochechar com parte do o anti-sptico bucal fornecido por 1 minuto.
4. Aguardar aproximadamente 3 minutos e repetir a coleta do material
semeando no quadrante B.
5. Bochechar novamente com o anti-sptico bucal por 1 minuto.
6. Aguardar 3 minutos e repetir a coleta do material semeando no quadrante
C.
7. Deixe a placa na estufa at o dia seguinte.
Resultados:
Fazer a leitura das placas, anotando o crescimento microbiano com cruzes
(de + a ++++) na tabela abaixo.

Cresciment
o
Microbiano
A (antes do tratamento)
B (depois do primeiro tratamento)
C (depois do segundo tratamento)
11

12

C) Efeito de agentes qumicos sobre bactrias: lcool iodado a 0,1%

Material:

01 tubo contendo aproximadamente 1 mL de lcool iodado a 0,1%

01 tubo contendo salina estril

01 Placa de gar-nutriente

03 zaragatoas estreis

Procedimento:
1. Umedea uma zaragatoa em um tubo contendo salina. Aps retirar o excesso
de salina, pressionando a zaragatoa contra a parede do tubo, esfregue-a
vigorosamente no dorso de uma das mos;
2. Passe a zaragatoa em rea correspondente metade de uma placa com gar
nutriente;
3. Umedea uma segunda zaragatoa em lcool iodado a 0,1% e esfregue no
dorso da outra mo;
4. Aguarde 2 minutos para que haja ao do antissptico;
5. Passe ento, nessa rea, uma terceira zaragatoa umedecida, tomando
cuidado para no ultrapassar a rea higienizada. Inocule, passando a
zaragatoa na superfcie da outra metade da placa com gar nutriente;
6. Incube a placa na estufa, durante uma noite.
7. Observe a intensidade de crescimento anotando com sinal + na tabela abaixo.

Resultados:
Observe a intensidade do crescimento microbiano anotando com cruzes
(de + a ++++) na tabela abaixo.

Antes do

Depois do

Tratamento

Tratamento

Crescimento
Microbiano

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GENTICA BACTERIANA
CONJUGAO

Material:

01 Placa de MacConkey contendo cido nalidxico (Nal)

01 Placa de MacConkey contendo Cloranfenicol (Clo)

01 placa de gar MacConkey contendo Nal + Clo

Culturas A (Escherichia coli C600, lac-), B (Escherichia coli J53, lac+) e M


(cultura A + cultura B) em meio lquido

Ala de nquel cromo

Procedimento:
1. Semeie as amostras A, B e a mistura (M) nas placas contendo meio
seletivo MacConkey, com antibticos (Nal + Clo), conforme o esquema abaixo.
2. Para controle das culturas A e B, semeie cada uma das culturas recebidas
para essa aula prtica em placas de gar MacConkey contendo Nal e Clo
(separadamente), visando definir a capacidade das amostras em fermentar da
lactose e o perfil de resistncia.
3. Incube as placas a 37C at o dia seguinte.

14

Resultados:
Registre os resultados obtidos na tabela abaixo:
Crescimento em gar
Bactria

MacConkey:
Nal Clo Nal + Clo

Fermentao

Padro

da lactose

de Resistncia

A
B
M
Nal (cido nalidxico, 50 g/mL), Clo (cloranfenicol, 50 g/mL)

Quais as hipteses possveis para explicar o ocorrido?

Como voc poderia comprovar a sua hiptese utilizando mtodos


moleculares?

15

Anlise Molecular do Experimento de Conjugao

Eletroforese do DNA em gel de agarose das amostras A, B e da resultante da


mistura M
Atividade:
Identifique o perfil plasmidial de cada uma das amostras empregadas
nessa aula prtica no gel apresentado acima.
Perfil

Amostra

Plasmidial
1
2
3

16

DETERMINAO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS


Interpretao de Antibiograma pelo Mtodo de Bauer e Kirby
Material:
- Culturas bacterianas em gar Meller-Hinton crescidas em contato com 5 discos
contendo drogas distintas
- Rgua
- Tabela de referncia
Procedimento:
1. Com o auxlio da rgua, medir o dimetro do halo de inibio do crescimento.
2. Consultar a tabela de referncia, para interpretar os resultados e anotar no
quadro abaixo.
Droga

Concentrao
(g/ml)

Dimetro do halo de
inibio do
crescimento

Interpretao*

1
2
3
4
5
* S = Sensvel; R = Resistente; I = Intermedirio.

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STREPTOCOCCUS
EXERCCIOS
A) Observar placas de gar sangue semeadas com as culturas C, D e E.Verificar
o tipo de hemlise.

Cultura
C
D
E

Hemlise

B) Observar a colorao de Gram das culturas C e E.

Cultura C

Cultura E

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C) Prova da catalase.
Colocar sobre a cultura C(em caldo) e sobre uma cultura controle positivo
(Staphylococcus aureus) algumas gotas de gua oxigenada. Verificar a reao e
anotar o resultado (Positivo = formao de bolhas).
Catalase
Cultura C
Staphylococcus aureus (Controle +)
D) Prova de sensibilidade bacitracina.
Princpio: O princpio desta prova baseia-se na inibio de crescimento do
Streptococcus pyogenes (-hemoltico, grupo A) frente a uma pequena
quantidade de bacitracina.
Tcnica: Verificar se ocorre uma zona de inibio de crescimento ao redor do
disco de papel de filtro contendo bacitracina, colocado sobre a cultura C.
Leitura: sensvel: existncia de uma zona de inibio do crescimento.
resistente: ausncia de zona de inibio de crescimento.

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E) CAMP Teste
Princpio:A atividade da hemolisina do S. aureus aumentada pela atividade
hemoltica do S. agalactiae (-hemoltico do grupo B).
Tcnica: Verificar zona de hemlise, em placa de gar sangue (feito c/ sangue
de carneiro), semeada coma cultura D e S. aureus.
Leitura: resultado - positivo: formao de uma zona de hemlise semelhante
"ponta de flecha" na unio das duas hemolisinas.
negativo: no formao de "ponta de flecha".
F) Prova da bilesolubilidade
Princpio: Esta prova verifica a sensibilidade da bactria lise por sais biliares
Tcnica: Adicionar 0,1 ml de uma soluo a 10% de desoxicolato de sdio a 1
ml da cultura D. Incubar a 37 o C e examinar aps 15 minutos.

Anotar o

resultado. Fazer o mesmo com a cultura E.


Leitura. Resultado positivo (suspenso solvel) - a cultura fica transparente.
Resultado negativo (suspenso insolvel) - a cultura permanece turva.
Cultura
D
E

Bile-solubilidade

G) Identificao das culturas


Cultura C
Cultura D
Cultura E

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STAPHYLOCOCCUS

A) Observar placas de gar sangue semeadas com as culturas A e B. Descrever


as caractersticas das colnias e verificar hemlise.
Cultura

Caractersticas das
Colnias

Hemlise

A
B

B) Observar esfregao da cultura A, corada pelo mtodo de Gram e desenhar.


Observar ao microscpio e desenhar.

Cultura A

21

C) Prova da Catalase
Colocar sobre as culturas A e B e sobre uma cultura controle algumas gotas de
gua oxigenada. Observar a reao e anotar o resultado.
Cultura
A
B

Prova da Catalase

D) Prova da Coagulase
Princpio:
A coagulase uma enzima bacteriana que age sobre o plasma sanguneo.
Tcnica:
Misturar 0,5 ml da cultura A com 0,25 ml de plasma citratado de sangue de coelho
a 1%. Incubar a 37 oC e observar durante 4 horas. Fazer o mesmo com a cultura
B e anotar os resultados.
Resultado positivo - formao de cogulo.
negativo - suspenso inalterada
Cultura
A
B

Prova da Coagulase

E) Compilao dos resultados e Identificao das culturas


Hemlise

Catalase

Coagulase

Identificao

Cultura A
Cultura B

22

ESQUEMA DE IDENTIFICAO DOS GNEROS Staphylococcus E Streptococcus

23

PSEUDOMONAS

1. Observar placa de gar sangue semeada com Pseudomonas aeruginosa.


Descrever as caractersticas das colnias e verificar hemlise. Observar, tambm,
a pigmentao verde do crescimento em gar simples uma caracterstica
peculiar da espcie.
Cultura

Caracterstica das colnias

P. aeruginosa

2. Corar, pelo mtodo de Gram, esfregao da cultura de Pseudomonas


aeruginosa. Observar ao microscpio e desenhar.

24

Pseudomonas aeruginosa

25

3. Teste de fermentao de Glicose


Observar uma cultura de Pseudomonas aeruginosa e uma de Escherichia
coli em caldo glicosado contendo vermelho fenol ou indicador andrade. Interpretar
a diferena de cor das culturas bacterianas e anotar os resultados na tabela
abaixo.

Cultura
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli

Cor da Meio

Fermentao da Glicose

4. Prova da Citrocromo-oxidase
Fazer prova da citocromo-oxidase com a cultura de P. aeruginosa e com
uma cultura de Escherichia coli, para fins de comparao. Anotar o resultado.

Cultura
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli

Prova da citocromo-oxidase

26

ENTEROBACTRIAS
1. Observar a colorao das colnias das bactrias A, B e C cultivadas em placas
de gar MacConkey e SS. Anotar os resultados da prova de lactose.

Cultura

Colorao da colnia em
MacConkey
SS

Lactose

A
B
C
D
2. Interpretar crescimento das culturas A, B, C e D em meio de EPM, MILi e
Citrato de Simmons (conforme orientao nas pginas 26 e27) Anotar abaixo os
resultados (+ ou -) das provas para cada cultura.
Prova
A

Cultura
B
C

Citrato
Glicose
Gs
Urease
H2S
LTD*
Motilidade
Lisina
Indol
Lactose**
*LTD = L-triptofano desaminase
** Ver resultados nos meios de isolamento (item 1)
Comparando o perfil acima com o apresentado na tabela da pgina 28, identificar
cada uma das culturas.
Culturas: A________________________
B________________________
C________________________
D________________________

27

3. Reao sorolgica para confirmao dos resultados de identificao


bioqumica.
Fazer reao de aglutinao em lmina com as culturas B e C, utilizando os
soros anti - S. flexnerie anti - Salmonella sp.Anotar os resultados (positivo ou
negativo).

Soro

Cultura
B

Anti - Shigella flexneri


Anti Salmonella sp.

28

29

Perfil Bioqumico e Motilidade de Algumas Enterobactrias


Prova
Citrato
Glicose
Gs
Urease
H2S
LTD*
Motilidade
Lisina
Indol
Lactose

E. coli Shigella Edwardsiella Salmonella Citrobacter Klebsiella Enterobacter Serratia Proteus Proteus Morganella Providencia
tarda
flexneri
sp
freundii pneumoniae cloacae marcescens mirabili vulgaris morganii
rettigeri
s
+ ou+
+
+
+
+ ou+ ou+

+
+ ou-

+ ou+ ou-

+
+

+
+ ou-

*LTD = L-triptofano desaminase

+
+
+
+
+
+
-

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+
+
+
+
-

+
+
+ ou-

+
+
+ ou-

+
+
+
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+
+ ou-

+
+ ou-

+
+

+ ou+ ou-

+ ou-

+
+
-

+
+
+
-

+ ou-

+ ou-

+ ou-

+
+
+
+
+
-

+
+

+
+
+
+
-

+ ou-

+
-