UNIVERZITET U NOVOM SADU TEHNOLOŠKI FAKULTET Instrumentalne metode analize

ODREĐIVANJE SELENA U PREHRAMBENIM PROIZVODIMA ELEKTROTERMALNOM ATOMSKOM APSORPCIONOM SPEKTROFOTOMETRIJOM -diplomski rad-

Branislava D. Milić

Novi Sad, 2009. godine

UNIVERZITET U NOVOM SADU Tehnološki fakultet KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

Redni broj: RBR Identifikacioni broj: IBR Tip dokumentacije: TD Tip zapisa: TZ Vrsta rada: VR Autor: AU Mentor/Ko-mentor: MN Naslov rada: NS Određivanje selena elektrotermalnom spektrofotometrijom u prehrambenim proizvodima atomskom apsorpcionom Dr JAROSLAVA ŠVARC-GAJIĆ BRANISLAVA D. MILIĆ Diplomski rad Tekstualni štampani materijal Monografska publikacija

Jezik publikacije: JZ Jezik izvoda: JI Zemlja publikovanja: ZP Uže geografsko područje: UGP Godina: GO Izdavač: IZ Mesto i adresa: MS Fizički opis rada: FO broj poglavlja: broj strana: lit. citata: tabela: slika/grafikona: Naučna oblast: OB Hemija 5 33 22 3 8 21000 Novi Sad, Srbija, Bulevar Cara Lazara 1 autorski reprint 2009. Vojvodina Srbija srpski/engleski srpski (latinica)

Naučna disciplina: DI Analitička hemija

Predmetna odrednica/Ključne reči: PO UDK Čuva se: ČU U biblioteci Tehnološkog fakulteta u Novom Sadu, 21000 Novi Sad, Srbija, Bulevar Cara Lazara 1 selen, atomska apsorpciona spektrofotometrija

Važna napomena: VN Izvod: Nema U ovom radu je definisana metoda za određivanje selena u prehrambenim proizvodima iz grupe čajnog peciva i testenine primenom atomske apsorpcione spektrofotometrije u grafitnoj kiveti. Pored osnovnih eksperimentalnih uslova tehnike u radu je ispitano i više različitih modifikatora. Definisana je metoda pripreme uzoraka mikrotalasnom digestijom. Primenom definisanog postupka sadržaj selena je određen u većem broju prehrambenih proizvoda, tipa testenine i čajnog peciva, domaćih i stranih proizvođača.

Datum prihvatanja teme od strane NN Veća: DP Datum odbrane: DO Članovi komisije: (Naučni stepen/ime i prezime/zvanje/fakultet) KO 15.05.2009.

Predsednik: Mentor: Član:

Prof. Zvonimir Suturović, redovni profesor Tehnološkog fakulteta u Novom Sadu Dr Jaroslava Švarc-Gajić, docent Tehnološkog fakulteta u Novom Sadu Dr Biljana Pajin, docent Tehnološkog fakulteta u Novom Sadu

UNIVERSITY OF NOVI SAD Faculty of Technology KEYWORDS DOCUMENTATION

Accession number: ANO Identification number: UNO Document type: DT Type of record: TR Contents code: CC Author: AU Menthor/co-menthor: MN Title: TI Determination of selenium in foodstuffs by electrothermal atomic absorption spectrometry Assistant Professor JAROSLAVA ŠVARC-GAJIĆ BRANISLAVA D. MILIĆ B. Sc. thesis Textual material, printed Monographic publication

Language of text: LT Language of abstract: LS Country of publication: CP Locality of publication: LP Publication year: BY Publisher: PB Publ. Place: PL Physical description: PD Chapters: Pages: References: Tables: Figures/Graphs: Scientific field: SF Chemistry 5 33 22 3 8 21000 Novi Sad, Serbia, Bulevar Cara Lazara 1 author’s reprint 2009. Vojvodina Serbia Serbian (Times New Roman) (scr)/English Serbian (Times New Roman) (scr)

Scientific discipline: AD Analytical Chemistry

Subject/Key words: SX UC Holding data: HD Library of the Faculty of Technology, Novi Sad, 21000, Novi Sad, Serbia, Bulevar Cara Lazara 1 Selenium, Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry

Note: N B. Sc. thesis= Diplomski rad Faculty of Technology=Tehnološki fakultet Abstract: AB This study describes a method development for the determination of selenium in pastry and pasta dietary products by electrothermal atomic absorption spectrometry. Besides basic experimental parameters of the technique the influence of several different modifiers was investigated. Sample preparation method by microwave digestion was defined. Using the defined method selenium was determined in domestic and foreign pastry and pasta food products.

Accepted by the Scientific Board on: ASB Defended on: DE 15.05.2009.

Thesis defend board: (Degree/name/surname/title/faculty) DB

President: Menthor: Member:

Prof. Zvonimir Suturović, Sr. Professor, Faculty of Technology, University of Novi Sad Ph. D. Jaroslava Švarc-Gajić, Assistant Professor, Faculty of Technology, University of Novi Sad Ph. D. Biljana Pajin, Assistant Professor, Faculty of Technology, University of Novi Sad

Najsrdačnije se zahvaljujem mentoru Dr Jaroslavi Švarc-Gajić, docentu Tehnološkog fakulteta u Novom Sadu na velikoj pomoći pri izradi ovog rada. Na saradnji i pomoći se zahvaljujem gospodinu Saši Popov. Na moralnoj i svakoj drugoj pomoći i podršci zahvaljujem se svojoj porodici i Slobodanu.

SADRŽAJ
1. Uvod ................................................................................................................................ 1 2. Teorijski deo ................................................................................................................... 2 2.1. Atomska apsorpciona spektrofotometrija (AAS)..................................................... 2 2.1.1. Atomski apsorpcioni spektrofotometar ............................................................. 3 2.1.1.1. Svetlosni izvori .......................................................................................... 3 a. Šuplja katodna lampa ................................................................................... 3 b. Lampa sa električnim pražnjenjem .............................................................. 4 c. Kontinualni izvor .......................................................................................... 5 2.1.1.2. Elektrotermalni atomizeri .......................................................................... 6 a. Grafitni atomizer .......................................................................................... 7 2.1.1.3. Atomizacija u plamenu .............................................................................. 8 2.1.1.4. Modifikatori matriksa ................................................................................ 8 2.1.1.5. Smetnje u AAS .......................................................................................... 9 a. Hemijske smetnje ......................................................................................... 9 b. Fizičke smetnje........................................................................................... 10 c. Spektralne smetnje...................................................................................... 10 d. Jonizacione smetnje.................................................................................... 10 e. Smetnje usled apsorpcije pozadine............................................................. 10 2.1.1.6. Optimizacija uslova plamene atomizacije ............................................... 12 2.1.2. Hidridna tehnika.............................................................................................. 12 2.2. Metode razaranja uzorka ........................................................................................ 13 2.2.1. Suvi postupak razaranja organskog materijala ............................................... 14 2.2.2. Razaranje dejstvom koncentrovanih mineralnih kiselina ............................... 14 a. Razaranje u otvorenom sistemu.................................................................. 14 b. Razaranje u zatvorenom sudu .................................................................... 15 2.2.2.1. Razaranje mikrotalasima.......................................................................... 15 a. Razaranje potpomognuto mikrotalasima u otvorenom sistemu ................. 15 b. Razaranje potpomognuto mikrotalasima u zatvorenom sistemu................ 16 2.2.3. Razaranje UV-zracima .................................................................................... 16 2.2.4. Razvoj metode razaranja uzorka mikrotalasima u zatvorenom sudu.............. 17

2.3. Selen....................................................................................................................... 17 2.4. Metode određivanja selena .................................................................................... 19 3. Eksperimentalni deo...................................................................................................... 22 3.1. Aparatura i pribor................................................................................................... 22 3.2. Hemikalije i rastvori .............................................................................................. 23 3.3. Uzorci ..................................................................................................................... 23 3.4. Priprema uzorka ..................................................................................................... 24 4. Rezultati i diskusija ....................................................................................................... 25 4.1. Ispitivanje uticaja i odabir modifikatora ................................................................ 25 4.1.1. Linearnost ....................................................................................................... 25 4.1.2. Reproduktivnost .............................................................................................. 26 4.2. Granica detekcije ................................................................................................... 27 4.3. Određivanje selena u realnim uzorcima ................................................................. 28 5. Zaključak....................................................................................................................... 31 6. Literatura ....................................................................................................................... 32

1. UVOD
Poslednjih decenija određivanje selena privlači značajnu pažnju, pre svega zbog njegovog velikog biološkog značaja. Selen se u organizam unosi putem hrane i spada u mikroelemente koji su neophodni za normalno funkcionisanje ljudskog organizma. Količina selena koja se unosi u organizam zavisi od vrste hrane i tipa zemljišta na kojem se ta hrana uzgaja. Zbog velikog biološkog značaja selena razvijano je mnogo metoda za njegovo određivanje u prehrambenim proizvodima. Neke od tih tehnika uključuju: gasnu hromatografiju, elektrohemijsku striping analizu, atomsku apsorpcionu spektrofotometriju, nuklearnu magnetnu rezonancu, induktivno spregnutu plazmu-atomsku emisionu spektrofotometriju [1]. Pomenute tehnike se zasnivaju na različitim principima i svaka od njih ima prednosti, u odnosu na druge tehnike, ali i mane. Najznačajnije prednosti atomske apsorpcione spektrofotometrije u grafitnoj kiveti u odnosu na druge tehnike su: potrebna mala količina uzorka za analizu, niska granica detekcije, malo spektralnih smetnji nastalih usled preklapanja apsorpcione linije analita sa apsorpcionim linijama drugih prisutnih elemenata u rastvoru uzorka, kao i činjenica da je instrument veoma robustan [2]. Kako bi se uzorak uspešno analizirao njegova priprema se mora vršiti na adekvatan način. Različite tehnike zahtevaju različitu pripremu uzoraka. Neki od načina pripreme uzoraka u zavisnosti od analita, matriksa, uzorka i primenjene tehnike su: ekstrakcija, suvi postupak razaranja organskog materijala, razaranje UV-zračenjem, razaranje mikrotalasima [3]. Prednosti razaranja mikrotalasima u odnosu na druge načine pripreme su to što je potrebno kratko vreme za potpuno razaranje uzorka. Razaranjem u zatvorenom sudu izbegnuti su gubici analita usled isparavanja i smanjena je mogućnost kontaminacije. Elektronska kontrola postupka obezbeđuje veoma reproduktivne uslove razaranja a samim tim je smanjeno angažovanje čoveka. Cilj ovog rada je da se razvije brza, selektivna i reproduktivna metoda za određivanje selena u nekim prehrambenim proizvodima. U skladu sa tim biće ispitan i definisan uticaj različitih modifikatora na određivanje selena atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom u grafitnoj kiveti. Uzorci će biti pripremljeni razaranjem mikrotalasima u zatvorenom sudu. Metoda će biti primenjena za analizu prehrambenih proizvoda iz grupe testenina i čajnog peciva domaćih i stranih proizvođača.

1

2. TEORIJSKI DEO
2.1. Atomska apsorpciona spektrofotometrija (AAS)
Atomska apsorpcija je proces koji se dešava kada atom u osnovnom stanju apsorbuje energiju u obliku elektromagnetnog zračenja specifične talasne dužine, rezonantne talasne dužine, i biva preveden u ekscitovano stanje. Apsorpcioni spektar elementa sastoji se od serija rezonantnih linija koje nastaju kada element iz osnovnog elektronskog stanja pređe u različita ekscitovana stanja. Uglavnom je prelaz između osnovnog i prvog ekscitovanog stanja praćen linijom najjačeg intenziteta koja se najčešće koristi za određivanje elementa. Prelaz elementa iz osnovnog u ekscitovano stanje se dešava kada atomi u osnovnom energetskom stanju prime određeni iznos energije koji je proporcionalan frekvenciji njegovog prelaza do sledećeg energetskog nivoa. Pri tome se samo deo energije ukupnog zračenja izvora (P0 ) apsorbuje. Intenzitet propuštene svetlosti dat je sledećom formulom:
P = Po e − ( εl)

Gde je:
ε

- apsorpcioni koeficijent analita, - horizontalna putanja dužine zračenja kroz plamen.

l

Atomska apsorpcija se meri merenjem razlike ukupnog zračenja rezonantnih linija u prisustvu i odsustvu atoma analita. Širina emitovane linije svetlosnog izvora mora biti reda veličine apsorpcione linije analita. Ovaj zahtev izvora svetlosti ispunjava cev sa šupljom katodom o kojoj će u daljem tekstu biti više reči. Količina apsorbovane energije iz snopa zračenja na talasnoj dužini rezonantne linije će zavisiti od količine atoma u osnovnom energetskom stanju. Odnos između količine apsorbovane energije i koncentracije ispitivanog elementa se može odrediti pomoću serije standardnih rastvora. Nepoznate koncentracije elementa u uzorcima se određuju upoređivanjem količine zračenja koje apsorbuju uzorci prema zračenju apsorbovanom od strane standardnih rastvora pri istim uslovima atomizacije. Savremeni softveri instrumenata automatski izračunavaju koncentraciju određivanog elementa u uzorku. 2

Tehnika AAS omogućava prilično osetljivo određivanje većine elemenata. Tako se npr. atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom u grafitnoj kiveti bor može odrediti sa osetljivošću od 43 µg / l , kadmijum i kalijum sa osetljivošću od 0,02 µg / l a magnezijum sa osetljivošću od 0,01 µg / l [1]. 2.1.1. Atomski apsorpcioni spektrofotometar Atomski apsorpcioni spektrofotometar se sastoji iz četiri osnovna dela: emisionog, apsorpcionog, selekcionog i mernog dela. Uloga emisionog dela je da obezbedi izvor zračenja rezonantne talasne dužine. Apsorpcioni deo je najvažniji deo aparata i ima zadatak da stvara atome elementa u osnovnom stanju. U zavisnosti od načina atomizacije, ovi aparati se mogu podeliti u dve grupe: plamene i besplamene [4]. Kod besplamenih instrumenata atomizacija se može vršiti laserskim zracima, pomoću električnog luka u grafitnim kivetama ili katodnim isparavanjem. Selekcioni deo, monohromator, ima ulogu da iz snopa svetlosnih zraka izdvoji uži snop zraka. Kod ovih instrumenata uloga monohromatora je svedena na minimum jer izvor zračenja obezbeđuje monohromatsko zračenje. Merni deo može biti fotoćelija ili fotomultiplikator. Moderni aparati imaju mogućnost biranja talasne dužine preko prekidača ili tastature. Instrumentom se veoma jednostavno upravlja pomoću softvera integrisanog u instrument. Softver u sebi sadrži prozore i padajuće menije koji korisniku pokazuju sve mogućnosti aparature i omogućavaju da se na jednostavan način odaberu željeni uslovi analize. Ovakav način upravljanja instrumentom korisniku dozvoljava da prati napredak bilo koje automatske sekvence uključujući detalje metoda, signalnu grafiku, kalibraciju, izmerene parametre rastvora u momentu posmatranja kako u toku analize tako i po njenom završetku, a moguće je i paralelno štampanje izveštaja. 2.1.1.1. Svetlosni izvori Svetlosni izvori u atomskom apsorpcionom spektrofotometru treba da obezbede monohromatsko zračenje rezonantne talasne dužine. Najčešće korišćeni izvor svetlosti je šuplja katodna lampa i lampa sa električnim pražnjenjem. Kontinualni izvori zračenja su novijeg datuma ali će na ovom mestu i o njima biti reči. a. Šuplja katodna lampa

Šuplja katodna lampa je najčešće korišćen izvor zračenja u atomskoj apsorpcionoj spektrofotometriji. Njeni osnovni delovi su anoda, katoda i stakleni ili kvarcni izlazni prozor, koji su zatvoreni u Pyrex cilindar [5] napunjen inertnim gasom (argon ili neon) pod pritiskom od 4-10 torr (1/760 atm=1 torr). Neonski gas obezbeđuje veći intenzitet emitovanih elementovih linija. Neon se kao inertni gas koristi samo kada neonska emisiona linija leži u blizini rezonantne linije katodnog elementa. Anodna žica se najčešće pozicionira duž cilindrične katode. Katoda je izgrađena u vidu šupljeg cilindra prevučenog elementom čiji spektar treba proizvesti, ili u nekim slučajevima, legure pažljivo odabrane mešavine metala koje spektralno ne interferiraju. Zaštitni omotač (neprovodan) oko spoljašnjosti katode odmah iza oboda sprečava neželjena pražnjenja 3

oko spoljašnjosti katode. Izvori zračenja se u glavnom zagrevaju strujama do 30 mA. Šematski prikaz šuplje katodne lampe sa svim njenim delovima prikazan je na slici 1.

Slika 1 - Šuplja katodna lampa

Šuplje katodne lampe emituju svetlost prolazeći kroz nekoliko faza. Saopštavanjem potencijala između anode i katode gasno punjenje se jonizuje. Pozitivno naelektrisani joni se sudaraju sa negativno naelektrisanom katodom. Atomi metala se nakon izbijanja iz katode dalje ekscituju preko sudara sa jonizovanim gasom emitujući svetlost specifične talasne dužine za taj element prilikom vraćanja iz ekscitovanog u osnovno atomsko stanje. Pošto katoda lampi sadrži jedan element određivanje svakog pojedinačnog elementa zahteva posebnu lampu. Ovo predstavlja osnovni nedostatak šupljih katodnih lampi. Komercijalne lampe su dostupne za 65 pojedinačnih elemenata, ali je dostupno i 20 multielementnih lampi [5]. Lampe za pojedinačne elemente izrađene su za neke metale: Cs, Ln, Os, Th, U, za radioaktivne elemente, plemenite gasove, dok su lampe za halogene, C, N, O i S nedostupne. Male širine emisionih linija šupljih katodnih lampi obezbeđuju visoku selektivnost određivanja iako, u zavisnosti od elementa, može doći do preklapanja apsorpcionih linija različitih elemenata. Spektralna interferencija se može desiti kada različiti atomi apsorbuju energiju na talasnim dužinama koje se razlikuju za 0,05 nm i manje. Spektralna preklapanja se jedino mogu prevazići uklanjanjem interferentnog elementa ili, ako je moguće, izvođenjem određivanja na drugoj apsorpcionoj liniji. b. Lampa sa električnim pražnjenjem

Lampa sa električnim pražnjenjem (electrodeless discharge lamp - EDL) se sastoji od elementa ili soli elementa smeštenih u kvarcnu cev ispunjenu atmosferom inertnog gasa. Kvarcna cev se nalazi u keramičkom cilindru na koji je namotan radiofrekventni kalem. Kada se primeni radiofrekventno polje dovoljne jačine, inertni gas se jonizuje i udružena energija izaziva isparavanje elementa i ekscitovanje atoma unutar cevi, što rezultira emisijom karakterističnog spektra. U većini instrumenata EDL i njeno postolje često su lako zamenljivi sa šupljom katodnom lampom. Šematski prikaz lampe sa električnim pražnjenjem dat je na slici 2. 4

Slika 2 – Lampa sa električnim pražnjenjem

U poređenju sa šupljom katodnom lampom EDL izvori obezbeđuju veći intenzitet zračenja a samim tim i veću osetljivost određivanja. Ovi izvori nude veću preciznost a njihova primena se preporučuje za analize u kojima je velik intenzitet šuma posledica slabe katodne emisije. Izvori ovog tipa su dostupni za sledeće elemente: As, Bi, Cd, Cs, G, Hg, K, P, Pb, Rb, Sb, Se, T, Ti, Tl, Zn [5]. c. Kontinualni izvor

Kontinualni izvori zračenja u AAS su savremeni izvori koji još uvek nemaju široku primenu. Ovi savremeni izvori zračenja omogućavaju određivanje velikog broja elemenata, što predstavlja značajnu prednost u odnosu na klasične katodne lampe koje se koriste uglavnom za po jedan element. Odgovarajuća selektivnost se postiže primenom uz kontinualni izvor čak i do dva-tri savremena monohromatora dobijena fotolitografskim postupkom. Izdvajanje trake elektromagnetnog zračenja reda veličine atomske apsorpcione linije je postignuto sa najmanje dva monohromatora. Izuzetne selektivnosti, a velik intenzitet upadnog zraka se postiže specifičnom konstrukcijom ksenonskih lampi. Postoji tri vrste ksenonskih lampi [6]: 1. kontinualne ksenonske lampe kratkog električnog luka (xenon short-arc lamps) 2. kontinualne ksenonske lampe dugog električnog luka (xenon long-arc lamps) 3. ksenonske blic lampe (xenon flash lamps) Osnovna konstrukcija svih tipova lampi je ista. Lampa se sastoji od balona izrađenog od stakla ili kvarca sa elektrodama od volframa na svakom kraju. U staklenom balonu je vazduh zamenjen ksenonom. Veoma mali luk između elektroda omogućava da se svetlost veoma tačno usmerava iz lampe. Izgled ksenonske lampe prikazan je na slici 3.

5

Slika 3 - Ksenonska lampa

U AAS tehnikama se koristi prvi tip ksenonskih lampi, kratkog električnog luka. Omotač lampe je izrađen od kvarca a elektrode od volframa su impregnirane torijumom. Kvarc je jedino ekonomično rešenje za izradnju omotača jer podnosi visok pritisak (25 atm) i visoku temperaturu a pri tom ostaje optički proziran. Torijum u elektrodama u velikoj meri poboljšava emisiju elektrona sa elektroda. Kvarc i volfram imaju različite koeficijente toplotnog širenja, pa se elektrode od volframa obmotavaju trakama čistog molibdena ili legure gvožđa i nikla (invar), koje imaju nizak koeficijent toplotnog širenja, i zatim se utope u kvarc kako bi se obezbedilo idealno zaptivanje. Postoje dve modifikacije ksenonske lampe kratkog električnog luka: lampa sa čistim ksenonom i mešavinom koja sadrži male količine žive. U čistoj ksenonskoj lampi najveći deo svetlosti se stvara unutar malenog oblaka plazme, veličine glave čiode, koji se nalazi u blizini vrha katode. Oblak je oblika kupe i intenzitet emitovane svetlosti eksponencijalno slabi približavanjem anodi. Elektroni posle prolaska kroz oblak plazme udaraju u anodu prouzrokujući njeno zagrevanje. Iz tih razloga anoda mora da bude ili veća od katode ili da se hladi vodom. Ove lampe daju spektar koji je veoma blizak sunčevoj svetlosti. U ksenon-živa lampama svetlost koja se emituje se nalazi u malom oblaku plazme na vrhu obe elektrode, veličine glave čiode. Oblik ovih oblaka je kao dve presecajuće kupe i intenzitet emitovane svetlosti eksponencijalno opada ka vrhu svake kupe. Ove lampe emituju belo-plavičast spektar i izuzetno snažnu emisiju u UV oblasti. Pored primene u analitici, ove lampe se koriste još i u medicini, za sterilizaciju predmeta i stvaranje ozona. Kako bi se postigla maksimalna efikasnost ksenonskih lampi, ksenon se unutar nje nalazi pod velikim pritiskom (do 300 atm) što nosi sa sobom određene faktore rizika kao što je opasnost od pucanja lampe. Čak pod ovako visokim pritiskom nedostatak ovih lampi predstavljaju snažne emisione linije u infracrvenoj oblasti spektra, oko 850-900 nm, koje mogu činiti i do 10 % ukupne emitovane svetlosti. 2.1.1.2. Elektrotermalni atomizeri Elektrotermalna atomizacija se najčešće izvodi električnim lukom u grafitnoj kiveti iako se može izvesti i laserskim zracima ili katodnim isparavanjem. Elektrotermalni (bezplameni) atomizeri nude nekoliko značajnih prednosti u odnosu na plamenu AAS: 1. Potrebne su male količine uzorka, 10−8 − 10−11 g čvrstog ili 5-100 µ l tečnog 6

2. čvrste materije se mogu analizirati direktno, često bez posebne pripreme, 3. pozadinski šum je veoma mali, i 4. osetljivost se povećava zato što je proizvodnja slobodnih atoma analita efikasnija u poređenju sa atomizacijom u plamenu. Sa druge strane, komponente matriksa često mogu izazvati velike smetnje, i preciznost, tipično 5-10 % (izraženo kao relativna standardna devijacija), ide u prilog plamenoj AAS. Prilikom atomizacije analita besplamenim postupkom zagrevanje grafitne kivete se izvodi postepeno, po fazama, kako bi se izveli sledeći koraci: sušenje, spaljivanje, i atomizacija. 1. U ciklusu sušenja uzorak se zagreva 20-30 s na 110 ° C da bi se ispario sav rastvarač i isparljive komponente matriksa. 2. Korak spaljivanja se izvodi pri umereno visokoj temperaturi ( ∼ 500 ° C) da bi se komponente matriksa visoke tačke ključanja isparile (masti i ulja) i organski deo matriksa spalio. U ovom koraku može doći do gubitka analita ukoliko se analit predugo drži na toj temperaturi ili ako je temperatura spaljivanja previsoka. 3. U atomizacionom koraku primenjuje se maksimalna snaga zagrevanja da bi se temperatura kivete podigla do odabrane atomizacione temperature ili maksimalne temperature kivete. Prisutni analit se ispari i razloži do slobodnih atoma koji će apsorbovati svetlost iz AAS izvora. Poželjno je brzo merenje apsorpcionog signala u ovoj fazi. a. Grafitni atomizer

Grafitni atomizer se sastoji iz šupljeg grafitnog cilindra 28 mm dugačkog i 8 mm u prečniku, unutrašnjosti prevučene pirolitičkim grafitom. Ranije je uobičajena konstrukcija podrazumevala da je otvor kivete za unošenje uzorka bio okrenut na dole da bi se povećala temperatura na tom mestu ili su se kivete sužavale ka sredini kako bi se oblikovale po optičkom zraku i povećala gustina slobodnih atoma u njihovom središtu. Moderne kivete nemaju ni jednu od ovih konstrukcija. Grafitna kiveta se nalazi između dve elektrode postavljene u liniji sa svetlosnim izvorom. Dve najveće mane grafita su njegova poroznost i tendencija ka obrazovanju karbida. Ove mane se delimično mogu prevazići presvlačenjem kivete pirolitičkim grafitom koji je daleko manje porozan. Neki proizvođači proizvode cele kivete od pirolitičkog grafita. Staklasti ugljenik se takođe može koristiti za izgradnju kiveta, ali to nije čest slučaj. Grafitna kiveta se zagreva pomoću struje niskog napona (obično 10 V) i velike jačine (do 500 A) koji se reguliše potenciometrom. Zagrevanje treba da je veoma brzo kako bi se za kratko vreme dostigle visoke temperature (2500 °C ). Atomizer se hladi vodom kako bi se postigao brz povratak na niže temperature. Pri izboru temperature atomizacije treba voditi računa o tome da temperatura ne bude previše visoka kako se ne bi nepotrebno oštetila kiveta, ali ne sme biti ni previše niska da se ne izgubi na osetljivosti određivanja. Grafitni atomizeri pružaju mogućnost analize tečnih i čvrstih uzoraka. Tečni uzorci se u grafitnu kivetu uvode pomoću mikrošprica kroz mali otvor na sredini kivete. Inertni gas, često argon, se u kivetu uvodi sa oba kraja i izlazi kroz prolaz kroz koji se uvodi uzorak. Tok inertnog gasa otklanja otparene komponente matriksa i sprečava oksidaciju grafitne kivete u procesu zagrevanja. U atomizacionom koraku se tog inertnog gasa isključuje. Čvrsti uzorci se mogu 7

postaviti u kivetu korišćenjem posebnih grafitnih čamčića. Korak uvođenja uzorka može biti izvor zagađenja pa je poželjno koristiti autouzorkivač. 2.1.1.3. Atomizacija u plamenu Plamena AAS je 60-tih i 70-ih godina 20. veka bila najčešće korišćena tehnika za analizu metalnih tragova. Pojavom drugih tehnika kao što su ICP-MS, ICP-AES, nuklearna magnetna rezonanca i dr. njena upotreba je smanjena, ali ne i potisnuta [7]. Primenjuje se kada je uzorak tečan ili se lako prevodi u tečno stanje. Tečni uzorci se tankom cevčicom uvode u plamen. Pri prolasku analita kroz plamen odigravaju se sedeći procesi: 1. isparavanje rastvarača: voda ili drugi rastvarač isparavaju ostavljajući sitne čestice suve soli elementa; 2. sublimacija nastalih čestica: na visokoj temperaturi plamena suva so prelazi u gasno stanje; 3. disocijacija molekula: deo ili svi molekuli disociraju oslobađajući atome u osnovnom stanju. U plamenoj AAS jedan od najčešćih uzroka smetnji predstavlja reakcija nastalih atoma elementa sa radikalima ili atomima koji potiču od plamenih gasova. Čest je slučaj da atomi određivanog elementa reaguju sa hidroksilnim radikalima ili atomskim kiseonikom iz plamena pri čemu nastaju oksidi, hidroksidi ili hidridi metala. Tako nastali molekuli takođe se mogu ekscitovati u plamenu emitujući elektromagnetno zračenje i time prouzrokujući značajne smetnje. 2.1.1.4. Modifikatori matriksa Modifikatori matriksa su hemijska jedinjenja koja se dodaju rastvoru uzorka kako bi se analit lakše izdvojio iz matriksa oslobađajući ga od drugih jedinjenja prisutnih u matriksu koja mogu izazvati interferencije. Ovo se može postići na dva načina. Prvi način je da se dodatkom hemikalije snizi temperatura isparavanja matriksa i tako ubrza njegovo otklanjanje. Primeri ovih reagensa su amonijum-nitrat, azotna kiselina, kiseonik ili vazduh. Pomenuti gasovi se često koriste pri analizi bioloških uzoraka. Gasovi potpomažu sagorevanje organskog matriksa oslobađajući analit. Veliki broj modifikatora matriksa su namenjeni termalnoj stabilizaciji analita, smanjujući njegovu isparljivost i time omogućavajući više temperature spaljivanja bez gubitka analita. Na ovaj način se može ukloniti veća količina matriksa omogućavajući određivanje analita sa manje interferencije. Primeri modifikatora ovog tipa uključuju neke prelazne metalne jone, npr. Ni, Pd koji obrazuju stabilna jedinjenja sa analitom. Organske kiseline kao što su askorbinska, limunska ili oksalna se takođe mogu koristiti u ovu svrhu. Često se koristi i kombinacija modifikatora. Jedna od uobičajenih kombinacija je Mg i Pd-nitrat. Ova kombinacija se koristi u velikom broju analiza pa se može označiti i kao univerzalni modifikator matriksa. Koncentracija modifikatora je bitan parametar i zahteva pažljivu istragu u razvijanju metoda.

8

2.1.1.5. Smetnje u AAS AAS spada u relativne metode kod kojih se pomoću rastvora poznate koncentracije definiše zavisnost apsorbancije od koncentracije analita. Na osnovu definisane zavisnosti i dobijenog kalibracionog dijagrama merenjem apsorbancije uzorka određuje se nepoznata koncentracija analita u uzorku. Standardni rastvori i rastvori uzorka mogu biti različitog hemijskog sastava pa nastaju različite greške. To rezultuje time da se pri istoj koncentraciji analita u standardnom i rastvoru uzorka atomizacijom dobije različit broj atoma u osnovnom stanju koji su sposobni za apsorpciju. Smetnje koje nastaju u AAS mogu se podeliti u pet osnovnih grupa [4]: 1. hemijske smetnje 2. fizičke smetnje 3. spektralne smetnje 4. jonizacione smetnje 5. smetnje usled apsorpcije pozadine. a. Hemijske smetnje

Hemijske smetnje predstavljaju najveći izvor problema u AAS. One mogu nastati kada ispitivani element obrazuje hemijsku vezu sa drugim atomima ili radikalima prisutnim u plamenu što onemogućava da se ukupna količina analita atomizuje i tako nastaje greška u određivanju. Još jedan način nastajanja ovih smetnji je kada u plamenu nastaju teško isparljive soli koje ne disociraju u potpunosti pa se ne prevede ukupna količina elementa u atomsko stanje već jedan njen deo ostaje u vezanom obliku. Ove smetnje se mogu umanjiti ili izbeći na više načina. Jedan od načina je korišćenje plamena više temperature ili korišćenje plamena pogodnijeg hemijskog sastava. Drugi način smanjenja hemijskih smetnji je dodatak pogodnog katjona ili anjona koji će vezati druge anjone i katjone koji mogu reagovati sa ispitivanim elementom i na taj način se ispitivani element „oslobađa“ i može se u celokupnoj količini atomizovati u plamenu. Dakle, ako anjoni izazivaju smetnju dodaje se odgovarajući katjon i obrnuto. To su takozvani „oslobađajući reagensi“ [4, 8]. Ovi reagensi se dodaju i u standardne rastvore iako u njima nema katjona ili anjona koji izazivaju smetnje. Oslobađanje analita od drugih atoma prisutnih u rastvoru se može vršiti na veoma jednostavan način tečno-tečnom ekstrakcijom [8]. Često je dovoljno da se prostom jednostrukom ekstrakcijom izdvoji najveći deo interferirajućeg jedinjenja tako da smetnje koje proizvodi budu zanemarljive. Ukoliko je potrebno ukloniti svu količinu elementa koji stvara smetnje, ekstrakcija se može ponoviti više puta. Još jedan od načina uklanjanja hemijskih smetnji je izjednačavanje sastava rastvora matriksa i standardnih rastvora. Ovo je moguće samo ukoliko je sastav matriksa jednostavan. Hemijske smetnje je moguće umanjiti i vezivanjem ispitivanog elementa u kompleksno jedinjenje koje će u plamenu lako disocirati. U rastvoru je, dakle, ispitivani element zaštićen kompleksirajućim agensom i onemogućena je njegova reakcija sa drugim atomskim vrstama. Po 9

dostizanju u plamen, kompleksno jedinjenje lako disocira stvarajući na taj način atome u osnovnom stanju. Kao kompleksirajući agens se može koristiti npr. EDTA. b. Fizičke smetnje

Fizičke smetnje mogu nastati usled različitih fizičkih osobina standardnih rastvora i rastvora uzorka. Fizičke osobine ovih rastvora koje se mogu razlikovati su viskoznost, površinski napon, gustina rastvora, isparljivost rastvarača koji se koristi za pripremu rastvora uzorka. Fizičke smetnje su često kombinovane sa hemijskim smetnjama a mogu ih izazvati različite organske i neorganske materije. Efekti ovih smetnji su smanjenje brzine raspršivanja i povećanje veličine raspršenih kapljica. Različite organske materije mogu izazvati redukcioni efekat u plamenu jer se povećava broj ugljeničnih radikala u plamenu. Različita organska jedinjenja takođe mogu uticati i na temperaturu plamena a mogu proizvesti i tipične hemijske smetnje stvaranjem organskih jedinjenja sa metalima. c. Spektralne smetnje

Spektralne smetnje nastaju kada dva elementa apsorbuju energiju na istoj talasnoj dužini. Talasne dužine na kojima pojedini elementi apsorbuju svetlost su dobro definisane. Primenom šupljih katodnih lampi koje emituju zračenje tačno određene talasne dužine spektralne smetnje su svedene na minimum. d. Jonizacione smetnje

Na visokim temperaturama dolazi do značajne jonizacije atoma većeg broja metala, naročito onih atoma koji imaju niže jonizacione potencijale. Jonizovani atomi ne apsorbuju elektromagnetno zračenje rezonantne talasne dužine. Jonizacija se dešava u plamenu viših temperatura. Da bi se ona sprečila preporučuje se dodatak jonizacionog pufera u rastvor ispitivanog uzorka. Kao jonizacioni pufer se koristi element koji ima niži jonizacioni potencijal. To mora biti element koji neće interferirati spektralnim linijama ispitivanog elementa. Često se u tu svrhu rastvorima dodaju elementi kao što su K, Cs, ili Cr u približno 100 puta većoj koncentraciji. Elementi koji služe kao jonizacioni puferi će jonizovati na nižim temperaturama nego ispitivani element povećavajući na taj način koncentraciju elektrona u plamenu čime će biti suzbijena jonizacija ispitivanog elementa. Jonizacione pufere je pogodno koristiti kada se radi sa uzorcima u kojima se određuj lako-jonizujući alkalni i zemnoalkalni metali. e. Smetnje usled apsorpcije pozadine

Jedan od najznačajnijih tipova smetnji u AAS predstavlja pozadinska apsorpcija. Pozadinska apsorpcija je odgovorna za smanjenje intenziteta upadnog zračenja do kojeg dolazi usled rasipanja svetlosti na tečnim i čvrstim česticama prisutnim u plamenu i usled apsorpcije od strane molekula ili radikala u plamenu. Ovi efekti se mogu kompenzovati uz pomoć UV lampi, magnetnim poljem ili primenom velikih naponskih impulsa. Jedan od najjednostavnijih načina pozadinske korekcije podrazumeva primenu deuterijumske lampe ukoliko se određuju elementi sa rezonantnom talasnom dužinom u opsegu od 180-350 nm, odnosno volfram halidnu lampu za elemente sa rezonantnom talasnom dužinom 10

u opsegu od 350-800 nm. Halidi su dvokomponentna hemijska jedinjenja koja se sastoje od halogenog elementa (flor, hlor, brom, jod) i elementa ili radikala koji je manje elektronegativnosti od halogena. Pri emisiji iz linijskog izvora zračenja kao što je šuplja katodna lampa mereni signal odgovara atomskoj apsorpciji, apsorpciji molekulskih vrsta i čestičnog rasipanja. Čestična rasipanja mogu se označiti kao nespecifična apsorpcija. Kada se koristi kontinualni izvor, npr. deuterijumska lampa, količina atomske apsorpcije od strane ispitivanog analita je zanemarljiva dok je količina nespecifične apsorpcije jednaka kao u slučaju korišćenja linijskog izvora. Greška usled pozadinske apsorpcije se uklanja oduzimanjem signala merenog pri korišćenju kontinualnog izvora od signala merenog pri korišćenju linijskog izvora. Razvijene su i drugi načini pozadinske korekcije. Jedna od njih je sistem korekcije apsorpcije pozadine Zeeman-ovim efektom. Atomska spektralna linija se u prisustvu snažnog magnetnog polja može podeliti na tri komponente bliskih talasnih dužina. Magnetno polje se može primeniti na više načina. Može se primeniti na izvor ili na same atome u transferzalnoj (magnetno polje i zrak su pod uglom od 90 ° ) i longitudalnoj (paralelni su) konfiguraciji. U najprostijem obliku transferzalnog Zeeman-ovog efekta atomska apsorpciona linija se pojavljuje kao trokomponentna. π komponenta je smeštena na talasnoj dužini linije koju koristimo u određivanju, σ+ i σ− komponente su smeštene na podjednakoj razdaljini sa obe strane osnovne apsorpcione linije. σ komponente su linearno polarizovane normalno na magnetno polje. Ako je polje dovoljne jačine ove komponente će ležati van atomskog apsorpcionog domena. Pri korekciji pozadinske apsorpcije ovim postupkom primenjuje se magnetno polje frekvencije ~ 5060 Hz. Svaki ciklus merenja se sastoji od dve faze. U jednoj fazi je magnet isključen a u drugoj uključen. Kada je magnet isključen meri se i atomska i pozadinska apsorpcija. Kada je magnet uključen, atomske apsorpcione linije su podeljene i dve σ komponente ne uključuju atomsku apsorpciju ali sadrže pozadinsku apsorpciju. Atomski signal se, dakle, može dobiti oduzimanjem signala kada je magnet uključen od signala kada je magnet isključen. Još jedna vrsta sistema pozadinske apsorpcije razvijena je od strane Smith-a i Hiefste-a. Ova tehnika je korisna kada postoje snažne molekulske interferencije. Napajanjem šuplje katodne lampe jednosmernom strujom mereni signal će poticati i od atomske i od molekulske apsorpcije. Ako se lampa pulsira periodično na mnogo jače struje sprečene su praktično sve atomske apsorpcije dok molekularne apsorpcije ostaju nepromenjene. Prostim oduzimanjem ova dva signala dobija se signal atomske apsorpcije. Ovaj metod korekcije negativno utiče na životni vek šuplje katodne lampe u odnosu na druge metode korekcije. Pozadinska apsorpcija samog plamena potiče od vodonikovih molekula, OH radikala i delimično sagorelih molekula gorućeg gasa i rastvarača. Ove vrste, zajedno sa oksidima i hidroksidima metala sačinjavaju pozadinu plamena čija se korekcija može izvršiti na dva načina: metodom skeniranja i modulacijom talasne dužine. Metoda skeniranja podrazumeva merenje apsorbancije na talasnim dužinama nešto većim i manjim u odnosu na apsorpcionu liniju elementa. Talasna dužina se podešava tako da se izmeri pozadinska apsorpcija na višoj pa zatim na nižoj talasnoj dužini i te vrednosti se oduzmu od čitanja apsorpcione linije analita sa pozadinom. Modulacija talasne dužine se može postići korišćenjem oscilatornog refraktornog tanjira, vibrirajućeg ili rotirajućeg ogledala i oscilirajućih slitova. Sistem se postavlja pre ulaznog slita (proreza) ili pre izlaznog slita monohromatora. Optički snop zraka refraktuje se i prouzrokuje male oscilatorne pomeraje svetlosnog snopa koji napušta monohromator. Analitova linija, linija pozadine i susedne pozadine se mere naizmenično i njihovi signali se oduzmu. 11

2.1.1.6. Optimizacija uslova plamene atomizacije U radu sa plamenim AAS potrebno je obratiti pažnju na neke karakteristike plamena kao što su temperatura, brzina sagorevanja, profil plamena i reakciona zona plamena. U plamenoj AAS rastvor uzorka se u plamen uvodi kao aerosol. Za ove tehnike veoma je bitan hemijski sastav gasa koji se koristi za sagorevanje. Neke mešavine gasova koje se koriste su acetilen/vazduh, azot-suboksid/acetilen, acetilen/kiseonik. Veoma su bitne oksidacionoredukcione osobine plamena kao i odnos pojedinih gasova u smeši. Od ovog odnosa, gorivooksidant zavisi tačna temperatura plamena i generalno je najveća za stehiometrijske mešavine [5]. Acetilen/vazduh je najčešće korišćen plamen, stabilan je, lak za korišćenje i omogućava dovoljnu atomizaciju analita u plamenu oslobađajući ga od interferencije mnogih elemenata i time omogućavajući dobru osetljivost određivanja. Što je plamen bogatiji gorivom ima jača redukciona svojstva i poboljšava atomizaciju elementa ali se paralelno sa povećanjem redukcionog svojstva temperatura plamena smanjuje. Plamen azot-suboksid/acetilen ima visoku temperaturu i ima redukciona svojstva. Njegova visoka temperatura doprinosi efikasnoj disocijaciji analita. Elementi koji se najbolje određuju u ovom plamenu su: Al, B, Ba, Be, Mo, Si, Ta, V, W, Zr, lantanidi i aktinidi. Sa ovim plamenom se mora raditi pažljivo vodeći računa da se talog ugljenika ne gomila u plameniku. Za bilo koju smešu gorućih gasova mora se voditi računa o brzini sagorevanja plamena. Ako njegova brzina premašuje približno 40 cm3 / s može se desiti da se plamen uvuče u komoru u kojoj se nalazi mešavina gorućih gasova što može dovesti do eksplozije. Kada se koristi acetilen/azot-suboksid plamen, prvo treba pustiti vazduh, zatim upaliti acetilen/vazduh plamen i potom treba postepeno nadvladati tok vazduha tokom azot-suboksida sve dok plamen ne pokaže karakterističnu crvenkastu boju u središnjoj zoni plamena. Ovaj redosled treba obrnuti kada se gasi plamen. Moderni aparati imaju sposobnost da ove operacije izvedu automatski. Pored brzine sagorevanja plamena, veoma je bitno u kom delu plamena će se desiti atomizacija analita. Najefikasnija atomizacija se dešava u središnjoj, reakcionoj zoni plamena, tj. plavom delu plamena. Stoga je potrebno podesiti visinu plamenika, tako da se središnja zona plamena nalazi u optičkoj osi instrumenta. Visina plamenika se podešava ručno pomoću zavrtnja ili automatski u modernim instrumentima 2.1.2. Hidridna tehnika Pri određivanju nekih elemenata pomoću AAS, npr. As i Se, javljaju se određene poteškoće zato što su na rezonantnim talasnim dužinama ovih elemenata interferencije znatno izražene s obzirom da su one u UV oblasti. Plamena AAS nije pogodna za određivanje ovih elemenata u tragovima. Značajnom povećanju selektivnosti doprinosi prevođenje ovih elemenata u hidride. Generisani lako isparljivi hidridi se izdvajaju iz matriksa uzorka čime su interferencije znatno smanjene a osetljivost znatno povećana. Postupak generisanja hidrida je prikazan na slici 4.

12

Slika 4 – Generisanje gasovitog hidrida analita

Hidridi se formiraju u reakcionoj komori. U reakcionu komoru se uvodi kiselina, HCl, koja zakišeljava uzorak a potom se redukcija vrši uvođenjem NaBH 4 stabilizovanog sa NaOH. Obrazovani hidridi se izdvajaju iz rastvora tokom gasa nosača i dovode do kvarcne kivete koja se zagreva izazivajući raspad obrazovanog hidrida elementa do atoma u osnovnom stanju. Iako povećava osetljivost određivanja, ova tehnika je ipak sklona određenom broju sistematskih grešaka. Uz generisanje hidrida istovremeno nastaje i višak vodonika koji može izazivati smetnje. Još jedan vid grešaka u određivanju se može javiti ukoliko se analit u rastvoru nalazi u različitim oksidacionim stanjima čija je efikasnost redukcije sa NaBH 4 različita. U tom slučaju, pri određivanju se neće određivati ukupna koncentracija ispitivanog elementa već samo jedan njen deo. U slučaju selena Se(VI) se ne redukuje lako sa NaBH 4 kao što je to slučaj sa Se(IV). Stoga se pre operacije generisanja hidrida selena, sav selen mora prevesti u Se(IV) kako bi se pri određivanju odredila ukupna koncentracija prisutnog selena. Iz prethodnog se može videti da je veoma bitno da elementi koji grade hidride moraju biti u tačno definisanom valentnom stanju što zahteva prethodnu pripremu uzorka. Pri određivanju selena bi to bila prethodna redukcija Se(VI) u Se(IV) koja se može vršiti ključanjem u HCl. Prevođenje svog prisutnog analita u jedno oksidaciono stanje je neophodno jer se za različita oksidaciona stanja istog elementa postižu različite analitičke osetljivosti i javljaju se različite interferencije pri njihovom određivanju.

2.2. Metode razaranja uzorka
Većini analitičkih tehnika prethodi priprema uzorka koja može biti veoma složena u zavisnosti od analita i matriksa uzorka. Tokom pripreme uzoraka mora se voditi računa da ne dođe do njihove kontaminacije. Instrumentalne metode često zahtevaju da analit koji se određuje bude oslobođen matriksa što se može postići nekom od metoda razaranja ili ekstrakcije uzorka od kojih su najčešće primenjivani: suvi postupak razaranja organskog materijala, razaranje uz 13

dejstvo mikrotalasa, razaranje dejstvom koncentrovanih mineralnih kiselina i razaranje UVzračenjem. Postupci ekstrakcije novijeg datuma uključuju ubrzanu ekstrakciju dejstvom rastvarača na povišenim temperaturama i pritiscima (ASE – Accelerated Solvent Extraction), ekstrakciju fluidima u super- i subkritičnom stanju, ekstrakciju potpomognutu ultrazvukom, ekstrakciju u električnom polju (PEF- Pulsed Electric Field) i dr. 2.2.1. Suvi postupak razaranja organskog materijala Ova metoda se koristi za razaranje uzoraka koji sadrže veliku količinu organske materije. Pogodna je kada se određuju tragovi neisparljivih metala. Ova metoda je veoma jednostavna i podrazumeva spaljivanje i žarenje uzorka u odgovarajućim vatrostalnim posudama koje su najčešće izrađene od porculana ili platine [9]. Uzorak se prvo spaljuje na plameniku dok se ne izdvoje svi gasoviti produkti spaljivanja a potom se stavlja u peć za žarenje. Spaljivanje se može vršiti bez ili sa dodatkom reagensa, ukoliko je to potrebno. Reagensi kao što su sumporna ili azotna kiselina se dodaju da bi se izvršilo završno razaranje, omogućila bolja rastvorljivost ostatka u drugim kiselinama i sprečilo isparavanje lako isparljivih hlorida metala. Žarenje se može vršiti na atmosferskom pritisku ili na povišenom pritisku u atmosferi kiseonika. Ovaj postupak je pogodan za pripremu uzoraka u kojima se određuju elementi kao što su Fe, K, Ca, Mg, Mn prisutni u hrani u značajnim količinama [9]. Takođe se ova metoda može koristiti za pripremu uzoraka u kojima se određuju elementi u tragovima kao što su Zn, Co, Cr, Mo, Ba i Fe [10]. Nedostaci ove metode su: moguć gubitak metala usled njihovog isparavanja, kontaminacija uzorka iz vazduha i adsorpcije metala na zidovima suda. 2.2.2. Razaranje dejstvom koncentrovanih mineralnih kiselina Razaranje koncentrovanim mineralnim kiselinama se može vršiti u otvorenim i zatvorenim sistemima. a. Razaranje u otvorenom sistemu

Ovo je jedna od najstarijih i najčešće korišćenih tehnika za razaranje organskih i neorganskih uzoraka. Glavna prednost u odnosu na suvo spaljivanje je njena brzina, mada je ograničena niskom temperaturom ključanja kiseline ili mešavine kiselina koje se koriste na atmosferskom pritisku. Često oksidaciona moć azotne kiseline nije dovoljna na temperaturi od 122°C, koja odgovara njenoj tački ključanja na atmosferskom pritisku, pa se dodatkom sumporne kiseline poveća tačka ključanja smeše i pojačava oksidaciona moć [11]. U praksi se najčešće koristi smeša kiselina, a sastav smeše zavisi od vrste uzorka koji treba razoriti. Univerzalna smeša kiselina koja bi se mogla koristiti za sve tipove uzoraka ne postoji. Ova metoda ima određene nedostatke kao što su opasnost od gubitka elemenata u tragovima, mogućnost zagađenja iz vazduha i velike količine potrebnih reagensa kao i zahtevi za njihovom velikom čistoćom [11].

14

b.

Razaranje u zatvorenom sudu

Zatvoreni sistemi imaju određene prednosti u odnosu na otvorene sisteme koje se ogledaju u činjenici da je smanjena mogućnost kontaminacije uzorka i gubitka lako isparljivih analita. U zatvorenom sudu usled povećanja pritiska povećava se temperatura ključanja kiselina i pojačava njihovo oksidaciono dejstvo. Prvi put je ovakav sistem opisan od strane Cariusa i Mitscherlicha 1860. godine [11] i poznat je pod nazivom Cariusova tehnika. Carius je razorio organske materijale koncentrovanom azotnom kiselinom u zapečaćenoj kvarcnoj ampuli smeštenoj u metalnu posudu koja je u pećnici zagrevana na 250-300 °C nekoliko sati. Ova tehnika je vremenom unapređena i današnje posude se sastoje od reakcionog dela , najčešće, od teflona i čeličnog omotača sa poklopcem [10]. Izrađuju se u različitim dimenzijama a vreme razaranja zavisi od vrste i količine uzorka. 2.2.2.1. Razaranje mikrotalasima Jedan od najsavremenijih izvora energije za procedure mokrog razaranja su mikrotalasi. Zagrevanje reakcione smeše je efikasnije od konvencionalnog zagrevanja. Osnovni princip zagrevanja uzoraka mikrotalasima se zasniva na dva mehanizma: dipolnoj rotaciji i jonskoj kondukciji. Polarni molekuli imaju tendenciju da izjednače svoj dipolni momenat sa mikrotalasnim elektromagnetnim poljem. Kako se elektromagnetno polje konstantno menja molekuli rotiraju i sudaraju se sa obližnjim molekulima. Joni prisutni u rastvoru, imaju tendenciju da se kreću u mikrotalasnom polju što prouzrokuje sudare sa drugim molekulima u rastvoru uz oslobađanje energije sudara u vidu toplotne energije. Osnovna prednost ove tehnike nad ostalim tehnikama razaranja ogleda se u činjenici da je tehnika veoma brza i da se mogu razoriti neki uzorci koji se drugim tehnikama veoma teško razaraju [11]. Takođe, mogućnost automatizacije eliminiše potrebu za angažovanjem analitičara tokom procesa. Mikrotalasno razaranje uzoraka se može vršiti u otvorenim i zatvorenim sistemima. a. Razaranje potpomognuto mikrotalasima u otvorenom sistemu

Mikrotalasni sistem razaranja u otvorenom sudu, koji se može koristiti i za ekstrakciju, se sastoji od magnetrona za generisanje mikrotalasa, usmerivača talasa za navođenje i fokusiranje mikrotalasa, i šupljine u koju se stavlja kiveta sa uzorkom. Dizajn otvorenog suda sprečava porast pritiska u kiveti tokom procesa razaranja i omogućava dodatak reagensa tokom samog procesa, ukoliko je potrebno. Ovom tehnikom se mogu razarati relativno velike količine uzorka, do 10 g za čvrste i 50-100 ml za tečne uzorke. Kisela isparenja koja nastaju se uklanjaju aspiratorom. Fokusirani mikrotalasi omogućavaju brže zagrevanje uzorka a mikrotalasna energija usmerena samo na deo suda koji se nalazi na putanji fokusiranih talasa obezbeđuje da vrat kivete i refluksna jedinica ostaju hladni tokom procesa. Uzorci se stavljaju u kivete od borosilikatnog stakla zapremine 250 ml. Ovakav sistem može biti potpuno automatizovan, a često se koristi i za izvođenje ekstrakcije čvrstih uzoraka.

15

b.

Razaranje potpomognuto mikrotalasima u zatvorenom sistemu

Mikrotalasna digestija u zatvorenom sudu, ima nekoliko prednosti u odnosu na metode razaranja u otvorenom sudu. Kivete za mikrotalasno razaranje u zatvorenom sistemu imaju određene prednosti u odnosu na keramičke ili staklene sudove. Reakcione posude su napravljene od polimernih materijala koji podnose visoke temperature. Mogućnost kontaminacije materijama koje su prisutne u vazduhu je smanjena jer se razaranje vrši u zatvorenom sudu. Zatvoreni sud, kiveta, sprečava isparavanje i smanjuje potrebnu količinu kiselina za razaranje, eliminiše gubitke isparljivih metalnih vrsta, koji mogu da budu problem pri razaranju uzorka u otvorenom sistemu, naročito pri spaljivanju do pepela. Još jedna prednost ovog sistema je mogućnost automatizacije postupka čime se umanjuje potreba za angažovanjem analitičara tokom procesa i omogućava velika reproduktivnost uslova razaranja. Sistem mikrotalasnog razaranja uzorka se sastoji od mikrotalasne pećnice, rotora u koji se smešta više „digestionih bombi“ i sistema za učvršćivanje istih i kontrolu uslova razaranja [9]. Sistem u mikrotalasnoj pećnici obezbeđuje praćenje i merenje temperature i pritiska u sudovima. Na početku razaranja temperatura se polako povećava i razaranje je sporo. Tek kada je najveći deo matriksa razoren pristupa se razaranju na visokim temperaturama. Regulator temperature prati temperaturu i na osnovu nje podešava snagu magnetrona održavajući pri tome temperaturu u rasponu ± 3 ° C. Sudovi za uzorke, koji se smeštaju na rotor unutar pećnice, su napravljeni od materijala koji dobro podnose visoke temperature i pritiske. Najčešće su to polikarbonat ili politetrafluoretilen (PTFE). Sudovi za uzorke, kivete, koji su komercijalno dostupni se mogu koristiti za razaranje uzorka na temperaturi do 300 °C i pritisku do 55,2 bar. Pod ovakvim uslovima se čak i vatrostalni materijala mogu uspešno razoriti, Al2 O3 kao izuzetno tvrd neorganski materijal se može ovim postupkom razoriti na 280 °C pri pritisku od 2,76 bar u mešavini H 2SO 4 i H 3 PO 4 [9]. Slični materijali se mogu digestirati hlorovodoničnom kiselinom na nešto nižoj temperaturi, 240 °C, ali na znatno višem pritisku, 45,5 bar. Kivete, u kojima se vrši razaranje uzoraka kiselinom, ili smešom kiselina, se na odgovarajući način zatvore. Zatvaranje kiveta se vrši sistemom poklopaca preko kojih se stavlja sigurnosni prsten i potom se one pričvrste u ramove koji se stavljaju na rotor unutar peći za mikrotalasno razaranje. Svaka pojedinačna ovako napravljena „bombica“ ima ventil za kontrolisanje pritiska. S obzirom da je svaka reakciona posuda baždarena na određenu vrednost pritiska, pri dostizanju pritiska iznad maksimalnog, sigurnosni ventil će omogućiti ispuštanje gasovitih proizvoda do ponovnog uspostavljanja pritiska baždarenja. Novije konstrukcije reakcionih posuda omogućavaju ponovno zaptivanje reakcione posude čime su gubici analize umanjeni. Starije izvedbe reakcionih posuda su sadržale membranu, po čijem je pucanju uzorak bio nepovratno kompromitovan. 2.2.3. Razaranje UV-zracima Razaranje UV zracima spada u grupu fotolitičkog razaranja. Izvor zračenja je živina ili ksenonova lampa. Uzorci se razaraju UV-zračenjem u prisustvu malih količina vodonik peroksida ili kiseline, najčešće azotne [11]. Mehanizam razaranja se može objasniti formiranjem 16

OH˙ iz vode i vodonik-peroksida koje započinje usled dejstva UV-zraka. Nastali radikali mogu da oksiduju organske materijale do CO 2 i vode. Da bi se dobio bistar rastvor ponekad je potrebno dodavati vodonik-peroksid više puta. Ovom metodom se ne mogu razoriti neka organska jedinjenja kao što su nitro-fenoli, hlor-fenoli, heksahlorbenzen [11]. 2.2.4. Razvoj metode razaranja uzorka mikrotalasima u zatvorenom sudu Pri razvoju metode za razaranje uzorka u zatvorenom sudu treba ispitati uticaj snage magnetrona, vreme razaranja kao i različite smeše kiselina. Poželjno je početi sa malim količinama uzorka i kiseline. Pritisak u kiveti se prati pomoću senzora i te vrednosti se upoređuju sa vrednostima koje je pomoću kompjutera, koji je u sastavu aparature, zadao analitičar. Ako pritisak u sudu premašuje zadatu vrednost, regulator pritiska će otvaranjem sigurnosnog ventila ispuštati gasovite produkte dok se pritisak ne snizi. Istovremeno se snižava i snaga magnetrona. Ovo omogućava da se koristi maksimalna snaga peći za određeno vreme i dopušta da sistem nenadgledan dovrši razaranje. Uzorci neorganskog porekla kao što su metali, voda, minerali i sedimenti, se relativno lako razaraju u kiselinama uz oslobađanje male količine gasovitih produkata. Uzorci koji sadrže visok procenat organskog materijala proizvode obilne količine gasovitih proizvoda i zahtevaju više temperature razaranja da bi se razorile u potpunosti. Na temperaturama iznad 250 °C većina polimernih materijala počinje da se topi, prelazi u tečno stanje ili se razlaže. Za polimerne uzorke kao što su poliimidi u mikrotalasnu peć se stavlja keramička rotaciona ploča na koju se stavljaju otvoreni sudovi od borosilikata, kvarca ili staklastog ugljenika, koji mogu da podnesu znatno više temperature u odnosu na polimerne materijale. Uzorak se smatra razorenim kada više nema vidljivih čvrstih ostataka i kada rastvor ostaje bistar pri razblaživanju. Pošto kiveta nije providna teško je ustanoviti da li je razaranje izvršeno u potpunosti, pa se kiveta mora ohladiti, otvoriti i osloboditi gasovitih nusproizvoda. Ukoliko razaranje nije potpuno, kiveta se ponovo zatvori i postupak razaranja ponovi.

2.3. Selen
Selen (Se, latinski - sellenium) je metaloid VI-a grupe, atomskog broja 34 i mase 78,96 g/mol. Otkriven je 1817. godine od strane Jons Jakob Berzelijusa. Ime je dobio od grčke reči selene koja znači mesec (zato što se uvek javljao uz telurijum, latinski tellus-zemlja). Poznato je nekoliko njegovih izotopa čije se atomske mase nalaze između 69-91. Tačka topljenja kristalne alotropske modifikacije selena je 217 ° C a tačka ključanja 685 ° C [12]. Selen može imati sledeće valentnosti: +6, +4, +2, 0 i -2. U zemljinoj kori selen je zastupljen u količini od 0,05-0,09 mg/kg [6, 13], u zavisnosti od područja, kao pratilac nekih ruda sumpora. U industriji se dobija kao sporedni proizvod prečišćavanja ruda bakra i sumpora. U laboratoriji se selen dobija redukcijom selenitne kiseline hidrazinom. Slobodan selen se može dobiti rastvaranjem selen-dioksida u azotnoj kiselini, i propuštanjem rastvora kroz rastvor sumpor-dioksida, čime se selen izdvaja kao crveni talog [6].

17

Selen ima veliku primenu u foto industriji i najviše se koristi za izradu foto-ćelija. Koristi se i kao dodatak staklu i čeliku. Sulfid selena se koristi u šamponima protiv peruti. Zbog položaja u periodnom sistemu osobine selena podsećaju na osobine sumpora. Selenatna kiselina, slično kao i sumporna kiselina, je veoma jaka kiselina sa oksidacionim delovanjem. U oksidacionoj sredini dvovalentni selen veoma lako prelazi u viša oksidaciona stanja. Selen je jedan od esencijalnih mikroelemenata koji se mora unositi hranom. On je neophodan za funkciju enzimskog sistema glutation peroksidaze koja razlaže štetne perokside i tako štiti ćelijsku membranu od oštećenja. Ovaj esencijalan element je veoma bitan za funkcionisanje odbrambenog sistema organizma i rad štitne žlezde. Selen pojačava antioksidativno delovanje vitamina E i zajedno sa drugim antioksidansima štiti srce, smanjujući rizik od srčanih bolesti. Takođe ima ulogu u zaštiti od slobodnih radikala, pomaže pri depresiji, premoru i prevelikoj nervozi. Elemenat još redukuje količinu štetnih jedinjenja koja izazivaju nastanak reumatskih zapaljenja. Smatra se da sprečava nova izbijanja herpesa, mutaciju ćelija iz kojih često proizilazi kancerogeneza i pomaže u lečenju AIDS-a (pacijenti imaju manje infekcija, popravlja im se apetit i funkcija creva). Prosečna odrasla osoba sadrži oko 20 mg selena a najveći deo se nalazi u jetri, skeletnim mišićima, bubregu, srcu, slezini i testisima. Selen se u organizam unosi hranom a njegov sadržaj u hrani zavisi od vrste namirnice i količine selena prisutne u zemljištu na kojem se uzgajaju sirovine za proizvodnju različitih prehrambenih proizvoda. Proizvodi bogati selenom su pšenica, neprerađena riža, ovas, semenke dinje, mleko, posno meso i riba. Selen u hrani može biti prisutan u obliku neorganskog selena (selenit- SeO32− ) ili kao aminokiselina selenocistein i selenometionin koji predstavljaju analoge aminokiselinama sa sumporom-cisteina i metionina. Biljke koje rastu na zemljištu sa velikom količinom selena formiraju selenometil-cistein i selenohomocistein koji se mogu u biljkama akumulirati u količinama i do 5000 mg/kg uzrokujući time trovanja selenom ljudi i životinja koji ih konzumiraju. Smatra se da se neorganske soli selena, kao i organski vezani selen relativno dobro resorbuju iako ima malo informacija o mehanizmu i regulaciji resorpcije. Od ukupne količine resorbovanog selena oko 55-60% se izbacuje urinom, oko 5% znojem i manje od 1% disanjem [6]. Ukoliko dođe do trovanja selenom onda se procenat selena izbačen dahom znatno povećava (dah na beli luk). Preporučena količina selena koju odrasle osobe treba da unesu dnevno iznosi 55 mikrograma. Višak selena je štetan i smatra se da unošenjem preko 400 mikrograma dnevno može da izazove trovanje [6]. Trovanje selenom je opisano kod ljudi i životinja, ali još nije jasan mehanizam trovanja. Rani simptom je miris belog luka u dahu što je posledica izdisanja dimetil selenida, jednog od njegovih metabolita. Do akutnog trovanja selenom može doći zbog inhalacije značajnih količina selena u elektronskoj industriji i u industriji stakla i boja. Problem trovanja selenom se javlja i u područjima gde je relativno visok nivo selena u zemljištu. Specifično stanje, selenoza, je povezana sa hroničnim unosom preko 12 µ mola (~1 mg) Se dnevno koje može dovesti do gojenja, zamora, povraćanja. Kod dece može doći i do pojave 18

karijesa. Kao posledica selenoze može dogoditi depigmentacija kože, gubitak i oštećenje noktiju, sušenje i gubitak kose. Takođe se javljaju neurološke abnormalnosti koje uključuju paraesteziju, paralizu i hemiplegiju. Simptomi nedostatka selena se sreću samo kod ljudi koji žive na područjima gde ima malo selena u zemljištu. Područja Evrope, delovi SAD, Novi Zeland i deo Kine su područja gde ima malo selena u zemljištu. Nedostatak selena često se javlja i kod kritičnih grupa ljudi, kao što su alkoholičari, osobe koje se u znatnoj meri hrane industrijski obrađenom hranom i tzv. „brzom hranom“, osobe obolele od HIV-a, osobe obolele od bolesti jetre, osobe sa Daunovim sindromom i oboleli od fibrocističnog oboljenja dojke [14]. Nedostatak selena uzrokuje proširenje srca, koje konačno dovodi do kongestivnog zatajivanja srca, kao i gubitak aktivnosti ćelija pankreasa. Ostali poremećaji koji se javljaju usled nedostatka selena su: Kešanova bolest, Kašin-Bekov sindrom, kancer, razne kardiovaskularne bolesti, problemi u trudnoći, astma, reumatoidni artritis, katarakta, anemija, otežano disanje, mišićna slabost, depresija i povišen krvni pritisak [14]. Kako je uloga selena u normalnom funkcionisanju ljudskog organizma velika on se može koristiti u lečenju većeg broja bolesti i poremećaja kao što su kancer, bolesti srca, astma, reumatoidni artritis, detoksikacija organizma usled trovanja arsenom, kadmijumom i živom, angina, katarakta, visok krvni pritisak u trudnoći. Selen se koristi u preparatima za tretiranje kose, kože i noktiju, kao i u lekovima za poboljšanje raspoloženja, lečenje depresije i umora [14].

2.4. Metode određivanja selena
Selen se može određivati velikim brojem metoda. Izbor metode zavisi od količine selena u uzorku kao i od vrste uzorka koji ispitujemo. Neke od metoda će biti pomenute u ovom poglavlju. Od optičkih analitičkih tehnika najčešće primenjivane su elektrotermalna atomska apsorpciona spektrofotometrija (ETAAS) [15], hidridna tehnika atomske apsorpcione spektrofotometrije (HGAAS) [16], koje su obrađene u prethodnim poglavljima, induktivno spregnuta plazma/masena spektrometrija (ICP-MS) o kojoj će biti reči u daljem tekstu. U okviru hromatografskih tehnika kombinovane tehnike kao što su tečna hromatografija visokog pritiska/induktivno spregnuta plazma/masena spektrometrija (HPLC-ICP-MS) omogućava određivanje različitih organskih formi selena. Elektroanalitičke tehnike kao što su anodna striping voltametrija (ASV), katodna striping voltametrija (CSV), redukciona striping analiza i hronopotenciometrijska striping analiza (CSA) takođe pružaju mogućnost određivanja selena u većem broju realnih uzoraka. ICP MS je metoda koja se koristi za određivanje selena u velikom broju uzoraka, npr. u pijaćoj vodi, otpadnim i podzemnim vodama. Metoda je takođe uspešno primenjena za određivanje selena u prehrambenim dodacima pri čemu je ostvarena granica detekcije Se(IV) od 0,048 ng/g i Se(VI) od 0,84 ng/g [17]. ICP MS metoda je korišćena za rutinska određivanja Se u krvnom serumu i za uzorke crvenih krvnih zrnaca (eritrocita). Razlog za korišćenje ove metode u 19

biološkim određivanjima je to što je potrebno veoma malo uzorka, 100 µ l, čime je i priprema uzoraka znatno pojednostavljena. Vreme određivanja je kratko i iznosi 140 s za serum i 160 s za krvna zrnca. Postignuta granica detekcije Se(IV) za serum je iznosila 0,02 µ mol/l [18]. HPLC ICP MS je tehnika koja se veoma lako automatizuje pa se može koristiti za rutinske kontrole totalnog selena u uzorcima životne sredine i prehrambenim proizvodima [19]. Ova tehnika se najviše koristi za određivanje selena u vodi. Primena gasne podeone hromatografije za određivanje selena u biološkim uzorcima omogućava eliminisanje interferencije iz biološkog matriksa. GC zahteva prethodno razaranje organskog materijala sa HNO3 . Tehnike gasne hromatografije se uglavnom baziraju na merenju količine piazo-selenola formiranog u reakciji Se(IV) sa odgovarajućim reagensima u kiselom medijumu. Korišćenjem 1,2-diamino-3,5-dibrombenzena kao reagensa Shimoishi je ostvario granicu detekcije 1 × 10−9 g Se/g uzorka [1]. Masena spektrometrija zasnovana na određivanju pomoću izotopa Se, primenjena nakon gasno-hromatografskog razdvajanja (IDGC/MS) je tehnika visoke tačnosti koja je korišćena za određivanje selena u hrani, plazmi, serumu i crvenim krvnim zrncima. U ovoj metodi stabilni izotop selena se dodaje uzorku pre digestije. Ova procedura eliminiše potrebu za primenom standardnih rastvora selena, odnosno za kalibracijom. Mana ove tehnike je da su obogaćeni izotopski standardi skupi [1]. Striping analiza je veoma jednostavna i osetljiva metoda za određivanje Se(IV). CSV je primenjena za određivanje ukupnog selena u različitim uzorcima. Postupak koji su razvili Filichkina, Zakharova i Slepchenko uključuje mineralizaciju uzorka sa magnezijum-nitratom u 6M HCl radi redukcije Se(VI) do Se(IV) i određivanje selena katodnom voltametrijom na živagrafitnoj elektrodi u rastvoru HCl u prisustvu jona bakra i žive [20]. Pored uobičajeno korišćenih živinih radnih elektroda selen je uspešno određen i primenom tankoslojne bizmutove elektrode formirane na pirolitičkom grafitu. Tehnika se zasniva na redukciji Se(IV) trovalentnim jonima bizmuta uz obrazovanje vodonika koji proizvodi jasan katalitički talas na -1150 mV u odnosu na srebro/srebro-hloridnu referentnu elektrodu. Određivanje pomenutim postupkom izvedeno u prirodnim vodama je pokazalo da se ovaj metod može koristiti za određivanje i Se(IV) i Se(VI). Se(IV) je redukovan na potencijalu od -500 mV 30 s mešanjem bez prisustva vazduha u rastvoru. Nakon pauze od 10 s merenje je izvršeno skeniranjem elektrodnog potencijala od -400 mA do -1400 mA [21]. Bryce, Izquierdo i Castro su ASV primenili kao kontinualni metod za određivanje selena. Posle prekoncentracije Se (IV) na radnoj elektrodi od zlata na primenjenom potencijalu od 0,4 V, izvedeno je anodno skeniranje od 0,4-1,6 V pomoću kojeg je selen rastvoren na potencijalu od ~0,912 V. Proizvedena struja je proporcionalna Se(IV) u uzorku. Samoj analizi je prethodilo uklanjanje smetajućih jona pomoću on-line separacije korišćenjem katjonskog izmenjivača jona u koloni. Primenjeni metod ima opseg linearnosti određivanja između 5-100 ng/ml Se(IV) sa korelacionim koeficijentom r 2 od 0,9969 i relativnom standardnom devijacijom analitičkog signala selena (RSD) od <4,7% [22]. CSA je primenjena za određivanje selena u stočnoj hrani od ribljeg brašna i kvasca. Kao radna elektroda korišćen je film žive formiran na staklastom ugljeniku. Tačnost metode je 20

potvrđena analizom standardnog referentnog materijala- žitnog durum brašna. Vreme elektrolize iznosilo je 600 s na potencijalu od -0,1 V, a ostvarena je granica detekcije od 0,5 µg / dm3 [10].

21

3. EKSPERIMENTALNI DEO
3.1. Aparatura i pribor
Sva ispitivanja u ovom radu su izvedena na sistemu za atomsku apsorpcionu spektrofotometriju u grafitnoj kiveti „Thermo, electron corporation; Spectrometer: S Series GE711344 v 1,26“ u Enološkoj stanici u Vršcu. Ovaj instrument je predstavljen na slici 5.

Slika 5 - Atomski apsorpcioni spektrofotometar

Uzorci su pripremani u aparatu za mikrotalasnu digestiju „Milestone Sr1“ koji je prikazan na slici 6.

Slika 6 - Aparat za mikrotalasnu digestiju u zatvorenom sistemu

22

U svim određivanjima korišćen je uobičajeni pribor kao što su pipete, normalni sudovi i dr., opran i održavan na odgovarajući način. Za pripremu standardnih rastvora korišćena je mikropipeta „Tranferpette“ sa promenljivom zapreminom (5-50 µ l).

3.2. Hemikalije i rastvori
U radu su korišćene sledeće hemikalije: - Azotna kiselina 65% najveće čistoće „Merck“ - Vodonik peroksid 35% medicinske čistoće „Merck“ - Standardni rastvori SeO 2 u HNO3 0,5 mol/l; 1000 mg/l Se (IV) „Merck“ - Sirćetna kiselina p.a. „Merck“ - Askorbinska kiselina p.a. „Merck“ - Magnezijum-nitrat p.a. „Merck“ - Nikl (II) nitrat- heksahidrat „Merck“ - Paladijum (II)nitrat „Merck“ - Ultra čista voda otpornosti 18,2 MΩ / cm Pored pomenutih hemikalija korišćeni su i sledeći rastvori: Standardni rastvor selena (IV) 10 µg / l pripremljen tako što je odmereno 0,1 ml standardnog rastvora selena u normalni sud od 100 ml i sud dopunjen do marke ultra čistom vodom Nikl (II) nitrat 0,4 g/100 ml koji je pripremljen tako što je odmereno 0,63 g nikl(II)-nitrata heksahidrata i rastvoreno u 100 ml ultra čiste vode u normalnom sudu od 100 ml Magnezijum nitrat 0,4 g/100 ml, odmereno je 0,4 g magnezijum-nitrata i rastvoreno u 100 ml ultra čiste vode u normalnom sudu od 100 ml Paladijum (II) nitrat 0,4 g/100 ml, odmereno je 0,4 g paladijum(II) nitrata i rastvoreno u 100 ml ultra čiste vode u normalnom sudu od 100 ml Askorbinska kiselina 0,4 g/100 ml, odmereno je 0,4 g askorbinske kiseline i rastvoreno u 100 ml ultra čiste vode u normalnom sudu od 100 ml Sirćetna kiselina 0,4 ml/100 ml, pripremljena je tako što je odmereno 0,4 ml sirćetne kiseline i razblaženo ultra čistom vodom do marke u normalnom sudu od 100 ml

-

-

3.3. Uzorci
U radu je određivan sadržaj selena u različitim uzorcima testenina i čajnog peciva domaćih i stranih proizvođača dostupnih na tržištu. Korišćeni su sledeći uzorci: K1- Wellness integralni keks sa ovsenim pahuljicama; Bambi, Beograd 23

-

K2- Doria Bucaneve Cereali; Banli, Verona, Italia K3- Plazma; Bambi, Beograd K4- Frollini con granelli di zucchero; Conad s. c. Bologna, Italia K5- Petit Beurre keks sa maslacem; Bambi. Beograd K6- Jo D’oro inspiracija sa cimetom; Bambi, Beograd K7- Posni keks LALA; Swisslion Takovo, Vršac, Srbija T1- Del Castello Pastificio Bragagnolo 57 fusilli integrali; Pasta zara S. p. A. Italia T2- Integralna testenina Fillipili; „Ambrosia“ D.O.O. Beograd T3- Pasta Adria; Adria MM doo Banja Luka, BiH T4- Buitoni Farfalle; Nestle Italiana, Milano, Italia T5- Granoro Pasta di Semoladi Grano Duro Spirali n. 32; Italia T6- La Perfetta Testenina Spirala; Kikindski mlin, Kikinda, Srbija T7- Barilla G. eR- Frateli; Parma, Italia

3.4. Priprema uzorka
Uzorci su razarani u aparatu za mikrotalasnu digestiju koji je ranije pomenut. Uzorci su bili samleveni u mlinu za kafu. 0,5 g samlevenog uzorka je odmereno i premešteno u kivetu za mikrotalasnu digestiju, nakon čega je dodato 7 ml azotne kiseline i 1 ml vodonik peroksida. Kiveta je zatvorena na odgovarajući način i postavljena u pećnicu. Vreme zagrevanja je iznosilo 10 minuta do temperature od 200 °C pri snazi od 700 W. Korak razaranja je trajao 15 minuta na temperaturi od 200 °C i pri snazi od 700 W. Po završenom razaranju, uzorci su ohlađeni i prenešeni u normalne sudove od 25 ml u digestoru. Normalni sudovi su potom dopunjeni ultra čistom vodom do marke. Uzorci su do analize čuvani u polietilenskim bočicama u frižideru.

24

4. REZULTATI I DISKUSIJA
U radu je ispitan uticaj većeg broja modifikatora na analitički signal selena. Pri ovim ispitivanjima, menjan je samo modifikator matriksa dok su ostali uslovi analize ostali nepromenjeni.

4.1. Ispitivanje uticaja i odabir modifikatora
Ispitivanje uticaja modifikatora na analitički signal selena je izveden tako što je ponavljana analiza standarda selena, poznate koncentracije (10 µ g/l), pod istim opštim uslovima analize, na različite modifikatore. Kao modifikatori ispitivane su sledeće supstance: nikl-nitrat, magnezijum-nitrat, paladijum-nitrat, askorbinska kiselina i sirćetna kiselina. Poređene su reproduktivnost analitičkog signala selena i linearnost zavisnosti apsorbancije od koncentracije selena u prisustvu različitih modifikatora. Treba napomenuti da je jedan od bitnih faktora pri odabiru modifikatora bila i visina analitičkog signala selena. Uticaj pojedinačnih modifikatora koje smo upoređivali, i na osnovu kojih smo doneli odluku o optimalnom modifikatoru, biće izložene u narednim poglavljima. 4.1.1. Linearnost U cilju optimizacije uslova spektrofotometrijskog određivanja neophodno je bilo ispitati linearnost analitičkog signala selena u prisustvu različitih modifikatora matriksa. Poželjno je da je zavisnost apsorbancije od koncentracije analita linearna, da je nagib linije što veći a odsečak što manji. Slaganje zavisnosti apsorbancije od koncentracije selena sa pretpostavljenom linearnom zavisnošću, kao i visina analitičkog signala, dati su za različite ispitane modifikatore na slici 7.

25

0,9 0,8 0,7 apsorbancija 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 koncentracija (µg/l)
Slika 7 – Linearnost analitičkog signala selena uz različite modifikatore

y = 0,0133x + 0,0377 R² = 0,9961 y = 0,0121x + 0,0229 R² = 0,9997

nikl-nitrat magnezijum-nitrat sirćetna kis. askorbinska kis.

y = 0,0089x + 0,0447 R² = 0,9822 y = 0,0006x + 0,0254 y = 0,0014x + 0,0173 R² = 0,9015 R² = 0,9945

paladijum-nitrat nikl-nitrat magenizijum-nitrat sirćetna kis. askorbinska kis. paladijum-nitrat

Iz slike možemo videti da je najbolje slaganje eksperimentalnih rezultata sa pretpostavljenom linearnom zavisnošću bilo uz primenu magnezijum-nitrata kao modifikatora dok je nagib najveći u slučaju primene nikl-nitrata. Zavisnost analitičkog signala selena od koncentracije sa pretpostavljenom linearnom funkcijom je takođe bilo dobro i uz paladijumnitrat kao modifikator, čineći ga jakim konkurentom nikl-nitratu. Pri korišćenju sirćetne i askorbinske kiseline kao modifikatora, selen je imao znatno nižu visinu signala, znatno manji nagib kalibracione prave i visinu odsečka sličnu kao kod drugih modifikatora. 4.1.2. Reproduktivnost Reproduktivnost analitičkog signala je računata na bazi pet merenja apsorbancije standardnog rastvora selena, sadržaja 10 µg / l . Vrednosti relativne standardne devijacije za ispitane modifikatore date su u tabeli 1.

26

Tabela 1 - Relativne standardne devijacije analitičkog signala selena na različite primenjene modifikatore

Modifikator

Relativna standardna devijacija analitičkog signala selena(%) 8,97 7,37 14,69 13,59 44,7

paladijum-nitrat nikl-nitrat magnezijumnitrat askorbinska kiselina sirćetna kiselina

Iz tabele vidimo da je vrednost relativne standardne devijacije (koeficijenta varijacije) najniži u slučaju korišćenja nikl-nitrata kao modifikatora. Na osnovu prethodno iznesenih podataka možemo zaključiti da su nikl-nitrat i magnezijum-nitrat pokazali znatno bolje osobine od preostalih modifikatora. Slaganje zavisnosti analitičkog signala selena od koncentracije sa pretpostavljenom linearnom zavisnošću je najbolja u slučaju primene magnezijum-nitrata kao modifikatora sa većim koeficijentom korelacije i manjim odsečkom od nikl-nitrata. Korišćenju nikl-nitrata kao modifikatora u prilog ide najveći nagib dobijene kalibracione prave, najveća visina analitičkog signala i najmanji koeficijent varijacije. Iz tih razloga, za dalja merenja, odabrali smo nikl-nitrat kao modifikator.

4.2. Granica detekcije
Postoje različiti pristupi određivanju granice detekcije i samim tim i različiti načini njenog definisanja. Granica detekcije se može definisati kao najniža koncentracija analita koja može biti detektovana i statistički opravdana. Granica detekcije se često definiše kao vrednost analitičkog signala dobijenog u slepoj probi, koja je uvećana za reproduktivnost (3SD) ostvarenu pri analizi slepe probe. Osetljivost ne zavisi samo od signala registrovanog u slepoj probi nego i od vrednosti šuma aparata i u spektrofotometrijskim i hromatografskim tehnikama granica detekcije se često definiše onim sadržajem elementa u rastvoru koji proizvodi trostruko jači signal u odnosu na signal šuma aparata. U ovom radu kao granica detekcije usvojena je vrednost od tri standardne devijacije analitičkog signala selena dobijenog pri analizi standardnog rastvora koji daje trostruko veći signal od signala šuma aparata. Standardni rastvor selena koji je proizvodio analitički signal dovoljno visok da bude usvojen kao kriterijum za definisanje granice detekcije je sadržao 10 µg / l Se(IV). Kao rezultat dvanaest analiza KV je iznosio 2,90 %. Nakon prevođenja 3SD u jedinicu koncentracije , interpolacijom u zavisnost apsorbancije od koncentracije, dobijena je granica detekcije od 0,75 µg / dm3 Se(IV). 27

4.3. Određivanje selena u realnim uzorcima
Nakon definisanja optimalnih uslova tehnike i pripreme uzoraka, definisani metod je primenjen za određivanje selena u većem broju realnih uzoraka. Selen je određivan na atomskom apsorpcionom spektrofotometru koji je ranije pomenut. Pripremljeni uzorci su stavljani na automatski uzorkivač (autosampler). Uslovi analize dati su u tabeli 2.
Tabela 2 - Uslovi analize pri određivanju selena

Korak Sušenje Spaljivanje Atomizacija Čišćenje

Temperatura (°C) 100 1100 2200 2500

Vreme (s) 30 30 3 3

Brzina zagrevanja (°C/s) 10 150 0 0

Tok gasa (l/min) 0,2 0,2 Isključen 0,2

U svim analizama je kao modifikator matriksa korišćen nikl-nitrat. Korekcija pozadine je vršena uz pomoć deuterijumske lampe. Karakteristična talasna dužina na kojoj je izvedeno merenje apsorbancije selena iznosila je 196 nm. Za analizu je korišćeno 20 µl pripremljenog uzorka. Koncentracija selena je određivana metodom kalibracione krive. Srednje vrednosti određenih sadržaja selena (pet ponavljanja) u ispitivanim uzorcima date su u tabeli 3.
Tabela 3 - Sadržaj selena u realnim uzorcima određen definisano m metodom

uzorak T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7

sadržaj (µg/kg) 45,9808 41,3724 65,5478 48,9609 198,6710 60,6904 52,5532

KV (%) 4,11 7,53 3,80 5,48 5,25 3,64 7,13

Uzorak K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7

sadržaj (µg/kg) 3,9308 17,6109 26,9406 23,1396 14,4059 20,1046 21,9080

KV (%) 7,06 8,31 5,19 7,29 6,72 7,29 5,04

Originalan zapis softvera integrisanog u primenjenom spektrofotometru: S Series GE711344 v 1,26; Thermo, electron corporation, pri jednoj seriji analize svih uzoraka je prikazan na slici 8.

28

Slika 8 - Originalni rezultati određivanja selena

29

Slika 8 – Originalni rezultati određivanja selena (nastavak)

30

5. ZAKLJUČAK
1. Definisana je metoda za određivanje selena u različitim uzorcima tipa čajnog peciva i testenine primenom atomske apsorpcione spektrofotometrije u grafitnoj kiveti. 2. Razvijen je i definisan postupak pripreme uzoraka mikrotalasnom digestijom u zatvorenom sistemu. 3. Ispitan je i odabran najpogodniji modifikator matriksa za ovakva određivanja. Ustanovljeno je da je najbolja reproduktivnost analitičkog signala selena i najbolje slaganje zavisnosti apsorbancije od koncentracije selena sa pretpostavljenom linearnom zavisnosti postignuto sa nikl-nitratom kao modifikatorom. S obzirom na navedene kriterijume magnezijum-nitrat može biti dobra alternativa nikl-nitratu. 4. Sadržaj selena u različitim uzorcima tipa čajnog peciva i testenine određen je metodom kalibracione krive, i kretao se u intervalu od 4 µg / kg do 198 µg / kg . 5. S obzirom na jednostavnost, reproduktivnost i brzinu definisane metode, ona se može koristiti za rutinska određivanja selena u ovakvim uzorcima, iako cena eksploatacije nije zanemarljiva.

31

6. LITERATURA
1. J. Risher, A. R. McDonald, M. J. Citra, S. Bosch, R. J. Amata, „Toxicological profile for Selenium“, Public Health Service, Agency for Toxic Substances and Disease Registry, 2003. 2. Thermo Elemental, ”AAS, GFAAS, ICP or ICP-MS? Which tehnique should I use? An elementary overview of elemental analysis”, Thermo Elemental, 2001. 3. J. V. Švarc-Gajić, „Magistarski rad“, Tehnološki fakultet, Novi Sad, 2001. 4. N. J. Marjanović, I. F. Jankovitš, „Instrumentalne metode analize“, Tehnološki fakultet - Zavod za izdavanje udžbenika, Novi Sad, 1983. 5. P. Patnaik, „Dean’s amalytical chemistry handbook“, Mc Graw-Hill companies, 2004. 6. http://sh.wikipedia.org/wiki/Selen 7. http://www.cofc.edu/~deavorj/521/History%20of%20Spectroscopy.html 8. G. H. Jeffery, J. Bassen, J. Mendham, Re. Denney, „Vogel’s textbook of Quantitative chemical analysis“, John Wiley & Sons, Inc., 1989. 9. S. Mitra, „Sample preparation techniques in Analytical Chemistry“, John Wiley & Sons, Inc., 2003. 10. J. V. Švarc-Gajić, Z. J. Suturović, N. J. Marjanović, S. Ž. Kravić, „Chronopotenciometric Stripping Analysis of Selenium in Feed“, Asian Journal of Animal and Veterinary Advances 1, 2006., 13-22 11. Z. Mester, R. Sturgeon, „Sample preparation for trace element analyses“, Wilson & Wilson’s, 2003. 12. http://www.encyclopedia.com/doc/1G2-3427000092.html 13. http://www.chemistryexplained.com/elements/P-T/Selenium.html 14. http:/www.chem.bg.ac.yu/~srðan/mineravita/min/se/se.html 15. P. Viòas, M. P. Martin, M. Hernándes-Cordoba, „Rapid determination of selenium, lead and cadmium in baby food samples using electrothermal atomic absorption spectrometry and slurry atomization“, Analytica chimica acta, 412, 2000., 121-130 16. V. Kos, M. Veber, V. Hudnik, „Determination of selenium in soil by hydride generation AAS“, Fresenius Journal of Analytical Chemistry 360, 1998., 225-229

32

17. M. Nash, „Determination of Selenomethionine in Nutritional Supplements using HPLC coupled to the X Series ICP-MS with CCT“, Thermo Electron Corporation, 2003. 18. C. E. Sieniawska, R. Mensikov, H. T. Delves, „Determination of total selenium in serum, whole blood and erythrocytes by ICP-MS“, Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 14, 1999., 109-112 19. M. Bueno, F. Pannier, M. Potin-Gautier, „Determinatin of Organic and Inorganic Selenium Species Using HPLC-ICP-MS“, Agilent Technologies, Inc., Applications, 2007. 20. O. G. Filichkina, E. A. Zakharova, G. B. Slepchenko, „Determination of Selenium in Fodstufs by Cathodic Stripping Voltametry at Mercury-Graphite Electrode“, Journal of Analytical Chemistry, 59, 2004., 481-486 21. J. Long, Y. Nagaosa, „Determinaton of selenium (IV) by Catalytic Stripping Voltametry with in sity Plated Bismuth-film Electrode“, Analytical Sciences, 23, 2007., 1343-1346 22. D. W. Bryce, A. Izquierdo, M. D. Luque De Castro, „Flow-injection anodic stripping voltametry at a gold electrode for selenium (IV) determination“, Analytica Chimica Acta, 308, 1995., 96-101

33

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful