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Resultados y Discusin
IV.
RESULTADOS Y DISCUSION
IV.1.
la
finalidad
de
obtener
un
parmetro
de
medida
de
la
actividad
(ecuacin 7)
Donde Am= rea del halo de la muestra a testar (mm 2), Ae= rea del halo del
estndar de nisina (mm2) y m= valor de la pendiente obtenido a partir del modelo dosisrespuesta (patrn de nisina frente a el microorganismo indicador expresado en
mm2/unidades de concentracin).
Este modelo lineal se basa en que los halos de inhibicin detectados, o respuesta
inhibitoria, varan linealmente con el logaritmo de la concentracin de sustancias
antimicrobianas, lo que implica que la pendiente de la curva dosis-respuesta es constante
para una bacteriocina dada, por lo tanto esta es considerada un parmetro de sensibilidad.
35
350
300
2
250
200
150
100
50
0
0
4
5
Ln C (mg/L)
Figura IV.1. Relacin entre el rea de inhibicin (mm2) y el logaritmo neperiano (Ln) de la
concentracin de nisina (mg/L) para L. innocua.
Cabe destacar que los lmites de deteccin para la nisina, bajo estas condiciones,
fueron de 25 mg/L a 1000 mg/L. Estos resultados coinciden con los observados por
Pongharangku & Demirci (2004). Con concentraciones de nisina de 1100 y 1200 mg/L no se
observ un incremento del halo de inhibicin respecto al obtenido con una dosis de 1000
mg/L, lo que indicara que la difusividad de la solucin de nisina en el agar no es infinita
(tabla IV.1). As, es de resaltar que las zonas de inhibicin se ven condicionadas por
mltiples factores como son el tipo de medio, la presencia o ausencia de surfactantes, la
pred-difusin (Pongtharangkul & Demirci, 2004) as como la variabilidad de bacteriocinas
(Delgado et al., 2005).
36
Tabla IV.1. Ajuste lineal de la relacin entre el logaritmo neperiano de la concentracin de nisina y el
rea del halo de inhibicin en mm2.
N ecuacin
8
Ecuacin
A = 49,549 LnC 58,956
R2
0, 99
Log C (mg/L)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
10
15
20
25
Dimetro del halo de inhibicin (mm))
37
a)
b)
Figura IV.3. a) Relacin entre la concentracin de nisina (mg/L) y los recuentos de Listeria innocua
(ufc/mL) b) Ampliacin del intervalo prctico de accin, concentracin de nisina (mg/L) frente al
logaritmo de las ufc/mL de L. innocua.
Como se puede observar en la figura IV.3 la nisina tuvo una marcada actividad
antimirobiana frente a Listeria innocua, siendo la CMI (concentracin mnima) que gener la
mortalidad total de 300 mg/L 300 UI/mL.
Las ecuaciones obtenidas tras el ajuste lineal de las curvas dosis-respuesta
obtenidas tanto mediante las tcnicas de difusin en agar como mediante la de dilucin en
tubo (figuras IV.2 y IV.3, respectivamente) se muestran en la tabla IV.2.
Tabla IV.2. Ajuste lineal de las relaciones dosis-respuesta de la nisina frente a L. innocua, obtenidas
mediante la tcnica de difusin en agar (ecuacin 9) y dilucin en tubo (ecuacin 10).
N ecuacin
9
10
Ecuacin
Log C = 0,2149*(D) 1,0951
log(ufc/mL) = - 0,0426* C + 5,6928
R2
0,99
0,99
38
Figura IV.4. Curva de crecimiento de L. lactis ajustada con los modelos cinticos de Gompertz y
Baranyi.
39
Tabla V.3. Parmetros cinticos del crecimiento microbiano y coeficiente de correlacin obtenidos a
partir de los modelos cinticos de Baranyi y Gompertz para L. lactis.
MODELOS
Parmetro
Gompertz
Baranyi
[(log ufc/mL)h-1]
0,5442
0,4954
[h]
2,4142
2,0376
No [log ufc/mL]
3,8303
3,8142
10,6232
10,1006
R2
0,9737
0,9809
Como se puede observar con los valores de R2 (tabla IV.3.) el crecimiento de L. lactis
se ajusta perfectamente a los modelos de Gompertz y Baranyi, no obstante el modelo de
Baranyi present un ajuste algo ms alto. Los resultados obtenidos reflejan que la fase de
latencia de L. lactis se sita en torno a las 2 horas, la velocidad de crecimiento es del orden
de 0,5 [(log ufc/mL)h-1] y la mxima densidad de poblacin es algo superior a 10 log
ufc/mL.
40
41
a)
b)
c)
Figura IV.5 Evaluacin del nivel de crecimiento de L. lactis y actividad antilisteria correspondiente
expresada en funcin a) % potencia,b) concentracin equivalente de nisina y c) la supervivencia de
L.innocua.
42
En la fase inicial del estudio se trat de identificar los ingredientes del medio que
tienen un efecto significativo en la produccin de sustancias antimicrobianas. Para ello se
43
opt por un diseo factorial fraccionado (DDF) 2 6-2, con seis factores a dos niveles,
requirindose por tanto 16 experimentos (ver apartado III.3.4.1)
En la segunda fase del estudi se trat de describir la naturaleza de la superficie de
respuesta en la regin del optimo, utilizando un diseo central compuesto (DCC) para dos
factores, con un diseo factorial 22 con 2 factores (Ver apartado III.3.4.2)
44
para la cepa 539. En tercer lugar, se situara la formulacin 3 para la cepa 539 y la 7 y 9
para la cepa 4434. En la tabla IV.5. se resumen estos resultados
L. lactis
CECT 539
CECT 4434
formulacin
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
dilucin inhibitoria *
13
5
7
11
9
5
7
11
8
15
16
17
14
16
14
11
3
5
6
15
9
7
9
11
10
13
16
17
15
12
13
10
45
a)
b)
Figura IV.6. Actividad antilisteria (mg/L) para las 16 formulaciones del medio de crecimiento
estudiadas (n ensayo) para L. lactis CECT 539 (a) y CECT 4434 (b).
Tabla IV.5. Resumen de las formulaciones con mayor actividad antilisteria para L.lactis CECT
539 y CECT 4434.
L.
LACTIS
CECT
539
CECT
434
FORMULACI
N
8
2
14
3
8
14
7
9
Actividad
(UI/mL)
COMPONENTES (G/L)
X1
13,333
13,333
13,333
6,667
13,333
13,333
6,667
6,667
X2
13,333
6,667
6,667
13,333
13,333
6,667
13,333
6,667
X3
14,000
6,000
14,000
6,000
14,000
14,000
14,000
6,000
X4
6,667
6,667
13,333
6,667
6,667
13,333
6,667
13,333
X5
3,000
3,000
1,000
3,000
3,000
1,000
1,000
1,000
X6
0,047
0,167
0,167
0,047
0,047
0,167
0,167
0,167
X1: Sacarosa, X2: Peptona, X3: Extracto de levadura, X4: KH2PO4, X5: NaCl, X6:MgSO4.7H2O
46
1500
1200
1200
1000
1500
1200
1000
1000
Uno de los controles que se realiz sobre los medios de cultivo fue la determinacin
de su pH antes de la extraccin del SPP. Como se muestra en la figura IV.7. existi una
correlacin lineal, para ambas cepas, entre el pH del medio de cultivo y la actividad
antilisteria del SPP.
a)
b)
Figura IV.7. Representacin de actividad (UI/mL) frente a pH para L. lactis a) CECT 539, b)
CECT 4434.
Los resultados obtenidos indicaron una buena correlacin entre el pH del medio,
comprendido entre 4 y 6,5, y la actividad antilisteria de los sustratos parcialmente purificados
obtenidos tras incubar las distintas cepas de L. lactis en los medios de cultivo elaborados
con las 16 formulaciones testadas en esta fase del trabajo. La tabla IV.6. muestra las
ecuaciones de regresin lineal obtenidas as como los coeficientes de correlacin para cada
una de las cepas de L. lactis.
Tabla IV.6. Ecuaciones de regresin lineal y coeficientes de correlacin entre los valores de
actividad y de pH para L.lactis CECT 539 (ecuacin 11) y CECT 4434 (ecuacin 12).
N ecuacin
11
12
Ecuacin
A = 563 pH-2194
A = 558,46 pH-2088,7
R2
0,86
0,91
A: actividad (mg/L)
Lo que significa que cuanto ms elevado es el pH del medio, entre 4 y 6,5, mayor es
la actividad antilisteria. As, el control del pH es esencial a la hora de optimizar la produccin
de bacteriocinas. el pH ptimo para la sntesis de bacteriocinas es por lo general de 5,5 a 6,
valor algo menor que el ptimo para el desarrollo de las LAB, aunque este valor sufre
variaciones entre especies incluso entre cepas (Parente et al., 1994; Chinachoti et al., 1997).
47
Ecuacin
R2
0,28
0,16
A: actividad (mg/L)
X1: Sacarosa, X2: Peptona, X3: Extracto de levadura, X4: KH2PO4, X5: NaCl, X6:MgSO4.7H2O (g/L)
Al analizar los valores de los coeficientes de regresin obtenidos (R2), 0,28 y 0,17
para las cepas 539 y 4434 respectivamente, se deduce que la superficie de respuesta en
estos casos no se puede ajustar a un plano. Para obtener un mejor ajuste habra que
emplear un modelo de orden superior o bien un modelo no lineal.
Otra forma de comprobar el ajuste del modelo es comparando los resultados
obtenidos experimentalmente para cada una de las cepas con los valores predichos o
estimados por el modelo mismo.
Los resultados de actividad antilisteria (mg/L) obtenidos con los modelos lineales
anteriormente mencionados (ecuaciones 13 y 14) as como los valores reales observados,
para cada una de las formulaciones testadas, se muestran en la tabla IV.8.
48
Tabla IV.8 Diseo experimental factorial fraccionado DDF y resultados de actividad (mg/L)
observados y predichos.
L. lactis
OBSERVAD
PREDICHOS
3
OS2
1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
428,6
597,156
2
+1
-1
-1
-1
+1
+1
1200,0
859,119
3
-1
+1
-1
-1
+1
-1
1000,0
733,756
4
+1
+1
-1
-1
-1
+1
375,0
752,144
5
-1
-1
+1
-1
+1
+1
750,0
923,194
6
+1
-1
+1
-1
-1
-1
600,0
946,256
7
-1
+1
+1
-1
-1
+1
857,1
816,219
8
+1
+1
+1
-1
+1
-1
1500,0
1082,86
CECT 539
9
-1
-1
-1
+1
-1
+1
600,0
383,756
10
+1
-1
-1
+1
+1
-1
600,0
650,394
11
-1
+1
-1
+1
+1
+1
375,0
520,356
12
+1
+1
-1
+1
-1
-1
461,5
543,419
13
-1
-1
+1
+1
+1
-1
428,6
714,469
14
+1
-1
+1
+1
-1
+1
1200,0
732,856
15
-1
+1
+1
+1
-1
-1
857,1
607,494
16
+1
+1
+1
+1
+1
+1
500,0
869,456
1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
375,0
300,0
2
+1
-1
-1
-1
+1
+1
857,14
740,996
3
-1
+1
-1
-1
+1
-1
750,0
825,0
4
+1
+1
-1
-1
-1
+1
428,57
544,714
5
-1
-1
+1
-1
+1
+1
333,33
449,474
6
+1
-1
+1
-1
-1
-1
600,0
675,0
7
-1
+1
+1
-1
-1
+1
1000,0
883,856
8
+1
+1
+1
-1
+1
-1
1500,0
1425,0
CECT 4434
9
-1
-1
-1
+1
-1
+1
1000,0
1075,0
10
+1
-1
-1
+1
+1
-1
461,54
577,684
11
-1
+1
-1
+1
+1
+1
375,0
300,0
12
+1
+1
-1
+1
-1
-1
545,45
429,306
13
-1
-1
+1
+1
+1
-1
500,0
383,856
14
+1
-1
+1
+1
-1
+1
1200,0
1125,0
15
-1
+1
+1
+1
-1
-1
750,0
866,144
16
+1
+1
+1
+1
+1
+1
500,0
575,0
1: factores y niveles codificados (X1: Sacarosa, X2: Peptona, X3: Extracto de levadura, X4: KH2PO4,
X5: NaCl, X6:MgSO4.7H2O)
2: valores de actividades experimentales
3: valores de actividades calculadas segn el modelo lineal de primer orden (ecuaciones 13 y 14)
Formulacin
X1
1
X21
X3
X4
X5
X6
49
L. lactis
CECT 539
CECT 4434
FACTOR
X1:sacarosa
X2:peptona
X3:extractolevadura
X4:KH2PO4
X5:NaCl
X6:MgSO4
Error total
Total (corr.)
X1:sacarosa
X2:peptona
X3:extractolevadura
X4:KH2PO4
X5:NaCl
X6:MgSO4
Error total
Total (corr.)
SUMA DE
CUADRAD
OS
81239,3
877,641
170714
178190
59328,8
21,8556
1,25919E6
1,74956E6
GL
1
1
1
1
1
1
9
15
R2=0,28
63676,7
1
17030,9
1
158131,
1
16387,2
1
24181,0
1
2810,33
1
1,40756E6
9
1,68978E6
15
R2=0,17
CUADRAD
O MEDIO
RAZNF
VALORP
81239,3
877,641
170714
178190
59328,8
21,8556
139910
0,58
0,01
1,22
1,27
0,42
0,00
0,4656
0,9386
0,2980
0,2883
0,5312
0,9903
63676,7
17030,9
158131,
16387,2
24181,0
2810,33
156395,
0,41
0,11
1,01
0,10
0,15
0,02
0,5393
0,7490
0,3409
0,7536
0,7033
0,8963
50
51
52
Por otro lado la produccin de nisina es ptima cuando se utiliza como fuente de
carbono la glucosa, sacarosa o xilosa (Matsusaki et al., 1996; Chinachoti et al., 1997). Sin
embargo, una produccin mxima de biomasa no se corresponde con obligatoriamente con
una produccin mxima de bacteriocina (Parente y Ricciardi, 1994).
53
R2
0,94
0,99
ecuaci
n
15
16
- 4,0621X4
A: actividad (mg/L)
X3: Extracto de levadura, X4: KH2PO4 (g/L)
54
Los resultados de actividad antilisteria (mg/L) obtenidos con los modelos de segundo
orden anteriormente mencionados (ecuaciones 15 y 16) as como los valores reales
observados, para cada una de las formulaciones testadas, se muestran en la tabla IV.11,
cabe destacar que los intervalos analizados fueron de 4,34 y 15,66 g/L, correspondientes a
las codificaciones -1 y +1 respectivamente.
Tabla IV.11. Diseo experimental DCC rotable y ortogonal y resultados de actividad (mg/L)
observados y predichos.
L. lactis
CECT 539
CECT 4434
Formulaci
n
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8
X31
X41
OBSERVAD
OS2
PREDICHO
S3
-1
1
-1
1
1,414
-1,414
0
0
-1
1
-1
1
1,414
-1,414
0
0
1
1
-1
-1
0
0
1,414
-1,414
1
1
-1
-1
0
0
1,414
-1,414
850,0
1100,0
1000,0
1400,0
800,0
600,0
465,5
428,6
750,0
1100,0
750,0
1100,0
600,0
333,3
200,0
200,0
937,438
1109,18
1033,13
1270,26
885,299
514,701
397,142
496,958
773,02
1107,5
777,068
1042,41
635,437
297,863
178,406
221,594
X3:extractolevadura
X4:KH2PO4
AA
AB
BB
Error total
Total (corr.)
SUMA DE
CUADRAD
OS
60615,9
23904,3
41951,2
4403,48
67575,6
49558,1
774880
55
GL
CUADRAD
O MEDIO
1
1
1
1
1
2
7
2
R =0,93
60615,9
23904,3
41951,2
4403,48
67575,6
24779,0
RAZNF
VALOR-P
2,45
0,96
1,69
0,18
2,73
0,2583
0,4296
0,3229
0,7143
0,2405
CECT
4434
X3:extractolevadura
X4:KH2PO4
AA
AB
BB
Error total
Total (corr.)
130454
1351,11
55164,6
4923,46
38560,9
8079,73
929325
1
1
1
1
1
2
7
R2=0,99
130454
1351,11
55164,6
4923,46
38560,9
4039,86
32,29
0,33
13,66
1,22
9,55
0,0296
0,6215
0,0661
0,3847
0,0907
+
-
BB
A:extracto de levadura
AA
B:KH2PO4
AB
0
2
3
Efecto estandarizado
56
+
-
A:extracto de levadura
AA
BB
AB
B:KH2PO4
0
2
3
4
Efecto estandarizado
1500
actividad (mg/L)
1200
900
600
300
0
18
15
12
9
12
extracto de levadura
15
18
9
6
3
KH2PO4
0
actividad (mg/L)
0.0-150.0
150.0-300.0
300.0-450.0
450.0-600.0
600.0-750.0
750.0-900.0
900.0-1050.0
1050.0-1200.0
1200.0-1350.0
1350.0-1500.0
1500.0-1650.0
57
1500
actividad (mg/L)
1200
900
600
300
0
18
15
12
9
12
extracto de levadura
15
18
9
6
3
KH2PO4
0
actividad (mg/L)
0.0-150.0
150.0-300.0
300.0-450.0
450.0-600.0
600.0-750.0
750.0-900.0
900.0-1050.0
1050.0-1200.0
1200.0-1350.0
1350.0-1500.0
1500.0-1650.0
L lactis
CECT 539
L lactis
CECT 4434
Factor
X3 (g/L)
X4 (g/L)
Actividad*
(mg/L)
X3
X4
Actividad *
(mg/L)
ptimo
12,20
8,84
1421,95
12,77
10,51
1247,97
* Actividad predicha
generan un mayor actividad de las cepas L.lactis CECT 539 y CECT 4434.
Componente
Concentracin (g/L)
CECT 539
CECT 4434
58
Sacarosa
Peptona
Extracto de levadura
KH2PO4
NaCl
MgSO4.7H2O
6,667
6,667
12,20
8,84
1,000
0,047
59
6,667
6,667
12,77
10,51
1,000
0,047