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Gnie gntique

1. Prparation et extraction des ADN-ARN


Prparation hmatologique
-A partir de sang frais ou dcongel (10 30 mL de sang), faire un choc thermique en ajoutant
une solution hypotonique (permet de garder uniquement les leucocytes), raliser une
centrifugation.
- Ajouter un dtergeant SDS (dtruit les membranes, libre lADN), et la protinase K
(dtruit les histones et les protines lis l ADN)
- Extraire lADN au phnol- chloroforme le phnol permet la dprotinisation de lacide
nuclique, et le chloroforme permet denlever toute trace de rsidus.
Prcipitation lthanol glacial avec sel permet de dshydrater lADN et le sel augmente
la force ionique. (LADN prcipite sous forme de filaments)
-Solubilisation dans un tampon T10E1, pour maintenir la stabilit de lADN.
Prparation partir de tissus (ralis durant les labos)
- Dcouper le tissu, y ajouter le tampon de Lyse destruction de la paroi- cellulosique.
Constituants du tampon de Lyse :
*NaCl : les ions Na+ neutralisent les phosphates de lADN facilit laggrgation des
molcules.
*EDTA : inhibe laction des Dnases en complexant les ions Mg 2+ vite lhydrolyse de
lADN
*SDS : dtergeant ionique provoquant la dnaturation des protines et la lyse de la membrane
plasmique libre lADN du noyau.
Filtrer la suspension obtenue
-Ajouter lalcool glac apparition dun muqueux blanc dADN
-Solubiliser lADN dans un tampon T10E1

Extraction
Cette mthode consiste liminer toute sorte de contaminants pouvant tre prsent dans
lchantillon dADN.
Extraction au phnol- chloroforme : agiter lchantillon, centrifuger basse vitesse,
rcuprer la phase aqueuse qui contient les acides nucliques.
Extraction lisobutanol : limine les contaminants organiques, se fait aprs les tapes
prables enzymatique ou de sparation.

Prcipitations
Cette mthode permet de rcuprer les acides nucliques sous forme solide, et concentrs.
Prcipitation lthanol et sel : en ajoutant de lthanol, un prcipit dADN y est rcupr.
Pour ce faire, lthanol doit tre glac (-20), contenir un sel (haute force ionique). Le
rendement final est lev.
Prcipitation lisopropanol : lADN peut aussi tre prcipit lisopropanol pour de petits
volumes. Il ny a pas besoin de sel, retire les fragments de faible PM, rinage lthanol.

Dosage des acides nucliques


Cette mthode permet de vrifier la qualit dextraction de lADN par un spectrophotomtre.
Pour estimer la contamination dun chantillon, on procde en absorbant une longueur
donde de 260 nm et 280 nm. (Les protines absorbent 260 et 280 nm)
Suite aux rsultats obtenues, on effectue le rapport des 2 DO :
ADN propre : DO 260/DO280 1.8 2
Si le rapport est bas : restent des protines.
Si le rapport est haut : traces dARN ou petits fragments.

2. Sparation des ADN / ARN


Ultracentrifugation
La centrifugation est une technique analytique et prparative permettant la sparation des
particules solides des substances en solution.
-En gradient continu de CsCl : permet de sparer diffrents types dADN (chromosomiques et
plasmidiques) dans un gradient de chlorure de csium rserv aux purifications prcises.
-En gradient saccharose : permet de sparer les constituants cellulaires (membrane- cytosol)
classique et rapide.
- En gradient discontinu (sur coussin) : prparation massives de phages.
Remarques : Il est important dquilibrer les centrifugeuses. En plaant les tubes de masses
gales en opposition. Si les masses sont trop diffrentes, possibilit dquilibrer avec des
tubes deau.
Chromatographie

- Exclusion molculaire sur gel : utilise pour une sparation en fonction du PM, retiens les
nuclotides libres, les sondes non hybrides.
- Echangeuse dion : retiens les acides nucliques en raison de leur charge, retiens des petites
quantits dADN aprs modification.
- Chromatographie daffinit : utilise pour reconnaitre une squence prcise. (+/_)
- HPLC : utilise lorsque il faut une forte rsolution en fonction de la taille, prpare les
oligonuclotides de synthse, les plasmides, les fragments,

Electrophorse
Technique de sparation analytique et prparative.
Llectrophorse nest pas utilise uniquement en mthode analytique, elle est aussi utilise
pour purifier les fragments dADN.
La migration de lADN se fait travers un gel rticul dans un champ lectrique.
les acides nucliques anioniques migrent vers lanode
- la migration se fait en fonction de la masse molculaire de lADN et le type de gel
Types dlectrophorse :
- Gel dagarose : convient pour la sparation de fragments dADN de tailles comprises entre
quelques centaines de paires de bases et +- 20 Kb trs utilis, la migration se fait
lhorizontal, le tampon utilis pour cette migration est basique ( tris- Borate-EDTA).
- Gel dacrylamide : utilis pour sparer des fragments dADN plus petits ; infrieur 1Kb
la migration se fait verticale entre 2 plaques de verre, trs rsolutif car purifie les
oligonuclotides, dtermine des squences.
- Electrophorse en champs pulss : permet de sparer des molcules de tailles allant jusqu
10 Mb dans des gels dagarose.
Analyse des gels :
- Le tampon de charge utilis pour la migration lectrophortique permet un suivi des
migrations en temps rel.
(Role ?)
Coloration pendant et aprs la migration :
* bromure dthidium, ractif mlang de lADN. Il sintercale entre les brins dADN.
* Dtection ralise par exposition aux U.V, fluorescence orange aprs raction avec le BET
- La migration est inversement propre au log du nombre de Pb obtenues ltalonnage se
fait avec des marqueurs de poids molculaires connues.