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Construo de sistemas de expresso

1)
- LacIq pTac -> amplificado do pMAL2-c2X -> clonado para vector pHeL2
- LacZ -> clonado entre SpeI e BamHI dos stios de clonagem de pHeL2
-pHeL2- TL-> introduzido na estirpe N6 de H.pylori.
- Mediu-se a atividade da B-galactosidase na presena de IPTG
. Problemas:
-produo de B- galactosidase foi baixa
- observou-se atividade B- galactosidase residual sem a adio de IPTG.
* Problema devido => falta de reconhecimento de promotores E.coli pela
RNA polimerase da Hpylon ( diferenas entre os fatores sgima codificados
por genes rpoD da E.coli e H.pylori)
Resolveu-se a fuga de plasmdeo pHeL2-TL => pela adio uma 2 copia de
LacIq sob o controlo do promotor amiE => gerando plasmdeo PILL2150 : h
boa leitura de B-galactosidase. Logo, pode ser usado para controlar a
expresso genes essenciais de H.pylori para estudar o papel fisiologico das
proteinas codificantes sob condies com falta de IPTG.

2)
Melhorar o nvel de produo de B-galactosidase para se poder usar os
plasmdeos para controlar a produo de protena recombinante, interaes
proteina-proteina ou expresso de RNAs antisense(?)
Em pILL2150, apenas o 2 lacIq ficou sob o conrolo de um promotor de fora
(pamiE) ento, para substituir a regio LacI q- pTac por outro promotor de
fora, usou-se ureI.
Criou-se os primers pureI-LacI(op)- BgLII e pureI-LacI(op)-SpeI onde foi
introduzido um sitio de ligao LacI que no afetou as caixas -35 e -10
Amplificou-se o promotor ureI usando os primers (pureI-LacI(op)- BgLII
e pureI-LacI(op)-SpeI) e colonaram-se ambos em pHeL2-TL e pILL2150
por substituio da regio LacI9-pTac => criando pILL2151 e pILL2153
*a introduo do sitio de ligao da lacI no afetou a funcionalidade de pureI
(Pill2151) ver na FIGURA1
No entanto, a represso no foi eficiente o suficiente para permitir o estudo
de por exemplo o efeito da expresso exagerada do crescimento de
interaes protena-proteina.
Na ausncia de IPTG, pILL2153 expressou razoveis actividades de bgalactosidase

Portanto: decidiu-se introduzir um novo sitio de ligao de LacI. Ao mesmo


tempo inverteu-se 2 nucleotidos nas posies -3 e -2 de AC para CA para
restaurar o sitio de NdeI, gerando o plasmideo pILL2157.
Resultou no melhoramento substancial da regulao do gene LacZ e na
produo de B- galactosidase comparado com pILL2153.
O plasmdeo PILL2157 continou com fugas e a actividade da B-galactosidase
foi significante sem IPTG.

Portanto, PILL2157 podia ser usado para constuir mutantes condicionais de


genes altamente expressos, protenas recombinantes de H.pyloi, domnios
de interao protena-proteina sob condies nativas ou RNA antisense
enquanto pILL2150 podia ser usada para genes expressos a baixos nveis.

Em estudos recentes, foi possvel mostrar que a actividade da protena de


Hpylori podia ser titulada recorrendo concentracoes de IPTG e ao plasmdeo
lisado (pILL2150 ou pILL2157)
No entanto, uma limitao poderia ser: a toxicidade dos genes da Hpylori
para a E.Coli explica fugas, que podem dever-se falta de reconhecimento
do gene promotor amiE pelo RNA polimerase da E.Coli e consequentemente
a m expresso do repressor LacI na E.Coli.

Para ultrapassar potenciais problemas de toxicidade: usa-se as estirpes de


E.coli que contenham um gene repressor LacI altamente expresso.

Criao de mutantes:

Para validar o que foi feito criou-se mutantes de genes pensados ou


essenciais. Selecionaram-se pbp1 e fts1 que foram comprovados como
essenciais atravs de sucessivas tentativas de inactivao por uma
cassete no polar de canamicina.
Os genes foram clonados em pILL2150 gerando pILL2161 e pILL2163, (pbp1
e fts1, respectivamente)
Os plasmdeos resultantes foram transformados na estirpe N6 e geraram
estirpes com 2 cpias de cada gene seleccionado (ou pbp1 ou fts1).
Para tentar inactivar a cpia cromossmica de cada gene, amplificaram-se
as regies laterais 500bp de cada gene e geraram uma regio de 3
fragmentos em que cada gene de interesse foi substitudo por uma
cassete no polar de canamicina.
Transformaram-se os diferentes derivados de N6 que contm as duas cpias
do gene pbp1 de interesse com os 3 fragmentos que contm os pbp-no
correspondentes na presena ou ausncia de IPTG.

Tabela 2
A seleco de clones resistentes canamicina dependia da presena de
IPTG. Os poucos clones que cresceram em placas sem IPTG podem ser
explicados por mutantes promotores que perderam a forte regulao por
LacI9 ou Lac9-sem mutaes.

Selecionaram-se, ao acaso, 8 clones de cada mutao e confirmou-se por


amplificao PCR a deleo da copia do gene cromossmico.
O crescimento de clones seleccionados foi estritamente dependente da
adio de IPTG.

Anlise dos fentipos morfolgicos mutantes:


PBP1 e PBP3 codificados por pbp1 e fts1 so protenas de ligao de
penicilina que podero estar envolvidas na juno (ligao) peptidoglicanica
e morfologia bacteriana.
Selecionou-se um clone representativo de mutantes pbp1 e fts1 para
estudar os efeitos da sua depleo na morfologia da Hpylori.
Depleo de PBP1 levou paragem prematura do crescimento aps 2 ou 3
geraes.
Em contraste, a depleo de PBP3 no teve impacto no crescimento
bacteriano nas culturas liquidas.
Depois, fez-se scanning microscpico electrnico dos mutantes sob
condies deplectivas.
Depleo de PBP1 levou formao prematura de bactrias cocos enquanto
a depleo de PBP3 levou formao de bactrias filamentosas (fig. 5)
PBP3 = 20uM (que na estirpe N6 era 2uM)

FOLHA 3

N6 ftsI

K2 PILL2163 com IPTG apresentou umas bactrias mais longas

(3 a 4m) indicando que o nvel de expresso ftsI do plasmdeo pILL2163


no compensou totalmente a deleo da copia cromossimica de ftsI.
A inibio da acividade dos fentipos na H.pylori por diferentes antibiticos
B-lactam sugeriu um papel do PBP1 na manuteno da morfologia
espiral/em roda e PBP3 na diviso celular.
Juntos, formou-se o 1 mutante da H.pylori.

Transformao do pILL2150 e pILL2157 em diferentes isolados


- estirpes de H.pylori tem uma alta diversidade devido recombinao e
altos nveis de mutaes.
Barreiras de restrio modificaes imitaram o uso de pHeL2 para
algumas estirpes.
Tabela 3- mostra a dificuldade de introduzir pHeL2 em 5 diferentes
gentipos.
Enquanto que N6 foi transformada com eficincia com pILL2150 e pILL2157,
nenhuma ds ouras estirpes estava aberta a receber os 2 plasmideos.
Para expandir o leque de estirpes capazes de aceitar estes vetores de
expresso adaptou-se o processo de metilao in vitro.
Em comparao ao plasmdeo de DNA directamente purificado da E.coli, a
metilao do plasmdeo de DNA in vitro com extratos de protena de cada
estirpe receptora levou a isolao consistente de clones resistentes a
clorafenicol , apesar da baixa frequncia em comparao altamente
transformante N6.
Como se estimou a concentrao de plasmdeo intacto apos a metilao in
vivtro por eletroforese em gel de agarose, a baixa frequncia de
transformantes provavelmente devido a diferenas intrnsecas na eficcia
na transformao de cada estirpe em relao a estirpe 6.
A baixa frequncia pode tambm ser explicada pela instabilidade destes
plasmdeos nas diferentes estirpes.
De qualquer forma, foi possvel purificar o plasmdeo pILL2150 da estirpe
B38(Figura 9) que indica que o plasmdeo pode ser mantido em outras
origens genticas que no o N6.