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Universidad Tecnolgica de Puebla

Carrera de Qumica rea Tecnologa Ambiental


Asignatura: Microbiologa Ambiental

Prctica No. 9 Cuantificacin de bacterias Coliformes Totales y


Fecales de una muestra de Agua por la metodologa de filtro de
membrana.
Objetivo:
Conocer y aplicar la metodologa de filtro de membrana para evaluar la
calidad sanitaria del agua y obtener un resultado directo de la
concentracin de bacterias Coliformes.
Introduccin:
Antes de la segunda guerra mundial se empez a pensar en la aplicacin
de filtros de membrana en el examen bacteriolgico del agua (recuento
de bacterias, determinacin de Coliformes, aislamiento de patgenos).
Alemania y Rusia fueron los primeros pases en aplicar esta tcnica y
principalmente Alemania, cuando tuvo muchos de sus laboratorios
destruidos por el efecto de la guerra.
En 1955 la dcima edicin de los Standard Methods for Examinatin
of
Water, Sewage and Industrial Wastes lo inclua como mtodo
tentativo en la determinacin de coliformes. Posteriormente, en las
ediciones 11 y 12 ediciones de la publicacin, este mtodo se hizo
oficial para la determinacin de coliformes.
Actualmente la prueba de filtro de membrana est siendo utilizada como
un mtodo normalizado para evaluar la calidad sanitaria del agua y
definir su potabilidad. La mayora de las muestras de agua puede ser
analizada por los mtodos de filtros de membrana.
La prueba de Filtro de Membrana es altamente reproducible, puede
utilizarse para estudiar volmenes relativamente grandes de muestra y
proporciona resultados numricos ms rpidos que el mtodo de los
tubos mltiples. Este mtodo es muy til para controlar las posibles
situaciones de urgencia en relacin con el agua potable y para estudiar
distintas aguas naturales.
Ventajas del uso de Filtro de membrana para las aguas:
1.

Rapidez en la obtencin de resultados

2.

Ahorro de manos de obra, medios, materiales de vidrios, y coste


de los materiales si el filtro se lava y se vuelve a utilizar.

3.

Pueden exponerse los organismos a medio de enriquecimiento


muy fcilmente durante un corto tiempo y a una temperatura
conveniente.

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Sin embargo, esta tcnica tiene limitaciones sobre todo para estudiar
aguas con elevada turbidez o que contengan bacterias No Coliformes.
Para estas aguas, y tambin en caso de que no se haya utilizado
anteriormente la tcnica del filtro de membrana, es preferible llevar a
cabo pruebas paralelas mediante la tcnica de fermentacin en tubos
mltiples para demostrar la aplicabilidad y comparabilidad de aqulla.
Principio del mtodo:
Recuento de Coliformes en Filtro de Membranas (Mtodo):
Se hace pasar al vaco parte de la muestra por una membrana de
filtracin de acetatos de celulosa con poros y dimetro de 0.45 m que
capte la bacteria, en tanto que permita el paso libre del H 2O.,
la membrana de filtracin se coloca aspticamente en una caja de petri
en medio de cultivo nutritivo, o en un cojincillo absorbente saturado con
un medio de cultivo nutritivo, se incuba, se examina la membrana con
microscopio de poca potencia y se cuentan las colonias.
MARCO TERICO
Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y
constituyen un grupo de bacterias que se definen ms por las pruebas
usadas para su aislamiento que por criterios taxonmicos. Pertenecen a
la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para
fermentar la lactosa con produccin de cido y gas, ms o menos
rpidamente, en un periodo de 48 horas y con una temperatura de
incubacin
comprendida
entre
30-37C.
Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no
esporulados. Del grupo <<coliforme>> forman parte varios gneros:
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en
el intestino del hombre y de los animales, pero tambin en otros
ambientes:
agua,
suelo,
plantas,
cscara
de
huevo,
etc.
Una elevada proporcin de los coliformes que existen en los sistemas de
distribucin no se debe a un fallo en el tratamiento en la planta, sino a
un recrecimiento de las bacterias en las conducciones. Dado que es
difcil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas
contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son
nuevas contaminaciones, mientras no se demuestre lo contrario.
Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el
de los Coliformes fecales. Los coliformes fecales son coliformes totales
que adems fermentan la lactosa con produccin de cido y gas en 24-

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48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45C en presencia de


sales biliares. Los coliformes fecales comprenden principalmente
Escherichia coli y algunas cepas de Enterobacter y Klebsiella.
Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran ndices de
contaminacin fecal. Pero el verdadero ndice de contaminacin fecal es
Escherichia coli tipo I ya que su origen fecal es seguro. Desde el punto
de vista metodolgico Escherichia coli es el Coliforme s es positivo a la
prueba del Indol.

Filtros de superficie de membrana


Elaborados generalmente de acetato de celilosa o nitrato de celulosa,
contiene poros de tamao uniforme. Se puede saturar rapidamente y la
velocidad del filtrado a traves de ella es muy lenta.
Membrana de nitrato de celulosa.
La nitrocelulosa es un material utilizado de manera habitual para la
fabricacin de filtros de membrana. Estas membranas son de naturaleza
hidroflica, es muy uniforme lo que permite excelentes niveles de
retencin de partculas y un comportamiento perfecto en pruebas
microbiolgicas.
Membrana de acetato de celulosa
Son de naturaleza hidroflica, permite gran capacidad de carga y altas
velocidades de flujo, por lo que resulta apropiado para la esterilizacin y
clarificacin de soluciones acuosas, alcohlicas y aceites.
Las partculas ms grandes que el tamao del poro son rechazados por
la superficie de la membrana y el remanente permanecen o se
concentra all. El volumen del flujo y otras partculas finas de menor
tamao del poro pueden pasar a travs de la membrana del sitio de
filtrado.
1 Pinza de punta redonda
1
Equipo
de
Filtracin
METODOLOGA esterilizado
1 mechero
1 Matraz de Kitasato
1 Bomba de Vaco
1 Vaso de precipitados de
250ml
2 Membranas para filtrar con
poro de 0.45m estriles
4 Pipetas de 10 ml estriles

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Materiales, equipos y reactivos


Materiales
1 parrila
1 esptula
1 matraz erlenmeyer de 250 ml
1 matraz erlenmeyer de 100 ml
1 varilla de vidrio
1 probeta de 100 ml
1 balanza granataria
1 pipeta Pasteur
10 tubos de 13 x 100 mm
1 gradilla
1pipeta de 1 ml
1 pipeta de 5 ml
1 matraz aforado de 200ml
2 matraces aforados de 50 ml
1 vaso de precipitados de 200 ml
1 vidrio de reloj
Reactivos:
Fosfato dicido potsio (KH2PO4)
Sulfato de magnesio heptahidratado
(MgSO4.7H2O)
NaOH 1 N
Medios de cultivo: TSI, SIM, UREA, RM-VP,
Endo
Reactivo para Tincin de Gram
Reactivo de Kovacs
Alcohol etlico
Agua destilada

Metodologa
Determinacin de Coliformes totales y coliformes fecales por la
metodologa de Filtro de Membrana
A. Procedimiento para la preparacin de los materiales y equipos a
utilizar.
El equipo de filtracin debe estar esterilizado al comienzo de cada serie
de filtraciones que pueden ser 30 o ms muestras. Una filtracin en
serie se considera interrumpida si hay un intervalo de 30 minutos o ms
entre las filtraciones de las muestras.

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1. La esterilizacin del equipo de filtracin debe realizarse en autoclave,


separando ambas partes del equipo y envolvindolas en papel grueso;
121C por 15 minutos.
2. Los filtros de membrana se deben esterilizar en un recipiente (vidrio)
por autoclave, 121C por 10 minutos, al finalizar la esterilizacin, deje
que el vapor escape rpidamente para reducir en lo posible la
acumulacin de agua de condensacin en los filtros.
3. Pinzas. Se seleccionarn las que tienen extremos redondos y punta
recta, no es conveniente que tengan rugosidades, pues pueden daar
las membranas al momento de trasladarlas al equipo de filtracin.
4. Almohadillas absorbentes para medios de cultivo. Deben ser de papel
filtro, con medidas de 48 mm de dimetro y un grosor suficiente para
absorber 1.8 a 2.2 ml de medio de cultivo. Deben ser esterilizados
previamente en autoclave a 121C durante 10 minutos.
5. Incubadora de bao de agua (bao Mara). Debe mantener la
temperatura a 44 +/- 0.5C, con agitador para mantener la temperatura
uniforme.
6. Matraz de Kitasato. Deben ser de vidrio; se colocan entre el equipo de
filtracin y la bomba de vaco.
7. Vasos de precipitado con alcohol al 95% para esterilizar las pinzas.
8. Bomba de vaco.
9. Placas de Petri estriles
Medios de cultivo y diluciones
10. Agar Endo o almohadilla embebida con medio Endo. Preparar y
esterilizar conforme lo establece el vial del medio de cultivo.
11. Preparacin del agua de dilucin amortiguada
Solucin stock A
Fosfato dicido potsico (KH2PO4) 34 g
Agua destilada
1000 ml
Disolver el fosfato dicido de potasio en 500 ml de agua destilada,
ajustar el pH a 7.2 con NaOH 1 N y completar el volumen para un litro,
con agua destilada.
Solucin Sotck B
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) 50 g
Agua destilada
1000 ml
Disolver el sulfato de magnesio en 500 ml de agua destilada y aforar a 1
litro.
Preparacin del agua de dilucin amortiguada.
Agregar 1.25 ml de la solucin Stock A y 5 ml de la solucin Stock B a
una litro de agua destilada. Distribuir en cantidades de 90 ml. Esterilizar
a 121C por 15 minutos.
Nota: considere que cada frasco contendr adems 10 ml de muestra.
12. Preparar 50 ml de solucin de hidrxido de sodio 1 N
14. Esterilizar 2 frascos conteniendo 100 ml de agua de dilucin
amortiguada cada uno.

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15. Esterilizar 4 pipetas de 10 ml.


16. Esterilizar un frasco para recolectar la muestra.
B. Procedimiento para la dilucin de las muestras:
Para aguas residuales domsticas es necesario previamente diluir las
muestras teniendo en consideracin que el nmero ideal de colonias en
el filtro de membrana sea de 20 a 60 para la determinacin de
Coliformes.
Tipo de muestra

Agua
Agua
Agua
Agua

residual
residual
residual
residual

cruda
efluente primario
efluente secundario
efluente terciario

Volumen necesario
10- 10- 10- 10-

10-

10-

10-

x
x

x
x

X
X
X

x
x
x
x

El equipo de filtracin debe estar esterilizado al comienzo de cada serie


de filtraciones. Se considera interrumpida una filtracin en serie cuando
hay un intervalo de 30 minutos o ms entre las filtraciones de muestras.
Si es necesario esterilizar el equipo durante el da varias veces, es
aconsejable exponer el embudo y el soporte a la luz ultravioleta durante
dos minutos. La esterilizacin puede ser efectuada tambin con agua
hirviendo.
Par asegurar que no existe contaminacin, al comenzar las pruebas se
debe someter a filtracin unos 100 ml de agua dilucin estril, antes de
iniciar la filtracin de las muestras.
C. Filtracin y siembra de la muestra (operacin repetida por dos).
Elegir la dilucin adecuada y filtrarla hacindola pasar a travs de la
membrana de celulosa de 0.45 m.
Posteriormente lavar el embudo tres veces con volmenes de 20-30 ml
de dilucin estril
Con la pinza estril retirar la membrana de la unidad de filtracin y
colocar con extremo cuidado sobre la placa del agar Endo o sobre la
almohadilla impregnada con caldo Endo.
Apoyarse en el siguiente diagrama:
Diagrama de la cuantificacin de bacterias Coliformes por la
Metodologa de Filtro de Membrana
10-1
10 ml

10-2
10 ml

10-3
10 ml

10-4
10 ml

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90 ml de
dilucin
amortigua
da

Muestra
de agua
cruda

Volumen a filtrar

90 ml de
dilucin
amortigua
da

10 ml

90 ml de
dilucin
amortigua
da

10 ml

90 ml de
dilucin
amortigua
da
10 ml

10 ml

Equipo de filtracin
estril

Transferir la membrana
utilizando pinzas estriles

Placas con agar Endo o con


almohadillas impregnadas con
caldo Endo

Volumen de
muestra
original
filtrada 0.1
ml

35
C

Volumen de
muestra
original
filtrada
0.001 ml

Volumen de
muestra
original
filtrada 0.01
ml

44
C

35
C

44
C

35
C

Volumen de
muestra
original
filtrada
0.0001 ml

44
C

35
C

44
C

35C incubacin/24h con paos hmedos en la estufa


Recuento
de colonias con reflexin de brillo verde amarillento metlico
Reportar como:
UFC de Coliformes Totales/100ml (Multiplicar por el
factor de dilucin empleado en su caso).
44C incubacin/24h en Bao Mara
Recuento de colonias con
reflexin de brillo verde amarillento metlico
Reportar como:
UFC de Coliformes Fecales/100ml.
(Multiplicar por el factor de dilucin empleado en su caso).

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En ambos casos comprobar la presencia de bacterias Coliformes con las


pruebas bioqumicas: TSI, SIM, UREA, OXIDASA, RM-VP, TINCIN DE
GRAM, siguiendo las temperaturas de incubacin como corresponde en
casa caso.
RESULTADOS
Se llevaron a cabo 2 diluciones (10-2 )
Agua
de
amortiguadora

dilucin Resultados

2 diluciones X 90 ml
=180 ml
180ml
+
800ml
(dilacin =980ml
amortiguadora para lavar cada
filtro)
980 ml + 20 de excedente
=1000ml
Solucin stock A
Fosfato didico 34g
de potasio
Agua destilada

Solucin stock B
Sulfato
de 50g
magnesio
heptahidratado
Aguas destilada 1000ml

1000ml

Clculos para agar ENDO


Para 3 placas de 35ml c/u = 115
ml
41.5g
1000ml
4.7725 g
115ml

Salida PTR (efluente)


Dilucin
10-1

UFC/100ml
CT (37C)
Incontable

UFC/100ml
CF(44C)
Incontable

10-2

Incontable

Incontable

-3

10

24 colonias
8 colonias
= 24,000 UFC/100ml de = 8,000 UFC/100ml de
CT.
CF

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10-4

Incontable

5 colonias
= 5,000 UFC/100 ml de
CF

Salida del canal de juncos


Dilucin
10-1

UFC/100ml
CT (37C)
Incontable

UFC/100ml
CF (44C)
Incontable

10-2

Incontable

Incontable

10-3

Incontable

Incontable

10-4

60 colonias
CT
=
UFC/100ml

51 colonias
600,000 CF= 510,000 UFC/100ml

ANLISIS DE RESULTADOS
Recuento de las colonias Tras la incubacin, se observan las colonias
bacterianas sobre la superficie del agar. Cada colonia representa a una
unidad formadora de colonia (UFC). Usualmente una UFC se corresponde
con una clula viable.
Cuando se obtienen recuentos de ms de 200 colonias sobre una misma
membrana pueden dar resultados errneos debido a la superpoblacin,
ya que lo que aparece como una colonia puede ser originado por varias
bacterias bajo condiciones de hacinamiento

Cuestionario
1. Cul es el uso recomendado de los filtros de membrana?
Se debe utilizar filtros de membrana con un diametro de poro que
permita una completa retencin de las bacterias colifotmes. Solo se

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emplean filtros en los que se haya comprovado, mediante una adecuada


prueba de control de calidad y por garantia del fabricante, que permita
una retencin de las bacterias caloformes.
Se recomienda utilizar filtros de membrana preesterilizados o en todo
caso esterilizar en el laboratorio en la autoclave por 15 minutos a 120C
2. Cules son las limitaciones del filtro de membrana?
Tiene limitacin para estudiar aguas con elevada turbidez o que
contengan bacterias No Coliformes
3. Adems de la filtracin, qu otros mtodos fsicos hay para el control
de microorganismos?
Las de tubos mltiples
4. Cul es la ventaja y desventaja de usar el mtodo de filtro de
membrana para la determinacin de bacterias coliformes?
Ventajas del uso de Filtro de membrana:
Rapidez en la obtencin de resultados
Ahorro de manos de obra, medios, materiales de vidrios, y coste de los
materiales si el filtro se lava y se vuelve a utilizar.
Pueden exponerse los organismos a medio de enriquecimiento muy
fcilmente durante un corto tiempo y a una temperatura conveniente.
Desventajas:
Interfieren los altos niveles de turbiedad
Las altas concentraciones de no coliformes interfieren en el recuento.

Conclusin
El conteo
diferencia
iguales y
coliformes

con filtro membrana es un conteo real y no estadstico, a


del ensayo con tubos mltiples; los dos resultados no son
generalmente se obtiene una recuperacin ms alta de
en el conteo con filtro membrana; adems, el conteo en filtro

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membrana puede hacerse a las 24 horas y no es necesario esperar las


48 horas requeridas en el ensayo de tubos de fermentacin, en su etapa
presuntiva.
La tcnica del filtro membrana puede usarse con mucho xito en el
anlisis de aguas salinas y otras, sin embargo, tiene limitaciones en el
anlisis de aguas turbias o aguas con proporciones altas de bacterias no
coliformes, debido a que el filtro puede obstruirse.
Bibliografa
Microbiologa. Pelczar/Reid/Chan. 1977. Cuarta Edicin. Editorial Mc Graw
Hill
Mtodos Normalizados para el anlisis de aguas potables y residuales.
APHA, AWWA, WPCF. 1992. Ediciones Daz de Santos.

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CARRERA QUMICA REA AMBIENTAL

RBRICA PARA EVALUAR REPORTES DE PRCTICAS DE LA ASIGNATURA DE


MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
CUATRIMESTRE: MAYO/AGOSTO-3013
No.

Concepto

Ponderacin

1.

El Marco terico fundamenta los temas sustantivos de la


prctica.

1 punto

2.

La Metodologa contempla con detalle: los requerimientos en


materiales, equipos y reactivos, el procedimiento

Los resultados se expresan adecuadamente utilizando


nombres y frmulas

1 punto

4.

La discusin de los resultados es congruente con el objetivo

1 punto

5.

La conclusin describe la evidencia y tiene una aplicacin con


el perfil profesional.

2 puntos

La bibliografa consultada y reportada es acorde al tema

7.

El trabajo se elabor respetando reglas ortogrficas y


redaccin.

1 punto

Las respuestas del cuestionario tienen congruencia con el


desarrollo de la prctica y las observaciones registradas
durante la misma.

1 punto

9.

La entrega del reporte de la prctica fue en tiempo y forma.

1 punto

10.

Durante la prctica se condujo con las medidas pertinentes y


adecuados de seguridad e higiene

0.5 puntos

Total

Observaciones:

0.5 puntos

1 punto

10

Calificacin

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Asignatura: Microbiologa Ambiental

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Asignatura: Microbiologa Ambiental

Prctica 7: Cuantificacin de bacterias Coliformes Totales y


Fecales de una muestra de Agua por la metodologa de filtro
de membrana.

Nombre del alumno: Marlen Tlapanco Contreras


Grado: 3do

Grupo: A

Nombre del profesor(a): Maria Oneida Rosado Garca

13-agosto- 2013