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Detección  de  quitina  en  paredes  fúngicas  
 Aplicaciones:  


Aplicable  a  secciones  de  muestras  frescas  o  secciones  obtenidas  por  congelación.  
Microscopía  de  campo  luminoso,  epifluorescencia  (cubos  U-­‐MWV2,  UV)  y  Confocal.  

Método  para  microscopía  de  campo  luminoso.  
1.

Preparación  de  las  muestras:  
a. Decoloración  de  las  hojas  afectadas.  Tratar  con  un  solución  de  0.15%  (p/v)  de  ácido  
tricloroacético  en  una  mezcla  3:1  (v:v)  de  etanol  y  cloroformo,  durante  12  horas.  
b. Tinción  de  las  hojas  decoloradas.  Tratar  las  muestras  con  una  solución  0.025%  (p/v)  de  azul  
de  anilina  en  lactofenol,  durante  2  h.  
c. Montar  y  observar  al  microscopio  de  campo  claro  y  Nomarski.  

Soluciones:  

Solución  0.15%  de  ácido  tricloroacético  (TCA):  Disolver  0.15  g  TCA  en  100  mL  de  una  mezcla  
3:1  (v/v)  de  etanol:cloroformo.  

Solución  de  anilina  al  0.025%:  Disolver  25  mg    de  azul  de  anilina  en  100  mL  de  lactofenol.  

Reactivos:  



Ácido  Tricloroacético  (Trichloroacetic  Acid;  PANREAC:  151067)  
Azul  de  anilina  (Aniline  Blue;  MERCK:  1275).  
Lactofenol  (Lactophenol;  PANREAC:  251837)  
Etanol  

Cloroformo  (Triclorometano;  PANREAC:  363101)  

Método  para  microscopía  de  epifluorescencia  y  Confocal.  
Para  hifas  endofíticas:  
a. Se  tratan,  bajo  vacío,  trozos  de  hojas  afectadas  con  una  solución  de  Isotiocianato  de  
Fluoresceína  conjugada  con  Aglutinina  de  Trigo  (WGA-­‐FITC),  diluida  a  100  µg/mL  con  PBS,  
pH  7,3.  Tratar  durante  10  min.  
b. Lavar  3  veces  con  PBS  (1  h  cada  vez)  
c. Montar  con  0.1%  (p/v)  de  p-­‐fenilendiamina  (solución  antifade).  
d. Observar  con  epifluorescencia  (cubo  U-­‐MWB2)  o  con  Confocal  (Blue  Diode).  
2. Para  hifas  superficiales:  
a. Sumergir  (5  min)  los  trozos  de  hoja  afectada  en  una  solución  acuosa  al  0.01%  (p/v)  de  
primulina.  
b. Lavar  y  montar  con  una  solución  antifade.  
c. Observar  con  epifluorescencia  (cubo  U-­‐MWB2)  o  con  Confocal  (Blue  Diode).  
3. Observación  en  el  Confocal:  
a. Usar  un  objetivo  Planapo  x83,  AN  1.2,  wáter  inmersión.  
b. Usar  laser  de  Argón  488  para  excitación.  
1.

 

 

 

Laboratorio  de  Anatomía  e  Histología  Vegetal  “Julio  Iranzo”.  Jardín  Botánico  de  Valencia  

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Protocolos  de  Tinción   2   Detección  de  quitina  en  paredes  fúngicas     Soluciones:   • Solución  de  Isotiocianato  de  Fluoresceína  conjugada  con  Aglutinina  de  Trigo  (WGA-­‐FITC)  diluida  a   100  µg/mL  con  PBS.  J.  C.  (1999).&  Lucas..  SIGMA  206865).  (WGA  FITC  conjugate.3   • • Solución  acuosa  al  0.   Reactivos:   • Isotiocianato  de  Fluoresceína  conjugada  con  Aglutinina  de  Trigo  (WGA-­‐FITC).  Stomatal  penetration  of  cowpea   (Vigna  unguiculata)  leaves  by  a  Colletotrichum  species  causing  latent  Anthracnose.  Plant  Pathology   48:  777–785   Laboratorio  de  Anatomía  e  Histología  Vegetal  “Julio  Iranzo”.1%  (p/v)  de  p-­‐fenilendiamina.   PBS  (Phosphate  buffered  saline.  A.   Solución  antifade  de  0.  Nash.  R.  pH  7.   • p-­‐fenilendiamina  (p-­‐Phenylenediamine.  O’Connell.  O.  A.01%  (p/v)  de  primulina.   SIGMA  L4895)   • • Primulina  (Primuline.  Jardín  Botánico  de  Valencia   Página  2   .  MERCK:  807246).  SIGMA  P4417)   Referencias:   •     Latunde-­‐Dada.  J.