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Biologia Molecolare

a. a. 2011/2012

Prof. Campo

I Lezione

02/05/2012

Il modulo sar diviso in due parti essenziali: una prima parte generale dove verranno presentati i
meccanismi molecolari che riguardano gli acidi nucleici; poi alla fine del corso alcuni argomenti di
biologia molecolare avanzata.
La biologia molecolare la biochimica del nucleo che il motore della cellula. una materia che
interessa tutte le discipline che verranno studiate nel corso degli studi in Medicina, sia per quanto
riguarda la parte basale, cio le materie di base, ma soprattutto per quelle che sono le materie
cliniche perch, tutte le materie cliniche ad eccezione delle materie chirurgiche, si basano
esclusivamente sulla biologia molecolare.

La struttura del DNA


In questa slide si pu vedere il dogma della biologia molecolare, ossia quello che il flusso
dellinformazione molecolare che contenuta nella molecola di DNA.
Come da immagine, il DNA ha tre propriet fondamentali da un punto di vista funzionale che sono:
la capacit di perpetuare s stesso attraverso il processo della replicazione quindi di formare
delle molecole identiche a s stesso, non solo la molecola di DNA in s ma anche altre
modifiche e in questo modo le molecole duplicate e quindi perfettamente identiche potranno
essere trascritte alle cellule figlie, se ci si riferisce al livello cellulare, se si ci riferisce al
livello di organismo potr essere trascritto dai genitori ai figli;
la capacit di riparare i danni che esso subisce continuamente a causa di diversi agenti
chimici, fisici; anche la stessa molecola dacqua capace di alterarne la struttura del DNA:
la capacit di trasferire linformazione molecolare che esso contiene ad unaltra molecola
che lRNA attraverso il processo della trascrizione e poi, gli RNA, o meglio la maggior
parte degli RNA, concorreranno alla fase finale di questo processo che la traduzione del
messaggio molecolare che un messaggio chimico che dar origine ad una proteina.
Questi saranno gli argomenti di base che verranno analizzati nel corso delle 24 ore a disposizione.
Questo dogma fondamentale sulla base di nuovissime scoperte comincia a vacillare non tanto come
flusso unidirezionale ma come capacit del DNA di poter funzionare anche in modo diverso rispetto
alle tre funzioni fondamentali appena accennate.
Se il DNA viene sottoposto ad un campo EM a bassa frequenza, avr la capacit di trasferire, come
un telefonino, la sequenza delle sue basi ad un altro mezzo ricostruendo a distanza s stesso in
modo non enzimatica. La cosa non ancora chiara.
Molti diranno che il DNA stato scoperto intorno agli anni 50 da Watson e Crick ma in effetti non
cos. Quando si parla di scoperta del DNA si deve andare nel 1868 circa, quando Miescher, uno
svizzero che lavorava in Germania, si divertiva ad isolare molecole da vari tessuti biologici. In quel
momento ebbe la pazza idea di utilizzare come materiale di partenza il pus presente sulle bende
ospedaliere (perch a quei tempi gli antibiotici non cerano quindi se una persona si feriva cera
linfiammazione, la suppurazione, la formazione di pus e queste bende erano impregnate di pus). Il
pus formato da globuli bianchi che accorrono a livello della lesione per difendere lorganismo e
cercare di portare approvvigione (?). I Globuli bianchi sono le uniche cellule nucleate del sangue e,
utilizzando dei metodi che non sono molto diversi da quelli che si attualmente utilizzano per
estrarre il DNA, ottenne un materiale che gi sembr completamente diverso rispetto alle altre
macromolecole, comprese le proteine, la cui natura era gi nota. Era un po una sorta di nubecola
che, se sciolta, somigliava al muco del naso in termini di aspetto. A quei tempi non cerano molte
tecniche per studiare le sostanze. Una delle tecniche pi utilizzate era di trattare questi materiali con
coloranti acidi o basici per valutarne la natura acida o basica della sostanza in esame.
Questa specie di materiale che Miescher isol dai globuli bianchi delle bende ospedaliere, si
colorava con coloranti basici molto fortemente. Quindi si trattava di una sostanza fortemente acida.
Alla sostanza sono stati dati diversi nomi fino a quando si decise di darle il nome di Acidi Nucleici

proprio perch sono degli acidi isolati dai nuclei. Il termine acidi nucleici viene adottato tutt'ora
perch in effetti le molecole di DNA ed RNA sono fortemente acide.
Il lavoro di Miescher stato pubblicato ma a quei tempi il mondo scientifico non era ancora pronto
a capire limportanza di questa scoperta perch il pensiero sulla riproduzione cellulare o sulla
riproduzione degli organismi era completamente differente.
Nello stesso periodo Mendel fece i suoi esperimenti sulle piante di pisello ed anche Mendel
pubblic i risultati. Anche i suoi studi non furono compresi e rimasero nel limbo per almeno una
trentina danni fino a quando, dopo il 1900, la mente degli scienziati pens meno vincolata ai
precedenti schemi e si cap che le generazioni spontanee non potevano esistere; si cominci a capire
che se c un organismo, un organismo deriva un altro organismo che gli deve trasferire delle
informazioni affinch esso si formi.
Da un lato sono stati esumati i lavori di Miescher e di Mendel: dai lavori di Mendel nacque la
genetica classica; dai lavori di Miescher cominci a nascere la biologia molecolare.
Nel corso degli anni sono stati fatti innumerevoli esperimenti. Si scopr che il DNA era il
depositario dellinformazione genetica, che era la molecola responsabile della trasmissione di tutti i
caratteri relativi ad ogni individuo. Si riusc a capire quali fossero i componenti chimici che davano
origine al DNA per non si riusciva a capire quale fosse la struttura tridimensionale di questa
molecola in grado di giustificare in modo corretto dal punto di vista molecolare le tre principali
funzioni di cui sopra, ossia replicazione, riparazione e trascrizione.
Sono stati proposti i modelli pi fantasiosi ma nessuno di questi rispondeva a quelle che erano le
caratteristiche funzionali della molecola di DNA. La migliore interpretazione stata fatta in seguito
ad un'intuizione di Watson, Crick e Rosaline Franklin.
Come sono fatti gli acidi nucleici? Sono degli acidi e sono degli eteropolimeri molto lunghi.
Ovviamente, come tutti gli eteropolimeri, sono formati da un monomero che viene in generale
definito nucleotide, distinto in desossiribonucleotide per quanto riguarda i monomeri che formano il
DNA e di ribonucleotide per quanto riguarda i monomeri che formano lRNA. Ciascun nucleotide
formato da tre componenti:
una base azotata;
uno zucchero a 5 atomi di carbonio;
molecole di acido fosforico.
Le basi azotate sono di due tipi (la sintesi ed il metabolismo vengono studiati in biochimica; in
biologia molecolare si fa cenno alla loro struttura generale e al tipo di legami che intercorrono per la
formazione dei nucleotidi): si distinguono in purine e pirimidine, sono basi eterocicliche,
aromatiche. Sono definite eterocicliche perch non contengono solo atomi di carbonio ma anche
atomi di azoto.
Lazoto ha un doppietto elettronico libero che lo rende basico ed per questo che si chiamano basi
puriniche e pirimidiniche.
Le basi pirimidiniche sono formate da un singolo anello eterociclico che composto da quattro
atomi di carbonio e due di azoto.
Come fa si numerano questi atomi? Si pu partire da qualsiasi posizione e si pu contare sia in
senso orario che antiorario. Per vedere se la numerazione corretta, bisogna considerare il numero
ottenuto dalla somma del numero attribuito agli atomi di azoto, che sono gli atomi estranei
allanello; la numerazione sar corretta (sia procedendo in senso orario sia antiorario) quando la
somma la pi bassa possibile.
Ci si pu accorgere che il numero pi basso si ottiene partendo dallazoto e, procedendo in senso
antiorario, si legge il carbonio 2, lazoto 3, il carbonio 4, 5 e 6. La somma 4 e non c' nessuna
posizione di partenza in cui la somma degli atomi di azoto inferiore o uguale a 4.
Lo stesso discorso vale anche per le purine. Per in questo caso le purine sono formate dalla
condensazione di due anelli (uno a sei atomi e laltro a cinque atomi) con due atomi di carbonio in
comune per un totale di nove atomi di cui sei di carbonio e quattro di azoto.
Si conoscono bene 3 basi pirimidiniche: due tipiche del DNA e due tipiche dellRNA. Quelle del

DNA sono la citosina e la timina. (Questa domanda di esami) che differenza c tra una
pirimidina generale ed una citosina? C un gruppo amminico ed un ossigeno carbonilico. Il gruppo
amminico sul carbonio 4, lossigeno carbonilico sul 2. Come si pu chiamare anche questa base?
2-ossi-4-ammino-pirimidina. Se si ricorda questo nome, si ricorda come le basi puriniche e
pirimidiniche si possano appaiare tra loro mediante la formazione di legami a idrogeno e quindi
quali gruppi sono impegnati nella formazione di legami a idrogeno. Si presti molta attenzione al
fatto che la citosina anche detta 2-ossi-4-ammino-pirimidina.
La timina differisce per tre particolari: due ossigeni carbonilici ed un gruppo metilico. Quindi si ha
un ossigeno carbonilico sul carbonio 4, un ossigeno carbonilico sul carbonio 2 ed un gruppo
metilico sul carbonio 5. Questo composto sar: 2, 4-biossi-5-metil-pirimidina. Quindi si ricordi che
la timina ha un gruppo metilico. Se si toglie il gruppo metilico, si ha luracile che la 2, 4-biossipirimidina.
Le purine hanno atomi di azoto, che sono basici, e sono gli atomi 1, 3, 7 e 9. La prima purina
ladenina. Ladenina differisce da una purina generale per un solo gruppo amminico sul carbonio 6.
Si chiama dunque 6-ammino-purina . La caratteristica delle basi, come tutte le sostanze aromatiche,
la spiccata apolarit. Le basi sono inoltre molto piatte, per grazie a questi gruppi chimici, che
invece sono polari, hanno la capacit di formare legami a idrogeno fra di loro e con proteine che
permettono il funzionamento del DNA. Quindi sono questi gruppi chimici banali che permettono
alla molecola di DNA non solo di funzionare come molecola informativa ma anche di funzionare
molto elegante allinterno della cellula.
Per quanto riguarda la guanina, i gruppi sono sempre gli stessi. Quindi c un gruppo carbonilico
sul carbonio 6 ed un gruppo amminico sul carbonio 2, dunque 2-ammino6-ossi-purina.
I gruppi sono grossomodo sempre questi perch si devono formare tra le basi complementari dei
legami a idrogeno. Tra quali atomi si possono formare i legami a idrogeno ed un atomo, per formare
un legame a idrogeno, che caratteristiche deve avere? Deve essere particolarmente elettronegativo.
Ci sono quindi questi composti a base di azoto e ossigeno che sono fortemente elettronegativi e che
quindi possono formare legami ad idrogeno, i legami pi forti tra i legami deboli. Grazie a questi
legami ad idrogeno si ha non solo la possibilit di avere una molecola di DNA altamente
informativa ma anche la possibilit che le proteine, sempre tramite legami ad idrogeno, possano
interagire con il DNA e viceversa. La struttura, la natura stessa delle proteine dipende fortemente
dai legami a idrogeno che si possono formare nelle catene laterali; in altre parole, la struttura
tridimensionale che una determinata proteina pu assumere (si parla di struttura secondaria e
terziaria) e che permetter a quella proteina di svolgere una determinata funzione strettamente
correlata alle interazioni intermolecolari con gli acidi nucleici. Quindi si ricordi che questi legami
banali sono in effettivamente il cuore della vita.
Lo zucchero componente i nucleotidi uno zucchero a cinque atomi di carbonio. Tutti gli zuccheri
si formano in forma emiacetalica in cui nel gruppo carbonilico si rompe il doppio legame e quindi si
forma un legame acetalico con uno degli altri gruppo alcolici o del carbonio 4 o del carbonio 5
(furanosica o piranosica); in questo caso si forma una forma furanosica. Anche in questo caso gli
atomi di carbonio dello zucchero avranno una specifica numerazione. Il carbonio 1 sar quello che
prima era aldeidico, quindi 1, 2, 3, 4 ed infine il carbonio 5 fuori dallanello emiacetalico, dove
lossigeno chiude lanello.
In questo caso questo particolare zucchero lo chiamiamo ribosio ed in effetti nellRNA c' il
ribosio. Nella molecola di DNA v' un ribosio modificato in cui, si ricordi, il carbonio 2 ridotto.
Se manca lossigeno ai pu mai parlare di ossidazione? Quindi ridotto. Il carbonio 2 non ha un
gruppo alcolico ma soltanto legato ad un idrogeno. Quindi, da un punto di vista sterico, si ricordi
che il desossiribosio pi piccolo perch ha un ossigeno in meno.
Altra cosa che importante focalizziate molto bene: il carbonio in 5 sia del ribosio sia del
desossiribosio, dove essere considerato come la testa, come lorigine di un acido nucleico e quindi
diremo sempre liniziale 5'. Quindi quando si parla di estremit 5', ci si riferisce sempre alla testa di
un acido nucleico.
La parte terminale di qualsiasi acido nucleico invece rappresentato dal carbonio in 3 con il suo

gruppo alcolico e quindi la parte terminale sempre la parte in 3', quindi si tenga sempre presente
questa polarit dal 5' al 3'. La lettura delle informazioni presenti negli acidi nucleici avvengono
sempre dal 5' al 3'.
Non si trova mai in soluzione una forma planare perch tutti i carboni sono uniti fra di loro e poi
anche con lossigeno mediante legami semplici e quando c un legame semplice i due atomi hanno
la possibilit di ruotare luno rispetto allaltro di 360. In questo caso la rotazione limitata ma ogni
atomo avr comunque la possibilit di ruotare in modo differente per cui in soluzione si troveranno
sempre strutture diverse che costituiranno il cosiddetto puckering del furanosio.
La molecola di DNA, essendo molto complessa, non consente agli atomi degli spostamenti notevoli
ma molto limitati. Le strutture che si possono trovare allinterno del DNA sono la struttura C-2endo
che sempre una struttura a busta aperta. Si chiama C-2endo perch se s'immagina la struttura
tridimensionale, il carbonio 2 verso linterno mentre il carbonio 3 in avanti. Laltra struttura
diametralmente opposta ed chiamata C-3endo; in questo caso il carbonio 3 ad essere verso
linterno ed il carbonio 2 verso lesterno. Queste strutture del desossiribosio sono fondamentali per
le diverse conformazioni che il DNA pu assumere.
Le basi sono legate sempre al carbonio 1 del ribosio o del desossiribosio mediante un legame
glicosidico che si forma tra il gruppo alcolico del carbonio 1 ed uno degli idrogeni della base
purinica e pirimidinica come ad imitazione di una molecola dacqua. In questo caso si ricordi che le
basi si legano al carbonio 1 dello zucchero sempre tramite un atomo di azoto e precisamente le
purine si legano sempre con lazoto 9: quindi lazoto 9 si lega col carbonio 1, il quale, essendo
impegnato nel legame glicosidico con lazoto, determina la formazione di un legame N-glicosidico.
Nel caso delle pirimidine vale la stessa regola solo che in questo caso le pirimidine si legano
tramite lazoto 1 al carbonio 1 sempre tramite legame N-glicosidico.
Quindi quando si analizzano le basi che si complementarizzano fra di loro, si devono ricordare
quali gruppi chimici sono impegnati nella formazione dei legami a idrogeno; si deve tener conto che
nel caso delle pirimidine lazoto 1 non potr mai essere impegnato in un legame a idrogeno perch
nelle pirimidine esso legato allo zucchero tramite legame glicosidico. Quindi nel caso delle
pirimidine ad essere impegnato in un legame a idrogeno pu essere solo lazoto 3.
Per le purine il problema non si pone poich pu essere impegnato sia lazoto 1 e lazoto 3 perch
ad essere impegnato il 9.
Quando uno zucchero si lega ad una base, purinica o pirimidinica, si dice che si formato un
nucleoside e il nucleoside prende il nome della base che legata allo zucchero distinta sempre in
ribo- o desossiribo- a seconda se lo zucchero sia il ribosio o il desossiribosio, per il resto il nome
uguale. Quindi se si lega unadenina al pentosio, il corrispondente nucleoside sar ladenosina, in
questo caso ribo- o desossiribo-; se si lega la timina sar la timidina; se si lega luracile sar
luridina; la citosina la citidina; la guanina la guanosina, sempre o ribo- o desossiribo-.
Quando il nucleoside si lega con una molecola di acido fosforico (gruppo fosfato) il nucleoside si
trasforma in nucleotide. Il gruppo fosfato si pu legare a qualsiasi gruppo alcolico e tutte le
molecole che contengono un gruppo alcolico possono ospitare uno o pi fosfati, comprese le
proteine.
In questo caso, nei nucleotidi che formano il DNA il gruppo fosfato si va a legare al gruppo
alcolico del carbonio 5, quindi esterno al gruppo furanosico: si tratta di un legame acido-alcol, che
legame ? un legame estereo ma, trattandosi di un acido inorganico, allora in questo caso si
preferisce legame fosfo-estereo.
In questo modo si viene a formare il nucleotide che monofosfato perch contiene una sola
molecola di fosfato. Se c ad esempio unadenina legata ad un desossiribosio e ad un solo gruppo
fosfato, il nucleotide corrispondente viene definito desossiriboadenosina monofosfato. Il fosfato
pu legare altri gruppi fosfato; quindi si potr avere il legame del fosfato con un secondo fosfato
mediante un legame acido-acido che si chiama legame anidridico. Si ricordi che, per formare un
legame anidridico, occorre molta energia; allo stesso modo, quando si rompe, se ne libera molta. La
cellula ricorre a questa strategia per raccogliere energia in eccesso o per spenderla quando ne ha di
bisogno.

I nucleotidi, oltre ad essere i monomeri degli acidi nucleici, funzionano come una sorta di batteria
per tutte le cellule, sia procariote che eucariote. In questo caso, se ce ne sono due, il nucleotide si
dice di-fosfato ma pu anche entrare il terzo gruppo fosfato formando un nucleotide trifosfato. I
nucleotidi nella forma trifosfato si trovano nella loro massima forma energetica. Il nucleotide
trifosfato un nucleotide massimamente carico di energia mentre il nucleotide monofosfato
completamente scarico di energia. Il nucleotide difosfato una media fra i due.
Quando si viene a costruire una molecola di DNA, sia in vitro sia in vivo, la cellula non pu che
utilizzare dei nucleotidi trifosfato, per il DNA desossiribonucleotidi trifosfato, per lRNA
ribonucleotidi trifosfato.
Dei tre fosfati, il primo legato allo zucchero detto fosfato alfa, quello di mezzo detto fosfato
beta, lultimo detto fosfato gamma. In biologia molecolare i meccanismi interessano
principalmente il fosfato alfa.

Possibili configurazioni spaziali del DNA


In figura una base legata allo zucchero fosfato. stato detto che un legame N-glicosidico
quindi, quando la base libera in acqua, praticamente la base e lo zucchero possono ruotare luno
rispetto allaltro di 360. Non c alcun tipo di impedimento ma, quando la base agganciata
allinterno di una molecola di DNA, ovviamente i movimenti di base e zucchero fosfato sono
fortemente limitati.
Le uniche due conformazioni che si possono trovare in una molecola grande e rigida come il DNA
sono schematizzate in questa immagine: una prima posizione, detta anti, in cui si osservae che
base e zucchero sono massimamente distanti fra di loro; laltra, anche in questo caso si vede che
diametralmente opposta, viene definita conformazione sin, cio quando base e zucchero sono
massimamente vicini.
Quindi anti - zucchero e base massimamente distanziati; sin - base e zucchero fosfato
massimamente ravvicinati. Si ricordino queste due conformazioni: C2endo, C3endo, ed anti e sin
perch pi avanti aiuteranno a comprendere il perch ci sono diverse conformazioni del DNA.
Si veda come una base si pu legare ad unaltra o comunque ad un filamento in crescita. I reagenti
sono un desossiribonucleotide trifosfato, la stessa cosa vale anche per lRNA, e un filamento di
DNA pi o meno grande (anche un singolo nucleotide).
Lossidrile in 3 del nucleotide precedentemente incorporato si lega con il carbonio alfa del
nucleotide entrante formando un filamento che pi lungo di una base, e una molecola di
pirofosfato, rappresentata dai fosfati beta e gamma. Quindi si ricordi che nella molecola di DNA
solo il fosfato alfa rimane, beta e gamma vengono eliminati.
Se si considera la stessa reazione e si aggiunge unaltra base, lossidrile in 3 del nucleotide
precedentemente incorporato reagisce col fosfato in alfa con formazione di un filamento di DNA
che avr un ulteriore base in pi, con eliminazione del pirofosfato.
In biochimica le reazioni sono tutte reazioni di equilibrio, quindi non come la dissociazione del
cloruro di sodio (reazione completa): sono tutte reazioni incomplete. Quindi i reagenti reagiscono
tra loro formando i prodotti, e i prodotti di reazione a loro volta reagiscono fra di loro per formare
reagenti fino a quando non si raggiunge lequilibrio. In questo caso si indica una doppia freccia di
equilibrio.
Che cosa succederebbe se le cose rimanessero cos? Semplicemente che il DNA si formerebbe e
degraderebbe in continuazione quindi si tratta di un equilibrio che non si sa a cosa potrebbe portare.
Ma Le Chatelieur affermava che, a proposito dellequilibrio chimico, se si vuole che una reazione
proceda sempre da sinistra verso destra, cio dai reagenti verso i prodotti, si deve eliminare di volta
in volta uno dei prodotti. Se si elimina di volta in volta uno dei prodotti, lequilibrio si sposta
sempre verso destra ed in questo caso si sposta completamente verso destra se eliminiamo uno dei
prodotti. Ecco perch nel caso della formazione del DNA si ha soltanto una freccia singola e non
una doppia freccia.
In questa reazione infatti, il pirofosfato, per azione di un enzima chiamato pirofosfatasi. viene

degradato in due molecole di fosfato inorganico. Quindi, ad ogni ciclo di reazione, il pirofosfato,
cio uno dei due prodotti, viene eliminato e quindi la reazione prosegue sempre in un senso ossia
unidirezionale, ossia irreversibile. Quindi la sintesi irreversibile perch uno dei due prodotti, in
questo caso il pirofosfato, viene sempre degradato.
Riguardo la trascrizione dellRNA, soprattutto nei procarioti, un piccolo rallentamento della
degradazione del pirofosfato permetter ai procarioti una importantissima reazione (poi si vedr
successivamente).
Ecco come un filamento di RNA si pu presentare. un RNA perch contiene il gruppo ossidrile in
2 e perch c luracile al posto della timina. Si ricordi che la timina non una base esclusiva del
DNA perch anche gli RNA possono contenerla attaccata al ribosio. Ed in effetti gli RNA nascono
sempre integri ma poi subiscono sempre delle modifiche post trasduzionali a carico delle basi. E
quindi, nelle molecole di RNA, anche negli RNA messaggeri, si troveranno sovente delle basi
modificate.
Le modifiche vengono subite dalle pirimidine e tra queste in particolare luracile. Una delle
modifiche consiste appunto nella metilazione del carbonio 5 con la formazione di timina (non il
contrario per!). Luracile nella molecole di DNA non tollerato e quindi un'eventuale
demetilazione della timina ad uracile o deaminazione della citosina ad uracile nel DNA viene
sempre riconosciuto come un danno e quindi quel tratto che contiene luracile viene
immediatamente riparato.
Quindi lRNA pu contenere la timina ma il DNA non tollera la presenza delluracile n qualsiasi
altro tipo di ribonucleotide.
Watson e Crick ebbero la capacit di capire la struttura tridimensionale del DNA che si rivelata
correttissima ed in grado di spiegare perfettamente tutte le funzioni della molecola di DNA. C da
dire una cosa: in effetti loro ebbero il premio Nobel per questa scoperta ma hanno scoperto solo
lacqua calda perch non hanno eseguito alcun tipo di esperimento, hanno preso gli esperimenti di
Tizio, Caio e Sempronio che separatamente non dicevano nulla, ed hanno avuto lintuito di metterli
insieme e capire come effettivamente fosse la struttura del DNA.
In relazione alla regolazione della trascrizione e della traduzione, c uno scienziato italiano
dellet di Watson, ora in pensione, delluniversit di Torino che negli anni '60 andato a studiare
con Watson, ottenne degli ottimi risultati studiando il DNA ma Watson glieli ha rubati. Nel 2001
questo studioso, si chiamava Angelotti, ha pubblicato un libro, ha scoperto una cosa importante,
ovverosia che la traduzione non avviene solo nel citoplasma ma anche nel nucleo anche se con delle
modalit e secondo un significato perfettamente differente.
La maggior parte dei dati che Watson e Crick presero per costruire la struttura tridimensionale del
DNA, deve la propria scoperta a Rosaline Franklin che lavorava mediante raggi X, la cosiddetta
diffrazione del DNA cristallizzato ai raggi X, e dalle analisi della diffrazione ottenne delle immagini
che fecero intuire, specialmente a Watson, che aveva appena 23 anni, che in effetti il DNA non era
un singolo filamento ma un doppio filamento e che i due filamenti non erano perfettamente paralleli
ma avevano un andamento ad elica e fu l che ha compreso molto bene. Siccome questo
esperimento stato cruciale per definire la struttura tridimensionale del DNA, nellarticolo
scientifico che Watson e Crick pubblicarono nel '53 sulla famosa rivista Nature presente il nome
di Rosaline Franklin, per a quei tempi, quando si studiava con i raggi X, non ci si difendeva come
oggi e quindi mor nel 1958 di leucemia allet di 38 anni.
Il premio Nobel stato conferito nel 1960 e quindi lei, essendo morta, non ha potuto ricevere
questo premio che invece avrebbe avuto: a lei si deve il lavoro. Attualmente nata unassociazione
chiamata per non dimenticarla in America, unassociazione a cui possono aderire non solo i
biologi molecolari ma anche tantissime persone compresi gli studenti ed interamente dedicata a
Rosaline Franklin.
Altro studioso che aiut a capire la struttura del DNA fu Chargaff che, nel 1950, pubblic un
articolo in cui scopr che in ogni molecola di DNA, la quantit di adenine e timine sempre uguale,
cio se ci sono X timine, ci sono X adenine, e che la quantit di guanine e citosine sempre uguale,
cio se ci sono Y guanine, ci sono Y citosine. Quindi cominci a capire nel 1950 che le basi si

complementarizzano fra di loro e che sicuramente la molecola di DNA non una molecola a
singolo ma a doppio filamento. Anche questi dati furono utili a Watson per capire la struttura del
DNA.
Nella struttura del DNA tridimensionale ci sono ben due filamenti polinucleotidici che formano la
struttura del DNA, ma questi due filamenti sono antiparelleli, cio la loro polarit chimica inversa:
mentre un filamento va dal 3 al 5, laltro filamento va dal 5 al 3, ossia esattamente invertito.
In questo modo, il piano su cui giacciono le basi dei due filamenti esattamente invertito e quando
questo piano invertito succede che due basi che si trovano vicinie, purinica e pirimidinica,
possono avere dei gruppi chimici idonei sufficientemente allineati in grado di formare legami a
idrogeno e permettere alle due basi di unirsi fra di loro in una reazione che viene indicata come
reazione di complementareit.
Ora nella struttura del DNA si trova uno scheletro di zucchero-fosfato-zucchero-fosfato-zuccherofosfato. da entrambi i lati, ed uguale per tutte le molecole di DNA, rigorosamente aspecifico.
Allinterno si trovano le basi, sia perch sono complementareizzate fra di loro ma anche perch le
basi sono apolari e quindi con lacqua non vanno daccordo. Quindi gi spontaneamente due
filamenti polinucleotidici hanno lintento di chiudere allinterno le basi puriniche e pirimidiniche
per proteggerle dal mezzo acquoso. Le basi in questo modo si allineano e possono formare legami a
idrogeno.
Ora molto importante capire che allinterno della doppia elica lo spessore di 20 permette di
contenere solamente tre anelli, un anello pirimidinico e due anelli purinici. Quindi inevitabile che
la complementariet tra le basi deve avvenire tra una base purinica ed una pirimidinica. Due purine,
anche se avessero dei gruppi chimici laterali ben allineati per formare legami a idrogeno, in effetti
non possono unirsi perch formerebbero quattro anelli e quindi ci comporterebbe che le due purine
si sovrapponessero luna sullaltra oppure una distorsione della doppia elica. La stessa cosa vale per
due pirimidine: anche se avessero i gruppi chimici idonei per formare legami a idrogeno, sarebbero
troppo lontane affinch questi si possano formare, e se i legami a idrogeno si formano, si forma una
sorta di invaginamento nella doppia elica del DNA e quindi anche in questo caso una distorsione
della doppia elica. In conclusione, due purine o due pirimidine non possono legarsi per problemi
sterici.
In modo simile, unadenina con una citosina non si pu complementarizzare, cos come una
guanina con una timina, anche se non vi sono problemi di ingombro sterico. Gli appaiamenti
possibili, almeno nella molecola di DNA, sono: adenina-timina, timina-adenina, guanina-citosina,
citosina-guanina.
Nella molecola di RNA, quando si formano strutture secondarie, c un ulteriore tipo di
appaiamento che si vedr successivamente.
Tra quali gruppi chimici avviene la formazione del legame a idrogeno? Nel caso dellappaiamento
adenina-timina o viceversa, lossigeno carbonilico in 4 della timina funge da accettore di legami a
idrogeno nei confronti del gruppo amminico delladenina sul carbonio 6, perch ovviamente
lossigeno carbonilico parzialmente ionizzato, Quindi in questo caso si viene a formare un legame
a idrogeno tra il gruppo amminico delladenina in posizione 6 e lossigeno carbonilico della timina
sul carbonio 4. Laltro idrogeno del gruppo amminico delladenina pu anche essere impegnato per
legami a idrogeno con altre molecole, ma non per la complementareit. Il secondo legame a
idrogeno si viene a formare tra lazoto 3 della timina che funge da donatore e lazoto 1 delladenina
che funge da accettore, e quindi questo il secondo legame a idrogeno.
Adenina e timina quindi sono legati da due soli legami a idrogeno con un energia di legame di circa
9 Kcal/mol, quindi non molto elevato. Si ricordi che quando il DNA legato prevalentemente da
adenine e timine, quel tratto di DNA un tratto piuttosto debole in termine di stabilit della doppia
elica.
Nel caso del legame guanina-citosina e viceversa, sono tre i legami a idrogeno, quindi questo
appaiamento molto pi forte, anche le due basi sono pi vicine tra di loro e la loro energia di
legame di circa 19 Kcal/mol, quindi molto ma molto pi forte. Il primo legame a idrogeno si
forma tra lossigeno carbonilico in posizione 6 della guanina, che funge da accettore, sempre con il

gruppo amminico in posizione 4 della citosina, che funge da donatore. Il secondo legame a idrogeno
molto simile a quello tra adenina e timina, si forma tra lazoto 1 della guanina, che in questo caso
funge da donatore, e lazoto 3 della citosina, che funge da accettore. Il terzo legame a idrogeno si
forma tra il gruppo amminico in posizione 2 della guanina, che funge da donatore, e lossigeno
carbonilico in posizione 2 della citosina, che funge da accettore, per un totale di tre legami a ponte
idrogeno, quindi un legame molto forte.
Tra timina e adenina le due basi si trovano ad una distanza di 11,1 mentre tra citosina e guanina la
distanza tra le basi di 10,8. Pu sembrare molto piccola per, se si va nel piccolo piccolo, tra
11,1 e 10,8 la differenza notevole.
Per conseguenza, citosina e guanina, per essere separate, necessitano una grande quantit di energia
mentre timina e adenina per poter essere separate hanno bisogno di una piccolissima quantit di
energia.
Timina-guanina e citosina-adenina non si legano perch non ci sono gruppi chimici idonei allineati
per formare legami a ponte a idrogeno. In alto si trovano due gruppi amminici, sono tutte e due
gruppi donatori, non c accettore e non si pu formare legame a idrogeno; nel mezzo vi sono due
azoti ma entrambi sono accettori, non c il donatore e non si pu formare legame a idrogeno.
In basso si osservano sulla citosina un ossigeno carbonilico che pu fungere da accettore, dallaltro
lato c solo un atomo di idrogeno e quindi non c il donatore per formare un legame a ponte a
idrogeno. Ecco perch citosina e adenina ma anche timina e guanina, pur essendo basi puriniche e
pirimidiniche, non possono complementarizzarsi.
Grazie a questa propriet, le basi si comportano da componente informativo, possono formare
quello che lalfabeto biologico e grazie a questo alfabeto biologico, possono derivare quelle che
sono le parole biologiche che specificano determinati messaggi: in particolare le proteine che poi
allinterno della cellula svolgeranno delle determinate funzioni che permettono ad ogni essere
vivente di essere un essere vivente.

II Lezione

03/05/2012

Tautomeria delle basi ed appaiamenti


Sopra stato accennato circa le basi, la complementariet, che adenina e timina si legano mediante
due legami a ponte di idrogeno, guanina e citosina si legano mediante tre legami a ponte di
idrogeno. Tra queste basi possibile solo questo tipo di complementariet, ed grazie a questo tipo
di complementariet che le basi funzionano da componente informativa per la molecola di DNA.
Grazie a questo appaiamento, la molecola di DNA pu funzionare non come un DVD ma come un
blu-ray, dove sono incise tutte le informazioni relative a ogni singolo individuo.
Ora c' un piccolo problema: le basi sono anche (oltre ad essere composti aromatici eterociclici) dei
chetoni e delle ammine, e dalla chimica si sa che i chetoni sono sempre in equilibrio con una forma
tautomerica che la forma enolica; si sa che le ammine sono anch'esse in equilibrio con una forma
tautomerica alternativa che la imminica. Anche le basi si ritrovano questa forma tautomerica,
cheto-enolica e ammino-imminica.

Ora, quando una base si trova nella sua forma tautomerica alternativa, quindi ci si riferisce in
questo caso alla forma enolica e alla forma imminica, succede che i gruppi chimici sono diversi, i
donatori e gli accettori dei legami a idrogeno sono diversi e quindi le basi in forma tautomerica
alternativa hanno la possibilit di instaurare legami a ponte di idrogeno con altre basi, diverse da
quelle analizzate.
In pratica, una qualsiasi base, nella sua forma tautomerica alternativa, in grado di
complementarizzarsi con le altre basi formando legami a idrogeno, e quindi in questo caso, quando
le basi si trovano in forma tautomerica alternativa, viene meno la loro capacit di essere
informative.
Ora, fortunatamente, all'interno della cellula, si osservi l'equilibrio. V' una freccia pi spessa e una
pi sottile. Cosa indicano queste frecce? Che l'equilibrio spostato prevalentemente verso sinistra:
all'interno della cellula la maggior parte delle basi si trova nella sua forma tautomerica normale e
quindi valgono quelli che sono gli appaiamenti proposti da Watson e Crick nel loro modello
tridimensionale.
Pur tuttavia, si tenga conto che, sia durante la replicazione del DNA ma anche durante la
trascrizione dell'RNA, la possibilit che vengano incorporate basi tautomeriche alternative sempre
presente. In questo caso, anche se gli enzimi che catalizzano queste importantissime reazioni,
possiedono delle capacit molto forti di impedire l'incorporazione di basi errate, se una base si trova
in forma tautomerica alternativa, in grado di ingannare questa capacit che possiedono gli enzimi,
e quindi la possibilt che durante la replicazione venga incoporata una base non corretta che
modifica il messaggio contenuto in quel tratto di DNA sempre presente, anche se ci saranno poi
dei sistemi, dei meccanisimi che permetteranno di correggere gli errori di incorporazione delle basi
tautomeriche alternative.
Si ricordi per una cosa: che sempre, anche allo stato attuale, durante ogni replicazione del DNA
una certa quantit di errori dovuti alle incorporazioni di queste forme tautomeriche permane
sempre, perch le capacit di correzione della cellula non sono al 100%.
Dunque errori, durante le replicazione e la trascrizione, si possono sempre formare, errori che sono
stati fondamentali per le cellule ancestrali poich, grazie ad essi, c' stata la possibilit di quella che
la selezione naturale e l'evoluzione che ha portato allo sviluppo di organismi che rappresentano la
massima espressione della vita allo stato attuale, e quindi ovviamente questo organismo
rappresentato dall'uomo... dunque non tutto il male vien per nuocere.
Per ovviamente bisogna fare il possibile e l'impossibile per evitare o correggere esternamente (e
questo compito del medico) quegli errori che possono essere causa di patologia poich, alterando
il messaggio molecolare, si altera anche la struttura della relativa proteina e, se la proteina alterata
nella sua struttura, in alcuni casi lo anche nella sua funzione e, di conseguenza, se si ha una
riduzione della funzione di questa proteina, ne pu scaturire una patologia: in questo caso si parler
di malattia genetica che in genere ereditabile ma pu essere anche spontanea, e sar compito del
medico correggere e supplire alla mancanza di funzionalit della proteina. Quindi si ricordino molto
attentamente le forme tautomeriche alternative di basi puriniche e pirimidiniche poich sono
oggetto di domanda agli esami.
Stabilito che la molecola di DNA una lunga molecola a doppia elica destrorsa, quali sono le forze
deboli che tengono uniti i due filamenti polinucleotidici e in definitiva rendono molto stabile la

molecola di DNA? Si ricordi che la molecola di DNA una delle molecole pi robuste che esistono
in natura, poco si pu fare per distruggerla, neanche le alte temperature riescono a degradarla
completamente; semplicemente possono frantumare il legame fosfodiestereo che esiste tra i diversi
nucleotidi legati tra di loro, quindi al massimo le alte temperature possono frantumare il DNA ma
non distruggerlo. Anche la decomposizione della materia in determinate zone dell'organismo (quali,
ad esempio, le ossa) non determina completamente la degradazione del DNA e quindi molecole di
DNA sono ivi presenti. Quando si sente parlare di analisi del DNA su resti di cadaveri anche dopo
lunghissimi periodi, proprio dovuto al fatto che, a livello delle ossa, il DNA non completamente
degradato quindi pu essere analizzato poich la molecola di DNA molto resistente ed a doppio
filamento.
Al contrario, invece, la molecola di RNA molto molto labile, non per la sua struttura (quasi
identica al DNA) ma perch nell'organismo (cos come fuori da esso) sono presenti enzimi che
degradano l'RNA poich deve avere una vita molto breve: vi sono difatti molti enzimi detti
ribonucleasi, ubiquitari che determinano la degradazione dell'RNA. Per questo, quando si deve
lavorare con l'RNA, molto difficile lavorarlo come tale perch lo si deve proteggere dall'azione
delle ribonucleasi. E allora, in questo caso, si preferisce trasformarlo in una molecola di DNA con
l'esatta sequenza che si chiama c-DNA o DNA complementare; si proceder quindi a lavorare e
studiare l'RNA sotto forma di DNA.
La molecola di DNA resistente poich ci sono molte forze che tengono uniti i filamenti
polinucleotidici: le forze principali sono i legami a idrogeno tra le basi complementari ma anche i
gruppi chimici laterali ionizzati o parzialmente ionizzati che non sono impegnati in legami a
idrogeno o in altri legami possono interagire tra di loro formando dei legami di tipo elettrostatico
che contribuiscono alla stabilit del DNA stesso. Perfino le basi giustapposte, gli anelli apolari,
instaurano tra di loro legami molto deboli, le forze di Van Der Waals. Anche se si tratta di legami
debolissimi, si tenga conto che le le forze di legame si sommano e quindi, in una molecola molto
lunga, tante forze deboli divengono una forza notevole e dunque anche le forze di Van Der Waals
contribuiscono in modo decisivo a stabilizzare la doppia elica di DNA.
Quanto lungo il DNA umano? Considerando 46 cromosomi, lungo 2 metri, se considerato in
senso aploide, lungo 1 metro.

Questa una molecola di DNA come stata descritta da Watson e Crick: si vedono i due filamenti
polinucleotidici con orientamento anti-parallelo e con lo scheletro di zucchero fosfato verso
l'esterno che racchiude all'interno le coppie di basi tra di loro appaiate mediante legami a ponte di
idrogeno e che costituiscono la componente informativa.

Se si osserva la doppia elica destrorsa, non la si vede perfettamente regolare come potrebbe essere
una scala a chiocciola, ma assume un aspetto un po' irregolare, perch si possono osservare delle
insenature: una pi grande, una pi piccola, poi ne segue una pi grande poi sempre una pi piccola
e cos di seguito... possibile visualizzare quest'organizzazione da tutti i lati del DNA, cio da
qualsiasi angolazione si guardi la molecola. Queste insenature si chiamano solchi, il pi grande
detto solco maggiore, il pi piccolo solco minore.
Bisogna soffermarsi su questi solchi perch il DNA, al contrario di quanto si possa pensare, nella
cellula non mai solo o isolato, sempre associato con un numero pi o meno grande di molecole
proteiche (non gli istoni) a seconda del suo momento funzionale. Ma le molecole proteiche sono
solubili, quelle funzionali, e a parte le proteine istoniche ci sono tante altre molecole funzionali che
hanno il compito di aiutare il DNA nello svolgimento di queste funzioni. Queste proteine devono
riconoscere non lo scheletro di zucchero fosfato (che uguale sull'intera superficie di una molecola
di DNA e per tutte le specie esistenti, virus compresi) ma deve prendere contatto con basi puriniche
e pirimidiniche sulla base della loro successione, che rappresenta un determinato messaggio.
Come fanno queste molecole proteiche solubili in acqua a prendere contatto con delle basi che sono
apolari e racchiuse all'interno dello scheletro? Lo possono fare solo attraverso i solchi, e
principalmente attraverso il solco maggiore. I solchi sono gli unici punti della molecola di DNA
attraverso i quali le proteine funzionali possono interagire con le basi in relazione alla sequenza, alla
successione delle basi stesse e quindi ai gruppi chimici che queste basi espongono e permettono di
farsi riconoscere dalle proteine.

Si cominci con l'appaiamento guanina-citosina, citosina-guanina. Si tenga conto che si tratta di due
appaiamenti diversi, anche se si legano sempre tra loro citosina e guanina. Se si legge da sinistra
verso destra (si potrebbe fare anche al contrario), una cosa che a sinistra v' una citosina, una cosa
v' una guanina, poich ognuna di esse rappresenta una lettera specifica dell'alfabeto biologico.
Quindi molto importante che una proteina, quando riconosce una sequenza di basi, supponendo
che legga da sinistra verso destra, deve sapere se incontra subito una citosina o una guanina. Questo
il messaggio, non tanto l'appaiamento in s.

Come da immagine, questo il legame N-glicosidico e qua presente lo zucchero, questo l'altro
legame N-glicosidico dell'altra base appaiata e qua presente lo zucchero; quindi i due legami N
glicosidici quando due basi sono appaiate non sono orizzontali ma obliqui. Quindi che succede? Ci
saranno dei gruppi chimici al di sotto dei due legami N glicosidici, e ve ne saranno alcuni che si
trovano al di sopra.

La parte superiore ai due legami N-glicosidici forma un angolo di 240, quella inferiore ne former
uno di 120. L'angolo di 240 nella molecola di DNA responsabile della formazione dei solchi
maggiori, mentre l'angolo da 120 dall'altro lato del solco maggiore, responsabile della
formazione del solco minore.
Si pu vedere tornando all'immagine che raffigura la struttura del DNA che, se si ha un solco
maggiore, dal lato opposto v' un solco minore, perch qua vi sono gli angoli delle basi appaiate di
240; qua, al contrario, vi si trova l'opposto di questi angoli, che sono quelli da 120 e danno il
solco minore. Al contrario, l dove v' un solco minore, dall'altro v' un solco maggiore.
Si osservi bene: si supponga che una proteina legga le basi come detto prima, da sinistra verso
destra, (ma questo un esempio, perch le proteine possono leggere da destra verso sinistra, quindi
possono essere lette da entrambi i lati; per l'esempio si ponga che una proteina entri nel solco
maggiore, si affacci in entrambi i solchi e li legga da sinistra verso destra), se si ha un appaiamento
guanina-citosina, la proteina incontrer prima quest'atomo di azoto che un accettore di legami a
idrogeno, poi incontrer questo ossigeno carbonilico che, bench impegnato in un legame a
idrogeno, avr sempre una parziale carica e quindi si comporter anch'esso da accettore; poi si avr
l'idrogeno del gruppo amminico della citosina, parzialmente impegnato nel legame a idrogeno con
la guanina, che funger da donatore di legami a idrogeno e poi vi sar un atomo di idrogeno che
del tutto ininfluente.
Questi sono i gruppi chimici che possono essere riconosciuti, quindi la proteina, entrando con i
propri gruppi chimici, incontra un accettore, un altro accettore, poi un donatore ed un atomo di
idrogeno; se invece l'appaiamento citosina-guanina, la proteina, entrando nel solco, cosa incontra?
Prima trova un atomo di idrogeno, poi un donatore, poi un accettore e poi un altro accettore.
Quindi, a livello del solco maggiore, se una proteina comincia ad entrarci, grazie a questi gruppi
chimici che sono differenti a livello dell'angolo di 240, pu benissimo discriminare se si tratta di
un appaiamento guanina-citosina o citosina-guanina perch:
se incontra accettore-accettore-donatore-atomo di idrogeno, la proteina riconosce che si
tratta di un appaiamento guanina-citosina;
se incontra atomo di idrogeno-donatore-accettore-accettore, si accorge che si tratta di
appaiamento citosina-guanina.
Quindi, a livello del solco maggiore, dell'angolo di 240, una proteina che si affaccia per prendere
contatto con le basi puriniche e pirimidiniche appaiate, in grado di discriminare che tipo di
appaiamento c'. Stesso discorso vale per quanto riguarda l'appaiamento adenina-timina o timinaadenina.

Per simili ragionamenti, a livello dell'angolo di 240


se c' l'appaiamento adenina-timina, c' la sequenza accettore-donatore-accettore-gruppo
metilico;
se c' l'appaiamento timina-adenina, c' la sequenza simmetrica, gruppo metilico-accettoredonatore-gruppo metilico.
Con i gruppi chimici s' in grado di riconoscere una determinata sequenza di basi. A livello del
solco minore questo non possibile, quindi si dice che il solco minore molto poco informativo,
perch nel solco minore c' un accettore, un donatore e un accettore nell'appiamento G-C, con
appiamento inverso (C-G), ancora la sequenza accettore donatore accettore. La proteina,
entrando, sar in grado di discriminare che si tratta di guanina e citosina, ma non sar in grado di
discriminare di quale appaiamento si tratta, per questo il solco minore detto poco informativo.
Lo stesso vale per accoppiamento A-T e T-A: qualsiasi sia l'appaiamento, v' sempre un accettore,
un atomo H e un accettore, quindi le proteine a livello del solco minore potranno semplicemente
valutare se si tratta di una coppia di basi A-T o viceversa, o di una coppia di basi G-C o viceversa;
non sono per in grado di discriminare il tipo di appaiamento. Solo a livello del solco maggiore
questo possibile: a livello del solco maggiore si pu sapere se c', entrando, una guanina, una
adenina, una timina, una citosina.
Poich le proteine, quando entrano nel solco maggiore per legare le basi mediante legami a
idrogeno, devono riconoscere una propria sequenza, che si chiama sequenza consenso, in genere
nella maggior parte dei casi formata da sei coppie di basi (essere di meno o di pi, a seconda della
proteina), necessario sapere la relativa sequenza; quindi ogni proteina, quando lega il DNA, non
pu legarlo in qualsiasi punto della molecola ma lo pu legare solo in quei punti dove presente la
specifica sequenza consenso che esibisce gli specifici gruppi chimici che sono in grado di legare i
propri gruppi chimici. E allora questa sequenza consenso per quella determinata proteina, si chiama
semplicemente consenso. Quando vien detto che quel tratto di DNA rappresenta il consenso per la
proteina X, vuol dire che la proteina X, nel momento in cui vuole legare il DNA, si pu legare solo
a livello di quella sequenza di basi puriniche e pirimidiniche, perch solo quella esibisce a livello
del solco maggiore i gruppi chimici idonei affinch la proteina possa entrare, penetrare e formare
legami solidi in grado di far funzionare il DNA.
Tutto il funzionamento del DNA si basa proprio su queste interazioni, tra proteine e relativi
consensi: le proteine possono interagire anche con lo scheletro di zucchero-fosfato ma si tratta di
una interazione aspecifica; mentre, quando una proteina interagisce con il proprio consenso,
l'interazione specifica ed in grado di far funzionare il DNA in un determinato modo.

Queste immagini dimostrano l'interazione di una proteina con il solco maggiore di un tratto di
DNA, e in questo caso lo mette da destra verso sinistra, quindi la proteina, con la sua struttura
tridimensionale, entra nel solco maggiore, riconosce i gruppi chimici e se la sequenza di basi
rappresenta il suo consenso, i gruppi chimici possono interagire con quelli delle basi e la proteina si
lega; se non il suo consenso la proteina esce e va a cercare un altro solco maggiore, scansionando
tutto, molto ma molto velocemente, fino a quando incontra il suo consenso e lo lega.
L ad esempio di un legame tra un aminoacido, acido glutammico, e una base purinica che in
questo caso un'adenina: si vede come si vengono a formare i legami a idrogeno, e dunque una
interazione stabile, forte, specifica tra l'aminoacido di una proteina che esibisce quei gruppi chimici,
e i gruppi chimici esposti dalla base di un consenso, in questo caso rappresentata da adenina.
Questo invece un legame tra una proteina e lo scheletro di zucchero-fosfato, quindi un legame di
tipo elettrostatico prevalentemente, ma a volte anche si possono trovare legami a idrogeno. un
legame aspecifico perch in questo caso, qualsiasi proteina che ha gruppi chimici idonei a legarsi
con lo scheletro di zucchero-fosfato, pu farlo ma in qualsiasi punto del DNA.

Conformazioni del DNA

In questa immagine vi sono tre strutture di DNA. Su alcuni testi si trovano anche altre strutture,
perch subito dopo che Watson e Crick hanno pubblicato la struttura tridimensionale, ovviamente
sono stati sfruttati i metodi che quasi nel corso dei 100 anni gli studiosi avevano usato per estrarre il
DNA, metodi che attualmente vengono ancora utilizzati. Nel momento in cui si conosceva la
struttura del DNA, eseguendo delle analisi mediante diffrazione ai raggi X, magari con strumenti
pi moderni, ci si accorti che in effetti non tutte le molecole di DNA, o comunque non tutti i tratti
di una determinata molecola di DNA, erano come descritti da Watson e Crick ma presentavano
delle differenze (ne sono state identificate tante). Alla fine la maggior parte di queste strutture si
rivelata un artefatto tecnico, perch comunque quando si estrae il DNA dalle cellule e si tolgono
anche le proteine con cui il DNA associato, in ogni caso esso subisce dei maltrattamenti e, anche
se una molecola molto resistente, questi maltrattamenti possono essere evidenti. Oggi si cerca di
essere un po' pi delicati; si fanno delle ''carezzine'' al DNA quando lo si estrae (tranne quando si
vuole fare della diagnostica molecolare; quindi il DNA estratto in un quarto d'ora e in questo caso

lo maltrattiamo abbastanza). Se si utilizzano tecniche convenzionali perch poi si vuole congelare il


DNA e conservare per le future generazioni, lo si pu fare perch il DNA duraturo; per far ci, si
utilizzano tecniche un po' pi lunghe e delicate nei confronti della struttura del DNA.
Alla fine si scoperto che in effetti due strutture alternative a quella descritta da Watson e Crick
erano presenti in natura. La struttura descritta da Watson e Crick detta conformazione B del DNA
o DNA in forma B, ed la forma sotto la quale si trovano oltre l'80% del DNA presente in qualsiasi
organismo. Una forma alternativa rappresentata dal cosiddetto DNA-A e un'altra forma alternativa
ancora rappresentata dalla cosiddetta forma Z del DNA.
Se si fa qualche piccolo calcolo strutturale, anche se teoricamente Watson e Crick non si sono
sbagliati di molto, anzi sono arrivati vicinissimi, si pu osservare che all'interno della doppia elica
del DNA, un giro della doppia elica il punto in cui un filamento reincrocia l'altro dallo stesso lato.
Quindi, se si considera il filamento viola, questo incrocia il filamento verde (viola e verde sono
riferiti all'immagine sulla slide; colorano le scale di zucchero-fosfato, la viola antiparallela
rispetto alla verde) superiormente qua, qua lo incrocia posteriormente, e qua lo incrocia dallo stesso
lato, e la parte in mezzo sar tutto un giro della doppia elica. Un giro della doppia elica lungo 3,4
nm, la distanza tra una coppia di una basi e un'altra di 3,4. E allora, in questo caso un giro della
doppia elica quante coppie di basi contiene? 10. In effetti il DNA nelle cellule lievemente pi
rilassato, ma di poco, ed stato stabilito mediante tecniche moderne di diffrazione ai raggi X che un
giro della doppia elica in effetti contiene 10,5 coppie di basi, quindi non che Watson e Crick,
facendo un calcolo teorico, si sono discostati molto. Lo spessore della doppia elica di 20. Questi
sono i parametri che interessano di pi, che bisogna conoscere.
Anche nel B-DNA, che il pi comune, le coppie di basi sono perfettamente perpendicolari all'asse
della doppia elica, questo un altro parametro fondamentale. In breve:
giro doppia elica: 3,4 nm (10,5 coppie di basi perpendicolari all'asse della doppia elica);
distanza base-base: 0,34 nm.
Sopra stato analizzato il desossiribosio in forma C2'-endo, C3'-endo e dei nucleotidi che si
possono trovare in conformazione syn o anti? Nella forma B del DNA il desossiribosio sempre
C2'-endo e i nucleotidi sono sempre nella forma anti.
Si vada alla forma A del DNA: stato osservato che il DNA pu cambiare conformazione e passare
dalla forma B alla forma A, quando? Quando si trova in condizioni di disidratazione o quando
alcuni tratti devono funzionare diversamente. In questo caso, il DNA lo stesso tratto identico,
appare pi corto, pi tozzo, pi robusto; le caratteristiche sono diverse: innanzitutto si nota subito
che le coppie di basi non sono pi perpendicolari all'asse della doppia elica ma oblique, un giro
della doppia elica sempre 3,4 nm, ma una coppia di basi rispetto all'altra non dista pi 0,34 nm,
ma 0,27 nm, cio le coppie di basi sono pi vicine, di conseguenza un giro della coppia elica
conterr circa 11 coppie di basi.
La cosa importante che in seguito a questo cambiamento di parametri il solco maggiore pi
stretto e pi profondo, al contrario il solco minore meno profondo e pi largo, ma di questo ci
importa poco perch si sa che il solco minore poco informativo e pochissime proteine
interagiscono con le basi a livello del solco minore. Quello che interessa il maggiore che pi
stretto e profondo rispetto alla forma B. A che cosa dovuto questo cambiamento? Perch il DNA
pu cambiare la sua conformazione dalle forma B alla forma A? Semplicemente perch ovviamente,
sempre interagendo con specifiche proteine, il desossiribosio passa dalla conformazione C2'-endo
alla C3'-endo, solo una modifica della conformazione del desossiribosio responsabile del
passaggio dalla forma B alla forma A, con uno sconvolgimento non grossissimo dell'intera struttura,
e quindi stringendo fortemente il solco maggiore, per il resto i nucleotidi si trovano sempre in forma
anti.
In altre circostanze, quando il DNA ad esempio o deve funzionare in modo diverso (soprattutto nei
procarioti) o quando si trova in condizioni di particolare torsione, tale che si pu rischiare la rottura
del legame fosfodiestereo in modo meccanico, il DNA ha la capacit di proteggersi oppure di
cambiare ulteriormente conformazione e passare dalla forma B alla Z. In questo caso si osserva

innanzitutto che i due filamenti polinucleotidici cambiano orientamento: anzich essere avvolti
l'uno attorno all'altro in modo destrorso, si legano in modo sinistrorso; altra caratteristica che i due
filamenti polinucleotidici sinistrorsi hanno un andamento (cio lo scheletro di zucchero-fosfato) a
zig zag e da questo deriva il nome di DNA Z.
La cosa che pi interessa per dei futuri medici sono i solchi: com' in questo caso il solco
maggiore? molto ampio, talmente ampio che come se costituisse esso stesso l'intera superficie
esterna della molecola di DNA, mentre il solco minore talmente profondo e stretto, che come se
fosse virtuale. A cosa dovuto questo cambiamento? dovuto al fatto che, mentre i nucleotidi
pirimidinici si mantengono sempre C2'-endo, anti, i nucleotidi purinici (tutti) si trasformano in C3'endo (il desossiribosio), syn (i nucleotidi). I purinici si trasformano dunque completamente, basi
massimamente ravvicinate: questo sconvolge la struttura regolare della doppia elica, tanto vero
che i filamenti si avvolgono l'uno attorno all'altro in senso sinistrorso, i due filamenti
polinucleotidici hanno andamento a zig zag e il solco maggiore molto ampio e poco profondo.
Perch tutto questo? In questo caso si osserva la meraviglia della natura, dimostra come un tratto di
DNA pu mutare la propria conformazione e dunque mutare la propria interazione con le proteine,
in pratica pu regolare esso stesso, come se avesse una capacit intrinseca, la propria funzionalit.
Quindi, se in questo solco maggiore, questo consenso di 6 coppie di basi, si supponga sia
riconosciuto da 10 proteine diverse di dimensioni differenti, nel momento in cui questo tratto di
DNA passa dalla forma B alla forma A, il solco maggiore diventa pi stretto e profondo, tutte e 10
le proteine saranno in grado di entrare nel solco maggiore? No! Le pi piccole, quindi da 10 si passa
a 4 o 3, quindi il DNA passando alla forma A limita l'interazione con le proteine strutturali gi da s,
per una sua caratteristica strutturale. Se invece passa dalla forma B alla forma Z, le 10 proteine
entrano tutte e 10? S. Ma ne entrerebbero anche delle altre? Certamente, perch ci saranno
sicuramente proteine di dimensioni maggiori che avranno i gruppi chimici idonei a riconoscere
sempre lo stesso consenso, in questo caso magari quando il DNA passa nella forma Z, quel solco
maggiore, quel consenso, non sar riconosciuto solo da 10 proteine ma anche da 20, 25 proteine di
dimensioni differenti, che lo faranno funzionare in modo diverso rispetto alle 3 proteine della forma
A o alle 10 della forma B. Il DNA, mutando la propria conformazione, ha la capacit di regolare
l'interazione dei propri consensi con diversi tipi di proteine e in definitiva anche la propria
funzionalit e questa una cosa molto bella, questo argomento deve interessare i futuri medici.
Si osservi l'immagine: un tratto della doppia elica di DNA, dove si vede l'appaiamento delle basi.
Una coppia di basi giace sullo stesso piano o su due piani che sono leggermente sfasati l'uno
rispetto all'altro a mo' di pala d'elica? Quale delle due immagini corretta (sempre nella forma B)?
Possono essere presenti tutte e due le forme a seconda di come ripiegato il DNA, perch il DNA
non mai lineare ovviamente, senn come ci entra? 2 metri di DNA in una cellula molto piccola
non pu mai entrare, deve necessariamente avere ripiegamenti. A seconda di come si trova il DNA,
le basi possono assumere una conformazione a mo' di pale d'elica oppure giacere perfettamente
sullo stesso piano, quindi sono valide entrambe le forme.
Una delle caratteristiche fondamentali che ha il DNA, e che anche alla base del suo
funzionamento, quella di poter essere denaturato senza subire alterazioni nella struttura; la
denaturazione consiste nella rottura dei legami a idrogeno tra le basi complementari e nella
separazione dei due filamenti polinucleotidici, denaturazione che avviene regolarmente in vivo tutte
le volte in cui il DNA deve funzionare. Si pu denaturare il DNA artificialmente, altrimenti non lo
si potrebbe mai manipolare, e lo si fa in modi diversi: ad esempio, se lo si mett3 in una soluzione
fortemente acida (pH 3) o fortemente alcalina (pH 11): con questi valori di pH i legami a idrogeno
non sono compatibili quindi si rompono e i due filamenti di separano (in passato, per denaturare il
DNA, si preferiva la soluzione alcalina poich quella acida normalmente distrugge il legame
glicosidico delle purine e si ha depurinizzazione delle basi con perdita dell'informazione, mentre a
pH alcalino ci non succede); si possono anche usare gli agenti denaturanti, ossia molecole come
dimetilsolfossido o urea, che hanno capacit di formare legami a idrogeno con le basi puriniche e
pirimidiniche - questo perch, se si considera una molecola di DNA, non si deve pensare che i
legami a idrogeno tra le basi che si formano siano statici (ci avviene in tutte le molecole) ma

dinamici: i legami a idrogeno si rompono e riformano continuamente, ad altissima velocit, in


questo caso anche l'unione tra i due filamenti polinucleotidici dinamica e non statica; cos avviene
anche per tutte le molecole, chi pi ne ha pi ne metta (similmente ci avviene anche con le
interazioni tra DNA e proteine o tra RNA e proteine, quindi tutto altamente dinamico).
Se si mette in una soluzione che contiene DNA un agente denaturante (piccola molecola ma che
contiene dei gruppi accettori o donatori di legami a idrogeno), nel momento in cui si spezza un
legame a idrogeno per una infinitesima quantit di tempo, questo, anzich riformarsi con le basi, lo
fa con l'agente denaturante che pi piccolo e si pu infilare pi facilmente. A questo punto, se le
basi formano un legame a idrogeno con l'agente denaturante, non si possono pi ripristinare questi
legami a idrogeno tra le basi stesse. Dunque, nel momento in cui si aggiunge un agente denaturante
ad una soluzione di DNA, si vede che prontamente i filamenti polinucleotidici si separano e restano
denaturati. Si possono rinaturare solo quando si riesce a togliere l'agente denaturante, ad esempio
mediante dialisi, mediante particolari membrane semipermeabili (un po' di pi di queste),
membrane che fanno passare piccole molecole e non grandi molecole, quindi le piccole molecole
rappresentate dall'agente denaturante possono essere facilmente allontanate, mentre il DNA della
macromolecola viene intrappolato dalla membrana. Quindi, se si allontanano gli agenti denaturanti,
il DNA si rinatura.
Il metodo pi utilizzato rappresentato dal calore: nel momento in cui si riscalda una soluzione di
DNA, quando essa raggiunge un determinato valore di temperatura, si osserva una immediata
denaturazione del DNA, i filamenti polinucleotidici si separano. Il DNA non si denatura molto
facilmente; la temperatura adatta 87,5C per quello umano, per ci sono, a parit di lunghezza
(cio si sta considerando la possibilit di selezionare tratti di DNA), zone di DNA che denaturano a
82C, al di sotto non denatura; altre che invece, per essere denaturate, hanno bisogno di 90C, con
tutte le possibilit intermedie che ci sono tra le due temperature.
Perch, a parit di lunghezza, alcune molecole denaturano a temperatura pi alta e altre a
temperatura pi bassa? Se in questo tratto di DNA v' un elevato contenuto di guanine e citosine,
ovviamente tre legami a idrogeno per essere denaturate necessitano di maggiore energia e la
temperatura deve essere pi alta; se invece in quel tratto di DNA v' maggiore prevalenza di
appaiamenti adenina-timina, essendo solo 2 legami a idrogeno, si ha bisogno di meno energia per
denaturarli, e la temperatura a cui si denatura quel tratto inferiore.
Gi da questo valore di temperatura si potrebbero anche avere informazioni sul contenuto di
guanina e citosina e sulla complessit di quel determinato genoma. Oggi non necessario per
fortuna perch con i sequenziatori di nuova generazione si in grado, in pochissimo tempo, di
sequenziare interi genomi.
Ora, si presti attenzione alle seguenti considerazioni: il valore di temperatura al quale la met delle
molecole di DNA risulta essere denaturata, si considera valore di denaturazione e si chiama
temperatura melting o TM. Quindi, se si domanda qual' la TM del DNA umano, la risposta
87,5C.
Ora, si veda che la denaturazione un processo che subiscono molte altre macromolecole, come
per esempio le proteine, ma nelle altre macromolecole la denaturazione irreversibile, nel caso del
DNA reversibile: infatti il DNA una molecola molto versatile anche per questo, perch la si pu
denaturare e poi il DNA si rinatura tranquillamente anche in vivo. Se si cucina un uovo, cosa fa la
parte viscosa che contiene le albumine? Si denatura e poi diventa solida e bianca. Se si lascia
raffreddare l'uovo anche per una settimana, un anno, questo diventa come prima? No, perch la
denaturazione irreversibile. La stessa cosa vale per una bistecca di carne: se la si cuoce ai ferri,
molto buona da mangiare ma impossibile che possa tornare nuovamente una fetta di carne fresca
se la si lascia raffreddare o la si tiene in frigorifero tutto il tempo si vuole.
Se si denatura il DNA al calore, ci sar ovviamente un valore di temperatura al quale i due
filamenti polinucleotidici tornano perfettamente a ricomplementarizzarsi riformando una molecola
di DNA a doppio filamento perfettamente funzionante: questo valore esattamente 25C in meno
rispetto alla TM, e si chiama temperatura di rinaturazione. Se la temperatura melting 90C, a che
temperatura il DNA si rinatura? 65C (temperatura di rinaturazione).

In vivo il DNA funziona mediante continui processi di denaturazione, che in questo caso chimica
perch avviene a temperatura corporea, e rinaturazione enzimatica, quindi denaturazione chimica
enzimatica e rinaturazione enzimatica. Il DNA, mediante questi cicli di denaturazione e
rinaturazione, pu svolgere le sue tre principali funzioni: replicazione, riparazione e trascrizione,
con trasformazione di alcuni tratti di RNA.

Struttura dell'RNA
Differenze tra DNA ed RNA: al posto del desossiribosio v' il ribosio ( uno zucchero un po' pi
grande; quindi, scendendo nel piccolo, la molecola di RNA un pochino pi grande come singolo
filamento); nasce sempre a singolo filamento e al posto della timina, in genere quando nasce,
contiene l'uracile (poi l'uracile potrebbe anche essere trasformato in timina). Queste sono le
differenze principali esistenti tra molecola di DNA e di RNA. Un'altra differenza che nel caso
dell'RNA il filamento molto pi corto della molecola di DNA, quindi tra trascrizione e
replicazione v' un'importante differenza.
Qua possibile osservare le differenze di cui sopra, per una cosa di cui bisogna sempre tener
conto [e su questo c' qualche quiz]: l'RNA viene sempre sintetizzato a singolo filamento ma non lo
si trova mai come tale, perch porzioni di RNA (in questo caso si ricordi che le basi sono molto pi
libere, anche il ribosio pi libero e pu formare pi conformazioni rispetto a C2'-endo e C3'-endo
visto per il desossiribosio, e ovviamente anche le conformazioni dei nucleotidi sono diverse: non
esistono solo anti e syn ma tutte le possibili combinazioni perch, ovviamente essendoci solo
legami singoli, ogni gruppo pu ruotare l'uno attorno all'altro secondo diverse configurazioni
energetiche, nel caso della molecola lineare) possono appaiarsi. La molecola lineare ha dei tratti in
cui le basi si incontrano e ci sono i gruppi chimici allineati in grado di formare legami a idrogeno:
questi gruppi si complementarizzano formando delle strutture di RNA a doppio filamento. Per
conseguenza, dopo la trascrizione, sicuramente l'RNA former almeno delle strutture a doppio
filamento: si formano le strutture secondarie.
Ma non basta: le strutture secondarie o terziarie che l'RNA pu formare possono essere molto ma
molto complesse ed in effetti l'RNA pu funzionare anche da componente strutturale: si ricordino i
ribosomi o gli spliceosomi; sono gli RNA che li formano e li fanno funzionare, sono molto pi
versatili rispetto al DNA.

Si possono vedere strutture tipiche della molecola di RNA: ci sono ad esempio le estremit dal 5' a
3', le porzioni terminali, che sono complementari, quindi si uniscono e si viene a formare una
struttura molto comune per la molecola di RNA: stem loop (stelo-ansa).
Qua si osserva invece una delle strutture in cui quasi tutti i nucleotidi sono complementari, quelli
che non sono complementari vengono esclusi verso l'esterno, ad esempio qua sono tre nucleotidi e
sono rivolti verso l'esterno, e questi a loro volta possono ruotare a 360 ed eventualmente unirsi con
altri nucleotidi di altre molecole di RNA; l, ad esempio, una sola che espulsa verso l'esterno e

questa struttura deve essere ricordata molto bene perch s'incontrer quando si disquisir sullo
spliceosoma. In questo caso, la base viene completamente spostata verso l'esterno, dunque, se ha dei
gruppi chimici particolari, questa base pu facilmente esibire questi gruppi e innescare determinate
reazioni.
Poi ci sono altre strutture, tipo questa adenina pu complementarizzarsi contemporaneamente con
due uracili, e questi due uracili possono far parte della stessa molecola di RNA. Bisogna pertanto
comprendere come la molecola di RNA si ripiega e come instaura rapporti chimici con altri acidi
nucleici. L'adenina e le due molecole di uracile viste prima, possono far parte di tre diverse
molecole di RNA che si uniscono insieme a formare una struttura terziaria molto ma molto
complessa. In strutture terziarie, le molecole possono addirittura catturare e quindi formare delle
tasche per coordinare dei cationi metallici (come ad esempio il magnesio) e l dove ci sono strutture
che contengono metalli, queste strutture funzionano da catalizzatori biologici. Come si chiamano i
catalizzatori biologici? Enzimi. Per bisogna sempre fare una distinzione: enzima deve essere
sinonimo di proteina; se a svolgere l'attivit catalitica invece un RNA, si parler di un ribozima e,
dunque, di attivit riboenzimatica. In effetti, molte molecole di RNA, anche umane, hanno attivit
riboenzimatica.
Addirittura le molecole di RNA (ma anche le molecole di DNA a singolo filamento) possono
formare degli appaiamenti multipli, con formazione di legame tra guanina e uracile, citosina e
uracile, che si chiama tetraloop, che una sorta di nodo che chiude determinate strutture, quali
possono essere, ad esempio nel caso dei cromosomi, le estremit, oppure nel caso di alcune
molecole di RNA per formare delle strutture molto complesse con cavit simile a quelle di alcune
proteine, per farle funzionare come catalizzatori biologici.
Una molecole di RNA pu, attraverso questi tipi di appaiamenti, formare prima una struttura
secondaria, poi un'altra struttura secondaria complessa e infine attorcigliarsi in una struttura
terziaria. Qua, due molecole di RNA in struttura secondaria, possono unirsi tra di loro per formare
delle strutture terziarie pi complesse, addirittura nella seconda immagine due strutture identiche si
uniscono e si dice che "si baciano". Ovviamente si ricordi che tutto questo non possibile a RNA
libero, perch verrebbe rapidamente degradato dalle ribonucleasi; tutto ci possibile perch
l'RNA, ancor pi del DNA, lo si trova sempre associato a proteine, non v' mai RNA libero,
neanche quando nasce (quando viene sintetizzato).
Nel caso dell'RNA, si pu osservare un appaiamento in pi, tra guanina e uracile, mediante la
formazione di 2 legami a idrogeno: il primo tra l'ossigeno carbonilico in posizione 6 della guanina
(che funge sempre da accettore) e l'azoto in posizione 3 dell'uracile (che funge da donatore); l'altro
si forma tra l'azoto 1 della guanina con l'ossigeno carbonilico in posizione 2 dell'uracile. Si formano
questi legami a idrogeno tra guanina e uracile, quindi una coppia di appaiamento in pi, quindi la
possibilit di formare strutture secondarie e terziarie in numero maggiore.
Quando una molecola di RNA si trova in struttura secondaria, cio forma un doppio filamento, esso
avr una sua conformazione. Come da immagine, la conformazione dell'RNA sempre la A (non
in forma B come nel caso del DNA), perch c' l'ossigeno in C2' in pi che ostacola la
conformazione C2'-endo, e la pi favorita la C3'-endo, e quindi conseguentemente la doppia elica
di RNA sar in forma A [questa la motivazione che si dovr dare all'esame; dunque, se vi sar un
quiz ''in che conformazione si trova l'RNA a doppio filamento?", non si legga DNA, si troveranno le
risposte tra le quali la forma A, ed quella che si deve segnare].
Nella molecola di RNA, nel momento in cui essa viene sintetizzata e cominciano questi
appaiamenti, si formano le strutture secondarie e terziarie: tutte le basi subiscono delle modifiche; le
basi che subiscono pi frequentemente modifiche sono le pirimidiniche, e tra queste l'uracile, in
assoluto la base che subisce le modifiche pi disparate. Tra queste modifiche v' la metilazione in
posizione 5 con trasformazione in timina; le altre due modifiche pi frequenti, che si trovano
soprattutto nell'RNA transfert, ma non solo, sono queste due: ossia il ribosio si sposta sempre con il
carbonio 1, dall'azoto 1 al carbonio 5, quindi in questo caso si avr un legame dell'uracile con il
carbonio 1 del ribosio tramite il suo carbonio 5 anzich l'azoto 1. Non sar pi un legame Nglicosidico [potrebbe essere una domanda da quiz] ma O-glicosidico. Quando succede questo, non

appropriata la definizione di uridina ma pseudouridina, indicandola con il simbolo PSI. Un'altra


trasformazione la perdita dell'aromaticit: in questo caso si rompe il doppio legame da il carbonio
5 e il carbonio 6 e ovviamente vengono aggiunti degli idrogeni, e non pi corretto parlare di
uridina ma di diidrouridina che si indica con il simbolo D.
Sono queste le modifiche pi comuni cui pu andare incontro l'uracile, ma poi ce ne sono altre e
tutti i tratti, tutti gli RNA, anche quelli che neanche lontanamente si immaginano, subiscono la
modifica delle basi.

Diidrouridina (D)

Lezione III

04/05/2012

RNA transfert e aminoacil-tRNA-sintetasi


Nelle molecole di RNA tutte le basi, dopo la sintesi, subiscono delle modifiche che sono essenziali
per il corretto funzionamento di ciascuna molecola di RNA. Tra queste basi, quelle pirimidiniche
sono quelle maggiormente coinvolte nelle modifiche e, tra le pirimidine, l'uracile sicuramente la
base che maggiormente subisce modifiche. In quest immagine si pu osservare uno degli RNA pi
importanti per la produzione delle proteine, cio lRNA transfert.
Come da immagine, lRNA transfert, subito dal momento in cui nasce (la lunghezza di tutti i
transfert varia tra i 70 e i 90 nucleotidi) assume immediatamente una conformazione
tridimensionale. Qui si ha invece la conformazione solo bidimensionale che esclusivamente
didattica e serve per capire come formato il tRNA. Si vede che ci sono dei punti di contatto che
formano diversi loop e alla fine un unico stelo dove le estremit 3e 5 si agganciano. Tutti questi
loop sono importanti per il corretto riconoscimento da parte degli enzimi che devono caricare su
questi transfert gli aminoacidi necessari alla formazione delle proteina.

La prima ansa che si vede alla sinistra detta ansa D, detta cos perch allinterno di questa ansa
c una grande quantit di diidrouridine. Poi c invece l'ansa dellanticodone dove presente una
serie di tre nucleotidi che poi vanno poi a complementarizzarsi con i codoni presenti sullRNA

messaggero, in modo che un messaggio biologico possa essere decodificato in un messaggio


chimico, rappresentato dalla proteina. Quindi questansa che funge da traduttore ed differente
per ogni transfert in funzione dellaminoacido che andr a formare. Poi si ha una piccola ansa (la
cui lunghezza va da 3 a 13 nucleotidi) che variabile da transfert a transfert. Questansa
importante per il corretto riconoscimento del transfert.
L altra ansa lansa (psi) che cos chiamata per la grande quantit di pseudouridine presenti in
essa. Infine v' il braccio accettore, il quale al 3 (per tutti i transfert) termina con quella sequenza
CCA, fondamentale affinch degli appositi enzimi vadano ad agganciare con legame covalente gli
aminoacidi su questi transfert, per il corretto trasporto verso i ribosomi. In effetti, nelle cellule
eucariote e procariote ci sono sistemi enzimatici specifici deputati alla riparazione di questi tre
nucleotidi CCA qualora un transfert dovesse subire un danno a carico di questa parte terminale.
Siccome i transfert vengono continuamente rinnovati dopo la loro sintesi, se la parte terminale
danneggiata, la cellula non sintetizza un nuovo transfert (ci sarebbe dispendioso), ma alcuni
enzimi riparano queste due citosine e ladenina terminale affinch il transfert torni ad essere
perfettamente funzionante.
Gli enzimi che operano il caricamento dei transfert e quindi legano covalentemente il gruppo
carbossilico degli aminoacidi sul braccio accettore (precisamente sulladenina) si chiamano
aminoacil-tRNA-sintetasi o semplicemente sintetasi (perch non se ne trovano altre in biologia
molecolare). Ma dove viene caricato laminoacido? Esso pu essere caricato o sullOH in posizione
2 dell adenina o sullOH in posizione 3 delladenina. Quindi, in base a ci, si distinguono due tipi
di sintetasi:
sintetasi di primo gruppo (caricano laminoacido sullossidrile in posizione 2);
sintetasi di secondo gruppo (caricano la.a. sullOH in posizione 3).
La sintetasi un enzima molto articolato: contiene molte cavit ed esiste una sintetasi per ciascuno
degli aminoacidi proteici che deve entrare a far parte della struttura di tutte le proteine e queste
sintetasi contengono in unapposita tasca il loro amminoacido. C anche vicino unaltra tasca che
contiene una molecola di ATP (molecola energetica per eccellenza) ed in effetti si direbbe che le
sintetasi si chiamano cos perch per svolgere la loro attivit catalitica devono idrolizzare una
molecola di ATP e quindi utilizzare lenergia che deriva dallidrolisi del legame anidridico
(normalmente il legame tra il fosfato ed il ) con passaggio da ATP ad ADP (v' una reazione
analoga nel caso degli acidi grassi prima che essi possano essere utilizzati dalla cellula a scopo
energetico).

Tutte le sintetasi sono degli enzimi molto accurati nelleseguire questa reazione enzimatica. Hanno
una terza cavit dove pu essere ospitato un determinato transfert. Nel momento in cui un transfert
entra in una specifica sintetasi (es. in una che deve caricare glicina) ci sar ATP e una specifica tasca
con laminoacido (nella struttura tridimensionale del transfert si vedr la struttura ad L rovesciata).
Il transfert della glicina entra allinterno della sua tasca ma la sintetasi non catalizza
immediatamente il caricamento del transfert (laggancio del gruppo carbossilico con l'ossidrile in 2
o 3 ). Prima controlla che il transfert sia corretto (cio che abbia un anticodone che corrisponda alla
glicina): controlla cio la sequenza di nucleotidi dellansa dellanticodone e anche di tutte le altre
anse. Se tutto il controllo va a buon fine, immediatamente la sintetasi cosa fa? Semplicemente fa in

modo che lATP si idrolizzi ad AMP e questo AMP viene caricato sul gruppo carbossilico
dellamminoacido con liberazione di un pirofosfato che, anche in questo caso, per rendere
irreversibile la reazione, viene degradato da una pirofosfatasi a due fosfati inorganici. Si ha, quindi,
un aminoacido adenilato, cio attivato. Lamminoacido attivato conserva in s l energia che stata
ricavata dallidrolisi dellATP ad AMP in via eccezionale ed interagisce con l ossidrile in 2 o 3 del
transfert mediante determinati meccanismi.

Laminoacido attivato verr caricato sull'OH in 2' o 3' sfruttando l'energia presente nel legame tra
l'AMP e laminoacido. In questo caso, quindi, dellenergia viene utilizzata per trasformare questo
legame estereo tra il gruppo ossidrile del ribosio dellultima adenina con il gruppo carbossilico
dellamminoacido e lAMP viene liberato. In questo modo, quindi, il transfert gi caricato, con un
bel legame covalente tra la.a. e il transfert stesso ma la sintetasi non lo libera subito. Si formata
infatti una nuova molecola con legame covalente (transfert ed amminoacido) e quindi la sintetasi,
sempre a livello di una nuova tasca (perch cambia la propria conformazione quando avviene questa
attivit enzimatica) ricontrolla accuratamente transfert e amminoacido. Essa controlla che
l'aminoacido sia stato caricato sul suo specifico transfert. Se questo controllo va a buon fine, allora
la sintetasi cambia conformazione, si apre e libera il transfert che poi, con la trascrizione, sar
reclutato da fattori responsabili del processo. Se invece il controllo non andato a buon fine (il
transfert non quello corretto o uno molto simile ma non quello) la sintetasi ha la capacit di
idrolizzare il legame estereo, separare di nuovo lamminoacido dal transfert, far uscire il transfert
scarico scorretto e lasciare lo spazio per un altro transfert dopo aver recuperato lAMP ed
incorporato una nuova molecola di ATP.
Gi in vista della traduzione, si ha una situazione di grande precisione a partire dal caricamento del
transfert. La cellula non pu permettersi il lusso di sbagliare durante questi processi, primo fra tutti
il caricamento dei transfert. Non pu caricare su un transfert diverso un aminoacido che non
corrispondente a quello del codone. La proteina conterrebbe un aminoacido diverso e
pregiudicherebbe la corretta funzionalit della proteina. Tutti i processi, dalla trascrizione alla
traduzione, sono altamente controllati in modo che il messaggio molecolare contenuto nella
molecola di DNA, relativo ad un determinato gene, sia accuratamente tradotto in una
corrispondente sequenza di aminoacidi e quindi in una corrispondente proteina.

Impacchettamento del DNA


Si cominci a parlare della formazione dei nucleosomi, cio del compattamento del DNA allinterno
del nucleo. Il DNA nella cellula umana lungo circa due metri e deve essere contenuto in un nucleo
di dimensioni molto ma molto limitate e deve essere quindi accuratamente avvolto tramite speciali
proteine in un modo molto elegante perch ciascun tratto di questi due metri deve poter essere
liberato per le diverse funzionalit cui pu andare incontro la molecola di DNA, soprattutto nei
processi di trascrizione. Quindi limpacchettamento del DNA deve essere molto dinamico oltre che
molto preciso (in effetti la natura ha pensato molto bene anche a questa evenienza).
Il DNA pu subire diversi tipi di accorciamenti che sono diversi a seconda dello stato in cui si trova
la cellula. Nella prima immagine, una molecola di DNA a doppia elica e l una rara immagine reale

al microscopio elettronico (rara perch non si trova mai il DNA a singolo filamento, cio libero da
proteine a meno che non si esegui unestrazione e le si elimina).
Il primo grado di accorciamento consiste nel formare delle particolari strutture che prendono il
nome di nucleosomi, mediante associazione con proteine istoniche. Si viene a formare una fibra di
DNA con tanti nucleosomi che prende il nome di fibra da 10 nm o fibra a collana di perle come si
pu ben vedere nellimmagine reale al microscopio elettronico. Tale fibra quella
trascrizionalmente attiva: quando il DNA trascrizionalmente attivo, la fibra di DNA si trova pi
spostata verso limpacchettamento da 10 nm ed cio decondensata. Per nel nucleo la fibra da 10
nm ha necessit di subire ulteriori gradi di condensazione e quindi si verr a formare una fibra pi
grande costituita appunto da un particolare avvolgimento di questa fibra da 10 nm, cio dei
nucleosomi stessi, per arrivare a formare quella da 30 nm. La fibra da 30 nm, a sua volta, si associa
ad uno scaffold nucleare, costituito da tutta una serie di proteine (molte proteine) le quali
agganciano questa fibra da 30nm a formare una sorta di occhielli. Nell'uomo ogni occhiello di fibra
da 30nm, ben agganciato alle estremit allo scaffold nucleare, contiene circa 100.000 coppie di basi
(quindi ci sono molti occhielli). In questo modo si viene a formare quella che la fibra da 300 nm.
Si tenga presente che nelle cellule interfasiche il DNA si ferma a livello di fibra da 300 nm come
condensazione, dove per lunit funzionale rappresentata dallocchiello costituito a sua volta
dalla fibra da 30 nm. Se invece la cellula entra attraverso il ciclo cellulare per dividersi quindi ha
necessit di replicare il proprio DNA e distribuire il DNA replicato alle proprie cellule figlie, la
fibra da 30 nm subisce ulteriori gradi di condensazioni (tramite condensine). Si viene a formare un
ulteriore grado di condensazione che porta alla formazione della fibra da 700 nm che,
condensandosi ulteriormente, forma poi la fibra da 1400 nm rappresentata dal cromosoma, che in
questo caso una struttura visibile anche al microscopio ottico. Questo per succede (cio si
possono osservare le fibre da 700 e 1400 nm che rappresentino il massimo grado di condensazione
con le proteine istoniche ma non solo istoniche) quando la cellula si sta dividendo. Quando la
cellula in intefase e sta regolarmente lavorando, il DNA si trova sotto forma di fibra da 300 nm.
Quindi lunit funzionale rappresentata dalla fibra da 30 nm la quale, a sua volta, in equilibrio
sempre con la fibra da 10 nm. Dunque occorre un notevole grado di decondensazione per far s che
il DNA possa funzionare almeno da un punto di vista trascrizionale, cio per trasferire, attraverso
molecole di RNA, quelle che sono le proprie informazioni.
In questimmagine possibile osservare gli istoni convenzionali.
I geni delle proteine istoniche sono distinti in due tipi:
i geni dipendenti dalla replicazione che producono istoni convenzionali;
i geni indipendenti dalla replicazione che, invece, producono degli istoni non convenzionali
detti varianti istoniche di rimpiazzamento.
Ora, mentre i geni per gli istoni non convenzionali sono del tutto identici ai normalissimi geni che
codificano per le proteine, quelli invece dipendenti dalla replicazioni che codificano per le proteine
istoniche convenzionali sono diversi. Anche il messaggero diverso, la loro maturazione diversa e
anche la traduzione avviene con modalit differenti. Inoltre questi geni sono raggruppati in clusters,
sono presenti molteplici copie e sono localizzati solo su 5 cromosomi umani.
Quand che questi geni dipendenti dalla replicazione vengono attivati e quindi trascritti nellRNA
messaggero per la produzione delle proteine istoniche? Nella fase S tardiva, in cui avviene la sintesi
delle proteine istoniche che poi servono per agganciare nuove molecole di DNA sintetizzate. Questo
perch nella fase precoce avviene la replicazione del DNA e, una volta che questo si replicato, le
proteine di vecchia sintesi non bastano per agganciare le due molecole di DNA che si sono appena
formate: deve essere sintetizzata una uguale quantit di proteine nuove uguali a quelle di vecchia
sintesi. Si tratta di una sintesi che avviene eccezionalmente durante la fase S tardiva del ciclo
cellulare perch durante la fase S la cellula non va incontro a processi biosintetici, ad eccezione
appunto della sintesi di proteine istoniche.
Gli istoni convenzionali vengono indicati con H che sta per Histone (dallinglese) e si distinguono
cinque tipi principali di istoni convenzionali:

H1 o linker;
H2A;
H2B;
H3;
H4.

Questi istoni sono altamente conservati in tutti gli eucarioti, comprese le piante. I pi conservati
sono gli H3 e H4. L'istone H4 umano e quello del mais differiscono per un solo aminoacido. Gli
istoni umani e quelli di topo sono praticamente identici, si possono mescolare senza che ci sia
alcuna problematica.
Tutti gli istoni sono formati da una parte globulare che quella centrale, e da delle porzioni a
singolo filamento che prendono il nome di code.
Listone H1 ha una coda carbossi (C-) ed una amino (N-) terminale molto grande. Listone H2 ha
una piccola coda C-terminale ed una discreta coda N-terminale. Ma gi a partire dallH2B la coda
C-terminale non c pi, c sempre la coda amino-terminale. Si ponga particolare attenzione a
queste code amino-terminali perch svolgono un ruolo di cruciale importanza per il corretto
espletamento dei processi vitali della cellula.
Tutti gli istoni contengono un elevato contenuto (soprattutto le code N-terminali) di due aminoacidi
basici (lisina e arginina; listidina, pur essendo basico, non viene considerata un a.a. basico vero e
proprio). Lisina e arginina hanno due gruppi aminici: uno in posizione alfa e l'altro un gruppo
aminico laterale, quello vero e proprio in grado di conferire a questi aminoacidi un elevato grado di
basicit. Per tale ragione nelle code vi sono delle cariche elettriche positive dovute proprio ai residui
di lisina e arginina. Queste cariche positive giocano un ruolo cruciale per i processi biologici.
Come si viene a formare un nucleosoma? Gli istoni, nel momento in cui vengono sintetizzati, non
si trovano mai liberi singolarmente ma subito si associano tra loro: in particolare, gli istoni H2A e
H2B si associano tra loro a formare dei dimeri con orientamento testa-coda e quindi rimangono
sotto forma dimerica. Anche gli H3 e H4 si uniscono tra loro a formare un dimero, sempre con
orientamento testa-coda, e poi i due dimeri si associano a formare un tetramero. il tetramero che
inizia ad accorciare il DNA: infatti, come da immagine, accorcia un tratto qualsiasi di DNA: non ci
sono sequenze specifiche a cui si agganciano le proteine istoniche perch i legami tra DNA e
proteine istoniche sono legami altamente aspecifici (avvengono solo con lo scheletro di zuccherofosfato). Il tratto di DNA che viene accorciato a livello di ciascun nucleosoma lungo, secondo
Watson, 147 coppie di basi (e, nonostante secondo altri autori siano 146, si sa che 147 il numero
corretto perch sono stati fatti degli studi anche con diffrazione a raggi X).

il tetramero H3-H4 che inizia questo tipo di accorciamento in quanto si aggancia ai primi 60
nucleotidi di questi 147 e prende contatto anche con gli ultimi 13 di questi 147. In questo modo,
questi sono i 60 centrali, questi sono gli ultimi 13, ecco che queste 147 coppie di nucleotidi di DNA
si avvolgono in senso sinistrorso per 1,65 volte attorno al tetramero di istoni. Ecco che si ha un
primo grado di accorciamento della molecola di DNA. Dopo di ci, rimangono ovviamente libere

porzioni tra gli ultimi 13 ed i 60 centrali da entrambi i lati, e queste vengono occupate da altre due
coppie (una da un lato ed una dallaltro lato) dei dimeri H2A e H2B. In questo modo si viene a
formare un ottamero di istoni.
Il nucleosoma quindi, in effetti, formato da un ottamero intorno al quale 147 coppie di basi sono
avvolte per 1,65 volte. Ovviamente, ogni nucleosoma termina con una piccola porzione chiamata
DNA linker, la cui lunghezza , per, variabile da specie a specie. Il numero di 147 nucleotidi che si
avvolgono in senso sinistrorso introno ad ogni ottamero di istoni invece uguale in tutti gli
eucarioti, la lunghezza del DNA linker (tra un nucleosoma e un altro) variabile. Nelluomo di
circa 80 coppie di basi (non si pu essere precisi proprio perch i nucleosomi sono molto dinamici).
Si guardi questimmagine. Cosa si osserva? Le code amino-terminali fuoriescono dal corpo
centrale dellottamero come se fossero i tentacoli di una piovra. Questa immagine e quella
successiva indicano che il DNA, quando si avvolge attorno allottamero di istoni, non si pu
avvolgere a livello di qualsiasi sequenza (anche se l avvolgimento sempre aspecifico) ma si
avvolge l dove v' un maggiore contenuto di adenine e timine, perch l il solco minore si presta
bene ad essere piegato a formare questi angoli e, come si ricorda, le basi, anzich giacere sullo
stesso piano, si spostano a mo' di pale delica. In queste regioni di A e T si ha la formazione di un
nucleosoma, mentre dove ci sono pi citosine e guanine si preferisce lasciarle come DNA linker. A
livello di ogni nucleosoma si vengono a formare oltre 100 legami a ponte idrogeno tra lo scheletro
di zucchero-fosfato e le proteine istoniche, e moltissime quantit di interazioni elettrostatiche e
forze di Van der Waals.
I legami tra il DNA e l'ottamero di istoni, anche in questo caso, non sono statici ma dinamici: si
rompono e quindi il DNA resta libero tra le proteine istoniche per una frazione di secondo e poi si
riformano ed grazie a questo continuo equilibrio tra formazione e rottura di legami che alla fine i
nucleosomi premettono allintera molecola di DNA di liberarsi completamente dagli ottameri di
istoni ogni volta che deve funzionare (replicarsi, ripararsi o trascrivere molecole di RNA). Quindi si
ricordi che anche in questo caso linterazione tra proteine istoniche e nucleosomi molto dinamica.
Listone H1, invece, che il pi grande ed ha entrambe le code cariche positivamente, si va ad
agganciare al DNA linker (perch si sa che il DNA fortemente acido per la presenza del gruppo
fosfato in alfa dunque si tratta di una interazione elettrostatica tra carica negativa del fosfato e carica
positiva delle code) e lo avvicina al nucleosoma stesso, prendendo contatto sia col DNA linker che
con quello gi agganciato ai nucleosomi. In effetti, alla fibra da 10 nm che si formata, imprime
una sorta di ulteriore grado di condensazione che determina la formazione della fibra da 30 nm.
Per si ricordi che la stabilit della fibra da 30 nm non dovuta allistone H1 come erroneamente
portato in molti testi. Non l'istone H1 che forma la fibra da 30 nm. Listone H1 semplicemente
imprime questa tendenza a condensarsi nella fibra da 10 nm per formare quella da 30nm. Chi poi la
tiene e la rende reale ed effettiva sono altre strutture che saranno oggetto di successive lezioni.
La struttura e le modalit con cui si forma questa fibra da 30 nm, non sono state ancora del tutto
chiarite. Per cui sono stati proposti solo due modelli che sono solo teorici. Quando listone H1 si
lega ed imprime questa tendenza alla formazione della fibra da 30, se il DNA linker molto lungo
si avr la cosiddetta formazione di una fibra da 30 a zig zag; se invece il DNA linker corto, allora
l'istone H1 imprime la formazione di una fibra da 30 a solenoide. Nelluomo, dove il DNA linker
lungo circa 80 relativamente corto dunque si forma la fibra a solenoide. Questi sono solo modelli
teorici, ci sono ancora oggi molte perplessit in proposito.
Si veda come nella cellula si trovano la fibra da 30nm e la fibra da 10 nm in equilibrio sempre, a
meno che un gene non sia disattivato. Quindi i possono avere tutte le combinazioni possibili tra una
fibra completamente compattata e una completamente rilassata. Tutte queste combinazioni ci danno
la dinamica della cromatina! Si ha compattamento e rilassamento in base ai geni che devono
funzionare.
Quando la fibra da 30 nm fortemente compattata, tutte le sequenze del DNA sono ben mascherate
sia dalle proteine istoniche che da altre proteine, quindi il gene non facilmente raggiungibile dalle
proteine funzionali che devono farlo funzionare e da un punto di vista funzionale silenziato.
Quando la fibra decondensata, quindi ha uno spessore di 10 nm, v' invece molto DNA libero e

molti consensi sono disponibili per le proteine funzionali e il DNA trascrizionalmente attivo. Nel
primo caso si parla di eterocromatina, nel secondo di eucromatina. Eucromatina sta per cromatina
decondensata mentre eterocromatina sta per cromatina fortemente condensata e dunque non
accessibile alle proteine funzionali. Nell'ambito delleterocromatina, si distinguono poi la
transitoria (geni che in alcune circostanze devono funzionare e vengono attivati e si trasformano in
eucromatina mentre in altre circostanze i geni devono essere transitoriamente spenti; la fibra non
sar comunque troppo compattata) e la permanente (quei geni restano sempre condensati).
Ma chi realmente responsabile della formazione della fibra da 30 nm e di questa dinamica della
cromatina? Che sono queste strutture nellimmagine? Sono le code amino-terminali degli istoni,
soprattutto di H3 ed H4 che, come da immagine, fuoriescono dal nucleosoma e, avendo cariche
positive, agganciano il DNA dei nucleosomi adiacenti e sono loro che rendono reale, concreta la
fibra da 30 nm. Le code determinano la dinamica della cromatina, cio lallentamento della fibra da
30nm a quella da10nm e viceversa, quindi come permette il funzionamento di ogni singola cellula
differenziata.
Le code amino-terminali degli istoni con le loro cariche elettriche positive sono proprio le strutture
che rendono reale la fibra da 30nm, ma sono anche le strutture che rendono dinamica la cromatina.
Affinch la cromatina sia dinamica, oltre ad alcune attivit e modifiche speciali che devono subire
le code amino-terminali degli istoni continuamente, devono agire altri enzimi. Come si forma la
fibra da 30 nm? Alla fine la fibra da 30 nm si ripiega ad occhiello, si aggancia allo scaffold nucleare
proteico formando la fibra da 300 nm e, se la cellula si sta dividendo, poi si avr la fibra da 700 e
poi quella da 1400 che il cromosoma intero. Ecco qui il modello a solenoide e quello a zig zag,
anche se sono ipotesi. Questa la cellula interfasica quindi si ha la fibra da 300 nm, gli occhielli di
fibra da 30 nm e lequilibrio dovuto alle code amino-terminali che porta la fibra a decondensarsi
sotto forma di fibra da a 10 nm o a condensarsi sotto forma di fibra da 30 nm. Quando condensata
eterocromatina (transitoria o permanente) e quando decondensata eucromatina. Tutto questo
a carico delle code amino-terminali degli istoni.
Gli istoni convenzionali di cui sopra, sono degli istoni che vengono prodotti durante la tardiva fase
S, per ci sono degli istoni, detti di rimpiazzamento che invece sono prodotti quando la cellula in
interfase o quando la cellula in particolari condizioni. Ce ne sono di tanti tipi. Il pi noto (primo
ad essere stato scoperto) l'istone di rimpiazzamento detto CENP-A. Questo istone sostituisce
l'istone H3 a livello del cinetocore (a livello del centromero) e ha una lunga coda amino-terminale
che termina con una struttura globulare e non carica positivamente. Questa struttura globulare in
grado di penetrare efficientemente (tipo una chiave nella propria serratura) in una scanalatura che
presente. Questa una sezione della fibra del fuso mitotico e quindi praticamente i cromatidi fratelli
si spostano nella mitosi ai poli opposti della cellula perch proprio questo istone CENP-A,
agganciandosi alle fibre del fuso, ci scorre dentro come se fosse una sorta di carrucola e quindi
porta i cromatidi fratelli ai poli opposti della cellula. A livello del cinetocore, durante la mitosi, non
ci sar dunque listone convenzionale ma quello di rimpiazzamento CENP- A, prodotto
normalmente come qualunque altro gene che produce le proteine.

In rosso, la variante dell'istone H3, CENP-A

Poi ci sono tanti altri istoni di rimpiazzamento, alcuni servono per rimpiazzare istoni che subiscono
danni in interfase e dunque sono uguali a quelli convenzionali, altri invece presentano delle
differenze e vanno a rimpiazzare gli istoni convenzionali in determinate regioni della cromatina. Ad
esempio, alla periferia del nucleo ci sono istoni che permettono di agganciare la cromatina e, in
questo caso, i nucleosomi pi periferici, che sono sempre eterocromatizzati, possono interagire con
le lamne della lamina nucleare, cio della membrana nucleare interna (membrana che quindi gioca
un ruolo fondamentale per l'organizzazione della cromatina nel nucleo). Sono istoni importanti, in
relazione alla regione del nucleo in cui si trova quella particolare zona di cromatina ed in relazione
al momento funzionale.
Affinch possa avvenire la dinamica della cromatina ed un tipo cellulare possa ben funzionare,
necessario che le code amino-terminali degli istoni subiscano delle modifiche, che costituiscono la
cosiddetta epigenetica. Per tali modifiche non bastano per rendere un gene trascrizionalmente
attivo perch, comunque, anche se la fibra da 10 nm perfettamente depolarizzata, sicuramente a
livello del DNA linker, che libero, ci saranno dei consensi dove potranno legarsi le proteine
funzionali a livello del solco maggiore ma, ovviamente, ci sono sempre i nucleosomi e, se questi
consensi si trovano a livello dei nucleosomi, sono mascherati dalle proteine istoniche dellottamero
e non possono essere raggiunti dalle proteine funzionali. Quindi, oltre alle modifiche, occorrono
enzimi che devono agire in concerto con le modifiche che si chiamano enzimi di rimodellamento
[non necessario sapere i nomi ma solo la funzione]. Sono enzimi che hanno bisogno di molecole
di ATP per funzionare e possono funzionare secondo tre meccanismi diversi. Il primo lo
scivolamento: questi enzimi permettono al nucleosoma di scivolare in avanti verso il DNA linker
libero e a sua volta il DNA linker viene agganciato dal nucleosoma, mentre la porzione che prima
era agganciata al nucleosoma viene liberata in modo tale che i relativi consensi possano essere
riconosciuti e lasciati liberi e agganciati dalle proteine funzionali. Lenzima di rimodellamento,
idrolizzando molecole di ATP, fa scivolare pi in basso il nucleosoma in modo che il consenso
venga liberato e possa essere agganciato dalla proteine funzionali. Questo tipo di rimodellamento si
verifica in circa il 20% della complessiva dinamica della cromatina.
Il secondo meccanismo lo spostamento o trasferimento: un nucleosoma ha con due consensi che
sono necessari per attivare, ad esempio, la trascrizione del DNA contenuto in questo nucleosoma;
quindi bisogna liberare entrambi; per, quando la cellula ha questa necessit, ci sar sicuramente un
altro tratto di 147 coppie di basi in qualsiasi parte della cromatina (non necessariamente deve
appartenere allo stesso cromosoma) che ha gi funzionato e deve essere riagganciato da un ottamero
di istoni. Quindi questi enzimi idrolizzando molecole di ATP provocano materialmente lo
spostamento dellottamero di istoni da queste 147 coppie di basi che devono funzionare, a quelle
147 coppie di basi che hanno gi funzionato. Quindi vi sar un nuovo nucleosoma in unaltra parte
della cromatina dove sar agganciato nuovamente e quindi condensato il DNA che ha funzionato,
mentre quello che deve funzionare sar completamente liberato ed entrambi i consensi possono
essere legati dalle proteine funzionali. In questo modo, tutto il tratto potr funzionare e cos di
seguito per tutta la lunghezza del gene. Questo meccanismo di spostamento molto frequente ed
quello che maggiormente si riscontra quando un gene deve essere trascritto. Quindi continuamente i
nucleosomi vengono spostati su altri tratti che hanno gi funzionato (sia nella stessa porzione di
DNA o in porzioni differenti) con conseguente progressiva liberazione di tutto un tratto di DNA che
costituisce un gene e che deve essere trascritto.
Infine, il terzo meccanismo di rimodellamento, che rarissimo, detto rimodellamento
propriamente detto e non provoca alcun movimento dellottamero di istoni. Semplicemente c un
consenso che deve essere agganciato da una proteina funzionale. Questa terza classe di enzimi di
rimodellamento idrolizza sempre ATP e provoca una denaturazione locale (transitoria) della
proteina istonica dove si trova il consenso, in modo che si rompano completamente i legami tra
DNA (tra la sequenza consenso) ed il nucleosoma, cos che che la sequenza resti associata al
nucleosoma ma sia libera e possa essere agganciata da proteine funzionali (avviene raramente
nelluomo). Meno raramente avviene lo sliding (che era il primo meccanismo, quello di

scivolamento) ed il pi frequente il trasferimento. Questo perch le interazioni tra DNA e


ottamero di istoni sono dinamiche (continua rottura di legami tra proteine istoniche e DNA) e se
agiscono gli enzimi di rimodellamento questequilibrio tra rottura e legame si sposta a favore della
rottura.
In questimmagine, le proteine funzionali si legano ai relativi consensi e liberano con meccanismi
differenti (i tre meccanismi suddetti) progressivamente il DNA che deve essere trascritto. Possono
agire contemporaneamente due proteine funzionali, una pi in basso e una pi in alto (lo si vedr
nella trascrizione), oppure pu agire una sola proteina.
Le strutture fondamentali che determinano la dinamica della cromatina sono le code aminoterminali e, precisamente, le modifiche post-trascrizionali continue che queste code subiscono per
condensare o decondensare la fibra da 30 nm. Queste modifiche vengono studiate da una branca
della biologia molecolare che prende il nome di epigenetica. Come pu essere definita
l'epigenetica? quella scienza che studia le modifiche che subiscono le code amino-terminali degli
istoni in modo tale che una cellula differenziata possa leggere lo stesso genoma in modo diverso
rispetto ad unaltra cellula differenziata dellorganismo. Esempio: una cellula epatica ha morfologia
e funzioni diverse da quelle di un neurone. E perch tale differenza? E perch quando queste cellule
si dividono danno luogo a cellule morfologicamente e funzionalmente uguali alle madri? Il DNA
lo stesso, sia nella cellula epatica e sia nella cellula nervosa. Ma sono le modifiche epigenetiche che
permettono alluna di leggere il DNA in un certo modo ed alla cellula nervosa di leggere il genoma
in maniera diversa, in modo da avere funzionalit e forma diverse. A livello della cellula epatica, ci
saranno delle zone del DNA fortemente condensate e l i relativi geni non saranno mai letti dalla
cellula; cos come nella cellula nervosa invece ce ne saranno altri condensati e verranno letti altri
geni. Ovviamente, nelle cellule alcuni geni vengono sempre letti allo stesso modo. Altro esempio,
nel sangue si trovano i globuli rossi in cui presente lHb che formata da 4 catene globiniche
differenti e uguali a due a due. I geni che codificano per tali catene globiniche si trovano nel DNA.
Quindi ogni cellula contiene tali geni globinici, sia quelle del derma, del pancreas, ecc.. Tuttavia in
queste cellule, tali geni sono altamente condensati quindi non vengono trascritti e non vengono letti:
vengono letti solo dal precursore del globulo rosso, ancora nucleato che invece ha questi geni
decondensati e questi consentono di produrre una grande quantit di queste catene globiniche.
Anche durante lo sviluppo embrionale lo zigote, nel momento in cui i due pronuclei si uniscono,
completamente libero da modifiche epigenetiche e quindi lo zigote la cellula staminale per
eccellenza. Poi si divide cominciando a formare l'embrione. Ancora nelle primissime fasi dello
sviluppo embrionale, le cellule sono totipotenti. Man mano che procede lo sviluppo embrionale,
ecco che compaiono le prime modifiche epigenetiche che, man mano nei tessuti che si devono
differenziare, diventano via via differenti tra una cellula e l'altra, fin quando una cellula giunge a
differenziamento e diventa cellula di quel particolare tessuto. Le cellule differenziate, a loro volta, si
dividono e trasmettono alle cellule figlie non solo il DNA replicato, che perfettamente uguale, ma
soprattutto trasmettono anche le stesse modifiche epigenetiche, cos che una cellula differenziata
che si divide alla fine produrr le cellule figlie che saranno esattamente uguali alla madre e potranno
cominciare da subito lo stesso lavoro che svolgeva la cellula madre. Ci perch avranno ereditato
non solo lo stesso il DNA ma anche le modifiche epigenetiche che le permettono di essere quel tipo
cellulare, di avere quella forma e di funzionare in quel determinato modo. Chiaro questo concetto?
Fino ad oggi [2012], sono state individuate ben nove modifiche epigenetiche, elencate in questa
slide:
fosforilazione su residui di serina o treonina;
acetilazione di residui di lisina;
metilazione di residui di lisina o arginina;
ubiquitinilazione;
sumoilazione;
ADP-ribosilazione;
glicosilazione;
biotinilazione;

carbonilazione.

Possono subire modifiche i residui basici (cio lisine e arginine ma anche serine, la cui modifica ha
pi che altro un ruolo di indirizzo, non una vera e propria modifica: indirizza quale lisina o
arginina deve subire modifiche). La prima modifica in assoluto la fosforilazione su residui di
serina e a volte treonina. Poi c lacetilazione su residui di lisina (modifica ben nota), la
metilazione dei residui di lisina o arginina (i cui effetti oggi sono noti ma non sono ben riportati sui
libri). Per quanto riguarda le altre modifiche, come l'ubiquitinilazione (come meccanismo di
regolazione e non come meccanismo che porta le proteine verso la degradazione al proteosoma) la
sumoilazione, la ribosilazione, la glicosilazione la biotinilazione e la carbonilazione, esse sono delle
modifiche epigenetiche gi note ma i cui effetti ancora, purtroppo, non si conoscono. Non si sa bene
quali siano gli effetti che esse producono quando i relativi gruppi si legano ai residui di arginina e
lisina prevalentemente a carico delle code amino-terminali. Cio non si sa se producono un
allentamento o una condensazione della cromatina. Le modifiche che sicuramente sono note sono la
metilazione e la acetilazione.

Lezione IV

07/05/2012

Epigenetica
La lezione di oggi riguarda l'epigenetica. Si riprenda l'excursus della lezione precedente, ossia dalle
code amino-terminali degli istoni, che giocano un ruolo fondamentale nella dinamica della
cromatina e, avendo delle cariche positive dovute ai residui di arginina e lisina, determinano la fibra
da 30 nm. Affinch possano agire le fibre di rimodellamento, necessario che la fibra di 30 nm si
decondensi a fibra di 10 nm. Le code amino-terminali degli istoni, principalmente H3 e H4 in
quanto maggiormente studiati, riguardano delle modifiche post-traduzionali sui residui di serina e
treonina per quanto riguarda la fosforilazione, e non hanno un ruolo diretto nel determinare la
condensazione o la decondensazione della fibra da 30 nm; tutte le altre modifiche riguardano i
gruppi amminici laterali delle lisine, principalmente, e delle arginine. Queste modifiche sono
essenzialmente 9, e sono:
fosforilazione su residui di serina e treonina;
acetilazione su residui di lisina;
metilazione su residui di lisina e arginina;
ubiquitinazione;
sumoilazione;
ADP-ribosilazione;
glicosilazione;
biotinilazione;
carbonilazione.
Le prime tre sono note, delle ultime sei non si conoscono n i residui coinvolti, n a che tipo di
reazione conducono, se condensazione o decondensazione. Si ritiene che possano determinare un
grado pi fine di condensazione sulle basi delle necessit metaboliche della cellula, oltre a
determinare se un gene deve essere trascritto velocemente o c' tempo per farlo.
Si analizzino le prime tre modifiche epigenetiche.
Fosforilazione: una reazione reversibile e consiste nella addizione di un enzima che si chiama
chinasi, che trasferisce il fosfato in su residui di serina e di treonina. Non ha una funzione
specifica nel determinare condensazione o decondensazione ma, pi che altro, la fosforilazione di
determinati residui in certe posizioni determina la tipologia delle altre modifiche che subiranno altri
residui di arginina e lisina, una sorta di effetto di orientamento delle altre modifiche. Se ad esempio

un residuo non deve essere metilato o acetilato, si fosforiler un residuo di serina o treonina vicino.
Acetilazione: consiste nellinserimento di un gruppo acetato sul gruppo amminico laterale della
sola lisina (un solo gruppo acetato per ogni gruppo amminico). L'acetato un acido, quindi possiede
delle cariche elettriche negative. Quando si carica un gruppo acetato, si annulla di netto una carica
positiva, quindi si riducono nettamente le cariche positive delle code amino-terminali. Se si
riducono le cariche positive, che succede? La cromatina si decondensa, spostandosi pi verso la
fibra da 30 nm, si libera DNA linker e si possono aggiungere enzimi di rimodellamento, che
liberano consensi permettendo lattivazione della trascrizione ed il passaggio ad eucromatina. In
questo modo i geni possono essere trascritti con produzione della relativa proteina.
Metilazione: fino a poco tempo fa il problema era controverso, perch non si capiva se la
metilazione attivasse o inibisse la trascrizione. Se l'ammoniaca, legata ad atomi di idrogeno, viene
sostituita con dei gruppi alchilici, aumenta la propria basicit. Se avviene una metilazione e la
basicit aumenta, questa correla con una maggiore condensazione, perch il gruppo amminico della
arginina pu essere mono- o bimetilato, mentre il gruppo amminico della lisina pu essere mono-,
bi- o trimetilato. Recenti studi dimostrano che, se i residui presentano un basso profilo di
metilazione, cio monometilazione, si determina la eucromatinizzazione, l'attivazione della
trascrizione. Al contrario, un elevato profilo di metilazione ha un effetto esattamente opposto: la bio la trimetilazione della lisina o arginina correlano con una maggiore condensazione della fibra da
30 nm, la chiusura e la inattivazione. Questi sono meccanismi puramente chimici, che permettono
lattivazione o la disattivazione della cromatina, perch si basano su interazioni tra code e DNA dei
cromosomi adiacenti, alterando la termodinamica delle interazioni DNA-istoni; nei primi due casi
linterazione spostata verso una maggiore rottura, mentre nel terzo caso si determina la riduzione
dei tempi di rottura delle interazioni tra istoni e DNA.
Queste modifiche agiscono anche con altri sistemi. Nella cellula esistono dei complessi sistemi
multiproteici, contenenti domini in grado di riconoscere le modifiche, portandosi a livello dei
nucleosomi, e potenziando l'effetto chimico. Se le code sono acetilate, arriveranno dei complessi
multiproteici che allenteranno ulteriormente la fibra da 30 nm, attivando la trascrizione. Sono
complessi che portano in loco dei fattori di trascrizione che sono quelli necessari per iniziare il
processo di sintesi dell'RNA. Se le code sono altamente metilate, altri complessi contribuiscono ad
un ulteriore condensamento e mascheramento del DNA, inibendo i processi trascrittivi.
Le diverse proteine sono pi complesse man mano che si sale con la scala evolutiva, quindi negli
eucarioti superiori sono di meno ma pi grandi e la maggioranza delle proteine dell'uomo
presentano delle regioni distinte, ciascuna delle quali ha particolari funzioni: si tratta dei domini
proteici, regioni che svolgono una funzione specifica e indipendente rispetto alle altre regioni.
Questi complessi proteici contengono domini particolari in grado di riconoscere le modifiche e
portare a livello dei nucleosomi il complesso stesso, che attraverso altri domini svolger il suo
compito. I domini pi conosciuti sono quattro e, tranne quelli della terza tipologia, si conoscono
molto bene:
cromodomini: regioni tridimensionali di una determinata proteina che contengono uno ione
cromo; sono in grado di riconoscere le metilazione a carico delle code amino-terminali;
domini Tudor: riconoscono la metilazione, correlandola ad una eterocromatinizzazione;
Wd40: non chiara la loro funzione, non si sa se riconoscono le metilazioni a basso o alto
profilo; possono portare delle proteine che determinano sia la eterocromatinizzazione che la
eucromatinizzazione, per quanto poco se ne sappia ancora;
bromodomini: contengono ben legati degli ioni bromo, essendo, come i cromodomini, dei
complessi di coordinazione; questi riconoscono le code amino-terminali acetilate; tutte le
proteine nelle quali possibile identificare un bromodominio sono sempre coinvolte
nellattivazione della trascrizione, nelleucromatinizzazione di regioni pi o meno ampie del
nucleo di una determinata cellula.
Le modifiche agiscono quindi in due modi, un modo chimico e un modo, per cos dire, funzionale,
poich si verifica il richiamo di complessi proteici, che determinano etero- o eucromatinizzazione.

Listone che apparentemente pu subire pi modifiche sembrerebbe essere listone H3 ma, in realt,
pi facile identificarle qui in quanto questo listone pi facilmente isolabile allo stato nativo:
anche negli altri istoni ci sono parecchie modifiche. Non per niente sono istoni altamente
conservati.
La stessa sequenza amminoacidica dello stesso istone pu subire diverse modifiche: una volta si
pu trovare acetilato, unaltra mono-, bi- o trimetilato, secondo uno schema combinatoriale molto
complesso: se si parla di dinamica della cromatina, bisogna tener conto del fatto che uno stesso
residuo pu subire istante dopo istante diverse modifiche. A seconda dello schema combinatoriale,
si pu avere un diverso grado di attivazione o disattivazione della cromatina e trascrizione. Questo
ha portato alcuni studiosi ad ipotizzare la presenza di un cosiddetto codice degli istoni, che verrebbe
trasmesso non sono dalla cellula madre alla cellula figlia ma anche e soprattutto da un organismo ad
un altro.
Il codice messo in discussione da altri studiosi. Altri affermano che esista, e non come un codice
genetico ma come un codice presente a titolo informativo nel DNA proprio per far funzionare bene
gli organismi pluricellulari.
Esempio di fosforilazione: se si va a fosforilare la serina 10 dellistone H3, la metilazione della
lisina 9 fortemente inibita. La stessa fosforilazione della serina 10 facilita fortemente l'acetilazione
della lisina 9 e 14; quindi, in un certo modo, la fosforilazione della serina 10, anche se non esercita
influenza sulla condensazione, inibendo o favorendo altre modifiche, correla con la condensazione
o con la decondensazione. Altro evento molto singolare: quando un dominio di quei quattro visti in
precedenza, riconosce una modifica legandosi al residuo della coda, oltre a produrre gli effetti di cui
sopra (cio potenziare quelli gi esistenti), richiama a sua volta o contiene in s altri domini che
favoriscono la modifica. Ad esempio, le lisine acetilate vengono riconosciute dai bromodomini, che
portano i complessi e esercitano una decondensazione a livello dei residui che sono acetilati. La
stessa cosa succede se c' un alto profilo di acetilazione, con i cromodomini.
Acetilazione: pu avvenire solo sui gruppi amminici laterali di lisina. I responsabili sono gli
enzimi istoni-acetiltrasnferasi (HAT). Dove ci sono RNA-polimerasi, si trover associato questo
tipo di enzimi perch, durante tutto il processo di trascrizione, il DNA deve essere decondensato e,
quindi, sono necessari questi enzimi che, acetilando di volta in volta le code amino-terminali degli
istoni, determinano la decondensazione di quel tratto di cromatina. Le istoni-acetiltrasnferasi sono
raggruppate in cinque famiglie; si ricordino solo le prime tre: GNAT, MYST, p300/CBP. Questi
enzimi sfruttano lacetil-coenzima A e trasferiscono il gruppo acetilico sulla coda laterale della
lisina.
Quando un gruppo acetile deve essere rimosso, ci sono altri enzimi che lo fanno, chiamati istonideacetilasi (HDAC). Si dividono in quattro classi: uno, due, tre e quattro. Uno, due e quattro
presentano uno ione zinco che favorisce lintroduzione di una molecola dacqua e quindi il distacco
del gruppo acetile, che viene caricato su una molecola di CoA. Al contrario, la classe tre e le SIR,
anzich trasferire il gruppo acetilico sul CoA, lo trasferiscono su una molecola di NAD ossidato. Il
NAD una molecola molto importante, perch indica lo stato metabolico della cellula. Quando c
molto NAD ossidato, significa che lo stato metabolico della cellula buono; quando c poco NAD
ossidato, significa che lo stato metabolico della cellula non eccellente. Quando pu agire, quindi,
la terza classe di istoni-deacetilasi? Quando il NAD abbondante, altrimenti, se non abbondante,
serve ad altri scopi, cio scopi metabolici. In questo caso, se la cellula sta metabolicamente bene e
possiede molto NAD, allora molti enzimi energetici non servono e i relativi geni sono silenziati e
condensati. In questo caso agiscono le deacetilasi di tipo SIR, interpretando lo stato metabolico
della cellula e deacetilando.
Lo stesso avviene per la metilazione degli istoni, catalizzata dalla metil-trasnferasi (PRMT). Questi
enzimi devono utilizzare un intermedio biochimico rappresentato dalla metionina attivata, la smetil-metionina (SAM). Non si conoscono bene gli enzimi che determinano un basso profilo di
metilazione o un alto.
[Non si considerino i raggruppamenti]
Metilazione degli istoni: anche i gruppi metilici devono essere adeguatamente eliminati. Fino a

poco tempo fa non si riuscivano ad isolare gli enzimi in grado di svolgere questa attivit in vitro.
Uno dei primi enzimi ad essere stato scoperto il PAD4, in grado di trasformare la mono-metillisina in citrullina, un amminoacido non proeico. Recentemente sono state scoperte delle vere e
proprie istone demetilasi, soprattutto di due tipi, con domini specifici che demetilano ossidando un
gruppo metilico a gruppo formilico (formile). Questi enzimi appartengono al gruppo delle aminoossidasi. Si ritiene che questi enzimi siano in grado di eliminare le mono- e le bimetilazioni. Non
sono stati scoperti enzimi in grado di eliminare tutti e tre i gruppi metilici, per cui, secondo alcuni
autori, non ne esistono e la trimetilazione rappresenta un codice che i vari istoni si portano nel
tempo. Altri autori ipotizzano che ancora non si abbiano raggiunto le conoscenze e i metodi corretti
per poterli separare. Ad ogni modo, la trimetilazione si trova solo nella eterocromatina permanente.
Metilazione del DNA: unaltra modifica, non tipica degli eucarioti, e che ha un significato
completamente diverso nei procarioti. Negli eucarioti superiori interessa la molecola di DNA.
Questa modifica non essenziale per le attivit trascrizionali, in quanto nella mosca Drosophila
Melanogaster non c' DNA metilato, per cui si ritiene che non sia essenziale. Nei vertebrati
sempre presente, per cui si pensa che abbia un ruolo per il funzionamento della cellula e
l'organismo. Nei vertebrati il DNA pu subire un'aggiunta di un gruppo metile sul carbonio 5 di una
citosina; in questo caso agiscono speciali enzimi, DNA-metil-trasnferasi, e la citosina che ospita
questo gruppo metilico non pu essere una citosina qualsiasi ma, nella maggior parte dei casi,
precede immediatamente una guanina: si parla infatti di nucleotidi citosina-fosfato-guanina (CpG),
o pi raramente CpNpG, CpA, CpT (dove N sta per un nucleotide qualsiasi e p per gruppo
fosfato). Queste ultime tre sequenze sono comunque molto rare e nel 99% dei casi si trovano
sequenza CpG. Per quanto riguarda questi dinucleotidi, dopo che stato decodificato il genoma
umano e di altri organismi vertebrati, stato calcolato che la quantit di sequenze CpG nettamente
inferiore rispetto a quanto ci si potrebbe aspettare su base statistica. Questo un dato importante
perch, se la citosina viene metilata, diventa 5-metilcitosina ma le citosine possono andare
spontaneamente incontro a deaminazione, perdendo il gruppo amminico in posizione 4 e
sostituendolo con un gruppo carbonilico. In questo caso la citosina, che di norma 2-ossi-4aminopirimidina, diventerebbe 2,4-biossipirimidina, per con il gruppo metilico 5-metilpirimidina,
e cio una vera e propria timina, con conseguente introduzione di una mutazione in modo
spontaneo. Per tale ragione, nel corso dellevoluzione i genomi si sono protetti concentrando questi
di nucleotidi CpG in specifiche zone del DNA, dove leventuale mutazione non altera il messaggio
contenuto nel DNA. Di norma le zone che contengono questi di nucleotidi che possono essere
sottoposti a metilazione sono racchiusi in regioni del DNA, che prendono il nome di isole CpG e
possono avere una grandezza tra i 500 ed i 1000 nucleotidi di lunghezza. Quali sono queste regioni?
Una regione a monte della sequenze codificante di un determinato gene e rappresenta il promotore
(o sequenza di regolazione). Altre regioni possono interessare le cosiddette sequenze LINE, SINE, e
retrotrasposoni LTR. Il resto di queste sequenze interdisperse, dove si ritiene non ci siano geni
codificanti, rappresenta circa il 40% del genoma umano.
Effetto della metilazione: se la citosina metilata su entrambi i filamenti, le citosine sporgono nel
solco maggiore, una di fronte all'altra, mascherando i gruppi chimici esposti a livello del DNA. Se i
gruppi sono nascosti, pu un eventuale consenso che contiene la citosina metilata essere
riconosciuto dalle proteine funzionali? No. La metilazione del DNA ha quindi un effetto di
eterocromatinizzazione. Perch le isole CpG si trovano ad esempio a livello delle sequenze di
regolazione? Perch le sequenze di regolazione sono fondamentali per dare inizio al processo di
trascrizione. Se delle citosine sono metilate, queste da un lato nascondono tutti i consensi e quindi le
proteine funzionali non possono assolutamente agganciare il consenso stesso e quindi lanciare
quello che il processo trascrizionale. Quando un gene deve essere represso nella sua trascrizione,
ovvero silenziato, si ha metilazione delle citosine. Nel resto del genoma la metilazione ha il compito
di eterocromatinizzazione tutta la cromatina, in modo da proteggere il genoma. Perch, se una
porzione che non deve funzionare allentata, non solo le proteine funzionali possono arrivare ma,
non trovando i relativi consensi, sarebbe un arrivo del tutto futile; addirittura potrebbero favorire
lazione di agenti patogeni che, inserendosi in questa zona del DNA, la alterebbero. importante

soprattutto che le regioni che si trovano in periferia del nucleo, strettamente agganciare con le
lamine della lamina nucleare interna, debbano essere fortemente eterocromatinizzate, per impedire
che agenti estranei possano destabilizzare il genoma della cellula.
Anche la metilazione della citosina deve essere eliminata, quindi esistono DNA-demetilasi che
eliminano il gruppi metilici dal DNA.
Riepilogando: non si confonda la metilazione delle code con quella del DNA. Quella del DNA, alla
quale la cellula ricorre solo quando strettamente necessario, correla sempre con il silenziamento
permanente dei geni. Se leterocromatina transitoria, il DNA sar mai metilato? No. Se bisogna
silenziare definitivamente un gene, come un gene embrionale, il DNA viene metilato, i gruppi
acetilici sugli istoni sono deacetilati, gli istoni sono fortemente metilati (trimetilati). Quindi un
silenziamento permanente del gene correla con la metilazione dei dinucleotidi CpG della molecola
di DNA in quella regione, soprattutto nella regione di regolazione, la totale deacetilazione, ed un
elevatissimo profilo di metilazione delle code amino-terminali degli istoni. In questo modo
giungono quei complessi proteici che aiutano a compattare ancora di pi la fibra da 30 nm. Anche a
livello della metilazione del DNA avviene lo stesso, dove non solo maschera i gruppi chimici a
livello dei solchi maggiori dei consensi ma addirittura permettono il riconoscimento da parte delle
citosine metilate di speciali domini che prendono il nome di domini MBD.
Le DNA-metil-trasnferasi (DNMT) si dividono in diverse classi di cui ancora se ne conoscono solo
alcune, e si sa solo che hanno un dominio catalitico comune ad un carbossi-terminale, mentre
allamino-terminale appartengono il dominio MBD, in grado di riconoscere anche le citosine
metilate e potenziare il processo di metilazione.
Anche queste proteine, come quelle del dominio MBD, si comportano come quelle che riconoscono
la metilazione a carico delle code amino-terminali degli istoni, richiamando quei fattori e quegli
enzimi che contribuiscono ulteriormente a sigillare la fibra da 30 nm e rendere il DNA, in quella
zona, fortemente eterocromatinizzato.
Esistono delle DNA metilasi in grado di riconoscere e completare la metilazione del DNA
emimetilato. La replicazione del DNA semiconservativa, ossia le due nuove molecole che nascono
contengono un filamento di nuova sintesi ed uno di vecchia sintesi. Se il filamento di vecchia sintesi
conteneva delle citosine metilate, ovviamente il filamento di nuova sintesi non le contiene. Quindi,
se le due nuove molecole di DNA in quella specifica regione devono essere metilate, anche il
filamento di nuova sintesi dovr essere metilato. In questo caso intervengono le DNA-metiltransferasi di tipo 1 che si legano con una particolare struttura della forca replicativa e la pinza di
scorrimento, che negli eucarioti si chiama PCNA (antigene di proliferazione nuclare) e, man mano
che si forma il filamento di nuova sintesi, l dove il filamento di vecchia sintesi presenta una
citosina metilata, una volta che viene copiata la citosina non metilata provvedono, sempre tramite la
SAM, a metilare anche questultima, in modo che il DNA, appena nasce, sia gi metilato.
Altre metilasi agiscono sul DNA non metilato, e quindi sono pi che altro delle metilasi che
funzionano prevalentemente durante lo sviluppo embrionale, quando le cellule devono subire il loro
differenziamento.

Formazione del corpo di Barr


Come avviene linattivazione del secondo cromosoma X della donna? Mentre luomo possiede un
cromosoma X e un cromosoma Y, la donna possiede entrambi i cromosomi X. Nella donna, quindi,
il secondo X produrrebbe il doppio delle proteine relative ai suoi geni rispetto a quanto non avvenga
nell'uomo, il che non assolutamente concepibile. Per tale ragione, quando, dopo la fecondazione,
si uniscono i pronuclei e si definisce il sesso del nascituro, a questo punto gi nello zigote uno dei
due cromosomi X, o quello che viene dal padre o quello che viene dalla madre, viene inattivato, in
modo che anche nella donna sia sempre uno solo il cromosoma X a funzionare. Come fa lo zigote a
inattivare il cromosoma X? Eterocromatinizzandolo in modo molto ma molto forte, quindi
metilando il suo DNA a livello delle sequenze CpG, deacetilando le code amino-terminali degli
istoni, e provvedendo ad un elevato profilo di metilazione delle arginine e delle lisine di tutti e

quattro gli istoni. In questo modo, lintero cromosoma X fortemente eterocromatinizzato e quindi
non pu funzionare da un punto di vista trascrizionale.
Nelle cellule precursori dei gameti, in questo caso negli ovogoni, il cromosoma X fortemente
eterocromatinizzato viene completamente liberato, soprattutto a livello dei gruppi metilici a carico
del DNA, in modo tale che, durante il processo meiotico, tutti e due i cromosomi X possano essere
perfettamente funzionali. Quando una persona somiglia moltissimo alla nonna materna, significa
che evidentemente il cromosoma che stato inattivato quello paterno, e il cromosoma inattivato
della madre era quello materno, che per poi si sbloccato ed stato ereditato dalla figlia.
Che cosa succede durante la fase S del ciclo cellulare? Una cellula gi differenziata svolge una
determinata funzione perch in grado di leggere il genoma in un certo modo, per cui ha una
determinata morfologia, perch alcuni dei suoi geni sono silenziati definitivamente, altri
transitoriamente in quanto, in caso di necessit, potrebbero diventare trascrizionalmente attivi. Altri
geni sono invece eucromatinizzati e sono quelli che permettono alla cellula di svolgere una
determinata funzione. Ogni tipo cellulare in grado di leggere in un determinato modo il genoma,
per cui lo schema di lettura dello stesso genoma permette di avere quella forma e funzione.
Ovviamente ci saranno alcuni geni indispensabili per tutte le cellule, indipendenti dalla funzione
specifica, sempre attivi o quasi sempre attivi. Durante lo sviluppo accade la stessa cosa, per cui
l'epigenetica studia anche le modifiche che subiscono le cellule embrionali (totipotenti) staminali
nel percorso di differenziamento. molto difficile, non si sa ancora tutto a riguardo e, mentre si sa
molto bene ci che riguarda una cellula gi differenziata, si sa molto poco per quanto riguarda lo
sviluppo embrionale. evidente che durante lo sviluppo determinate cellule subiranno determinate
modifiche, altre cellule altre modifiche e via dicendo. Si sa comunque poco sul differenziamento
cellulare durante la vita embrionale. Per quanto riguarda le cellule gi differenziate che si
riproducono, durante la fase S del ciclo cellulare avviene la replicazione del DNA e nella tarda fase
S avviene anche la sintesi delle nuove proteine istoniche che non hanno modifiche epigenetiche,
sono nude e crude. Come si concilia il fatto che si debbano agganciare al DNA di nuova sintesi e
portare le stesse modifiche, cos che le cellule figlie siano istantaneamente funzionali come la
cellula madre? Quando il DNA si replica, i nucleosomi vengono spostati, disassemblati nei prima in
tetrameri e poi in dimeri. Quando poi le due molecole di DNA si devono riassemblare, ecco che
istoni di vecchia sintesi ed istoni di nuova sintesi si mescolano fra di loro e riformano gli ottameri
per determinare la formazione dei nucleosomi sulle nuove molecole di DNA.
A questo punto ci saranno delle particolari chaperonine in grado di riconoscere le modifiche
presenti sugli istoni di vecchia sintesi e di richiamare gli enzimi modificatori e quindi indurre la
formazione delle stesse modifiche sugli istoni di nuova sintesi in quel determinato luogo, per cui,
punto per punto, le due nuove molecole di DNA, nel momento della replicazione, avranno non solo
la stessa precisa di nucleotidi ma anche le stesse modifiche epigenetiche, trasmesse alle due
molecole figlie insieme ai cromatidi fratelli. Nel momento in cui la cellula si divide, le cellule figlie
avranno le stesse precise modifiche epigenetiche della madre e, quindi, inizieranno istantaneamente
a leggere il genoma e quindi a funzionare esattamente come la cellula madre.
Su questo si fonda anche il principio fondamentale della vita di ogni singola cellula e quindi
dell'organismo nel suo completo.

Lezione V

09/05/2012

Topoisomerasi
Si ritorni un attimo alla molecola di DNA. Nei procarioti le molecole di DNA sono circolari mentre
negli eucarioti sono lineari per, quando la cromatina sotto forma di fibra da 300 nm, questa
ancorata ad uno scaffold nucleare, quindi porzioni di 100000 coppie di basi sono agganciate ad uno
scaffold nucleare e quindi hanno le estremit bloccate esattamente come un DNA circolare. Ora,
durante il funzionamento, il DNA non si trova mai rilassato, n nei procarioti n negli eucarioti, ma
variamente piegato sul suo asse (quindi vi sono due contributi d'interazione spaziale: attorno al
proprio asse per l'aspetto circolare del DNA; attorno all'ottamero di istoni per l'estenzione lineare
del DNA). Questo comporta che, durante i processi biologici in cui va incontro il DNA (in modo
particolare la denaturazione), le singole eliche o vengono concentrate riducendo quindi la distanza
tra le coppie di basi, oppure vengono allentate allontanando la distanza tra le coppie di basi; si parla
di superavvolgimento: nel primo caso, quando le coppie di basi vengono concentrate, il
superavvolgimento positivo; nel secondo caso invece, il superavvolgimento negativo [sul libro
d'adozione il discorso pi ampio; il docente afferma i preferire analizzare quanto detto
successivamente].
Quando il DNA subisce degli eccessivi superavvolgimenti, siano essi negativi siano essi positivi, se
non viene adeguatamente decondensato (quindi o mediante lintroduzione di nuovi giri nel caso di
superavvolgimenti negativi o mediante leliminazione di giri nel caso di superavvolgimenti
positivi), il DNA stesso potrebbe subire dei danni mediante rottura meccanica del legame
fosfodiestereo che tiene uniti i nucleotidi tra di loro. E questo ovviamente un evento che potrebbe
avvenire benissimo in vivo durante diversi modi funzionali del DNA, ma la natura ha pensato a
questo e quindi ha evoluto speciali enzimi che prendono il nome di topoisomerasi. Le
topoisomerasi si distinguono in due tipi. Il meccanismo della topoisomerasi II molto simile a
quello della topoisomerasi II, sebbene il suo funzionamente consti di proprie particolarit. Queste
topoisomerasi si trovano sempre associate al DNA mentre funziona, per cui, se durante il suo
funzionamento si vengono a creare dei superavvolgimenti positivi molto intensi tali da poter
determinarne un danno, ecco che intervengono questi enzimi determinando uno srotolamento del
DNA stesso, cio determinando questi superavvolgimenti positivi; se invece il DNA, durante il suo
funzionamento, va incontro a superavvolgimenti negativi (che anche in questo caso possono
determinare un danno al DNA stesso), le stesse topoisomerasi possono introdurre dei
superavvolgimenti cio delle spire. [La stragrande maggioranza dei meccanismi che vengono
studiati in biologia molecolare, sono del tutto identici, avvengono sempre con le stesse precise
modalit].

La topoisomerasi I un enzima che non ha bisogno di energia per poter introdurre o eliminare delle
eliche ed , come da immagine, un enzima globulare. Nel suo sito attivo presente un

amminoacido, un residuo amminoacidico dellamminoacido tirosina che presenta un gruppo laterale


rappresentato da un ossidrile. Nel momento in cui la topoisomerasi si avvicina al DNA perch
eccessivamente superavvolto (o positivamente o negativamente), deve necessariamente introdurre o
eliminare dei giri. Quando deve introdurre dei giri, allora spontaneamente la topoisomerasi si
avvicina al DNA, in un suo tratto qualsiasi, e, prendendo contatto con uno dei due filamenti (e si
ricordi tale particolare, con uno solo dei due filamenti), succede una cosa caratteristica: lambiente
che si viene a creare fa s che lossidrile si destabilizzi, cio che questo gruppo alcolico funzioni da
acido, quindi lidrogeno viene allontanato e lossigeno si carica negativamente, diviene un potente
nucleofilo, il quale esercita un attacco nucleofilo su uno dei due legami fosfoesterei (o quello al 3 o
quello al 5) ed tutto ininfluente. Cosa fa? Rompe questo legame fosfoestereo e lenergia che non
si libera, viene semplicemente trasferita per formare un legame fosfotirosinico, ad esempio tra il 5'
di un tratto di un filamento di DNA e la tirosina della topoisomerasi, quindi si ha un legame
covalente tra lenzima ed il filamento di DNA. Il filamento sottostante che rimane libero, e che
quindi contiene il 3' OH (come da esempio), pu o introdurre un giro, quindi un superavvolgimento,
oppure lo pu eliminare. Nel momento in cui quindi questo filamento ha eseguito un giro in senso
orario oppure in senso antiorario (a seconda se deve introdurre il giro oppure lo deve eliminare),
ecco che succede una reazione assolutamente diversa: lossidrile in 3' si ionizza e lossigeno in 3'
diventa negativo, esercita un attacco nucleofilo sul legame fosfotirosinico, quindi lenergia di
legame viene ripristinata e si riforma il legame fosfoestereo in questo caso al 5'. Quindi il filamento
viene nuovamente riunito, mentre lenzima si libera, riacquisisce il suo atomo di idrogeno e si
allontana per riprendere un nuovo ciclo di reazione.
Si guardi questanimazione: la topoisomerasi si avvicina, lossigeno della tirosina viene ionizzato
grazie allambiente presente, in questo caso esercita un attacco nucleofilo e rompe il legame
fosfoestereo in un singolo filamento della molecola di DNA. Come da immagine, si ha
lintroduzione di un superavvolgimento mediante aggancio dei due filamenti interrotti sullaltro
filamento intermedio, dunque avviene la reazione inversa, avviene il legame fosfoestereo al 5 o al
3 e quindi la topoisomerasi viene nuovamente riassemblata e torna ad essere un enzima attivo,
quindi pu staccarsi ed esercitare una nuova reazione.
Per quanto riguarda invece la topoisomerasi di tipo II, queste in effetti sono due enzimi che si
associano. Il meccanismo dazione del tutto identico sempre mediante un residuo di tirosina, solo
che essendo due enzimi in questo caso entrambi i filamenti vengono tagliati del DNA, rimanendo
comunque sempre strettamente associati allenzima. Si dice che la topoisomerasi II richiede energia
ma lenergia in questo caso rappresentata da molecole di ATP, non serve per la reazione enzimatica
ma serve per la dimerizzazione dei monomeri, dei due enzimi. Quindi questi due enzimi devono
essere agganciati e per essere agganciati hanno bisogno di energia, data da una molecola di ATP,
dopodich i due enzimi agiscono su entrambi i filamenti ed in questo caso contemporaneamente o
introduco o eliminano ben due giri della doppia elica. In genere le topoisomerasi II determinano
lintroduzione di giri perch agiscono prevalentemente sul DNA superavvolto negativamente.
Nei batteri la topoisomerasi II prende il nome di DNA-girasi che molto importante non solo per
eliminare i superavvolgimenti negativi che si formano durante la replicazione del DNA batterico,
ma anche poi per separare le due molecole di DNA circolare una volta che si completata la
replicazione, poich restano concatenati, quindi necessaria una rottura dei due filamenti affinch
le due molecole di DNA circolare si vadano a separare e poi portarsi ai due poli opposti.

Segnali elettromagnetici prodotti dal DNA


Si tratta di uno studio eseguito in parte in Francia, in parte in America, per lautore stato Luc
Montagnier, insignito del Premio Nobel per aver scoperto il virus dellAIDS. Si tratta di un lavoro
basato su dei concetti non convenzionali che vanno al di fuori di quelle che sono le normali
conoscenze che oggi si hanno della fisica, della chimica e della biologia in generale, e per tale
ragione, stato fortemente criticato (la scoperta risale al 2009). Molti americani lo hanno insultato
pesantemente. Eppure, nel 2012, qualche mese fa, alcuni gruppi, sia italiani sia altri europei sia

americani, hanno confermato questi esperimenti molto particolari che aveva descritto
precedentemente Montagnier. Quindi attualmente la questione resta aperta, rimane soprattutto
difficile la comprensione di questo particolare meccanismo, di questa nuova propriet che stata
scoperta essere tipica della molecola di DNA, e, se tale propriet viene studiata pi
approfonditamente, si potrebbero aprire scenari veramente impensabili che potrebbero rivoluzionare
completamente quelle che sono le nozioni scientifiche attuali, in particolar modo per quanto
riguarda le molecole di DNA.
[In seguito verr discusso circa l'esperienza di Montagnier e delle relative conclusioni; un
discorso fatto in termini di novit. Se questo verr confermato entro la data dell'esame, ne sar
oggetto.
Per
chi
interessato,
questo
sito
sembra
essere
interessante:
http://www.unimib.it/upload/gestioneFiles/redazioneweb/eventi/montagnier.pdf ]
Montagnier ha eseguito questi esperimenti esclusivamente sul DNA isolato da batteri patogeni per
luomo ed in modo particolare ha lavorato tantissimo sul micobatterio della tubercolosi. Poi si
spostato a lavorare anche su E. Coli, ma ha concluso che forse anche il DNA umano pu
comportarsi allo stesso modo. Che cosa ha fatto Montagnier? Ha coltivato determinati batteri nel
proprio mezzo di coltura, dopodich ha filtrato queste colture con appositi filtri dotati pori molto
sottili, anche di 20 nm, e quindi dei pori che sicuramente trattengono tutti i batteri. Quindi ottenne
questo liquido privo di batteri, un filtrato, lo test con delle tecniche di biologia molecolare per
valutare che non ci fosse DNA batterico e pens di eseguire una serie di diluizioni di questo filtrato.
Queste diluizioni sono state poste in uno strumento che comunque era gi stato precedentemente
costruito da due autori che sono Benveniste e collaboratori. Si tratta praticamente di una bobina in
rame allinterno della quale stata posta una provetta normalissima in plastica, col tappo chiuso,
contenente una determinata diluizione di questo filtrato proveniente dai batteri. La provetta e la
bobina sono state sottoposte ad un campo elettromagnetico ed il segnale proveniente da questo
campo elettromagnetico stato rilevato da un apposito strumento che lo ha poi amplificato ed il
tutto stato acquisito da un computer con un apposito software. Con sorpresa questi autori hanno
scoperto, hanno osservato che oltre al rumore elettromagnetico ambientale, era presente (solo per a
determinate diluizioni di quel filtrato) una particolare radiazione elettromagnetica a bassa
frequenza, che poteva essere ascritta alla provetta presente nella bobina.
Quando la soluzione veniva semplicemente filtrata, senza diluizione, non si aveva emissione di
messaggio. Dopodich inizi tutte una serie di diluizioni. Gi alla diluizione 7, cera unimpennata
di radiazioni elettroniche e questa radiazione elettromagnetica permaneva a diverse diluizioni (fino
alla diluizione 12) per poi scomparire nel momento in cui lautore eseguiva una diluizione eccessiva
del filtrato. Quindi cominci subito a capire che, in qualche modo, allinterno della soluzione dove
erano cresciuti questi batteri patogeni ed in assenza di essi stessi, se questa soluzione veniva
opportunamente diluita e sottoposta ad un campo elettromagnetico, essa emetteva queste radiazioni
proprie che quindi erano tipiche della soluzione che aveva contenuto un essere vivente quale il
batterio.
Inoltre, in determinati casi, gli autori avevano scoperto che a provocare la produzione di queste
onde elettromagnetiche a bassa frequenza emesse dalle soluzioni diluite, in effetti non era la bobina
(che si occupava semplicemente di acquisire queste onde), ma era il rumore elettromagnetico
ambientale. Egli si accorse che la condizione indispensabile per poter avere queste onde
elettromagnetiche nelle diluizioni appropriate, era semplicemente agitare per 15 secondi quella
provetta contenente quella determinata diluizione. Quindi, in seguito a questagitazione di 15
secondi, nel momento in cui la provetta veniva messa in quella bobina, mostrava appunto
lemissione delle onde elettromagnetiche a bassa frequenza. Se invece la provetta non veniva
agitata, le onde erano assenti, quindi cominci a capire che sicuramente qualche cosa allinterno
della soluzione diluita doveva in qualche modo emettere questi segnali ma segnali ben definiti. Per
valutare ci, esegu un altro esperimento.
Che cosa fece? Prese due provette. Una era indicata col segno - (corrispondete a assenza di
emissione, soluzione concentrata), laltra con il segno + (corrispondete a presenza di emissione,
soluzione diluita). Si trattava, nel primo caso, di una soluzione concentrata di quel filtrato, che

veniva messa a contatto con unaltra provetta (la seconda) contenente una soluzione diluita di quel
filtrato e che quindi nella bobina era in grado di emettere le onde elettromagnetiche. Le lasci a
contatto per 24 ore e dopo sottopose nuovamente le due provette ad analisi analoghe alle precedenti.
Con sorpresa osserv che anche la provetta la quale inizialmente, a quella determinata diluizione,
era in grado di emettere le onde elettromagnetiche, dopo 24 ore di contatto con la stessa soluzione
per pi concentrata (di segno -), non era pi in grado di emettere le onde. Comera possibile questo
fatto? Spiegava un qualcosa di estremamente insolito. Per valutare che cosa effettivamente fosse
successo, esegu delle diluizioni della provetta +, che prima era positiva per le onde e che dopo 24
ore di contatto con quella negativa diventava anchessa negativa. Gi dalla prima diluizione (10 -10)
osserv che questa soluzione tornava nuovamente ad emettere le onde elettromagnetiche. Per cui
questesperimento dimostrava che in effetti cera stato uno scambio attraverso le due provette messe
a contatto durante le 24 ore, uno scambio che aveva fatto aumentare la concentrazione di qualche
cosa che era presente nella provetta pi diluita. Tant vero che, aumentando la concentrazione della
provetta -, la provetta pi diluita (provetta +) diventava in effetti la pi concentrata e quindi tanto da
non riuscire pi ad emettere le onde elettromagnetiche. Se poi questa soluzione veniva sottoposta ad
ulteriori diluizioni, ovviamente in questo caso si ritornava in una condizione iniziale e quindi la
provetta emanava nuovamente le radiazioni elettromagnetiche. Questo indicava che in effetti tra la
prima e la seconda provetta cera stato lo scambio di qualche cosa. Quindi probabilmente quelle
onde che non potevano essere rilevate nella soluzione molto concentrata (perch forse venivano in
qualche modo mascherate dalleccessiva quantit di eventuali materiali presenti nella soluzione
concentrata stessa), potevano comunque essere trasmessi a distanza nella seconda provetta,
inducendo un aumento delle stesse molecole che appunto erano in grado di emettere queste
radiazioni e che poi, con la diluizione stessa, era stato possibile rilevarle con l'apposito strumento.
Che cosa hanno concluso i tre autori che hanno fatto questo strano lavoro? Che il DNA sicuramente
mostra questa insolita propriet. Montagnier ha ascritto questa propriet esclusivamente ad alcune
sequenze del DNA, soprattutto quelle che sono particolarmente patogene per luomo ma in effetti
oggi si sa non essere cos. Queste particolari sequenze di DNA sono in grado di emettere onde
elettromagnetiche a bassa frequenza che egli definisce onde elettromagnetiche di risonanza e la
risonanza una propriet molto particolare. Lenergia di risonanza lenergia della forma stabile di
un determinato composto. Le basi puriniche e basi pirimidiniche sono aromatiche, hanno dei gruppi
amminici e carbonilici; v' quindi tutta una serie (non solo la molecola planare in s) di elementi
che vanno incontro al fenomeno della risonanza. Quindi Montagnier conclude che sicuramente le
molecole di DNA, le basi puriniche e pirimidiniche sono in grado di emettere onde
elettromagnetiche di risonanza se eccitate dalle onde che costituiscono il rumore ambientale che in
grado si stimolare nelle basi lemissione di queste particolari onde.
Come fanno queste particolari onde a manifestarsi anche a distanza e creare in unaltra provetta
altre molecole di DNA o, meglio, segnali che indicano la sequenza stessa di quel tratto di DNA?
Perch il tutto ovviamente avviene in assenza del DNA stesso. Gli autori hanno postulato delle
ipotesi molto plausibili. In effetti lesperimento di trasferimento dellenergia ha mostrato che nella
provetta pi diluita vengono come create ex-novo delle particelle in grado a loro volta di emettere
queste onde elettromagnetiche di risonanza. Sulla base di alcuni lavori recenti sulla struttura del
DNA eseguita mediante diffrazione ai raggi X, con una strumentazione moderna, si sa che le
molecole di acqua sono in grado di formare una sorta di gel e queste si associano al DNA molto
fortemente ed in grandissima quantit. Per cui Montagnier ha ipotizzato, sulla base anche di
esperimenti diversi da quelli da lui effettuati, che il rumore elettromagnetico ambientale stimola le
basi di specifiche sequenze del DNA, le quali non solo inducono nelle molecole d'acqua la capacit
di emettere onde di risonanza a bassa frequenza, ma sono anche in grado di creare nelle molecole
d'acqua stesse dei dipoli particolari. Si configurano quindi dei polimeri dipolari di acqua, anche di
grandi dimensioni, capaci di emettere queste onde elettromagnetiche a bassa frequenza rilevate da
questo strumento. Non direttamente lo stesso DNA a far s che si verifichi tale fenomeno, bens
queste nanostrutture di acqua che si formano nel momento in cui lacqua viene a contatto con le
basi e quindi, allontanando le molecole di DNA che hanno indotto la formazione di queste

nanostrutture dipolari di acqua, queste riescono a mantenere per alcune ore la capacit di emettere
queste informazioni, che corrispondono a queste onde elettromagnetiche che rispecchiano la
sequenza del DNA che ha dato loro vita. Montagnier riuscito a stabilire che queste molecole di
acqua che formano questa sorta di nanostrutture, sono in grado di emanare onde elettromagnetiche a
bassa frequenza anche in assenza di DNA da alcune ore fino ad oltre 48. Quindi sono queste
molecole dacqua in questa particolare forma nanostruttura che, emettendo questi segnali che hanno
acquisito dalle molecole di DNA, sono in grado a distanza di provocare la ricostruzione di nuove
molecole di DNA o comunque di nuove nanostrutture che a loro volta sono in grado di permettere ai
desossiribonucleotidi trifosfato di associarsi tra di loro a formare anche a distanza le stesse molecole
di DNA presenti nella struttura originaria.
Questa una propriet del DNA che molto insolita, del tutto nuova ed anche difficile a credere,
per se si pensa alle basi puriniche e pirimidiniche, ad alcune caratteristiche insolite che presentano
le basi, soprattutto la guanina che funziona da quencer in determinate circostanze, cio da potente
oscurante di radiazioni elettromagnetiche come quelle che cadono nel visibile, e allora questa
possibilit del DNA di proiettare a distanza la propria sequenza molto probabilmente una propriet
concreta. Ovviamente ancora nulla si sa in merito, bisogna studiare approfonditamente questo
fenomeno mediante lausilio delle competenze dei bioinformatici ma soprattutto dei fisici perch i
biologi poco possono fare a questo proposito e quindi valutare poi se effettivamente il DNA in
grado di proiettare a distanza la propria sequenza, soprattutto come sfruttare in medicina questa
propriet.
Nel 2000 il genoma umano stato completamente decodificato o quasi ma, per fare questo con gli
strumenti di allora, sono trascorsi almeno 10 anni. Oggi invece si dispone di strumenti di seconda
generazione che sono in grado di decifrare lintero genoma di una cellula, di un singolo individuo
anche circa in 5 giorni; permettono anche di compararlo con il DNA degli altri individui e poterne
valutarne la variabilit. Con questa nuova propriet ovviamente si sar veramente al top perch, se
effettivamente si riuscisse a capire a quali frequenze emette il DNA e a raccogliere le informazioni
che il DNA in questo caso trasmette tramite questi nanopolimeri di acqua, grazie ad un computer ed
ad un software, sarebbe possibile sequenziare in brevissimo tempo degli interi genomi. Si pensi a
tutto quello che si potrebbe fare inducendo direttamente nelle cellule la produzione di determinati
acidi nucleici o di una determinata sequenza e quindi far s che le cellule funzionino in un
determinato modo piuttosto che in un altro, per esempio in un modo corretto piuttosto che in uno
patologico.
Questo ovviamente apre nuovi scenari per il futuro. Questa propriet della molecola della DNA a
doppio filamento deve essere ampiamente caratterizzata in assenza di pregiudizi che potrebbero
rivelarsi deleteri per nuove, affascinanti e non convenzionali scoperte. In pratica, con queste parole
si vuol dire: non si chiuda la propria mente sulla base delle cose che verranno acquisite da qui al
prossimo futuro, anche per quanto riguarda la stessa materia, ma si resti sempre disponibili perch
le pi grandi scoperte eseguite soprattutto negli ultimi tempi, sono sempre state fortemente
osteggiate da coloro che ritenevano di avere la piena conoscenza di tutto. Non si ha la piena
conoscenza di tutto; quello che si sa in merito alle molecole biologiche ed al metabolismo in
generale delle cellule, solo una piccolissima parte di quello che effettivamente .

Replicazione del DNA: DNA-polimerasi


La prima funzione del DNA consiste nel duplicare se stesso, cedendo due sue copie dalla cellula
madre alle cellule figlie e perpetuandosi da un unico organismo agli organismi figli: appunto il
processo della replicazione del DNA. Il DNA, per potersi replicare, ovviamente si deve denaturare;
ci sono a tal proposito specifici enzimi in grado di rompere il legame idrogeno in qualsiasi molecola
di DNA, quindi anche a temperatura corporea a 37C, per ovviamente utilizzando energia fornita
da molecole di ATP. In questo caso i due filamenti polinucleotidici si separano e ciascuno pu
fungere da stampo affinch gli enzimi a cui data la replicazione, che sono le DNA polimerasi,
possano copiare un nuovo filamento su quello gi preesistente e quindi, grazie alla caratteristica

della complementariet delle basi, sar perfettamente complementare quindi identico al filamento
stampo. Per conseguenza si generer una doppia molecola di DNA in cui si avr un filamento di
vecchia sintesi ed un filamento di nuova sintesi. per questo che, quando si parla di replicazione
del DNA, si parla di replicazione semiconservativa.

Un nuovo filamento di DNA sta per essere sintetizzato su questo stampo e, per far ci, le relative
basi devono essere copiate dalla DNA-polimerasi. La reazione in s costituita da due meccanismi
fondamentali: un primo meccanismo che il deossiribonucleotide fosfato, che entra per poter essere
incorporato nel nuovo filamento in sintesi, deve prima di tutto formare legami ad idrogeno con la
corrispondente base presente sullo stampo. Quindi, condizione essenziale affinch possa avvenire
lincorporazione di un nuovo nucleotide, che questo formi i corretti legami ad idrogeno con la
base presente sullo stampo. Nel momento in cui si formano questi legami idrogeno, la base si gi
complementarizzata con quella presente sullo stampo. E come avviene ci? Lossidrile in 3' del
nucleotide precedentemente incorporato si ionizza. L'ossigeno diventa negativo, quindi un potente
nucleofilo, il quale andr ad esercitare un attacco nucleofilo sul fosfato in alfa di questo nucleotide
la cui base si gi legata a quella presente sullo stampo. In questo modo si rompe il legame
anidridico tra fosfato alfa e fosfato beta e lenergia che si libera viene utilizzata per la formazione
del secondo legame fosfoestereo, che il legame fosfoestereo al 3'. Per cui in totale poi questo
nucleotide sar legato al nucleotide precedente mediante un legame fosfodiestereo.
Si analizzi pi dettagliatamente come avviene la reazione in s. La molecola a doppio filamento,
quella parentale, si separa nei filamenti polinucleotidici e poi ciascuno dei due filamenti funger da
stampo per la costruzione di due nuove molecole di DNA, di cui una avr un filamento parentale,
laltra un filamento di nuova sintesi. Questa si chiama forca replicativa e alla forca replicativa
vanno ad assemblarsi una quantit enorme di proteine ed enzimi che devono coordinare
accuratamente il processo di replicazione. La prima cosa fondamentale , come detto
precedentemente, che si formino i legami a idrogeno; se ad esempio c una timina ed entra una
deossiadenosintrifosftato, prima di tutto si formano i due legami idrogeno tra la base entrante e la
base presente sullo stampo. Se questi legami idrogeno che si formano sono quelli corretti, allora in
questo caso il fosfato in alfa sar prettamente allineato con lossidrile. Quindi lossidrile si ionizza,
esercita un attacco nucleofilo sul fosfato in alfa formando il secondo legame fosfoestereo. Dunque
in totale, fosfoestereo da un lato, fosfoestereo dallaltro, il legame si dir fosfodiestereo. Si libera un
primo fosfato che, grazie ad una pirofosfatasi, viene degradato in due molecole di fosfato
inorganico rendendo irreversibile la reazione di polimerizzazione. Ladenina stata ben incorporata,
qua si formato il legame fosfodiestereo (in effetti il legame che si formato questo al 3) quindi
esibisce il suo 3 OH e sar pronto per innescare la successiva reazione con il nucleotide entrante
(ad esempio una guanina), che andr a complementarizzarsi con il nucleotide sull'elica stampo

(quindi la citosina) che successivo che deve essere copiato. Se invece arriva un nucleotide che non
quello corretto da non conformare il legame a idrogeno con la base presente sullo stampo,
ovviamente non si allinea nulla e se ne va, mentre pu arrivare solamente il desossiribonucleotide
trifosfato che porta la base in grado di complementarizzarsi con quella presente sullo stampo che
deve essere copiata e cos di seguito fino a quando tutto il filamento polinucleotidico viene copiato
e si forma una molecola di DNA a doppio filamento.
Le DNA-polimerasi sono tantissime. Quelle impegnate nella sintesi del DNA sono dette DNApolimerasi polarizzanti. Secondo Watson ed i suoi collaboratori, che hanno eseguito diversi studi
sulla DNA-polimerasi mediante vari metodi (come per esempio la solita diffrazione ai Raggi X),
hanno scoperto che tutte le DNA-polimerasi hanno una struttura tridimensionale molto simile,
indipendentemente dalle subunit proteiche che costituiscono la DNA-polimerasi stessa. Questa
struttura tridimensionale somiglia moltissimo ad una mano destra semichiusa e, analogamente a
figura, si possono individuare tre domini. Cosa sono i domini? Sono regioni indipendenti della
proteina, ciascuna delle quali svolge una sua specifica funzione. V' il dominio a pollice, il dominio
a dita ed il dominio a palmo.

Al livello del dominio a palmo sono presenti due siti ad attivit catalitica. In alto c' il sito di
polimerizzazione, quello che catalizza proprio lingresso dei desossiribonucleotide trifosfato e che
quindi di fatto determina la replicazione del DNA, quindi la sintesi del DNA; in basso c un altro
sito enzimatico che servir solo in determinate circostanze. Questo il sito attivo della DNApolimerasi. Questo il filamento stampo e questo il filamento che sta per essere sintetizzato.
Come visto precedentemente, se in un filamento stampo c' un'adenina, entra un
desossiribonucleotide trifosfato (contenente la timina), la timina forma i due legami idrogeno
correttamente con ladenina e la base si posiziona correttamente allinterno del sito attivo, in un
apposito ambiente, ma ,siccome la base legaae con legame glicosidico al desossiribosio, anche il
desossiribosio si posiziona in una zona ben precisa e corretta del sito attivo. Lo zucchero al 5
legato ai tre fosfati , e e quindi, se la base ed il desossiribosio si posizionano correttamente, il
fosfato in viene perfettamente allineato con lossidrile in 3 del nucleotide precedentemente
controllato; per cui, quando questo ossidrile sar ionizzato e diventer un ossigeno negativo, potr
esercitare lattacco nucleofilo, rompere il legame anidridico tra e e quindi lenergia essere
utilizzata per formare questo secondo legame fosfoestereo e quindi in totale un legame
fosfodiestereo. Il pirofosfato sar degradato dalla pirofosfatasi. Se invece entra un nucleotide errato,
perch nel sito attivo non che c nulla di logico (entrano tutti i desossiribonucleotidi), pu pur
legarsi al nucleotide del filamento stampo ma non vi rimane; solo quello la cui base in grado di
complementarizzarsi con la base dello stampo, si lega e rimane, quindi gli altri vanno via perch
questa una propriet tipica, caratteristica della DNA-polimerasi. Allora, se entra una
desossiriboadenosina trifosfato e sullo stampo di DNA c come base che deve essere copiata
sempre unadenosina, tra adenina ed adenina intanto c un ingombro sterico, per cui si ha una
sovrapposizione degli anelli, ma comunque non si possono formare legami idrogeno, di

conseguenza questo nucleotide quando entra, la base non si va a posizionare nella regione corretta
del sito attivo, ma si posiziona in una regione che non quella giusta, di conseguenza anche il
desossiribosio non risulta essere posizionato correttamente e di conseguenza anche il fosfato in
disallineato rispetto allossidrile del nucleotide correttamente incorporato. In questo caso, anche se
questo ossigeno si ionizza, non sar in grado di esercitare lattacco nucleofilo sul legame anidridico
- e quindi non potr legare il fosfato in . Di conseguenza, in assenza di questa possibilit, la base
fuoriesce dal sito attivo, lasciando il posto ad unaltra base, possibilmente quella corretta e cio una
desossiribotimina trifosfato.
Un altro aspetto che bisogna tener in grande considerazione [vi sono dei quiz a questo proposito],
che allinterno del nucleo la concentrazione di desossiribonucleotidi trifosfato circa un decimo di
quella dei ribonucleotidi trifosfato perch nel nucleo la trasmissione, quindi la sintesi dellRNA,
pi rappresentata rispetto alla replicazione. V' unelevata probabilit che allinterno del sito attivo,
anzich entrare un desossiribonucleotide trifosfato entri un ribonucleotide trifosfato, ma questo non
pu essere tollerato perch il DNA non tollera ribonucleotidi. In effetti, nel sito attivo l dove si
deve localizzare il desossiribosio, sono presenti un gruppo di amminoacidi che costituiscono il
cosiddetto sito discriminatorio, ossia una sorta di muro che permette il corretto posizionamento solo
al desossiribosio il quale in 2 non ha lossigeno, ma solo un semplice atomo di idrogeno. Se
accidentalmente nel sito attivo entra un ribonucleotide trifosfato, il ribonucleotide porta
regolarmente una base in grado di complementarizzarsi con quella presente sullo stampo. Qua
entrata una ribocitidina trifosfato, la base si complementarizza regolarmente con la guanina presente
sullo stampo e si posiziona regolarmente nel sito attivo, ma il ribosio, avendo un ossigeno in pi in
posizione 2', per poter entrare nel sito attivo, deve spostarsi lateralmente, perch altrimenti non
potrebbe nel sito stesso. Quindi, quando entra un ribonucleotide trifosfato, i legami idrogeno tra le
basi si formano regolarmente ma il ribosio, a causa del sito discriminatorio, spostato lateralmente
e, se spostato lateralmente, il fosfato scende e non potr mai essere attaccato in modo nucleofilo
dallossigeno ionizzato. Quindi anche in questo caso fosfato in ed ossidrile in 3 sono fortemente
disallineati a causa dellossidrile presente in 2 sul ribosio e conseguentemente non pu essere
catalizzato il legame fosfoestereo in 3. Questo ribonucleotide, cos com entrato, altrettanto se ne
esce lasciando il suo posto invece ad un desossiribonucleotide trifosfato che potr essere
incorporato. Finch non si forma il legame fosfodiestereo, questi legami (sempre trattandosi di una
sola base) sono molto molto deboli, quindi , se non viene incorporata, si rompono in modo
meccanico.
Questa una propriet che hanno tutte le DNA-polimerasi ed la capacit che hanno di impedire
che vengano incorporati nel DNA in sintesi dei nucleotidi errati, compresi i ribonucleotidi che non
devono assolutamente entrare. Quindi una capacit di favorire il legame fosfodiestereo ed una
propriet tipica di molti enzimi (non solo della DNA-polimerasi) e va generalmente sotto il nome di
selettivit cinetica. Che cosa significa selettivit cinetica? Significa che un enzima, come la DNApolimerasi, in grado di catalizzare la formazione del legame (nel qual caso, legame fosfoestereo al
3) solo ed esclusivamente in presenza del corretto substrato, cio del nucleotide corretto che si
complementarizza adeguatamente con la base presente sullo stampo e che si posiziona
adeguatamente sul sito attivo in modo tale che il proprio fosfato in sia perfettamente allineato con
lossidrile in 3 del nucleotide precedentemente incorporato. Solo questa la condizione che
permetter alla DNA-polimerasi di catalizzare questo legame e quindi permetter la formazione del
secondo legame fosfoestereo: quindi un corretto allineamento tra lossidrile in 3 del ribosio
precedentemente incorporato ed il fosfato in presente sul ribosio del nucleotide entrante. Questa
capacit di catalizzare il legame solo in presenza del corretto substrato, va sotto il nome di
selettivit cinetica ed un meccanismo di controllo della bont di sintesi prelegame. Quindi, se in
un quiz viene chiesto Si descrivete la capacit della DNA-polimerasi di catalizzare il corretto
legame tra un nucleotide entrante ed il filamento in crescita, ci si deve riferire solo alla selettivit
cinetica e quindi a questo controllo prelegame, facendo questi due esempi esposti sopra, nel caso di
un desossiribonucleotide con la base errata o nel caso del ribonucleotide con una base corretta ma
ovviamente con lo zucchero sbagliato. Oppure si pu trovare scritto Si descriva la selettivit

cinetica e si deve dare la definizione e fare sempre i due esempi.


Che cos che provoca la ionizzazione dellossidrile in 3 qualora la base entrante, il nucleotide
entrante, si sia correttamente posizionato nel sito attivo? Al livello del sito attivo sono presenti due
cationi metallici, quindi con due cariche positive. Secondo una linea di pensiero, il primo
sicuramente un catione magnesio, il secondo potrebbe essere un catione zinco; secondo unaltra
linea di pensiero sono entrambi cationi di magnesio ed in effetti si sa perfettamente, ad esempio,
quando si sintetizzano in vitro molecole di DNA in provetta con delle DNA-polimerasi particolari,
se si dimentica di aggiungere alla miscela di reazione il magnesio sotto forma di cloruro di
magnesio o solfato di magnesio, la DNA-polimerasi non funziona e quindi non si ottiene mai la
sintesi del DNA in vitro. Questo perch? Perch soprattutto il primo catione magnesio
fondamentale per destabilizzare lossidrile in 3 a provocarne la ionizzazione. Se lossidrile in 3
ionizzato, pu esercitare il suo attacco nucleofilo sul fosfato in ben allineato; se invece non
ionizzato, questo attacco nucleofilo non possibile e quindi questo catione, questo magnesio
fondamentale per innescare la reazione stessa. Il secondo catione metallico invece va a coordinare
con dei legami di tipo dativo insieme ad altri amminoacidi del sito attivo, il pirofosfato esibendolo
in questo caso alla pirofosfatasi affinch lo scinda in due fosfati inorganici e rendere in questo modo
irreversibile la reazione sulla base dellequilibrio chimico di Le Chatelier, come visto
precedentemente.
Quindi, quando entra il corretto nucleotide, le dita si chiudono su questo che appena stato
incorporato, il catione magnesio ionizza lossidrile in 3 e questo a sua volta esercita lattacco
nucleofilo formando il secondo legame fosfoestereo. Il pirofosfato viene coordinato dal secondo
catione magnesio o zinco e anche da alcuni amminoacidi (come larginina e la lisina) e subito
esibito alla pirofosfatasi per la completa degradazione. Per quanto riguarda gli altri due domini,
quello a dita ha la funzione di far entrare i deossinucleotidi trifosfato e quella (vista appena sopra)
di effettuare una flessione per avvicinare il nucleotide all'ossidrile (una volta che entra e si lega
correttamente nel sito attivo), facilitando maggiormente l'azione catalitica; il dominio a pollice
invece non partecipa alla reazione di polimerizzazione ma serve per agganciare la DNA-polimerasi
allo stampo.
Per processivit [sulla quale vengono elaborati dei quiz] della DNA-polimerasi s'intende la
capacit della stessa di restare il pi possibile attaccata allo stampo e quindi sintetizzare lunghi
tratti del secondo filamento polinucleotidico, quello di nuova sintesi. Una DNA-polimerasi tanto
pi processiva quando pi resta attaccata allo stampo e quanto pi DNA di nuova sintesi viene a
formare. Se la DNA-polimerasi si stacca facilmente, si dice che una DNA-polimerasi poco
processava, quindi il dominio a pollice fondamentale per attaccare la DNA-polimerasi allo stampo
ma non sufficiente a renderla altamente processiva, come invece la replicazione del DNA richiede.
Ci sono delle molecole che, associandosi al dominio a pollice, fanno s che la DNA Polimerasi
diventi altamente processiva.
Quando secondo voi la selettivit cinetica della DNA-polimerasi pu essere ingannata e quindi pu
essere incorporato un nucleotide errato? Si pensi un momento ai gruppi chetonici ed amminici:
quando le basi si trovano transitoriamente nella loro forma tautomerica alternativa, sono in grado di
formare legami a idrogeno in modo non convenzionale, cio alterando completamente quella che
la complementariet delle basi secondo Chargaff e, quindi, una base di forma tautomerica
alternativa non una base informativa perch pu formare legami a idrogeno con una base in modo
non convenzionale. Quindi, se una base sotto forma di desossiribonucleotide trifosfato si trova in
forma tautomerica alternativa, inganna la selettivit cinetica e quindi la DNA-polimerasi catalizza la
formazione del legame fosfoestereo e quindi questa base errata viene incorporata. Dopodich torna
nuovamente nella sua forma tautomerica normale ma ormai il legame fosfoestereo che quello
covalente si formato, quindi i legami idrogeno che prima si erano formati e che avevano ingannato
la DNA-polimerasi si rompono e quindi sia avr quello che si chiama un errore di appaiamento, in
inglese mismatch.
Quando viene introdotto un nucleotide errato, si ha un blocco della replicazione, a meno che non
venga attivato il secondo sito enzimatico (e di fatti l'attivazione avviene come conseguenza) che si

trova in basso al palmo, che un sito detto esonucleasico 3-5, cio allindietro, detto anche sito di
correzione di bozze o in inglese sito proof reading. In questo caso, questo sito ha la possibilit, se
si ha il blocco della forca replicativa, il blocco della replicazione, di eliminare il nucleotide che
stato precedentemente incorporato (che prima si trovava nella sua forma tautomerica alternativa e
che ora tornato nella forma tautomerica normale, e quindi blocca lincorporazione di altri
nucleotidi per quanto normali). Come viene individuato l'errore?

Lezione VI

10/05/2012

Replicazione nei Procarioti


[Risposta alla domanda della lezione precedente] Se viene introdotto un nucleotide errato nella sua
forma tautomerica alternativa, quando questo ritorna nella forma normale (chetonica) rompendo i
legami con la base con la quale si era legato, si ha un blocco della forca replicativa. Il nucleotide
che si lega in forma enolica trasformandosi in forma chetonica, rompe i legami, di conseguenza i
due filamenti non sono perfettamente paralleli luno con laltro, quindi non c pi lo stesso
allineamento del gruppo 3 OH con il fosfato in .
Si prendendo in considerazione il caso in cui viene incorporata una base nella sua forma
tautomerica alternativa: supponendo che una timina si leghi con legami a idrogeno a unaltra timina
nella forma tautomerica alternativa, si viene a formare un legame fosfoestereo al 3 (in totale quindi
fosfodiestereo). Quando la timina in forma alternativa ritorna in forma normale, ovviamente i
legami a idrogeno si rompono, tutto questo va un po pi in alto e non perfettamente localizzato
nella posizione del sito attivo, dove si dovrebbe trovare. Di conseguenza, quando entra
regolarmente la base del successivo desossiribonucleotide, si lega nel giusto sito e anche il fosfato
in si localizza regolarmente per, in questo caso, lossigeno ionizzato (viene comunque ionizzato
dallo ione magnesio) non verr pi allineato con il fosfato in , quindi il problema diametralmente
opposto rispetto a quello osservato per la selettivit cinetica. Pur essendo il nucleotide entrante un
nucleotide corretto, non pu avvenire la formazione del legame fosfoestero al 3, di conseguenza
accade che questo nucleotide corretto per selettivit cinetica viene eliminato. Ne entra un altro
corretto, si lega ma il legame fosfodiestereo non pu avvenire perch lossidrile (colui che innesca
la reazione) si trova disallineato. Il nucleotide, a questo punto, riesce e ne entra un altro, e cos via.
In pratica si ha il blocco della forca replicativa che fa s che il DNA in sintesi perda la sua affinit
per il sito di polimerizzazione e si attivi invece laffinit per il sito esonucleasico. Il DNA a doppio
filamento scivola in basso nel sito esonucleasico, qui gli amminoacidi del sito attivo riescono a
valutare la geometria della parte finale della doppia elica di DNA e sono in grado di riconoscere che
c un nucleotide errato, cos facendo determinano un taglio endonucleotidico al legame
fosfodiestero, che si era formato precedentemente mediante questo inganno alla DNA polimerasi.
Eliminato il nucleotide errato, rimane il nucleotide precedente che quello corretto. Si riduce
laffinit per il sito esonucleasico e riaumenta laffinit per il sito di polimerizzazione. Dopo
l'eliminazione del nucleotide errato, il DNA risale nel sito di polimerizzazione e riprende la sintesi
aggiungendo il desossiribonucleotide corretto. Ogni volta che si verifica lingresso di un nucleotide
con la base nella sua forma tautomerica alternativa, succede sempre la stessa cosa, per questo
meccanismo non sempre particolarmente efficiente. In alcuni casi, a seconda di come si trova
(immaginando che si tratti di enzimi come la gelatina della carne), a volte si possono trovare un po
pi schiacciati verso un lato o laltro. Quindi pu succedere che, anche se c un nucleotide errato,
la cui base non legata alla base presente sullo stampo, lossigeno presente sullo stampo
accidentalmente si trovi allineato con il fosfato in e avviene la catalisi con formazione del legame
fosfoestereo al 3. Rimane, in questo caso, un nucleotide errato che non potr essere, almeno per
ora, eliminato. Si tratta di un mismatch o errore di appaiamento, cosa che avviene frequentemente.
Questa propriet che ha la DNA-polimerasi di correggere gli errori di appaiamento non
particolarmente efficiente, tant vero che, subito dopo la sintesi del DNA, ci sono altri sistemi che

nelluomo sono molto importanti, ma quello che si conosce pi dettagliatamente quello di E. Coli,
anche se nelluomo esistono tantissimi sistemi enzimatici in grado di correggere gli errori, dopo la
sintesi, quando il DNA a doppio filamento fuoriesce dalla DNA-polimerasi. Le alterazioni di
funzionalit di questi enzimi, col tempo, correlano sicuramente con alcune forme di cancro.
Man mano che procede la polimerizzazione, se viene introdotto un nucleotide errato (ad esempio la
timina), una guanina non pu entrare perch disallineata, entra solo la timina. Il dominio a dita
spinge ancora di pi il fosfato in vicino allossidrile abbassando ulteriormente lenergia di
attivazione e quindi innescando meglio la formazione del legame fosfoestereo al 3. Il dominio a
pollice si lega allo stampo rendendo molto processiva la DNA-polimerasi ma, se accidentalmente
viene introdotto un nucleotide errato nella sua forma tautomerica alternativa, laffinit per il sito di
polimerizzazione viene perduta mentre aumenta laffinit per il sito esonucleasico il quale lo
rimuove. Riaumenta laffinit per il sito di polimerizzazione e la DNA polimerasi continua a
sintetizzare laltro filamento. Il DNA a doppio filamento scivola in basso dove provvede a eliminare
il nucleotide errato. Una volta eliminato risale nel sito di polimerizzazione dove riprende la sintesi.
Le DNA-polimerasi di tutti gli esseri viventi e anche quelle di particelle non viventi come virus e
organelli, quali mitocondri e cloroplasti, hanno tutte un handicap, ossia non sono in grado
autonomamente di introdurre il primo nucleotide quando inizia il processo di replicazione. Invece,
questa capacit posseduta dallRNA-polimerasi, cio dallenzima che determina la sintesi
dellRNA. Affinch le DNA-polimerasi possano iniziare il processo di replicazione necessitano che
sullo stampo di DNA da copiare, sia presente un innesco che prende il nome di primer. quindi
necessario un enzima che vada a sintetizzare questo primer (in alcuni testi non particolarmente
recenti si pu leggere che il primer viene sintetizzato esclusivamente in una specifica regione del
DNA ma non assolutamente vero perch il primer pu essere sintetizzato in qualsiasi regione del
DNA).
A sintetizzare il primer v' un enzima specifico che prende il nome di primasi. Dato che le DNApolimerasi non hanno la capacit di introdurre il primo desossirboniucleotide trifosfato ma una
capacit che invece hanno le RNA polimerasi, il primer una sequenza di RNA. Anche se chiamata
DNA-primasi, in realt, la primasi un RNA-polimerasi. In genere vengono sintetizzati dei primer
che possono avere una lunghezza variabile, 10-13 a volte anche 15 nucleotidi di RNA. Le DNApolimerasi hanno bisogno, almeno quelle dei procarioti, di avere sullo stampo un 3 OH a cui
agganciare un desossiribonucleotide trifosfato; se non c il 3 OH, non possono innescare la
reazione di replicazione. Il primo enzima che agisce sullo stampo la primasi.
Il primo enzima in assoluto che deve agire quello che determina la rottura del legame idrogeno e
quindi lapertura dei due filamenti di DNA con la formazione dei due filamenti stampo.
Questenzima che utilizza molecole di ATP, detto elicasi e di norma in tutti gli organismi una
proteina multimerica a forma di ciambella, formata da sei subunit. Le elicasi vanno ad agganciare
il DNA a singolo filamento e idrolizzando molecole di ATP, rompono i legami a idrogeno nella
molecola di DNA. Rompendo i legami a idrogeno (la molecola ad elica) e separando i giri della
doppia elica, essi non fanno altro che concentrarsi verso la parte che non denaturata. Si arriva ad
un punto in cui il superavvolgimento di queste spire cos elevato che o non possibile denaturare
il DNA oppure il DNA si rompe mediante una rottura meccanica del legame fosfodiestereo. Per
impedire questo, la topoisomerasi agisce insieme allelicasi. In genere agisce la topoisomerasi I ma
questa pu essere vantaggiosamente sostituita dalla topoisomerasi di tipo II. Uno dei farmaci che
viene utilizzato come antiplastico, cio come farmaco per curare le metastasi, un farmaco che
inibisce la topo isomerasi I. Inibendo la topoisomerasi I, viene ridotta fortemente la capacit della
cellula tumorale di replicare il proprio DNA, appunto perch lelicasi non pu pi procedere a
denaturare DNA nei due filamenti polinucleotidici, poich i formano numerosi superavvolgimenti.
Se questa attivit forzata, si verifica la rottura del DNA e la destabilizzazione del genoma delle
cellule tumorali che in questo caso giungono alla morte. Quindi, i primi due enzimi che agiscono
sono lelicasi e le topoisomerasi, dopo di che devono agire necessariamente le primasi per
sintetizzare il primer di RNA, necessario per innescare la reazione di replicazione, quindi le DNApolimerasi in questo caso devono procedere alla polimerizzazione dei vari desossiribonucleotidi

trifosfato secondo le modalit viste, universali per tutti gli esseri viventi fatta eccezione per la
replicazione dei virus e la replicazione degli organelli.
La reazione della sintesi del nuovo DNA possiede una polarit. Lelicasi va a denaturare e le
topoisomerasi provvedono a eliminare superavvolgimenti e le DNA-polimerasi sintetizzano il
DNA. Ora, mentre uno dei due filamenti quello va dal 3 a l 5 pu essere tranquillamente copiato
secondo la direzione di progressione della forca replicativa (quindi di replicazione del DNA) in
modo continuo, laltro filamento che va dal 5 al 3, essendo antiparallelo rispetto al primo, quindi
avendo una polarit chimica opposta, dovrebbe essere sintetizzato in senso inverso ma questo
ovviamente non possibile. Per lungo tempo stato oggetto di discussione da parte dei biologi
molecolari fino a quando nel 1968 il giapponese Okazaki scopr, intu come potesse avvenire questa
replicazione del secondo filamento.
Per il filamento che pu essere copiato in modo continuo sufficiente un solo primer, quindi
possibile sintetizzare la molecola di DNA senza alcuna interruzione. Laltro filamento necessita di
tanti primer: prima viene sintetizzaro un primer e il filamento viene esteso in senso inverso, poi ne
viene sintetizzato un altro e il filamento viene esteso in senso inverso, quindi tanti primer e una
sintesi al contrario della seconda molecola di DNA. In questo caso quindi la seconda molecola di
DNA viene sintetizzata a tratti, a porzioni, quindi tanti primer alternati a tratti pi o meno lunghi di
DNA. Una molecola viene sintetizzata in modo continuo, quindi, il filamento stampo si chiama
filamento continuo o progressivo o leading, mentre laltro filamento che viene sintetizzato a tratti,
quindi tratti primer alternati a tratti di DNA (chiamati frammenti di Okazaki), siccome c un
lieve ritardo nella sintesi del DNA, dato che devono essere continuamente agganciati dei primer,
detto filamento regressivo o lagging. Per, dopo la sintesi dei frammenti di Okazaki, un tratto di
DNA e un altro tratto di DNA (dunque due frammenti di Okazaki; nella molecola di DNA non sono
assolutamente tollerati ribonucleotidi) interviene un altro enzima associato alla forca replicativa che
una ribonucleasi che procede a degradare tutti i ribonucleotidi che hanno costituito il primer.
Rimane quindi un gap, un buco, fra i due frammenti di Okazaki. Il 3OH che appartiene al DNA,
viene utilizzato da una DNA-polimerasi che procede a riempire con desossiribonucleotidi il gap
lasciato dal primer. In pratica sostituisce il primer di RNA con un uguale tratto di DNA ma, quando
questo nuovo DNA raggiunge quello precedente, si forma un nick, cio un 5 monofosfato e un
3OH, cio due gruppi che non hanno lenergia necessaria per potersi legare e formare un legame
fosfoestereo. Per unire il nick necessario un enzima in grado di portare lenergia necessaria per la
formazione di questo legame fosfoestereo; questo enzima si chiama DNA-ligasi ed un altro
enzima che partecipa alla sintesi del DNA. La DNA-ligasi in questo caso, incontrando un 5
monofosfato e un 3 OH, li unisce e insieme catalizza la formazione del legame fosfoestero
utilizzando dellenergia che si porta dietro. Nei procarioti, ad esempio, le DNA-ligasi viaggiano
con molecole di ATP, mentre negli eucariti viaggiano con altre molecole energetiche come il
NADH. Grazie a queste molecole energetiche possibile unire un nucleotide monofosfato, cio che
ha solamente un fosfato in e un 3 OH. Quindi di volta in volta i filamenti vengono saldati e,
anche in questo caso, si avr una molecola di DNA che perfettamente intera e integra anche sul
filamento regressivo. Tutti i primer, man mano che hanno donato il loro gruppo OH alla DNApolimerasi per sintetizzare il frammento di Okazaki, alla fine vengono degradati da una ribonucleasi
e un'altra DNA-polimerasi provvede a riempire il buco che le ribonucleasi lasciano con un uguale
tratto di molecole di DNA. Alla fine, i due frammenti di Okazaki vengono uniti assieme dalla DNAligasi perch non c energia sufficiente per poterli legare. Per molto tempo si pens che in effetti il
tutto funzionasse cos, quindi si pens che una DNA-polimerasi andasse sempre di continuo a
scorrere sul filamento mentre laltra si pensava si comportasse come una sorta di pendolo che va
avanti e indietro, provvedendo sempre nel senso di progressione della forca replicativa. Oggi,
invece, si sa molto bene che entrambe le DNA-polimerasi coinvolte nella sintesi delle due molecole
di DNA a partire dal DNA parentale, stanno ferme, non si muovono, tutti gli enzimi stanno fermi
allinterno del nucleo, il DNA molto dinamico che si muove attraverso gli enzimi, quindi il DNA
si muove attraverso le DNA polimerasi e si lascia replicare. sbagliato dire la DNA polimerasi
scorre sul filamento stampo. Si dice il filamento stampo scorre attraverso la DNA polimerasi.

Se le DNA-polimerasi sono ferme e il DNA scorre attraverso le DNA-polimerasi, la formazione dei


frammenti di Okazaki consentita da un'altra proteina che si aggancia alla DNA-polimerasi. Nei
procarioti e, in modo particolare, nell'E. Coli, questa proteina, chiamata pinza di scorrimento,
molto simile alla elicasi, cio una molecola formata da sei subunit ed ha la forma di una
ciambella, ha la capacit di arrangiarsi quando trova su un singolo filamento un primer legato ad
uno stampo di DNA, mentre quando il DNA gi a doppio filamento perde affinit e si stacca.
Quindi, ogni volta che la primasi sintetizza un primer su uno stampo, prontamente questa pinza di
scorrimento va ad agganciarsi mediante dei meccanismi di fosforilazione sullo stampo. Nel caso del
DNA progressivo, viene sintetizzato un solo primer e quindi una sola pinza di scorrimento si va ad
agganciare; nel caso del DNA regressivo ovviamente vengono sintetizzati pi primer e quindi, ogni
volta che viene sintetizzato un primer su di un tratto dello stampo, una nuova pinza di scorrimento
si va ad agganciare a questo stampo dove c il primer. Alla pinza di scorrimento si lega saldamente
il dominio a pollice della DNA-polimerasi. Grazie alla pinza di scorrimento, le DNA-polimerasi
diventano altamente processive perch solo il pollice non ce la fa a rendere processiva la DNApolimerasi. invece, grazie alle pinze di scorrimento, le DNA-polimerasi si agganciano e la pinza
scorre sullo stampo e non rilascia la DNA polimerasi che pu continuare la sua polimerizzazione
fino a quando non viene completata la sintesi del DNA. Ovviamente questo vale per il filamento
progressivo. Nel filamento recessivo ci sono dei limiti perch la pinza di scorrimento arriva fino al
primer o al filamento di Okazaki che era stato precedentemente sintetizzato, trova chiuso il doppio
filamento e quindi si stacca, cos come si stacca la DNA-polimerasi per poi riattaccarsi pi a monte
dove ci sar un nuovo primer e una nuova pinza di scorrimento. La novit che sul filamento
regressivo, ogni volta che una pinza di scorrimento si lega al filamento regressivo con un primer, lo
ruota di 180, quindi questo avr la stessa polarit chimica del filamento progressivo ed per questo
che le DNA polimerasi stanno ferme: attraverso una entra lo stampo progressivo che procede nel
suo senso di polarit chimica, il filamento regressivo, grazie alla pinza di scorrimento, si ruota di
180 ed esibisce alla DNA-polimerasi la stessa polarit chimica e procede nella stessa direzione.
Poich si ha una rotazione di 180, la DNA-polimerasi potr sintetizzare prima fino alla curva;
arrivati alla curva non potr andare pi avanti, quindi la pinza di scorrimento si stacca ma nel
frattempo un'altra pinza di scorrimento si sar legata al filamento regressivo denaturato e quindi,
ruotando ancora di 180, il successivo tratto di DNA si pu agganciare alla DNA polimerasi la
quale, senza muoversi, continuer la sua polimerizzazione e quindi a formare il frammento di
Okazaki.
La elicasi si lega sempre per funzionare al DNA a singolo filamento e per la precisione si lega
sempre sul filamento regressivo. In questo modo idrolizza molecole di ATP ad ADP e, con lenergia
che si libera, vengono idrolizzati i legami a ponte di idrogeno fra le basi complementari.
Nel momento in cui il DNA si denatura, prima che arrivino i complessi enzimatici, le due molecole
di DNA sono scoperte e la cellula non tollera assolutamente molecole di DNA a singolo filamento
perch possiede specifici enzimi, le DNAsi, che hanno il compito di degradare le molecole di DNA
a singolo filamento perch, se dovessero esserci molecole di DNA a singolo filamento, queste
potrebbero perturbare gravemente tutti i processi funzionali della molecola di DNA . La cellula, per
proteggere il DNA a singolo filamento che stato denaturato e che sta aspettando gli enzimi che
andranno a copiarlo, produce delle speciali proteine che si legano operativamente alle molecole di
DNA denaturato, in attesa che arrivino gli enzimi. Le proteine SSB (singol sprang binding
proteins, termine coniato per il DNA dei procarioti per pu essere usato per gli eucarioti perch si
tratta di proteine che hanno la stessa funzione) si legano al DNA a singolo filamento durante la
replicazione. Solo durante la replicazione il DNA a singolo filamento fuori dagli enzimi. Il DNA,
durante la trascrizione e la riparazione, si denatura allinterno degli enzimi, quindi gi protetto.
Solo durante la replicazione il DNA si denatura fuori dagli enzimi e deve essere protetto dalle SSB.
Le SSB legano il singolo filamento di DNA dalla parte dello scheletro di zucchero-fosfato lasciando
libere le basi perch sono quelle che poi devono essere copiate in quanto, penetrando le DNApolimerasi, questi enzimi devono sintetizzare il nuovo filamento. Le SSB servono anche per tenere
il DNA aperto, quindi hanno anche la funzione di tenere il DNA denaturato, ma si tratta di un

concetto vecchio perch la replicazione molto veloce. Dal momento che dalla denaturazione
allarrivo degli enzimi il tempo brevissimo, le molecole di DNA denaturate non hanno il tempo di
rinaturarsi perch i singoli filamenti si ritrovano subito avvolti dagli enzimi, necessario proteggerli
perch in questo caso le DNAsi sono pi veloci degli enzimi e potrebbero provocare dei danni allo
stampo e quindi al genoma della cellula.
I meccanismi di replicazione sono perfettamente uguali (tranne qualche piccolissimo dettaglio) sia
nei procarioti sia negli eucarioti. Quindi il DNA esibisce negli organismi viventi lo stesso
meccanismo per la propria replicazione anche se sono presenti sistemi enzimatici diversi, pi
complessi negli eucarioti con proteine multifunzionali e in numero maggiore, per quelle che
effettivamente rendono possibile la replicazione del DNA, sono uguali e le modalit sono identiche
in tutti gli organismi.
In E. Coli allo stato attuale sono state identificate cinque DNA-polimerasi ma non tutte servono per
la replicazione. In effetti, due DNA-polimerasi intervengono per la replicazione del DNA, mentre le
altre tre servono, invece, per la riparazione del DNA. Infatti, la DNA-polimerasi II stata la prima
DNA-polimerasi ripartiva di E. Coli che stata scoperta. Poi sono state scoperte anche le DNApolimerasi IV e V che, a loro volta, sono un gruppo di DNA-polimerasi che si chiamano DNApolimerasi di translesione e hanno il compito di riparare il DNA direttamente o indirettamente o,
comunque, se ci sono dei danni gravi che impediscono alle polimerasi vere e proprie di replicare il
DNA, permettono di superare questi ostacoli transitoriamente; per questo si chiamano di
translesione.
Quindi, le vere DNA-polimerasi che partecipano alla replicazione del DNA di E. Coli, sono due: la
DNA-polimerasi I e la DNA-polimerasi III. La DNA-polimerasi III che si assembla in un
complesso oloenzimatico quella che effettivamente replica la molecola di DNA ad alta velocit,
mentre la DNA polimerasi I va a riempire i gap di primer fra i frammenti di Okazaki, quindi
quella che ricostituisce lo spazio lasciato dal primer degradato e poi la DNA-ligasi andr a
completare il lavoro svolto dalla DNA-polimerasi. Quindi la III effettivamente la DNA-polimerasi
replicativa e la I quella in grado di riempire i gap fra i frammenti di Okazaki, quindi agisce solo
sul filamento regressivo. Tutte e due le DNA polimerasi si devono trovare dallo stesso lato e sono
agganciate ciascuna con una proteina che prende il nome di proteina (tau). Le due proteine che
provengono da ciascuna DNA-polimerasi sono a loro volta associate ad un complesso proteico,
formato da molte subunit, che si chiama complesso ma detto anche caricatore della pinza.
Una pinza di scorrimento aperta si aggancia al complesso ed pronta a chiudersi l dove trova uno
stampo di DNA con un primer gi sintetizzato. proprio il caricatore del complesso che
determina la chiusura e quindi il caricamento della pinza dove presente un primer agganciato ad
uno stampo. Quando invece il DNA completamente a doppio filamento, la pinza stessa, cio lo
stesso caricatore, esercita una reazione inversa facendola staccare perch perde affinit.
Il complesso o complesso caricatore della pinza, agganciandosi ad entrambi i filamenti stampo di
una molecola di DNA denaturata, ne determina la replicazione. La DNA-polimerasi I partecipa
solamente a riempire i gap fra i frammenti di Okazaki e poi la DNA-ligasi a completa lopera.
Il DNA di E. Coli circolare ed E. Coli ha un solo cromosoma; lorganizzazione molto simile a
quella degli eucarioti: il DNA di E. Coli si associa a delle proteine fasiche molto simili agli istoni,
formando degli occhielli di cromatina molto simili alle fibre da 30 nm. Durante la replicazione
queste proteine vengono rimosse come le proteine istoniche. Il DNA deve essere attivato per
iniziare il processo di replicazione. E. Coli replica il proprio DNA (E. Coli una cellula molto
semplice le cui esigenze dipendono dalla quantit di nutrienti presenti nel mezzo in cui si trova)
quando si trova in un mezzo in cui i nutrienti sono abbondanti e si replica rapidamente ogni circa 20
minuti. Se invece i nutrienti cominciano a ridursi, anche E. Coli riduce la propria riproduzione e
quindi anche la replicazione del DNA. Quando E. Coli si trova in un mezzo particolarmente ricco di
nutrienti, ecco che riceve dallesterno una sorta di segnale che permette di produrre una particolare
proteina che la prima proteina che detiene il processo replicativo. Questa proteina si chiama dnaA (da scrivere in minuscolo e non confondere con il DNA, in quanto tutti gli enzimi della forca
replicativa di E. Coli vengono indicati con la sigla DNA piccolo seguiti dalla lettera). Il processo di

replicazione innescato in una specifica sequenza chiamata origine di replicazione di E. Coli o


oriC. La lunghezza di oriC di 245bp (base pairs coppie di basi) e, allinterno di queste 245bp,
si trovano dei consensi; precisamente ci sono quattro consensi uguali che si chiamano quattro
ripetizioni da 9bp.
I l primo consenso rappresentato da quattro ripetizioni diverse da nove coppie di basi uguali (nel
libro possibile che ci sia scritto che sono cinque, per errato, sono quattro). Altri tre consensi
sono delle ripetizioni da 13 coppie di basi uguali particolarmente ricche in adenina e timina, quindi
in questi tratti il DNA legato da legami idrogeno troppo deboli. In fine, in tutto il DNA di E. Coli
particolarmente rappresentata la sequenza tetra nucleotidica GATC e, di queste sequenze
tetranucleotidiche, nellorigine di replicazione ce ne sono 14. GATC particolarmente rappresentata
nel DNA di E. Coli perch E. Coli metila le adenine di questa sequenza; la metilazione nel DNA dei
procarioti ha un significato completamente diverso rispetto alla metilazione del DNA degli eucarioti
(i batteri producono speciali enzimi per difendersi dai virus che sono gli enzimi di restrizione,
endonucleasi che riconoscono specifiche sequenze per cui, quando un batteriofago inietta il proprio
DNA in un batterio, il batterio produce questi enzimi che vanno a tagliare il DNA del virus
impedendogli di replicarsi per, siccome le stesse sequenze sono presenti anche sul genoma di E.
Coli, il batterio deve proteggere il proprio genoma metilando le adenine su entrambi i filamenti in
modo che gli enzimi di restrizione non siano in grado di riconoscere le sequenze, quindi tagliano il
DNA virale ma non il DNA del batterio).
Quando le condizioni di nutrimento del mezzo colturale sono ottimali, arriva sul DNA di E. Coli
uno stimolo che porta il batterio a produrre una grande quantit di dna-A, che un enzima inattivo
chiamato adenosintrifosfatasi che, quando inattivo, viaggia sempre associato con il substrato,
quando attivo idrolizza ATP ad ADP.
La dnaA la proteina chiave per attivare la replicazione in E. Coli, si va a legare riconoscendo
espressamente le quattro ripetizioni da nove coppie di basi ma non si lega ad una sola proteina dnaA ma se ne legano tante, in modo operativo, una accanto allaltra, da 20 a 40 monomeri diversi e,
quando avviene il legame di una proteina dna-A con questi consensi del DNA, si verifica una
modifica conformazionale della proteina stessa, la quale da inattiva diventa attiva e idrolizza ATP ad
ADP. In presenza di ADP legata alle sequenze consenso, la sua affinit per il DNA diventa
grandissima, quindi rimane attaccata al DNA e si viene a formare una sorta di complesso. La
tensione che i monomeri di proteina dna-A creano, deve essere scaricata aprendo la doppia elica di
DNA l dove il DNA pi debole, quindi al livello delle tre ripetizioni da 13 coppie di basi. Si
verifica lapertura meccanica della doppia elica, quindi si formano i due filamenti. A questo punto
interviene subito la elicasi di E. Coli che si chiama dna-B, si lega ad un filamento e unaltra elicasi
si lega allaltro filamento e si formano due forche replicative le quali procedono in senso opposto
sino a quando, replicando tutto il DNA circolare, si incontrano e si fondono nel punto
diametralmente opposto allorigine di replicazione, liberando le due molecole di DNA che
rimangono concatenate.
La prima parte che viene replicata lorigine di replicazione di E. Coli, quindi la prima porzione a
doppio filamento di DNA proprio lorigine di replicazione. Quindi potrebbe succedere che altre
molecole di proteina dna-A vadano a legare le quattro ripetizioni sui due filamenti ancora
incompleti, prima che la prima replicazione si sia completata, innescando un nuovo processo di
replicazione che porterebbe alla produzione di pi molecole di DNA. Ci sarebbe molto deleterio
per la cellula perch ogni cellula, sia procariote sia eucariote, nel momento in cui si riproduce, deve
necessariamente trasmettere alle cellule figlie lo stesso DNA e nella stessa quantit. Se da una
cellula madre derivano due cellule figlie e la cellula madre ha una sola molecola di DNA,
inevitabile che il DNA venga replicato una volta sola in modo che si formino due molecole di DNA,
una per ciascuna cellula figlia. Quattro molecole di DNA altererebbero il genoma della cellula, in
questo caso del batterio. Ci sono dei meccanismi che impediscono la replicazione dellorigine
mentre il DNA si sta replicando. Questo meccanismo che impedisce la riattivazione dellorigine in
E. Coli avviene mediante la produzione di una proteina chiamata Sec-A, in grado di riconoscere il
DNA emimetilato. Nel momento in cui si formano le due nuove molecole di DNA, il filamento di

nuova sintesi non ha le adenine metilate, che invece sono presenti solo sul filamento di vecchia
sintesi. Quindi, durante la replicazione e anche dopo, fino ad un certo periodo, le molecole appena
replicate restano emimetilate e la proteina dna-A riconosce proprio il DNA emimetilato, si lega al
DNA emimetilato mascherando fortemente i consensi, cio le quattro ripetizioni da 9bp. Le proteine
dna-A legate ad ADP che avevano funzionato precedentemente, rimangono in una certa misura
attaccate ai propri consensi. Quindi da un lato le proteine dna-A ADP sono disattivate e affiancate
a questi consensi, dallaltro la proteina dna-A si lega al DNA emimetilato. In pratica le due origini
di replicazione sul DNA che si sta replicando sono completamente mascherate e nuove molecole di
proteina dna-A ATP non possono legarsi alle origini fino a quando tutto il DNA non si replicato.
Con questo sistema di mascheramento dei consensi, la cellula impedisce la replicazione delle
origini. Quando le due forche replicative raggiungono il punto diametralmente opposto allorigine,
si fondono e si staccano. Per staccarle occorre la rottura dei due legami fosfodiesterei, e,
contemporaneamente, agisce la topoisomerasi II che nei batteri si chiama girasi. Le due molecole di
DNA si portano ai poli opposti della cellula ed a livello della membrana cellulare presente un
enzima particolare, la metilasi GAM che va a metilare il filamento di nuova sintesi (il DNA da
emimetilato diventa completamente metilato). Nel frattempo la cellula si costringe al centro e si
separa, il DNA metilato si trova nelle due cellule figlie. Con la metilazione del secondo filamento,
la proteina perde affinit, si stacca e, con essa, si staccano anche quei residui di dna-A ADP. Come
conseguenza, le origini nelle due cellule figlie sono completamente libere e possono essere
agganciate da nuove molecole di dna-A ADP per iniziare un nuovo processo replicativo, il che
avviene allincirca ogni 20 minuti quando le condizioni sono ottimali.

Lezione VII

11/05/2012

DNA-polimerasi negli Eucarioti


Le DNA-polimerasi identificate nelle cellule eucariote, uomo compreso, sono ben 15 e vengono
indicate con lettere greche. Di queste, per, sono effettivamente coinvolte nella replicazione del
DNA le polimerasi , e . La prima polimerasi identificata stata una polimerasi riparativa, la ;
la determina la replicazione del DNA nei mitocondri; tutte le altre sono di riparazione. I
meccanismi di replicazione sono identici a quelli dei procarioti: le DNA-polimerasi non sono in
grado di introdurre il primo nucleotide, necessario perci un primer di innesco che un primer a
RNA, di cui ne viene sintetizzato uno sul filamento progressivo e tanti su quello regressivo, dando
origine cos i frammenti di Okazaki. I primer poi vengono rimossi, le DNA-polimerasi sintetizzano
i tratti mancanti e la ligasi unisce i frammenti (si ricordi che la ribonucleasi dei procarioti la
ribonucleasi p quella degli eucarioti mrp).
I primer vengono sintetizzati dalla DNA-polimerasi . Questa formata da 4 subunit a due a due
uguali, due e due . Questa DNA-polimerasi particolare perch ha una doppia funzione: le
subunit la rendono RNA-polimerasi mentre quelle la rendono DNA-polimerasi a bassissima
processivit. Quindi essa stessa che sintetizza prima i primer di RNA, poi si gira e, con attivit
DNA-polimerasica, comincia a sintetizzare il DNA, precisamente un tratto di DNA detto iniziatore
o iDNA. Dopo aver sintetizzato la porzione di DNA, la DNA-polimerasi si stacca. La lunghezza
delliDNA varia da organismo a organismo. In alcuni eucarioti pu essere di 3-4 nucleotidi, in altri
anche di 200 ma questa non una regola: infatti la lunghezza dipende dalla processivit della DNApolimerasi ed perci variabile anche nello stesso organismo da filamento a filamento. L'iDNA
necessario perch le DNA-polimerasi che allungano il filamento, la e la , non riconoscono un
primer a RNA e quindi necessitano di questo frammento di DNA che fornisce lossidrile del
deossiribosio e permette lo switching delle DNA-polimerasi. Appena si stacca la , la e la si
assemblano e sono esse che effettivamente polimerizzano. Ancora oggi non si sa perch siano
necessarie due DNA-polimerasi negli eucarioti ma si conoscono alcune loro propriet: la DNA-

polimerasi simile alla tre dei procarioti; non processiva da sola ma ha bisogno di una pinza di
scorrimento che negli eucarioti detta PCNA cio Antigene di Proliferazione Cellulare (chiamata
cos perch fu identificata prima di scoprirne la funzione e si era osservato che era strettamente
associata alla replicazione del DNA e alla divisone cellulare); la invece gi molto processiva di
per s e probabilmente si lega da sola allo stampo o si associa alla delta. Secondo alcuni autori la
copia il filamento progressivo, mentre la quello regressivo; secondo altri la copia entrambi i
filamenti e la riempie i gap sul regressivo; secondo altri la addirittura riparativa. Alcuni studi
recenti dimostrano che le due DNA-polimerasi sono strettamente associate durante il processo di
replicazione e si trovano sia sul filamento progressivo che su quello regressivo. Si pu ipotizzare
che la intervenga, data la sua alta processivit, su sequenze particolarmente difficili da replicare.
Si sa per certo che lavorano insieme perci, per quanto riguarda gli eucarioti, ci si riferisce al
complesso di DNA-polimerasi -.
Le DNA-polimerasi dei procarioti sono molto veloci ma il DNA da replicare poco, quelle degli
eucarioti sono pi lente ma pi precise: infatti, con la velocit della DNA-polimerasi aumenta
generalmente la probabilit di introdurre un errore (in vitro per aumentare la precisione, infatti, si
abbassa la temperatura che fa agire pi lentamente la DNA-polimerasi). Per conseguenza, negli
eucarioti il DNA, che molto pi lungo, presenta moltissime origini di replicazione. Si stima che
nel DNA umano ci siano contemporaneamente almeno 30000 DNA-polimerasi attive. Attraverso
questo sistema, negli eucarioti si diminuisce la probabilit di errori e contemporaneamente si
sintetizza una grande quantit di DNA. Ogni tratto rappresentato da una forca replicativa che si
sposta detto replicone (nel genoma umano si stima perci la presenza di circa 30000 repliconi
contemporaneamente). Per quanto riguarda gli eucarioti lunica sequenza che rappresenta lorigine
di replicazione conosciuta quella del Lievito. Si pensa che il meccanismo sia molto simile in tutti
gli eucarioti. Perci si disserti circa il funzionamento della replicazione nella cellula del lievito.

Replicazione e ciclo cellulare negli eucarioti (cellula di Lievito)


Lorigine di replicazione del Lievito (e generalmente quella di tutti gli eucarioti) viene indicata
come ARS (Sequenza di Replicazione Autonoma). Da un punto di vista strutturale, nellARS si
trova un tratto di DNA in cui sono presenti dei consensi. Il primo consenso viene detto A ed ricco
in adenine e timine. Molto probabilmente, data la somiglianza, qui avviene qualcosa di simile a ci
che succede nelloriC dei procarioti. Successivamente c un altro consensom, B1, anchesso ricco
in adenine e timine; poi vi sono i consensi B2 e B3. Questa configurazione simmetrica rispetto ai
consensi A e B1, si avr perci B3-B2-B1-A-B2-B3. B1 e B3 sono presenti in doppia copia.
La replicazione del DNA dipende strettamente dal ciclo cellulare che si suddivide in 4 fasi: G1, S,
G2 ed M. Durante la fase G1 del ciclo, la cellula trascrizionalmente molto attiva e anche i
ribosomi sono molto attivi: vengono prodotte infatti tutte le proteine implicate nella duplicazione
cellulare, eccetto le proteine istoniche: questa sintesi avviene in modo stechiometrico (le proteine
sono tante quante ne servono, non si avranno eccessi). Sempre durante la fase G1, le sequenze ARS
vengono preassemblate e, precisamente, a livello dei consensi A e B1 si lega un complesso di sei
proteine, detto ORC (Complesso che Riconosce lOrigine). Nel momento in cui ORC si lega alle
sequenze A e B1, modifica la propria conformazione ed espone alla sua sinistra e alla sua destra dei
gruppi chimici in prossimit dei consensi B2. Immediatamente, questi gruppi e i consensi B2 sono
riconosciuti dalle proteine Cdc6 e Cdt1 dette anche caricatori della elicasi, si legano perci due
proteine a destra e due a sinistra dellORC prendendo contatti sia con i gruppi chimici del
complesso sia coi consensi B2. Una volta legati sia alle proteine sia al DNA, i caricatori modificano
la propria conformazione ed esibiscono dei gruppi chimici che richiamano a livello della sequenza
ARS lelicasi che, nel caso del lievito detta Mcm2-Mcm7. In questo caso lelicasi si lega su
entrambi i filamenti di DNA, una lega a destra e laltra a sinistra, associate, oltre che al consenso,
che B3, anche ai caricatori. In questo modo si forma il complesso prereplicativo (pre-RC), che
per inattivo. I caricatori, le proteine ORC e le elicasi sintetizzate in questa fase sono tante quante
sono le sequenze ARS. Sempre in fase G1 a livello delle sequenze ARS, il complesso prereplicativo

crea una sorta di peso, di tensione sul doppio filamento. Quindi gi in fase G1 questo tratto di DNA,
soprattutto a livello dei consensi A e B1, per scaricare adeguatamente la tensione, come avviene nei
procarioti, apre meccanicamente la doppia elica l dove il DNA legato con legami a idrogeno in
minor numero, ossia a livello della sequenza particolarmente ricca in adenine e timine. Gi in fase
G1 perci questi tratti sono in singolo filamento.
Il ciclo cellulare regolato da speciali proteine dette cicline (D, E, A, ecc.). Tra queste la E,
sintetizzata in fase G1, quella che permette la transizione della cellula dalla fase G1 alla fase S. In
questo modo tutto il DNA entra in fase replicativa. Durante questa fase vengono bloccate tutte le
attivit biosintetiche tranne per quanto riguarda, in tarda fase S, la sintesi delle proteine istoniche
dipendenti dalla replicazione. Durante la fase S la ciclina E provoca una serie di reazioni di
fosforilazione che, funzionando come interruttori molecolari, attivano delle chinasi (enzimi che
determinano il trasferimento di gruppi fosfato dallATP a determinati residui amminoacidici delle
proteine). Alcune di queste chinasi vanno a fosforilare i caricatori dellelicasi, cos questi cambiano
conformazione e, nascondendo i gruppi chimici che li tenevano legati, perdono affinit sia per
lORC sia per il B2, cos come per lelicasi, e si staccano. Inoltre, sempre alcune chinasi provocano
prima la fosforilazione e poi la defosforilazione di una subunit delle elicasi che quindi prima si
aprono dal DNA a doppio filamento, gi aperto per il peso del complesso prereplicativo, e poi si
localizzano, chiudendosi, sul singolo filamento regressivo, da un lato e dallaltro, formando due
forche replicative. Nel momento in cui legata sul singolo filamento, lelicasi diventa attiva,
idrolizza ATP e denatura il DNA, una da sinistra verso destra, laltra da destra verso sinistra perch
le due forche replicative sono in senso opposto. Ovviamente essa lavora in sincronia con le
topoisomerasi, in modo particolare con la topoisomerasi I. Poi arrivano le DNA-polimerasi e ,
poi la che, sintetizzato il primer a RNA e il frammento di iDNA, lascia il posto alle altre
polimerasi.
Anche la cellula eucariote deve impedire la riattivazione dellorigine, che il primo tratto ad essere
replicato, ma ci non avviene in queste cellule poich non possibile la riattivazione dellorigine
non essendoci, durante la fase S, i complessi ORC i caricatori e le elicasi che erano stati sintetizzati
in modo stechiometrico. Quindi tutto il DNA viene replicato, vengono poi sintetizzate le proteine
istoniche, queste si associano formando i nucleosomi dei cromatidi fratelli; avvengono, se ci sono,
le modifiche epigenetiche e la cellula entra in fase G2 preparandosi alla mitosi.
Quando arriva alla mitosi, in Metafase si ha lo switch dellistone H3 col CENP-A e quindi i
cromatidi si attaccano alle fibre del fuso e finiscono ai poli opposti della cellula. La cellula si
costringe al centro formando le due cellule figlie che cominciano a funzionare subito come la
cellula madre, quindi rientrano in G1 e possono sintetizzare tutte le proteine necessarie per la
replicazione. Perci la replicazione negli eucarioti sincronizzata con tutte le fasi del ciclo cellulare
ed ciclino-dipendente.
Nel DNA degli eucarioti, per, nella parte terminale dei cromosomi, il primer sul filamento
regressivo, utilizzato per sintetizzare lultimo frammento di Okazaki, nel momento in cui viene
degradato, non viene pi rimpiazzato, perch non c un frammento di Okazaki successivo che
possa esibire il suo gruppo ossidrilico alla DNA-polimerasi. Quindi lestremit del cromosoma
rimarrebbe a singolo filamento ma, poich questo pu provocare la perdita di materiale genetico ,
interviene un particolare enzima, la telomerasi, che sempre una polimerasi ma ha la funzione di
una trascrittasi inversa. Poich per non presenta comunque molte analogie di sequenza con gli
enzimi virali, viene indicata DNA-polimerasi RNA-dipendente, perch contiene in s uno stampo
di RNA che aggancia allestremit pi lunga del termine del cromosoma chee utilizza per
sintetizzare un uguale tratto di DNA. Questo si ripete un determinato numero di volte. Di norma
una sequenza di 6bp. L'unit ripetitiva variabile da organismo a organismo ed detta telomero,
linsieme delle ripetizioni sono i telomeri, il DNA terminale viene detto perci DNA telomerico e
contiene solo ripetizioni di una sequenza esanucleotidica che si ripete in genere tra le 200 e le 300
volte. Dopodich i telomeri cos sintetizzati vengono ricoperti da speciali proteine dette proteine
che legano i telomeri e quindi le estremit, oltre ad essere fortemente eterocromatinizzate, vengono
associate a queste proteine che le chiudono come dei nodi, impedendo la perdita di materiale

genetico durante le fasi successive del ciclo cellulare. Ad ogni modo, un tratto di telomero resta
sempre a singolo filamento e, costituito da molte guanine e timine, si comporta come un RNA,
formando dei tetra-loop che annodano la parte estremamente terminale del DNA. Lunit telomerica
esanucleotidica umana GGGTTG.
La lunghezza dei telomeri si credeva in passato fosse legata alla giovinezza e allattivit della
cellula, pi lunghi nelle cellule giovani e corti in quelle senescenti. Inoltre, il numero stesso di
ripetizioni inibisce la telomerasi, per questo si arriva al massimo di 200-300. Nelle cellule pi
vecchie la telomerasi fortemente inibita e perci si credeva che laccorciamento dei telomeri fosse
implicato nellinvecchiamento cellulare. Furono condotti diversi esperimenti, anche finalizzati ad
aumentare la lunghezza di questi telomeri nelle cellule pi vecchie, ma ci si accorse che la
senescenza non dipende dalla lunghezza dei telomeri: infatti si scoperto che le cellule tumorali
presentano cortissimi telomeri (tant che perdono continuamente materiale genetico) ma sono
cellule sempre giovani e capaci di riprodursi.

Errori e danni nella replicazione


Le DNA Polimerasi hanno una certa capacit di impedire lincorporazione di errori nella sintesi del
DNA ma questa non eccessivamente efficiente. Perci nelle cellule, sia procariote sia eucariote,
esistono dei sistemi enzimatici che permettono di ridurre almeno di un fattore 1000 gli errori che
rimangono sul DNA dopo che esce dalla polimerasi. Questi sono detti sistemi di correzione dei
mismatches o sistemi di correzione degli errori di appaiamento. Quello che viene in seguito
descritto quello di E. coli, essendo ben conosciuto, ma si sa comunque che nelluomo i sistemi
sono molto articolati e mutazioni a carico di questi sistemi correlano con alcuni tipi di tumori tra i
pi frequenti, quali ad esempio quello del colon, della prostata o dellutero. Quando gli errori
sfuggono anche a questi sistemi, lerrore rimane nel genoma e diventa una mutazione.
Le mutazioni si distinguono principalmente in puntiformi e delezioni-inserzioni. Le prime si
distinguono in transizioni quando a una purina si sostituisce una purina o ad una pirimidina una
pirimidina, e in transversioni quando una purina sostituita da una pirimidina e viceversa. Le
delezioni e le inserzioni, che possono riguardare da uno a centinaia di migliaia di nucleotidi,
normalmente derivano da problemi di scivolamento della DNA-polimerasi quando copia delle
sequenze particolarmente difficili: se scivola in avanti, si avr la delezione di un determinato tratto
di DNA, che viene saltato; se scivola indietro, si avr linserzione di un tratto che viene ricopiato.
Sia le inserzioni sia le delezioni, se riguardano tre nucleotidi o un numero multiplo di tre,
naturalmente fino a una certa distanza, di norma non provocano particolari alterazioni a carico della
proteina che deve essere sintetizzata: infatti o introducono un gruppo di amminoacidi o lo eliminano
e, se questi non si trovano nel sito attivo o in un sito particolarmente importante, la proteina
funziona regolarmente. Quando la delezione o linserzione rappresentata da tre o multipli di tre
nucleotidi la sequenza, il frame di lettura, non modificato ma, se queste riguardano uno o due
nucleotidi, o un altro numero non multiplo di tre, allora si ha la completa alterazione dello schema
di lettura che pu portare ad una proteina anomala. Questa comunque solitamente non viene
prodotta perch in genere compaiono nella sequenza alterata dei codoni di stop prematuri e i
messaggeri che li contengono vengono degradati. Delezione e inserzione perci generalmente
correlano con lassenza della proteina.
A questo punto si distingua il concetto di errore e quello di danno: gli errori derivano da unerrata
incorporazione di nucleotidi da parte della DNA-polimerasi, e vengono corretti; i danni derivano da
vari agenti, perfino la stessa molecola dacqua, e vengono riparati. Si tratti ora il sistema di
correzione di E. coli (in questo procariote il sistema uno solo, nelluomo sono almeno otto), detto
Sistema Mut. Nelluomo invece i sistemi sono quello MSH, dall1 al 6 ( studiato principalmente
il 2 al cui malfunzionamento correlano alcuni tipi di tumore, come quello al colon) e poi i sistemi
MSL 1 e 2. Ne sono stati identificati comunque altri ma sono ancora in fase di ricerca. Il sistema
Mut formato da tre componenti MutS, MutL, MutH, e, infine, c un quarto componente che
eccezionalmente appartiene ai meccanismi di riparazione e non a quelli di correzione. Due subunit

uguali MutS si associano a formare una sorta di semiluna e, nel momento in cui il DNA
neosintetizzato esce dalla DNA-polimerasi, questo dimero si aggancia ad esso e comincia a valutare
la geometria della doppia elica per controllare la presenza di distorsioni, dovute proprio agli errori
di appaiamento. Se incontra una distorsione, poich c un appaiamento errato, allora il dimero
MutS si blocca sullerrore, idrolizza una molecola di ATP ad ADP sfruttando lenergia che si libera
per una sua modifica conformazionale, cos i gruppi chimici che prima esponeva vengono
mascherati e ne vengono esposti di altri, sia a sinistra sia a destra (i gruppi chimici sono gli stessi),
richiamando cos da entrambi i lati un altro componente, MutL. Questo pu associarsi quindi o a
destra o a sinistra del dimero. La posizione varia in relazione al fatto che MutL si associa sul DNA a
livello di unadenina (ma questa deve essere metilata). Il filamento parentale in E. coli mantiene le
adenine metilate, MutL si legher cos dal lato che presenta unadenina metilata pi vicina allerrore
e quindi al dimero MutS. Nel momento in cui MutL prende contatto con l'adenina metilata e con
MutS, cambia anchesso conformazione esponendo nuovi gruppi chimici che richiamano il terzo
componente, MutH che tender ad agganciarsi a MutL, il quale per occupa il filamento parentale,
quindi legher al filamento di nuova sintesi a livello di una timina. Con questo stratagemma il
sistema permette a MutH di riconoscere il filamento di nuova sintesi che contiene lerrore. MutH
una endonucleasi, quindi ha la capacit di idrolizzare il legame fosfoestereo o al 3 o al 5 e quindi
produrre un nick che pu essere prodotto a destra o a sinistra in base a dove legata. A questo punto
tutti e due si staccano e rimane il filamento neosintetizzato con una incisione ma il filamento
legato perch fino al mismatch ci sono i normali legami a idrogeno. Interviene quindi a denaturare
questi legami unelicasi che riparativa, UvrD. Essa quindi denatura il filamento tagliato fino
allerrore, il quale perci si separer da quello parentale o a destra o a sinistra. Viene poi degradato
ad opera di alcune esonucleasi cos da eliminare lerrore: se questa degradazione avviene a sinistra,
interviene la esonucleasi 7 che ha orientamento 5-3; se invece lincisione avvenuta a destra,
interviene la esonucleasi 6 che ha orientamento opposto, 3-5. In ogni caso, rester un gap che,
come avviene per i frammenti di Okazaki, viene ricostituito ad opera di una polimerasi, in questo
caso sempre la DNA Polimerasi III. In seguito la DNA-ligasi provveder a richiudere il nick che
rimane tra il 5 monofosfato e il 3 OH.
Per quanto comunque gli errori possano essere ridotti, una certa quantit rimane. Tutto il DNA
presente nelle cellule sottoposto in misura maggiore o minore ad agenti che possono alterare la
struttura delle basi, anche la stessa molecola dacqua. Ad esempio, proprio per effetto di questa una
citosina pu trasformarsi in uracile, che riconosciuto sempre come una base danneggiata sul
DNA; la guanina pu essere trasformata in una serie di intermedi che possono creare vari tipi di
legami a idrogeno, quindi comportarsi come se fosse una base tautomerica alternativa; una citosina
metilata pu addirittura trasformarsi in timina provocando una mutazione. Vi sono comunque tanti
altri composti che possono alterare le basi e quindi i legami a idrogeno che formano
nellappaiamento. Ad esempio la guanina pu subire ossidazione, alchilazione, deaminazione del
gruppo amminico in 2; questo comporta problemi nella complementariet dellappaiamento. Un
altro agente, questa volta fisico, che pu provocare una grave alterazione nel DNA, costituito dai
raggi ultravioletti. Questi possono agire sulle pirimidine ma particolarmente sulle timine adiacenti,
provocando la formazione di legami covalenti tra le due timine e la formazione di un anello
ciclobutanico: si formano cos dei dimeri di timina che perdono la capacit di complementarsi e
quindi si ha nella replicazione il blocco della forca replicativa. Questo pu portare alla morte
cellulare o addirittura alla modifica della cellula trasformandola in cellula tumorale. A questo tipo di
mutazioni dovuto il tumore della pelle (melanoma) provocato in seguito allazione di raggi UV.
Altre sostanze che possono provocare danni sono gli agenti intercalanti, un tempo utilizzati come
coloranti alimentari e fortemente cancerogeni, e i raggi X, che possono distruggere completamente
una base e anche lo zucchero, essendo fortemente ionizzanti, provocando dei danni che, se
eccessivi, non possono essere riparati. I sistemi di riparazione si distinguono essenzialmente in
due tipi: diretti e indiretti. Tra quelli diretti, il pi rappresentato tra tutti gli esseri viventi,
procarioti e eucarioti, il sistema per escissione, che consiste nel tagliare o la base danneggiata
singolarmente o pi spesso un tratto contenente i danni, che poi viene risintetizzato dagli enzimi di

riparazione e riunito dalla ligasi. Ci sono due tipi di DNA-ligasi negli eucarioti, quella di primo tipo
agisce durante la replicazione, quella di secondo tipo nella riparazione.
Se la cellula si trova in difficolt nella replicazione perch c un qualsiasi danno che blocca la
forca replicativa, allora la maggior parte delle cellule presenta dei cosiddetti sistemi di
translesione, DNA-polimerasi di translesione. Quando, ad esempio, in E. coli viene incontrato un
dimero di timina, lenzima di translesione subentra alla DNA-pol III e interviene introducendo
forzatamente due nucleotidi qualsiasi. Superato il danno, che verr poi riparato dai sistemi diretti,
ritorna la DNA-pol-III. Nei procarioti, questi enzimi introducono degli errori che la cellula
preferisce pur di permettere la sopravvivenza del filamento parentale, anche se col dimero di timina,
perch pu essere riparato ed essere trasmesso alle generazioni successive. Negli Eucarioti invece,
questi enzimi sono tantissimi e sono molto precisi, esiste cio un enzima per ogni tipo di danno che
blocca la forca replicativa e questi enzimi nel filamento in sintesi inducono forzatamente i
nucleotidi corretti, per esempio nel caso del dimero di timina introduce due adenine.

Lezione VIII

14/05/2012

Trascrizione nei Procarioti


Gli enzimi che determinano la sintesi dellRNA (quindi la sua trascrizione) si chiamano RNApolimerasi. Esiste una sola RNA-polimerasi nei procarioti che determina la trascrizione di tutti gli
RNA.
Le RNA polimerasi, negli eucarioti, sono quattro. La polimerasi IV unisoforma, uno splicing
alternativo molto particolare e articolato dellRNA-polimerasi mitocondriale che ha un suo gene sul
cromosoma 19 del genoma umano, una scoperta recente. Gi da tempo, invece, si sa che nei
vegetali ci sono quattro RNA-polimerasi, la II e la IV trascrivono i messaggeri alternandosi
vicendevolmente a seconda del tipo di sequenze di regolazione che sono a monte di ciascun gene e
a seconda dei fattori di trascrizione che vanno a riconoscere queste sequenze e i relativi consensi.
Gli RNA pi comuni che vengono trascritti dalle diverse RNA-polimerasi sono gli RNA
ribosomiali che partecipano alla costruzione dei ribosomi e, in particolare, gli RNA ribosomiali pi
grandi, in entrambi gli organismi, hanno anche due porzioni che funzionano da riboenzimi. Il
ribosoma non ha bisogno di enzimi esterni per poter svolgere le proprie attivit catalitiche ma
queste attivit vengono svolte direttamente dagli RNA che li compongono.
Nei procarioti vi sono tre tipi di RNA ribosomiali, che sono il 5S (si indicano con il coefficiente di
sedimentazione), il 16S e il 23S. Il 23S svolge una duplice funzione: oltre a contribuire alla
costruzione della struttura dei ribosomi, presenta anche due specifiche attivit riboenzimatiche.
Per quanto riguarda gli eucarioti, si conoscono quattro RNA ribosomiali, il 5S, il 5.8S, il 18S, il
28S. Anche il 28S, analogamente al 23S, presenta due porzioni che funzionano da riboenzimi. Negli
eucarioti, gli RNA ribosomiali 5.8S, 18S e 28S sono i veri e propri RNA ribosomiali, vengono
trascritti dallRNA-polimerasi I, i relativi geni si trovano su cinque cromosomi e questi geni si
portano in una regione del nucleo che prende il nome di nucleolo. Invece, lRNA ribosomiale 5S
associato agli RNA transfert e viene trascritto dalla RNA-polimerasi III ed ha delle sequenze di
regolazione molto particolari che lo contraddistinguono.
Tra gli altri RNA v' lRNA messaggero, sia nei procarioti sia negli eucarioti, e, in particolare, negli
eucarioti trascritto dalla RNA-polimerasi II, tranne alcuni messaggeri che sono trascritti, in
determinate circostanze di emergenza, dalla RNA polimerasi IV.
Infine vi sono gli RNA transfert che vengono trascritti dallRNA-polimerasi III e presentano, come
gli RNA ribosomiali 5S, particolari sequenze di regolazione.
Le RNA-polimerasi III e II trascrivono anche altri RNA che servono per la maturazione del
messaggero e degli RNA ribosomiali. I primi si chiamano piccoli RNA nucleari o snRNA, i secondi
si chiamano invece piccoli RNA nucleolari e si indicano con la sigla snoRNA (vengono trascritti in
parte dalla RNA-polimerasi III e in parte dalla RNA-polimerasi II). La RNA-polimerasi III quella

pi versatile perch non in grado di trascrivere solo gli RNA su elencati ma anche una
grandissima variet di altri RNA che sono stati recentemente identificati e, per molti di questi
particolari RNA che sono presenti nella cellula, non si conosce assolutamente la funzione. Ad
esempio, nell'uomo c un RNA il D200 che sembra regolare alcuni geni coinvolti nel processo
della memoria e alterazioni nella trascrizione di questo particolare RNA sembrano correlare
fortemente con lAlzheimer.
Dai diversi geni che sono presenti sul DNA, attraverso il processo della trascrizione, vengono
generati tutti gli RNA che sono coinvolti nella sintesi delle proteine. Gli RNA di cui sopra, fatta
eccezione per lultimo (quelli particolari che vengono trascritti dallRNA-polimerasi III),
concorrono nel determinare il trasferimento e la traduzione del messaggio molecolare contenuto nei
geni che codificano per le proteine nella relativa proteina. LmRNA contiene il messaggio, gli rRNA
costituiscono il macchinario di sintesi delle proteine, mentre i tRNA funzionano da decodificatori
del messaggio biologico in messaggio chimico cio nella relativa proteina. Gli altri RNA (snRNA e
snoRNA) servono per la maturazione del messaggero e degli RNA ribosomiali.
Analogamente alla replicazione, a livello delle sequenze di regolazione, in ogni gene
(indipendentemente dal tipo di gene), si deve verificare lapertura della doppia elica e, in questo
caso, la denaturazione della doppia elica. Si ricordi che per gene non s'intendono solamente quelli
che codificano per le proteine ma un qualsiasi tratto di DNA che presenta una sua specifica
sequenza di regolazione e da cui deriva la sintesi di un determinato RNA, quindi pu essere anche
un RNA che non codifica per una proteina, come ad esempio lRNA transfert e lRNA ribosomiale,
e, in questo caso, quando vi sono geni che codificano per questi tipi di RNA strutturali, li
chiamiamo ncRNA cio non codificanti RNA. LmRNA lunico che trasferisce
uninformazione, nel caso degli eucarioti, dal nucleo al citoplasma per la traduzione; nel caso dei
procarioti direttamente perch trascrizione e traduzione avvengono contemporaneamente per
lassenza di una membrana nucleare. Anche in questo caso la denaturazione si verifica sempre in
modo meccanico a livello di sequenze particolarmente ricche in adenina e timina. Nel momento in
cui la doppia elica si apre, si viene a formare la cosiddetta bolla trascrizionale e ad unintera bolla
trascrizionale si aggancia una sola RNA-polimerasi. Quindi il processo della trascrizione differisce
dai meccanismi replicativi: dallapertura della doppia elica, infatti, si formano due forche
replicative. Nel caso della trascrizione, dallapertura della doppia elica si forma una sola bolla
trascrizionale che proceder nel senso di progressione del gene (e ci sono delle proteine che
indicano allRNA-polimerasi la direzione del gene).
LRNA nasce sempre a singolo filamento. Il filamento che funge da stampo sempre quello che va
da 3 a 5 e quindi il messaggero avr la stessa precisa sequenza del filamento 5 -3 che si chiama
filamento non stampo (o non template). Durante la sintesi, lRNA nascente rimane attaccato allo
stampo di DNA per un tratto non molto grande, variabile dai 6 ai 8, a volte anche 10 nucleotidi,
formando quindi un ibrido RNA-DNA ma sempre allinterno dellRNA polimerasi; dopodich si
stacca dal DNA stampo e quindi fuoriesce prendendo quella che deve essere la sua via e quindi il
suo destino. Questa lunica differenza (a parte i nucleotidi, ribonucleotidi al posto di
desossiribonucleotidi, luracile al posto della timina) che esiste tra la trascrizione e la replicazione
perch il resto cio laggancio dei ribonucleotidi allinterno del sito attivo dellRNA-polimerasi
avviene con le stesse identiche modalit della DNA-polimerasi, ossia ionizzazione dellossidrile in
3 del ribonucleotide precedentemente incorporato e attacco nucleofilo sul fosfato in del
nucleotide entrante, gi perfettamente complementarizzato con la base presente sullo stampo di
DNA; quindi eliminazione di pirofosfato, anche in questo caso, nel sito attivo della RNApolimerasi. Saranno presenti due cationi metallici che sono, in questo caso, tutti e due cationi
magnesio. Il primo serve per destabilizzare lossidrile in 3, il secondo serve invece per coordinare il
pirofosfato che si libera dalla reazione ed esibirlo cos alla pirofosfatasi. I due cationi che
coordinano il pirofosfato, nella RNA-polimerasi e nella DNA-polimerasi presentano una lieve
differenza: mentre la DNA-polimerasi esibisce immediatamente il pirofosfato alla pirofosfatasi
affinch avvenga la degradazione in fosfati inorganici, nel caso dellRNA-polimerasi,
principalmente nei procarioti, sembra che il catione magnesio ritardi lievemente in questa sua

azione di esibire il pirofosfato alla pirofosfatasi e quindi, il pirofosfato, dopo lavvenuta formazione
del legame fosfoestereo a 3, rimane per una frazione di secondo in pi rispetto al pirofosfato che si
libera, invece, allinterno del sito attivo della DNA-polimerasi. Quindi c un lieve ritardo
nellesibire questo pirofosfato alla pirofosfatasi. Altra differenza che le RNA-polimerasi, a
differenza di tutte le DNA-polimerasi, hanno la capacit di incorporare autonomamente il primo
ribonucleotide, nel momento in cui inizia la trascrizione. Gli unici legami che legano questo
ribonucleotide allo stampo di DNA sono legami a H e, siccome nella maggior parte dei casi il primo
nucleotide che viene incorporato unadenina e quindi sullo stampo di DNA c una timina, ci sono
solamente due legami a H quindi molto deboli. Nel sito attivo dellRNA-polimerasi ci sono tutta
una serie di aminoacidi i cui gruppi chimici laterali devono contribuire a mantenere correttamente in
sede il primo nucleotide che viene incorporato, altrimenti si inclinerebbe da un lato o dallaltro o
verso il basso o verso lalto, quindi lossidrile in 3 non potrebbe essere correttamente allineato con
il fosfato in del secondo nucleotide che sar incorporato. lambiente del sito attivo dellRNApolimerasi che mantiene perfettamente in sede e quindi ben posizionato sullo stampo il primo
nucleotide che viene incorporato. Queste sono le uniche differenze tra la replicazione e la
trascrizione.
LRNA-polimerasi dei procarioti unica e da sola in grado di riconoscere tutte le sequenze di
regolazione e trascrivere tutti gli RNA che sono necessari per il funzionamento della cellula
batterica. LRNA-polimerasi batterica formata da quattro subunit solamente contro le moltissime
subunit che invece formano le RNA-polimerasi eucariotiche, fatta eccezione per la IV che
formata da una sola subunit, cio da una sola proteina. Sono presenti due subunit uguali chiamate
, ciascuna ha una dimensione di 40 KDa e servono per lassemblaggio della RNA-polimerasi
batterica; poi sono presenti due subunit pi grandi e tra loro lievemente differenti che sono dette
subunit e subunit . La subunit ha una dimensione di 155 KDa mentre la subunit ha una
dimensione di 160 KDa. Queste due subunit ( e ) formano il sito attivo, cio la parte pi
importante dellRNA-polimerasi batterica. Tutte e quattro insieme, le subunit formano il core
enzimatico che lenzima che effettivamente esegue la trascrizione. Per, prima che inizi la
trascrizione, come in tutti gli organismi, necessario che il core enzimatico dellRNA-polimerasi
venga posizionato correttamente al livello del primo nucleotide che deve essere trascritto, di
qualsiasi gene. Nei procarioti v' una quinta subunit il cui compito esclusivamente posizionare
correttamente la RNA-polimerasi batterica a livello della sequenza di regolazione. Questa subunit
si chiama e pu avere una dimensione compresa tra 32 e 90 KDa. Questo significa che, in effetti,
nelle cellule batteriche vi sono molte subunit di dimensioni differenti, ciascuna delle quali in
grado di legarsi sempre allo stesso core enzimatico formato dalle prime quattro subunit. Questo
accade perch i diversi geni (che sono organizzati in operoni nei batteri) presentano diverse
sequenze di regolazione e queste diverse sequenze di regolazione possono essere riconosciute da
diverse subunit . Quindi, una subunit da 32 KDa in grado di riconoscere determinate
sequenze di regolazione che appartengono a determinati geni. Quella da 50 KDa riconosce, invece,
altre sequenze di regolazione che appartengono ad altri geni. Quella da 70 KDa, che la pi
comune, riconosce, invece la maggior parte dei promotori della maggior parte delle sequenze di
regolazione degli operoni e quindi dei geni che codificano per le proteine. C anche una subunit
pi grande, da 90 KDa, in grado di riconoscere altre sequenze di regolazione con consensi diversi e
che appartengono ad altri geni. Quindi, a seconda del tipo di gene che deve essere trascritto, il core
enzimatico, che sempre lo stesso, andr ad agganciarsi ad una diversa subunit la quale sar in
grado di posizionare questo core enzimatico a livello del primo nucleotide di uno specifico gene.
Le RNA-polimerasi procariotiche e quelle eucariotiche, anche se sono formate da proteine diverse
(anche in termini di numero), alla fine, acquisiscono la stessa struttura tridimensionale e quindi
funzionano tutte allo stesso modo. Le RNA-polimerasi batteriche hanno la forma di una chela di
granchio, con una pinza superiore molto grande ( molto grande soprattutto negli eucarioti). Le
due pinze, superiore ed inferiore, determinano la formazione di un canale attraverso il quale entra il
DNA a doppio filamento perch la denaturazione del DNA si verifica direttamente allinterno
dellRNA-polimerasi, in tutti gli organismi. Questo canale prende il nome di canale downstream,

alla base del quale presente il sito attivo dove avviene la reazione. Dopo ci sono altri quattro
canali di entrata ed uscita. A livello della pinza maggiore presente un canale che prende il nome di
NTP (nucleotide trifosfato) attraverso il quale entrano, dalla pinza maggiore, i ribonucleotidi
trifosfati necessari per la sintesi dellRNA. Poi sono presenti anche tre canali molto semplici: il
canale T (template), da cui fuoriesce, a singolo filamento, il filamento di DNA che ha funzionato da
stampo, cio il filamento reverse; poi c il canale NT (non template) dal quale, invece, fuoriesce
quel filamento di DNA che non ha funzionato da stampo. Una volta che questi due filamenti
(template e non template) fuoriescono, si ricomplementarizzano riformando lintera molecola di
DNA a doppio filamento. Ovviamente c un canale, che il canale exit, da cui fuoriesce lRNA
neosintetizzato. Le dimensioni del canale exit sono tali da permettere la fuoriuscita di un singolo
filamento di acido ribonucleico che lRNA che nasce sempre a singolo filamento e fuoriesce dal
canale exit sempre a singolo filamento, quindi le dimensioni del canale exit sono compatibili
esclusivamente con un singolo filamento e questo indica che strutture complesse non possono
fuoriuscire o, se fuoriescono, provocano delle alterazioni a carico dellRNA-polimerasi. La subunit
, eccezionalmente, nonostante sia una proteina procariotica, divisa in quattro domini, ciascuno in
grado di svolgere una sua specifica funzione (i quattro domini si indicano con i numeri romani): v'
il dominio I, il dominio II, il dominio III e il dominio IV. Il dominio I, quando ancora lRNApolimerasi, si deve posizionare sul DNA, si trova allinterno del canale downstream per proteggerlo.
Il canale downstream formato da aminoacidi fortemente basici e questo perch, essendo il DNA
una molecola acida, con i legami elettrostatici che si formano, mantiene rilassata la molecola del
DNA stesso.
La I, quando non c il DNA, mantiene protetto il canale downstream ed formata da aminoacidi
prevalentemente acidi perch deve emulare una molecola di DNA. La III lunico dominio della
subunit in grado di prendere contatto, mediante speciali legami a ponte idrogeno ed elettrostatici,
con il core dellRNA-polimerasi, quindi il dominio che tiene lRNA-polimerasi legata alla
subunit ( lunica parte della subunit che tiene unita questa subunit allintero core
enzimatico).
A monte di ogni operone, sono presenti delle sequenze di regolazione che, sia nei procarioti sia
negli eucarioti, prendono il nome di promotori e, allinterno di ogni promotore (molto corto nei
procarioti, molto ampio negli eucarioti), sono presenti dei consensi che vengono riconosciuti da
specifiche proteine. In ogni gene, sia esso procariote o eucariote, il primo nucleotide che viene
trascritto viene indicato come +1, i successivi nucleotidi (sempre trascritti) vengono indicati sempre
con i numeri progressivi (+2, +3, +10, +250, +2500 ecc). Quando, ad esempio, si trova loperone
del triptofano (nucleotide +250), si tratta del nucleotide che si trova allinterno delloperone in
posizione 250 rispetto al primo nucleotide che viene trascritto e che, ovviamente, viene copiato
nella molecola di mRNA. Invece, se si considerano i nucleotidi del promotore, questi vengono
indicati sempre con i numeri arabi per con segno opposto (quindi meno). Se si va quindi a monte e
si legge da destra verso sinistra, dopo il nucleotide +1 si trova il nucleotide -1, poi il -2, il -3, il -4, il
-5 ecc. Le sequenze negative non vengono trascritte nellRNA quindi servono solamente come
sequenze di regolazione, per regolare sia il corretto funzionamento della RNA-polimerasi ma anche
per regolare la trascrizione stessa (come avviene, ad esempio, nella sequenza di regolazione
delloperone del lattosio). Se, ad esempio, nel gene della -actina, nelluomo, e ci si riferisce al
nucleotide -970, s'indica il novecentosettantesimo nucleotide a monte (e quindi che si trova nel
promotore) del gene che codifica per la -actina e quindi un nucleotide che pu funzionare
esclusivamente da nucleotide di regolazione, che pu far parte di un determinato consenso
riconosciuto da determinate proteine che, oltre a favorire il corretto posizionamento dellRNApolimerasi (in questo caso la II eucariote sul promotore), regola anche il processo di trascrizione
quindi la velocit. Se deve avvenire la trascrizione, se non deve avvenire, se devono avvenire delle
modifiche genetiche, se il gene si deve chiudere, se si deve allentare o quando si deve chiudere o
quando si deve allentare, comunque il -970nt favorisce il corretto posizionamento dell'RNA. Ma i
nucleotidi che fanno parte del promotore non si troveranno mai trascritti nel relativo messaggero. Il
messaggero parte sempre dal nucleotide +1. Neanche nei procarioti, ovviamente, corrisponde al

nucleotide nello stampo. Il classico promotore procariote pu avere una lunghezza variabile ma,
allinterno, contiene solamente due consensi, entrambi formati da sei coppie di basi. Il primo
consenso si trova a partire dal nucleotide -10, ha un suo specifico nome, chiamato consenso -10.
Un po pi a monte, presente il secondo consenso (che tra laltro il pi importante) formato
anchesso da sei nucleotidi che sono variabili da promotore a promotore, parte dal nucleotide -35 e
viene chiamato consenso -35. Il consenso -10 praticamente uguale in tutti i promotori, formato
da adenine e da timine. Il consenso -35 specifico di ogni promotore e viene riconosciuto da una
determinata subunit . In alcuni casi, come ad esempio nel caso del promotore del lattosio, il
consenso -35 pu essere difettoso e quindi non consentire un corretto posizionamento della RNA
polimerasi che fa fatica ad agganciarsi con il sito attivo sul primo nucleotide che deve essere
trascritto. Quando il consenso -35 difettoso, di norma, presente, ancora pi a monte, un altro
consenso che si chiama elemento a monte o UP elemento, a cui si lega direttamente la RNA
polimerasi core tramite le porzioni carbossi-terminale delle due subunit che si chiamano coda carbossi-terminale. LUP elemento ha lo scopo di aiutare il corretto posizionamento della RNApolimerasi, si lega la porzione carbossi-terminale della subunit del core proteico. Porzioni
carbossi-terminale che ne formano praticamente una sola lineare che viene detta coda -carbossiterminale ( perch formata dalle porzioni carbossi-terminali delle due subunit identiche).
Lelemento a monte funziona anche da elemento di regolazione.
In altri casi, invece, la sequenza -35 e lelemento a monte non ci sono, mancano, mentre si trova
una sequenza a -10 pi grande e questo pezzettino in pi che presente rispetto alle adenine e alle
timine permette a determinate subunit di posizionare correttamente la RNA-polimerasi core.
La subunit ha la forma quasi di una sella, di una semiluna e con i due domini 2 e 4 in grado di
allinearsi perfettamente con i due consensi -10 e -35 e, precisamente, la II in grado di riconoscere
la sequenza -10 e di posizionarsi su di essa. La II riconosce la sequenza -10 ma non entra nel solco
maggiore, rimane solamente sullo scheletro di zucchero-fosfato quindi instaura solamente dei
legami idrogeno o elettrostatici con lo scheletro di zucchero-fosfato ma non penetra nel solco
maggiore. Il legame tra la -10 e la II un legame aspecifico; invece la IV in grado di riconoscere
la sequenza -35 e, in questo caso, essendo questa sequenza diversa, ci saranno diversi domini IV in
grado di riconoscere ciascuno la propria sequenza. Al contrario, il legame tra la IV e il consenso -35
un legame altamente specifico perch la IV penetra nel solco maggiore instaurando legami con le
basi (cos come visto precedentemente). Tutte le proteine che sono in grado di interagire con il solco
maggiore del DNA presentano dei motivi particolari. Questi motivi sono cinque. In questo caso, il
motivo posseduto dalla IV in grado di entrare nei solchi maggiori del DNA a livello del consenso
-35 si dice essere un motivo elica-giro-elica ed uno dei cinque motivi proteici in grado di
riconoscere il DNA. Nel momento in cui la IV penetra in modo specifico nel solco maggiore -35,
mentre la II si appoggia semplicemente sulla sequenza -10, succede che tutto il peso della RNApolimerasi (compresa la subunit ) sbilanciato sulla sequenza -10 e questo peso quello che
determina la solita deformazione conformazionale che provoca lapertura meccanica della doppia
elica a livello della sequenza -10 l dove, ovviamente, ci sono solo adenine e timine che tengono
unito il DNA. Nei batteri la denaturazione avviene dal nucleotide -10 al nucleotide +3 e rimane
sempre lo stesso, sono sempre 14 coppie di basi aperte e la bolla trascrizionale, nei procarioti,
sempre, per tutta la trascrizione, di 14 nucleotidi aperti: vale a dire, mentre viene denaturata una
coppia in avanti per essere copiata, viene rinaturata una coppia allindietro (quindi la bolla
trascrizionale, sempre allinterno della RNA-polimerasi, rimane sempre di 14 nucleotidi). In questo
caso non sono necessarie proteine SSD perch ovviamente il DNA a singolo filamento si trova
allinterno della RNA-polimerasi e quindi non ha bisogno di essere protetto perch gi protetto
dalla RNA-polimerasi stessa. N sono necessarie delle elicasi per denaturare il legame a idrogeno
tra le coppie di basi perch ciascuna coppia di basi, luna dopo laltra, vengono denaturate da una
propriet intrinseca alla RNA-polimerasi stessa (si riferisce anche agli eucarioti).
Il processo di trascrizione che valido anche per gli eucarioti (in termini di step) avviene in quattro
fasi: una fase che la pi critica la fase di pre-inizio, poi ci sar la fase di inizio che un flash,
quindi una fase di allungamento ed infine una fase di terminazione.

La fase di pre-inizio la fase pi complicata perch quella che deve permettere il corretto
posizionamento della RNA-polimerasi sul promotore. Nel caso del promotore batterico non ci sono
problemi perch la direzionalit del gene viene esclusivamente individuata dai due consensi, nel
senso che, leggendo da sinistra verso destra, s'incontrano prima la -35 poi la -10 quindi, in questo
contesto, la subunit sa come orientarsi perch la 4 deve riconoscere la -35 e la 2 la -10 e quindi
in grado di orientare in modo appropriato la RNA-polimerasi batterica. Negli eucarioti invece, il
problema molto pi complicato. La subunit , dopo aver agganciato il core della RNApolimerasi e quindi aver formato il complesso oloenzimatico, si avviciner al promotore e le due
porzioni della subunit , 4 e 2, si legano al promotore stesso. Nel momento in cui la RNApolimerasi arriva sul promotore, il promotore, con i semplici legami della IV che lappoggio sulla
sequenza -10 della II, il primo nucleotide che deve essere trascritto si trova perfettamente al centro
del sito attivo e quindi pu subito arrivare il nucleotide.
In queste condizioni si viene a formare il complesso binario chiuso (binario perch formato solo
da due componenti: lRNA-polimerasi e il DNA che ancora non si aperto) che un complesso
reversibile, nel senso che, in determinate circostanze, se la cellula lo ritiene opportuno, la RNApolimerasi si pu staccare dal promotore. Una volta che si forma il complesso binario chiuso, in
seguito a questa deformazione conformazionale indotta dallintero complesso della RNA-polimerasi
sul consenso -10, si verifica lapertura della doppia elica del DNA con la formazione della bolla
trascrizionale. Lapertura avviene dal nucleotide -11, -10 fino al nucleotide +3 per un totale di 14
nucleotidi aperti che rimangono sempre tali. In questo caso si viene a formare il cosiddetto
complesso binario aperto (binario perch c' sempre solo il DNA aperto e la RNA-polimerasi, non
ci sono altre componenti) e, nel momento in cui si forma, la RNA-polimerasi batterica subisce una
modifica conformazionale per cui le pinze, superiore e inferiore, come se si chiudessero sulla
doppia elica del DNA a livello del canale downstream. Questo processo, che non richiede consumo
di energia, un processo spontaneo e prende il nome di isomerizzazione della RNA-polimerasi
batterica. Per, nel momento preciso in cui avviene lisomerizzazione la RNA-polimerasi, ancora
perfettamente ancorata, tramite la subunit , a livello del promotore, comincia a introdurre il primo
nucleotide, il secondo nucleotide, ecc..., cio inizia il processo della trascrizione. Per non si
ancora in fase di inizio perch, quando lRNA-polimerasi arriva a polimerizzare circa 8 o al
massimo 9 ribonucleotidi di RNA, ha la necessit di denaturare degli ulteriori nucleotidi, quindi +4,
+5, +6 e quindi di muoversi sul DNA ma non lo pu fare perch ancora associato alla subunit
che la tiene ancorata sul promotore. Quindi, in questo caso, necessario che ci sia una sincronia tra
la polimerizzazione dei vari ribonucleotidi e la sua capacit di riuscire a staccarsi dalla porzione
quindi dallintera subunit che rester sempre sul promotore e solo quando riuscir a staccarsi
dalla subunit si passer dalla fase di inizio alla fase di allungamento, per questo flash, perch
durante questa fase di inizi particolari, se viene sintetizzato lRNA ma lRNA polimerasi non riesce
a staccarsi dalla subunit , non pu andare avanti, quindi rilascia lRNA appena sintetizzato e
ricomincia daccapo senza muoversi dal DNA aperto quindi si passer dal complesso binario aperto
al complesso ternario aperto perch in questo caso, oltre al DNA aperto e alla RNA polimerasi,
avremo anche lRNA aperto seppure questo RNA, per pi di una volta, verr rilasciato cio si
avranno degli inizi abortivi. Dopo una serie di inizi abortivi, nel momento in cui lRNA polimerasi
riesce ad introdurre correttamente il nono ribonucleotide ed entra in sincronia con la sua capacit di
staccarsi dalla 3, viene introdotto il nono nucleotide, si stacca dalla III, riesce a denaturare la
quarta coppia di desossiribonucleotidi sul DNA e quindi riesce ad introdurre il decimo nucleotide.
Con lintroduzione del decimo nucleotide si passa dalla fase di inizio alla fase di allungamento
quindi poi sar denaturata la quinta coppia, introdotto lundicesimo nucleotide mentre allindietro
saranno via via denaturati lundicesima coppia, la decima coppia, la -9, la -8, la -7 ecc in modo che
la bolla trascrizionale sia sempre di 14 nucleotidi. Nel momento in cui si passa dalla fase di inizio
alla fase di allungamento, possibile registrare la capacit dellRNA-polimerasi di introdurre il
decimo nucleotide e staccarsi dalla subunit la quale resta sul promotore ma ci resta per poco
perch, senza la RNA-polimerasi, perde affinit e quindi si stacca per legarsi ad un altro core
enzimatico e quindi riprendere un nuovo ciclo. Mentre la RNA-polimerasi, solo come core (cio

formata dalle 4 subunit di cui abbiamo detto), va ad allungare la trascrizione stessa e quindi a
sintetizzare quello che lRNA.
Ovviamente, durante il processo di allungamento, molte proteine si associano alla RNA-polimerasi
batterica. Non si conosce leffettiva funzione di tutte ma di una di queste, la proteina GRE, nota.
Nella fase di allungamento (cio di sintesi dellRNA) lRNA, per circa 6-8, nucleotidi rimane
attaccato allo stampo di DNA formando un ibrido RNA-DNA; dopo 8 nucleotidi si stacca dalla
stampo e intraprende il canale, comincia ad entrare attraverso il canale exit per fuoriuscire
dallRNA-polimerasi. Si tratta ovviamente di un RNA messaggero. Appena fuori dal canale exit, si
trover proprio sul ribosoma che inizier anche la traduzione che, nei procarioti, non solo avviene
contemporaneamente alla trascrizione ma addirittura inizia prima che si sia completata la
trascrizione stessa. I ribonucleotidi possono contenere delle basi tautomeriche alternative, quindi la
RNA-polimerasi pu essere ingannata e quindi anche nellRNA in crescita possono essere
introdotti nucleotidi errati e questa una cosa che nessuna cellula pu tollerare, soprattutto se si
tratta del messaggero perch ci sono alte probabilit che un eventuale errore di incorporazione alteri
completamente il messaggio, anche se il codice genetico degenerato, quindi non sempre la
presenza di un nucleotide al posto di un altro altera laminoacido che deve essere sintetizzato.
Siccome gli errori non sono tollerati, la geometria dellibrido RNA-DNA, allinterno del sito attivo,
viene adeguatamente controllata e, se c un errore di appaiamento, questo errore viene
riconosciuto. La proteina che, associandosi allRNA-polimerasi, in grado di valutare la corretta
geometria dellibrido RNA-DNA la proteina GRE la quale, eventualmente, induce quei tipi di
correzione che, nel caso della RNA-polimerasi, un processo di editing dellRNA (correzione ed
editing dellRNA sono la stessa cosa), da non confondere con un altro processo che si chiama
invece RNA-editing, ossia si edita lRNA e si cerca di correggere gli eventuali errori. Nei procarioti
sono stati identificati due tipi di correzione: un primo tipo detto editing-pirofosforolitico, il
secondo tipo detto editing-idrolitico. Se il nucleotide appena entrato (ovviamente errato) torna
immediatamente nella sua forma tautomerica normale, avviene come nel caso della DNApolimerasi, ossia lossidrile disallineato rispetto al fosfato in del ribonucleotide entrante e quindi
non pu avvenire lattacco nucleofilo e quindi la formazione del legame fosfo-estereo in 3 ; in
questo caso per, il secondo catione metallico non esibisce prontamente il pirofosfato alla
pirofosfatasi quindi, nel momento in cui lultimo nucleotide stato incorporato errato e torna nella
sua forma tautomerica normale e quindi disallinea il suo ossidrile in 3 , c ancora il pirofosfato,
quindi la cellula sfrutta questo pirofosfato che in grado di esercitare una reazione inversa mediante
lossigeno ionizzato del fosfato il quale esercita un attacco nucleofilo sul legame fosfo-estereo a 3
e quindi riforma nuovamente un nucleotide trifosfato staccandolo dallRNA in crescita e quindi quel
nucleotide che era stato incorporato nella sua forma tautomerica alternativa e che poi tornato nella
sua forma tautomerica normale, riesce mediante un attacco da parte del suo stesso pirofosfato
perch il secondo catione magnesio, allinterno del sito attivo dellRNA-polimerasi, non lo esibisce
subito alla pirofosfatasi e quindi esercita una reazione inversa e stacca questo nucleotide errato.
Quindi lediting pirofosforolitico in pratica una reazione inversa alla reazione di polimerizzazione
grazie al fatto che il pirofosfato mantenuto per un periodo lievemente maggiore allinterno del sito
attivo. Se, invece, il nucleotide torna nella sua forma tautomerica normale dopo che stato
incorporato, il successivo nucleotide quindi si potr trovare in seconda, in terza, in quarta posizione
rispetto allibrido DNA-RNA e allora, in questo caso, ovviamente rimarrebbe un errore e questa
alterazione nella geometria della doppia elica del DNA viene riconosciuta dalla proteina GRE.
Quindi, quando il nucleotide errato, non potr essere incorporato il successivo, c il pirofosfato
che idrolizza questo legame e fa fuoriuscire questo nucleotide come nucleotide trifosfato. Se,
invece, il nucleotide torna nella sua forma tautomerica alternativa, quando si trova, ad esempio, gi
al terzo o al quarto posto, ovviamente si rompono subito i legami idrogeno con la base presente
sullo stampo di DNA e quindi, tra il nucleotide dellRNA e quello del DNA, si forma un errore di
appaiamento, unalterazione della geometria dellibrido DNA-RNA. In questo caso, quindi, la
proteina GRE riconosce questa alterazione e richiama una specifica endonucleasi che andr a
tagliare tutto lRNA che si trova, a doppio filamento, incorporato con lo stampo di DNA quindi

viene eliminato anche il nucleotide errato che si trova sullRNA. La RNA-polimerasi scivola
indietro e ricomincia da dove era avvenuto il taglio. Questo lediting idrolitico. Quindi, in questo
modo, con uno dei due sistemi, la cellula batterica garantisce che la sequenza di nucleotidi presente
sul messaggero sia esattamente uguale a quella presente sul DNA, quindi non ci siano errori. Anche
negli eucarioti avviene qualcosa del genere ma, allo stato attuale, stata individuata una sola attivit
di editing, molto simile allediting idrolitico ma molto pi complicato (tutti e due i tipi di editing
avvengono sempre allinterno della bolla trascrizionale).
Arrivati alla fine delloperone, nei procarioti, sono presenti specifiche sequenze di terminazione
che si chiamano terminatori, dei quali ne esistono due tipi: i terminatori che si trovano tra un gene
e laltro allinterno dello stesso operone e che possono essere bypassati e si chiamano terminatori
rho dipendenti; laltro terminatore si trova sempre alla fine di ogni operone e non pu essere mai
bypassato, quindi, quando c questo terminatore, la trascrizione finisce sempre. Il terminatore
costituito da due sequenze uguali ma invertite e si chiamano palindromiche e sono separate da una
porzione variabile ma, dopo la seconda ripetizione, ci sono una serie di adenine sul filamento.
Quando lRNA-polimerasi ci passa sopra, succede che, arrivata alle adenine, le adenine vengono
accoppiate agli uracili, quindi lultimo tratto di 6-8 nucleotidi di RNA rimane attaccato allo stampo
solo mediante legami a idrogeno tra adenine e uracili che sono un po pi deboli rispetto ad adenine
e timine, mentre le due ripetizioni invertite formano gi a livello del sito attivo, una sorta di stemloop, quindi una struttura secondaria. A questo proposito sono state proposte due teorie (perch
nessuno riuscito ad entrare nella RNA-polimerasi batterica mentre sta funzionando per vedere
effettivamente come questi terminatori provocano la terminazione della trascrizione): secondo la
prima teoria, nel momento in cui si viene a formare lo stem-loop (cio una struttura pi pesante
allinterno del sito attivo dellRNA-polimerasi) e lRNA legato al DNA solo mediante legami tra
adenine e uracili, succede che lo stem-loop crea una sorta di peso che forzatamente stacca tutto
lRNA dallo stampo di DNA; con questo distacco, lRNA-polimerasi, in assenza di RNA sullo
stampo, si stacca immediatamente dallo stampo e termina la trascrizione. Quindi, secondo questa
prima teoria, proprio lo stem-loop con il suo peso che, staccando lRNA dallo stampo, provoca la
terminazione della trascrizione. Secondo laltra teoria, si deve tener conto del canale exit che ha
delle dimensioni che permettono ad un solo filamento di RNA di fuoriuscire ma, siccome si forma
lo stem-loop, nel momento in cui lo stem-loop sta per uscire dal canale exit, provoca una dilatazione
del canale exit e quindi un disassemblaggio di quelli che sono i contatti tra le quattro subunit
dellRNA-polimerasi batterica. In pratica lo stem-loop, fuoriuscendo dal canale exit, disassembla la
RNA-polimerasi e conseguentemente provoca la terminazione della trascrizione. Queste teorie sono
entrambe valide perch sia il peso sia lalterazione della struttura, il disassemblaggio delle quattro
subunit dellRNA-polimerasi sono fondamentali per provocare la terminazione irreversibile della
trascrizione. Invece, tra un gene e laltro di un operone sono presenti particolari sequenze che si
chiamano sequenze RUT e sono formate da sei coppie di basi. La sequenza RUT, sul DNA, non
riconosciuta da nessuno, riconosciuta solo se si trova sotto forma di RNA. Quando la RNApolimerasi batterica passa sulla sequenza RUT, la copia nellRNA e quando questa sequenza RUT
fuoriesce dal canale exit, viene immediatamente riconosciuta da una proteina esamerica che si porta
dietro molecole di ATP e si chiama proteina che una elicasi, e si va a legare alla sequenza RUT
sullRNA (lRNA appena uscito dallRNA-polimerasi): come se inseguisse la RNA-polimerasi,
idrolizza molecole di ATP e rompe tutti i legami idrogeno a livello dellibrido RNA-DNA, quindi
lRNA si stacca dal DNA e conseguentemente la RNA-polimerasi, in assenza di RNA legato allo
stampo di DNA, termina la trascrizione e si stacca. Per esempio, nelloperone del lattosio, costituito
da tre geni, dopo che viene trascritto il primo gene, si stacca la RNA-polimerasi, quindi viene
trascritto il primo gene e non gli altri due ma, se sono necessari tutti e tre i geni, viene prodotta
unaltra proteina simile alla proteina che si chiama proteina di anti-terminazione che in grado
di riconoscere e legare la sequenza RUT con maggiore affinit rispetto alla proteina . Quindi, nel
momento in cui la sequenza RUT fuoriesce dal canale exit dellRNA-polimerasi, la proteina di antiterminazione va a legare la sequenza RUT e la maschera alla proteina ; in questo modo la proteina
non si pu legare allRNA e quindi la trascrizione continua, si pu passare dal primo al secondo

gene, la stessa cosa succede se si deve passare dal secondo al terzo gene. Se invece necessario, in
un operone, solo il primo dei geni che possono essere presenti, allora la proteina di antiterminazione non viene prodotta oppure cessa di essere prodotta solo nel momento in cui un
determinato gene di un operone non deve essere trascritto perch non sempre tutti i geni che sono
presenti nelloperone vengono trascritti ma a seconda se servono o meno.

Lezione IX

15/05/2012

Processo di trascrizione negli Eucarioti


Negli eucarioti i geni sono sempre singoli, ogni gene contiene a monte una sequenza di regolazione
ma possono esserci anche delle sequenze di regolazione localizzate a distanze notevoli, sia a monte
sia a valle, dal primo nucleotide che viene trascritto, quindi l dove si viene a posizionare la RNApolimerasi II. A valle del promotore presente la sequenza codificante, quindi inizialmente c un
primo tratto che presente nel messaggero ma non viene tradotto poi dai ribosomi, che si chiama
regione 5 non tradotta, o regione 5 UTR, poi segue il codone di start e a questo punto c tutto il
messaggio. Per il messaggio negli eucarioti nella maggior parte dei geni interrotto da porzioni di
DNA, che sono pi o meno grandi, a volte sono molto grandi (migliaia di basi), e allora le sequenze
sempre piuttosto piccole che contengono il messaggio molecolare vengono chiamate esoni, dal
concetto secondo il quale poi queste sequenze fuoriescono dal nucleo per essere tradotte, mentre le
sequenze interrotte, che saranno rimosse durante il processo di maturazione del messaggero, sono
detti introni secondo lerrata convinzione che tutte queste sequenze, una volta rimosse, sarebbero
rimaste nel nucleo per essere degradate. Oggi invece si sa che alcune di queste funzionano da RNA
regolatore. Dopo il codone di stop, cio dopo lultimo esone, sempre nel messaggero presente un
tratto ma non viene tradotto, che detto regione 3 non tradotta o 3 UTR, ed infine una o pi
particolari sequenze consenso che si chiamano segnali di poliadenilazione, uguali in tutti gli
eucarioti.
Per quanto riguarda il promotore negli eucarioti molto pi grande in termini di coppie di basi
rispetto a quello dei procarioti, allinterno contiene molti pi consensi, a cui si legano molte
proteine che coadiuvano il processo della trascrizione, soprattutto nella fase di pre-inizio, cio di
assemblaggio della RNA-polimerasi. Alcune di queste sequenze, che si trovano anche a grandi
distanze dal gene, si possono trovare sia al 5, vale a dire a monte del promotore, ma pi spesso si
trovano al 3 del gene e sono delle sequenze molto particolari, perch vi si legano delle particolari
proteine che funzionano da interruttori molecolari e che vengono detti fattori di trascrizione
inducibili. Se questi ultimi, legando questi particolari consensi, che si trovano a distanza, attivano
la trascrizione, allora i consensi stessi prendono il nome di enhancer; se invece le proteine che
legano questi consensi inibiscono il processo della trascrizione, le sequenze si chiamano silencer,
quindi possono avere un nome differente a seconda del tipo di proteine che si legano a queste
sequenze e delleffetto che queste proteine esercitano sul processo della trascrizione, soprattutto
sulla fase di inizio della trascrizione.
In genere tutto l'organismo funziona grazie ai fattori di trascrizione inducibili, che sono delle
proteine che vengono attivate o disattivate sulla base di segnali che in genere provengono
dallesterno attraverso quei particolari meccanismi che sono detti vie di traduzione del segnale. La
maggior parte dei geni funziona proprio grazie a questi fattori di trascrizione inducibili che,
legandosi agli enhancer o ai silencer, permettono alla RNA-polimerasi adeguatamente posizionata
sul promotore di partire a diverse velocit e quindi di trascrivere nellunit di tempo una quantit
differente di messaggeri e, successivamente, di proteine, sulla base di quelle che sono le mutevoli
necessit metaboliche della cellula. Ma non basta solo questo in quanto ci sono a valle dei
meccanismi, i quali permetteranno di regolare la quantit di messaggero che alla fine sar destinato
ad essere tradotto dai ribosomi nella relativa proteina.
A livello del promotore possono essere presenti diversi consensi ma tre sono i pi importanti: il

primo un consenso basale, fondamentale per il corretto posizionamento della RNA-polimerasi II,
prende il nome di TATA box e assume una posizione variabile a seconda del promotore. Ancora pi
a monte si trova un altro consenso che prende il nome di CAAT box e prende il nome dal tipo di
basi di cui costituito, vi si legano particolari proteine che rendono pi efficiente il processo della
trascrizione stessa. Ancora pi a monte vi si trovano delle ripetizioni della sequenza GC, che quindi
costituiscono la cosiddetta GC box, ed anche qui vi si legano delle proteine che rendono efficace ed
efficiente la trascrizione stessa (esiste un certo numero di geni che mancano della TATA box, che
vengono detti tataless; in questo caso tutto il promotore invaso dal consenso GC box, quindi sar
il consenso GC box che, con le proteine che sono in grado di legarlo, sostituir la TATA box e
permetter il corretto posizionamento della RNA-polimerasi su questi particolari geni).
Lelemento TATA costituito da 4 subconsensi: il primo consenso la TATA box vera e propria,
ossia una sequenza costruita da una serie di ripetizioni di A - T , che possono essere in numero
variabili da gene a gene e l si verifica lapertura meccanica della doppia elica e quindi la
formazione della bolla di trascrizione; a monte dellelemento TATA un subconsenso che indicato
come BRE, ossia elemento di risposta al fattore B (fattore molto importante per individuare la
direzionalit del gene); a valle invece ci sar un consenso che comprende il primo nucleotide che
deve essere trascritto, quindi a livello di questo consenso si trover il sito attivo della RNApolimerasi II e si chiama iniziatore; ancora pi a valle, intorno a +28 - + 32,si trova il quarto
subconsenso, che prende il nome di elemento a valle e ovviamente a questo consenso vi si legano
alcune subunit di specifici fattori di trascrizione basali, tutti con lo scopo di creare unopportuna
piattaforma allinterno dellintero elemento TATA, in modo tale che venga posizionata
correttamente la RNA-polimerasi II.
I fattori di trascrizione basali hanno il compito di posizionare correttamente la RNA-polimerasi II
ma anche di determinarne la partenza, cio di indurre il passaggio della fase dinizio alla fase di
allungamento. La situazione differente rispetto alla RNA-polimerasi batterica, poich questa
utilizza una sola subunit, anche se presente in tante isoforme che sono in grado di riconoscere i
diversi promotori. Nel nostro caso invece della RNA-polimerasi II (ma anche delle altre RNApolimerasi), si avvalgono di proteine esterne che si legano al promotore creando quelle condizioni
affinch la RNA-polimerasi II possa correttamente posizionarsi e il suo sito attivo si possa trovare a
livello del primo nucleotide che viene trascritto. Il primo fattore di trascrizione si chiama TF II D,
un fattore multiproteico formato da molte subunit e una di queste la cosidetta TBP. Questultimo
la proteina chiave che riconosce lelemento TATA. Associati alla TBP vi sono 11 proteine TAF,
ossia fattori che si associano alla TBP: una TBP e 11 TAF formano il fattore TF II D, che riconosce
per primo lelemento TATA dei geni che codificano per le proteine.
Nellorganismo non sono presenti solo 11 proteine TAF ma se ne conoscono almeno una
cinquantina: alcune sono costantemente presenti in tutti i fattori TF II D, altri invece formano fattori
di trascrizione TF II D attraverso unattivit combinatoriale di queste 50 proteine TAF, sempre 11 a
11 che legano la proteina TBP : in questo caso s'individuano diversi tipi da un punto di vista
proteico di fattori TF II D, ognuno in grado di riconoscere un determinato promotore, perch
lelemento TATA pu avere un numero di ripetizioni differente a seconda del tipo di gene. Queste
ripetizioni devono essere riconosciute da un determinato assemblaggio di proteine TAF pi sempre
la proteina TBP, quindi non c' un solo fattore TF II D uguale da un punto di vista proteico ma tanti
fattori TF II D assemblati sempre allo stesso modo con una proteina TBP, per formati da una
diversa combinazione di proteine TAF.
La proteina TBP una delle pochissime proteine che al posto di penetrare nel DNA a livello del
solco maggiore, penetra attraverso il solco minore. Essa ha la forma di semiluna e presenta sia ad
una estremit sia allaltra due fenilalanine che riescono a penetrare nel solco minore: nel momento
in cui la proteina TBP penetra su due solchi minori anche distanti, provoca una inclinazione del
DNA e quindi appiattisce il solco minore a livello della sequenza data. Lappiattimento crea una
tensione tale che viene scaricata mediante la rottura meccanica dei legami ad idrogeno a livello dei
nucleotidi T - A, quindi si ha la formazione della bolla trascrizionale, che si viene a formare subito.
Le proteine TAF esibiscono dei gruppi chimici i quali richiamano il secondo fattore, che TF II A,

che si viene a legare a monte dellelemento TATA e quindi a livello del BRE, seppure in modo non
particolarmente specifico, per interagisce con le proteine TAF e si crea una nuova piattaforma che
espone nuovi gruppi chimici, i quali a loro volta richiamano il terzo fattore di trascrizione basale,
che il TF II B: questultimo si lega al DNA in modo asimmetrico, precisamente si lega a livello
del solco maggiore sulle BRE, che sono proprio i suoi consensi mentre lega invece quello che resta
della TATA box a livello di solco minore. Quindi, da un lato lega il solco maggiore, dallaltro quello
minore e questa simmetria fa s che tutti i fattori di trascrizione, che fino a questo momento sono
legati, creino una superficie tale che indica ai successivi fattori qual la direzione del gene, quindi
importante per indicare a che lato si deve posizionare la RNA-polimerasi II. In questo modo,
quando arriver la RNA-polimerasi II, si legher in modo tale da trascrivere da sinistra verso destra.
Nel genoma per ci sono anche dei geni che hanno una direzionalit esattamente opposta, allora il
fattore TF II B si legher in modo tale da indicare una direzionalit opposta del gene alla RNApolimerasi II. Gli specifici gruppi chimici della piattaforma venutasi a creare, vengono riconosciuti
dal quarto fattore di trascrizione, che il TF II F: presenta due braccia e, con una di queste, lega la
RNA-polimerasi II, con laltro riesce a riconoscere i gruppi chimici presenti nella piattaforma,
quindi il legame del fattore TF II F alla piattaforma non fa altro che portare la RNA-polimerasi II a
livello del promotore, e quindi posizionarla in modo tale che il primo nucleotide, che deve essere
trascritto, si trovi esattamente a livello del sito attivo. A questo punto v' un complesso binario
aperto, c gi la bolla trascrizionale la cui lunghezza variabile da gene a gene. La RNApolimerasi inizia subito la trascrizione: anche in questo caso, arrivati a questo punto, non pu pi
andare avanti perch viene bloccata dai fattori di trascrizione, che lhanno posizionata sul
promotore e quindi costretta a rilasciare quel tratto di RNA appena sintetizzato e a ricominciare da
capo. Fino a poco tempo fa, negli eucarioti si pensava che gli inizi abortivi non ci fossero ma oggi si
sa che gli inizi abortivi ci sono e sono anche molto veloci: nel momento in cui la RNA-polimerasi II
arriva sul promotore e trova gi la bolla trascrizionale pronta, inizia immediatamente il processo
trascrizionale con inizi abortivi continui, fino a quando non succeder un determinato evento.
Arriva un altro fattore di trascrizione, che il TF II E, il quale si localizzer a livello della pinza
superiore, prendendo contatto con la pinza stessa: assieme esporranno dei gruppi chimici che
richiameranno lultimo fattore di trascrizione, che il TF II H, esso si lega anteriormente alla
RNA-polimerasi. Questo fattore formato da nove subunit, di cui ci sar una subunit in grado di
idrolizzare molecole di ATP ad ADP ma non unattivit elicasica; unaltra subunit che
importante in questa fase una subunit chinasica (le chinasi sono enzimi in grado di trasferire un
gruppo fosfato da una molecola di ATP ad un amminoacido che contiene un gruppo ossidrilico:
sono tre questi amminoacidi cio la serina, la treonina e larginina). La RNA-polimerasi presenta
una coda, cio una porzione con una struttura lineare, che costituita da una serie di ripetizioni di
sette amminoacidi che si ripetono per un determinato numero di volte: quelli che interessano di pi
sono la serina in posizione 2 e la serina in posizione 5. A carico della coda nelluomo le ripetizioni
superano il numero di 52. La subunit chinasica del fattore TF II H, mediante molecole di ATP,
andr a fosforilare in questa prima fase la serina 5 di tutte le 52 ripetizioni eptaminoacidiche, in
questo modo cambia immediatamente la propria conformazione: in questo caso la coda, cambiando
conformazione, nasconde quei gruppi chimici che la tenevano legata ai fattori di trascrizione, che
sono stati responsabili del corretto funzionamento sul promotore della RNA-polimerasi II. Quindi
perde affinit per questi fattori, si stacca dai fattori che lhanno portata sul promotore cos non si ha
pi linizio abortivo, viene introdotto quel nucleotide in pi e si passa dalla fase di inizio ad una
fase di allungamento. La RNA-polimerasi II pu muoversi oltre il promotore e trascrivere in questo
modo tutto il gene, fino a quando non succeder qualcosa che provoca la terminazione della
trascrizione.
Prima che avvenga la fosforilazione della serina 2, esiste una fase molto cruciale per la regolazione
dellespressione genica, perch si ha il corretto assemblaggio ed anche perch sui fattori stessi
fanno sentire la loro influenza tutte le altre proteine che si legano ai loro consensi, in modo
particolare le proteine che si legano agli enhancer e ai silencer, permettendo in questo modo una
partenza pi o meno veloce della RNA-polimerasi o addirittura un suo blocco sul promotore: queste

proteine sono a grande distanza dal promotore ed interagiscono sempre con il complesso della
RNA-polimerasi II per esercitare questo controllo. Il DNA si incurva in modo tale che quelle
sequenze direttamente o, pi spesso, indirettamente possono venire a contatto con la RNApolimerasi II. Quando non possono venire a contatto, sempre presente negli eucarioti un
complesso mediatore formato da tantissime subunit, molte delle quali identiche dal lievito
alluomo, che svolgono un ruolo fondamentale nel permettere ai fattori di trascrizione inducibili di
far sentire la loro influenza nella fase dinizio della trascrizione. I fattori di trascrizione inducibili
sono fondamentali nelle attivit trascrizionali della stragrande maggioranza dei geni: tale attivit
viene esercitata a volte direttamente se si legano in prossimit del promotore, ma quando sono legati
agli enhancer e ai silencer hanno bisogno del complesso di mediazione che permette loro di
trasmettere la loro influenza al complesso di mediazione. Questultimo, legato al complesso di preinizio basale, fa sentire la sua influenza. Questi fattori, che si legano soprattutto agli enhancer,
legano sempre gli enzimi che rimodellano la cromatina ma anche listone acetil-transferasi, che
devono acetilare le code aminoterminali degli istoni, in modo tale che di volta in volta la fibra di 30
nm durante la trascrizione si allenti, consenta agli enzimi di rimodellamento di far spostare i
nucleosomi e di legare il DNA che deve essere trascritto.
In realt le RNA-polimerasi II sono preassemblate con tutti i fattori di trascrizione. In questo modo
si vanno a posizionare sul promotore grazie ai gruppi chimici che questi complessi oloenzimatici
esibiscono e sono in grado di riconoscere il relativo consenso, ed in questo caso il relativo consenso
della TATA box. I complessi si preassemblano sulla RNA-polimerasi II isolata, questa in forma
oloenzimatica si va a posizionare sul promotore iniziando la trascrizione. Inoltre su alcuni geni v'
sempre la RNA-polimerasi II preassemblata, anche se in questo momento i geni non vengono
trascritti: nel caso in cui una cellula, in un determinato momento di necessit, avesse bisogno della
relativa proteina, il tutto si trova preassemblato e la RNA-polimerasi II pu partire molto
velocemente, risparmiando il tempo necessario che occorre. Altri geni invece vengono
continuamente trascritti ma la relativa proteina non viene prodotta sempre. Allora il relativo
messaggero viene prodotto, maturato e degradato continuamente, per nel nucleo c sempre una
riserva di questo messaggero: se la cellula, allimprovviso, dovesse avere bisogno della relativa
proteina, il messaggero pu passare attraverso il complesso del poro nucleare dal nucleo al
citoplasma e subito essere tradotto. La cellula preferisce spendere molta energia ed avere una
riserva di questi messaggeri, in modo tale da aver rapidamente il relativo prodotto proteico in caso
di necessit. Nel momento in cui si passa dalla fase di inizio a quella di allungamento, unimmensa
quantit di proteine si associano alla RNA-polimerasi e al DNA nascente, quindi non si trover mai
il complesso trascrizionale libero ma sempre associato a una grande quantit di proteine.
I fattori che partecipano e mediano la trascrizione dei geni eucariotici che codificano per le proteine
prendono il nome di fattori di allungamento, ciascuno dei quali avr una propria funzione. Il
primo fattore di allungamento (gi visto come fattore dinizio) il fattore TF II H e rimane legato
alla pinza superiore trasformandosi in fattore di allungamento; come fattore di allungamento si
trova anteriormente al canale downstream, quello che per primo viene a contatto con il DNA a
doppio filamento che sta entrando nella RNA-polimerasi, quindi pu controllare i danni, la bont
del DNA a doppio filamento, se ci sono dei danni ha la capacit di bloccare la RNA-polimerasi II e
di richiamare istantaneamente gli enzimi del riparo, soprattutto quelli del riparo per escissione, cos
il DNA viene riparato subito dopodich, la RNA-polimerasi II pu ripartire e quindi copiare un
DNA che stato adeguatamente riparato. Un secondo fattore di allunamento si chiama TF II S , il
quale svolge due funzioni: si lega alla coda della RNA-polimerasi II e viene richiamato dalla serina
5 fosforilata. Le funzioni che svolge sono varie: una permette la riduzione dei tempi di pausa che la
RNA-polimerasi II si prende (ad esempio quando viene bloccata dopo il processo di maturazione),
che fornisce lo stimolo affinch la RNA-polimerasi II riparta; la seconda funzione legata alla
correzione degli errori, cio allediting, infatti tale fattore in grado di controllare la geometria
della doppia elica dellibrido DNA - RNA allinterno della RNA-polimerasi e, se trova un errore di
appaiamento, perch stata incorporata una base nella sua forma tautomerica alternativa, blocca la
RNA-polimerasi e poi richiama una chinasi e una fosfatasi: quest'ultima un enzima che, al

contrario delle chinasi, elimina i gruppi fosfati dai residui degli amminoacidi che li possono ospitare
e, richiamando una chinasi che utilizza molecole di ATP, va a fosforilare alcune serine del sito attivo
della RNA-polimerasi e transitoriamente trasforma la RNA-polimerasi in ribonucleasi. In questo
caso la RNA-polimerasi stessa bloccata che taglia un tratto di RNA, contenente lerrore, che poi
sar completamente degradato dalle esonucleasi. Dopo che avvenuto il taglio, la fosfatasi andr a
rimuovere questi gruppi fosfato, che sono stati introdotti nel sito attivo e che hanno transitoriamente
trasformato la RNA-polimerasi in ribonucleasi. Allora la RNA-polimerasi torna ad essere
polimerizzante, scivola indietro e riprende di introdurre i ribonucleotidi l dove essa stessa aveva
prodotto il taglio del messaggero.
Gli enzimi STP (nelluomo bisogna anteporre la lettera h) hanno una funzione importante
nell'ambito della trascrizione. Tra questi si conosce la proteina hSTP 5, la quale viaggia sempre
associato ad una chinasi ed a una fosfatasi. Il fattore hSTP 5 richiama gli enzimi per la prima
maturazione del messaggero. Questa maturazione avviene subito dopo la prima fase di
allungamento, cio nel momento in cui lRNA messaggero comincia ad uscire dal canale exit, e
subisce una modifica al 5. Tale modifica prende il nome capping, ossia laggiunta del cos detto
cappuccio. Per il cappuccio vengono richiamate in sede delle RNA-polimerasi proprio da questo
fattore, per il fattore si porta dietro una chinasi ed una fosfatasi: dopo aver richiamato gli enzimi
del capping, la chinasi andr a fosforilare la serina 2 mediante molecole di ATP, mentre la fosfatasi
andr a defosforilare la serina 5. Quindi, con larrivo di questo fattore, si verifica una modifica
irreversibile del profilo di fosforilazione della coda: il profilo di fosforilazione sar maggiormente a
carico della serina 2, essa far perdere laffinit per la coda a tale fattore, che in questo modo si
stacca e non avr mai pi alcuna possibilit di riattaccarsi alla coda, solo la sernina 5 lo richiamer.
I tre enzimi del capping sono una RNA-trifosfatasi, una guanosiltransferasi e una
metiltransferasi. La RNA-trifosfatasi agisce sul primo nucleotide del messaggero al 5 e andr ad
idrolizzare il legame anidridico tra il fosfato gamma e il fosfato beta, determinando leliminazione
del fosfato in gamma cosicch il primo nucleotide del messaggero rimanga bifosfato, cio il fosfato
alfa ed il fosfato beta. Il secondo enzima, vale a dire la guanosiltransferasi cattura una molecola di
guanosiltrifosfato e la va a trasferire a livello del primo nucleotide del messaggero, ora bifosfato,
prendendo contatto con questo primo nucleotide del messaggero e far in modo da allineare
accuratamente il fosfato beta del primo nucleotide del messaggero con il fosfato in alfa della
guanosinatrifosfato, allineandoli adeguatamente, e il fosfato in beta avr un ossigeno ionizzato:
questultimo eserciter un attacco nucleofilo sul fosfato in alfa della guanosinatrifosfato, romper il
legame anidridico e lo trasferir su se stesso. Legando in questo modo la guanosina con il suo
fosfato in alfa a s stesso sempre con un legame anidridico, si liberer sempre pirofosfato che sar
degradato dalla pirofosfatasi, la quale rende reversibile la reazione.

In questo caso la guanina stata incorporata e legata al primo nucleotide del messaggero in senso
inverso e con legame anidridico. La metiltrasferasi si andr a trasferire sullazoto 7 di questa
guanosina, formando la 7 metilguanosina, ma andr a metilare lOH del ribosio di questa guanina
metilata e anche gli OH in 3 dei primi due o tre nucleotidi del messaggero, quindi ci sar una estesa
metilazione, in modo particolare dellazoto 7 di questa guanosina. Adesso il primo nucleotide sar
la guanosina, cio il cappuccio legato al resto del messaggero con legame anidridico. Le
ribonucleasi che degradano il messaggero agiscono sui legami fosfoesterei, quindi le esonucleasi
non riconoscono questo primo legame per poterlo idrolizzare, non possono staccare il cappuccio e
di conseguenza non possono degradare il messaggero in crescita, quindi la prima funzione del
cappuccio di proteggere il messaggero dalla degradazione da parte delle ribonucleasi. Infatti il
messaggero, prima di essere tradotto, deve passare dal nucleo al citoplasma e quindi viene a
contatto con numerose esonucleasi, avendo la necessit di essere contenuto, ma ci non accade nei
procarioti. I gruppi metilici legati al cappuccio servono per essere riconosciuti da fattori di inizio
della traduzione, in modo tale che il messaggero venga portato sul ribosoma per essere tradotto, ma
il cappuccio verr agganciato da altre proteine per un meccanismo di regolazione.
La serina 2 fosforilata richiamer sempre sulla coda dei fattori che stimolano lo splicing, cio la
rimozione degli introni, che avviene durante la trascrizione stessa e non dopo. La serina 2
fosforilata richiama altri due fattori, che si chiamano di taglio e di poliadenilazione: la
poliadenilazione il terzo meccanismo di maturazione del messaggero mentre lo splicing il
secondo, il primo il cappuccio. Alla fine della regione 3 non tradotta presente almeno un
consenso che prende il nome di segnale di poliadenilazione: sul DNA AATAAA mentre sul
messaggero sar AAUAAA. Questi sei nucleotidi che si trovano sempre alla fine di ogni gene
rappresentano dei segnali di poliadenilazione. Quando la RNA-polimerasi ci passa sopra e trascrive
sul messaggero questo segnale di poliadenilazione, il segnale viene riconosciuto dai due fattori di
taglio e di poliadenilazione, i quali si spostano rapidamente e lo vanno a legare e quindi si legano a
livello del segnale di poliadenilazione. A questo punto il primo CSTF richiama una serie di
endonucleasi le quali producono un taglio del messaggero circa 20-40 nucleotidi a valle dal segnale
stesso. Il messaggero cos tagliato rilascer il fattore CSTF che ha prodotto il taglio, mentre laltro
fattore, il CPSF, rimarr sempre legato al segnale di poliadenilazione. Il fattore CPSF richiama a
sua volta un enzima, che si chiama poliapolimerasi e che, utilizzando molecole di ATP, andr ad
allungare lestremit 3del messaggero con una serie di adenine, che costituiscono la cosiddetta
coda di poli-A.
La coda di poli-A viene protetta dallazione delle esonucleasi, con orientamento 3 - 5, mediante la
deposizione di queste speciali proteine che si chiamano proteine TAPB di tipo C, ossia proteine che
legano la coda di pol- A di tipo C. Queste proteine sono importanti perch svolgono molte funzioni,
una delle quali permette la terminazione della traduzione degli eucarioti che avviene in modo
completamente diverso dai procarioti. Il messaggero a questo punto pu transitare dal nucleo al
citoplasma per essere tradotto oppure essere degradato tramite uno speciale controllore nucleare, a
seconda delle necessit metaboliche della cellula, ma esso ha anche la funzione di controllare
lintegrit del messaggero in tutte le sue parti, perch il messaggero deve contenere il messaggio
molecolare esattamente come presente sul DNA, in modo tale che venga prodotta una proteina la
cui sequenza di amminoacidi deve rispecchiare fedelmente la sequenza dei codoni presenti sul gene
a livello di DNA.
Dopo il taglio la RNA-polimerasi continua a trascrivere per un po, dopodich spontaneamente si
disassembla e termina la trascrizione. Non esistono sequenze di terminazioni ma la traduzione negli
eucarioti associata al segnale di poliadenilazione. Secondo un prima teoria, nel momento in cui
avviene il taglio, la parte al 5 del messaggero che resta dopo il taglio non ha un cappuccio n hSTB
5 ha la possibilit di crearne un altro, quindi la RNA-polimerasi II si ritrova con un messaggero
senza cappuccio e non lo riconosce. Daltra parte le esonucleasi cominciano la loro attivit e vanno
a degradare tutto il messaggero ad una velocit molto pi alta della velocit di polimerizzazione,
degradando tutto il messaggero anche allinterno della RNA-polimerasi. Questa rimane senza
messaggero e si distacca. Secondo un'altra teoria, nel momento in cui i due fattori si spostano dalla

coda fosforilata della serina 2 al segnale di polidenilazione sul messaggero, creano una
perturbazione a carico delle subunit che costituiscono la RNA-polimerasi II a tal punto che le
diverse subunit tendono gradatamente a disassemblarsi e la RNA-polimerasi riesce a trascrivere
circa e non pi di 200 nucleotidi, dopodich si disassembla proprio a causa di questa induzione
provocata dal passaggio dei due fattori dalla coda al messaggero.
Il promotore della RNA-polimerasi I, cio dei geni che codificano per gli RNA ribosomiali,
formato da due porzioni: una in prossimit del primo nucleotide che deve essere trascritto, si chiama
core del promotore, mentre laltro si trova a monte e si chiama elemento di controllo a monte, cui
si legano gli unici due fattori di trascrizione della RNA-polimerasi I, che sono il fattore UBS, e il
fattore SL1 ( formato da una proteina TBP e da 3 TAF). Un altro promotore tipico della RNApolimerasi III, in particolare per gli RNA ribosomiali 5 S e per i t-RNA, si trova allinterno del
primo nucleotide che deve essere trascritto e deve essere sempre rappresentato da due consensi. A
questi vi si legano dei fattori di trascrizione che sono tre e si chiamano TFIII (A, B, C) ma, in modo
particolare, il primo fattore di trascrizione, che il TFIII B, contiene sempre la proteina TBP oltre 5
o 6 TAF. Anche in questo caso il promotore per la RNA-polimerasi III riconosciuto da un fattore
di trascrizione che contiene sempre la TBP.
Lezione X

16/05/2012

Splicing dell'mRNA Transplicing Splicing alternativo Splicing


alternativo errato RNA-polimerasi IV
La seconda maturazione del messaggero consiste nel processo di splicing. In un gene il promotore
seguito dal primo esone che contiene ovviamente la regione 5' non tradotta e gli esoni sono
interrotti da queste sequenze introniche la cui grandezza, nella maggior parte dei geni, avvolte
molto consistente. Vi sono anche a pi di 20000bp all'interno delle quali si trovano degli esoni con
almeno 150 bp. Quindi il processo di splicing un processo molto importante per riunire quello che
il messaggio molecolare contenuto nel gene che, in questo modo, completamente spezzato. Il
motivo per cui si sono evoluti gli introni, sono tanti per non si conoscono bene.
Nel processo di splicing durante il processo di trascrizione, il messaggero, a partire dal primo
nucleotide che viene trascritto, contiene tutte le sequenze sia introniche sia esoniche. Per, man
mano che l'introne viene trascritto, i fattori dello splicing si legano immediatamente alla coda
carbossi-terminale dell'RNApol 2 (fosforilata sulla serina 2) e stimolano il processo dello splicing.
Quindi una serie di componenti catalitiche si assemblano gradatamente sia a monte sia a valle dello
splicing determinano la rimozione. Nel momento in cui si riuniscono tutti gli esoni, il risultato sar
il messaggero maturo. Ci sar il cappuccio in 5' e poi una piccola porzione 5' non tradotta che, a
seconda del messaggero, pu essere di grande dimensioni; ci sar poi la sequenza codificante; infine
c' una sequenza 3' non tradotta e al 3' c' la coda di poli-A.
Si analizzi dal punto di vista chimico in che cosa consiste la reazione di splicing. Prima di tutto si
deve osservare che a livello degli introni sono sempre presenti delle sequenze altamente conservate:
in modo particolare i primi due nucleotidi degli introni sono quasi sempre tant' G-T sul DNA e CU sull'mRNA. La stessa cosa vale per la parte terminale dell'introne. Gli ultimi due nucleotidi sono
sempre altamente conservati e rappresentati dal consenso A5. Ma un altro consenso molto
importante per innescare il processo di splicing si trova quasi a met, intorno ai due terzi terminale
del gene. Si trova in una regione ricchissima in pirimidine ma all'interno di queste spicca
un'adenina. Questo si chiama sito di ramificazione, anch'esso conservato in tutti gli organismi.
I tre siti fondamentali molto conservarti permettono all'introne di essere rimosso da un particolare
complesso catalitico riboenzimatico, lo spliceosoma.
La reazione di splicing una doppia reazione di transesterificazione perch non si ha la rottura di
legami fosfoesteri ma semplicemente un trasferimento di questi. L'denina nel sito di ramificazione
contiene al 2' un gruppo OH. E, come sempre accade nelle reazioni principali della biologia

molecolare, questa adenina sar portata a livello del sito di splicing quindi al 5' dove si trova il
nucleotide G-U. L'ambiente dello spliceosoma fa in modo che l'OH si ionizzi (s'allontani
l'idrogneno e quindi l'ossigeno si carichi negativamente) e diventi un potente nucleofilo, il tutto con
molta accuratezza, perch i due reagenti vengono accuratamente allineati. Si esercita dunque un
attacco nucleofilo a livello del legame fosfoesterico al 5' tra l'ultimo nucleotide dell'esone e il primo
nucleotide dell'introne: ad esempio sono una G del nucleotide dell'esone e una guanina dell'introne.
L'introne si stacca cos dall'esone e l'introne stesso instaura un legame fosfoestereo perch si ha
semplicemente un trasferimento del legame dall'OH 3' dell'esone all'OH in 2' del sito di
ramificazione. La porzione dell'introne viene ruotata a cappio e legata covalentemente con tre
legami fosfodiesterei: un legame al 3', uno al 5', e uno con l'OH in 2' che derivato dalla prima
reazione di transesterificazione. L'esone che si liberato, rimane sempre agganciato a tutti i
componenti dello spliceosoma; viene poi fatto scivolare lungo tutto l'introne per essere portato a
livello della giunzione di splicing in 3'. L'OH in 3' dell'esone che stato staccato viene ionizzato e
l'ossigeno negativo esercita un attacco nucleofilo tra l'ultimo nucleotide dell'introne e il primo
dell'esone successivo. Si avr quindi un trasferimento del legame fosfoestereo, e l'esone che era
stato precedentemente staccato viene direttamente legato con l'esone successivo. Ne prosegue che i
due esoni vengono legati insieme secondo lo schema di lettura tipico di quel gene. Diversamente,
l'introne viene elimenato sotto forma di cappio e poi eventualmente degradato. In alcuni casi,
l'introne pu essere ulteriormente processato e trasferito in altri tipi di RNA che hanno una grande
funzione di controllo sull'espressione genica e sulla produzione delle proteine a livello
citoplasmatico.
Ovviamente ogni introne subisce sempre di volta in volta, man mano che fuoriesce dalla RNApol
2, la stessa sorte, vengono cio eliminati. cos smentita l'ipotisi del "trascritto primario", ovverosia
il poliribonucleotide derivato da una prima trascrizione di tutto il gene e poi una reazione di
splicing. Non ci sar mai un primario trascritto uguale al gene all'interno del nucleo perch lo
splicing inizia durante il processo di trascrizione stesso. E se il messaggero non di grande
dimensioni, lo splicing termina prima della trascrizione stessa, e quando la trascrizione termina, tutti
gli esoni sono agganciati tra di loro e la seconda maturazione completata. Se invece il messaggero
di grande dimensioni, la trascrizione finisce prima e quindi lo splicing (seconda maturazione)
finir un po' dopo. Questo comprensibile se c' un numero elevato di introni.
L'adenina del sito di ramificazione legata contemporaneamente con 3 legami fosfoesterei. Quali
sono i ribozimi che catalizzano la reazione di splicing? Sono i piccoli RNA nucleari che vengono
trascritti in parte dall'RNApol 2 e anche in parte dall'RNApol 3 (prevalentemente dall'RNApol 3).
Sono cinque quelli che partecipano allo splicing nucleare (splicing nucleare indica il processo che
interessa i messaggeri ed i comuni geni che codificano per le proteine). I messaggeri per gli istoni
vengono maturati in modo diverso e c' un solo snRNA che matura i messaggeri degli introni in
modo completamente differente. Gli snRNA sono indicati con la sigla U e prendono il nome di: U1,
U2, U4-U6 (unico complesso), ed U5. E U3? U3 uno SNO cio un snRNA che partecipa alla
maturazione degli rRNA. U7 un RNA nucleare che invece partecipa alla maturazione dei
messaggeri per gli istoni. U1 presenta al suo introne una porzione che perfettamente
complementare ai primi 6 nucleotidi del sito di spicing al 5' dell'introne, quindi in grado di
complementarizzare l'inizio dell'introne. U2 in grado di complementarizzarsi con tutta la parte del
sito di ramificazione, ad eccezione proprio dell'adenina. Nel momento in cui U2 si lega al sito di
ramificazione, non avendo una base complementare per l'adenina, la quale viene estrusa verso
l'esterno e esibisce l'OH in 2', che quello che determiner la prima reazione di transesterificazione.
Anche che il sito di splicing al 5' pu essere legato da U6 (oltre che da U1) e da U2, che a loro volta
sono complementari.
Come si assembla gradatamente lo spliceosoma? Se presente U1, non c' U6 e viceversa, si
alternano. Nel momento in cui l'introne fa la sua comparsa al di fuori della RNApol 2, ci sar
qualcuno che andr a stimolare l'arrivo di U1 al 5' che si complementarizza tramite un suo tratto. Al
3' arrivano delle proteine in grado di riconoscerlo e legarvisi. La prima proteina si chiama U2AF35:
questa, legando l'RNA, esibisce dei gruppi chimici e richiama una seconda proteina, che si chiama

U2AF65 (35 e 63 rappresentano le dimensioni delle proteine). A loro volta, le due proteine (35 e
65) unite insieme esibiscono dei gruppi chimici che richiamano una particolare proteina che si
chiama BBP, la quale si va localizzare sul sito di localizzazione a livello dell'adenina. BBP prepara
il sito di ramificazione affinch venga adeguatamente complementarizzato da U2. Infatti, nel
momento in cui BBP si stacca, arriva U2 che si lega al suo posto, ma non ha un nucleotide in grado
di complementarizzarsi con l'adenina del sito di ramificazione. L'adenina viene estrusa verso
l'esterno. Una volta che arriva U2, U1 perde la sua funzione, si stacca e al suo posto arriva il
complesso U4-U6 ed U5 (si ricordi che U4 strettamente legata ad U6). U6 prende il posto di U e,
poich rappresentano un complesso molto grande perch gli RNA ribozimici sono coniugati ad altre
150 proteine diverse, si former uno spliceosoma molto grande il quale provoca un avvallamento
dell'introne, tra il sito di ramificazione e il sito di splicing al 5'. Tra U6 ed U2 (che sono
complementari) c' U4, il quale li separa. Quando U4 si stacca, l'OH in 2' dell'adenina viene portato
a livello del sito di splicing in 5', quindi perfettamente allineato tra l'ultimo nucleotide dell'esone e
il primo nucleotide dell'introne. L'OH viene dunque ionizzato e si avr la prima reazione di
transesterificazione. Si forma il cappio e l'esone si stacca. Il suo OH in 3' libero rimane attaccato
allo spliceosoma (formato dalle 150 proteine e da solo 3 snRNA). Arriva U5, il quale strettamente
associato all'esone staccato. U5 ha la capacita di scivolare lungo tutto l'introne, quindi si ha una
sorta di capovolgimento dello spliceosoma, al quale segue che l'esone viene staccato e portato
accuratamente a livello del siti di splicing in 3'. Nel frattempo le due proteine U2AF35 ed U2AF65
si sono staccate. Di nuovo avviene la ionizzazione dell'OH (adesso in 3') e l'ossigeno, ionizzato,
riceve il secondo attacco nucleofilo nella seconda transesterificazione che comporta l'unione dei due
esoni in modo accurato: l'ultimo nucleotide dell'esone precedentemente staccato si unisce in forma
fosfodiesterea con il primo nucleotide dell'esone successivo. I due esoni vengono accuratamente
legati fra di loro e l'introne viene eliminato insieme al resto dello spliceosoma. Poi, sia le proteine
dello spliceosoma sia gli snRNA si staccano per riprendere un nuovo ciclo e l'introne subisce il suo
destino: o viene degradato o viene utilizzato per altri fini.
Su chi agisce il fattore di splicing come fattore di allungamento della trascrizione che legato alla
coda carbossi-terminale dell'RNApol fosforilata sulla serina? I fattori dello splicing agiscono su
speciali sequenze che per sono presenti a livello di ogni esone e quindi ogni esone contiene dei
consensi che prendono il nome di sequenze ESE o enanchers esonici, ossia amplificatori esonici
dello splicing. Le sequenze ESE si legano ad un gruppo di proteine molto particolari di cui molte
sono coinvolte nel meccanismo dell'esporto del messaggero dal nucleo al citoplasma. Si chiamano
proteine SR e prendono questo nome dall'elevato contenuto di due amminoacidi: serina (S) e
arginina (R). Sono proteine basiche che contengono un elevato contenuto di serina ed arginina, per
questo sono dette proteine SR.
Le proteine SR si legano agli amplificatori esonici e fanno sentire la loro azione sui due introni
adiacenti. Sono legate al 3' dell'introne precedente e stimolano l'arrivo di UAF35; sono legate al 5'
dell'introne successivo e stimolano l'arrivo di U1. Le proteine SR, che sono presenti a livello di ogni
esone, agiscono quindi contemporaneamente su due introni. Per, affinch avvenga su ogni introne
il corretto assemblaggio dello spliceosoma, necessario che le proteine SR siano presenti su due
esoni adiacenti: il primo esone permetter l'arrivo di U1, il successivo permetter l'arrivo, e quindi il
legame, con UAF35. Occorrono dunque ben due amplificatori esonici con le relative proteine SR
affinch si possa assemblare correttamente lo spliceosoma su un introne.
L'OH del sito ramificazione agisce sul sito di splicing sul 5' formando il cappio, e, liberando l'esone
che poi agisce sul sito di splicing in 3', si unisce all'esone successivo e l'introne viene eliminato. U1
si lega al sito di splicing in U5 perch c' complementarit. U2AF35 e 65 si legano al sito di
splicing in 3' e richiamano le proteine BBP, le quali richiamano a loro volta U2 sul sito di
ramificazione, il quale vi si lega ed estrude l'adenina. Poi arrivano gli altri, U1 si stacca e si lega al
5'. U4 si stacca ed U2 si lega ad U6: l'adenina viene cos portata a a livello del sito di splicing al 5'.
Successivamente si verifica la seconda transesterificazione con l'unione degli esoni e l'eliminazione
degli introni sotto forma di cappio.
Nella cellula la quantit di proteine molto elevata. La cosa che aveva sorpreso gli scienziati del

2000 che il numero dei geni del genoma umano era inferiore di quello atteso perch la quantit
delle proteine belle cellule era nettamente superiore. E allora da dove derivano le proteine in pi?
Derivano da meccanismi di rimodellamento dei geni esistenti. Si ricordi che proteoma e genoma
non sono equivalenti perch il numero dei geni nettamente inferiore rispetto al numero di proteine
presenti, perch non c' corrispondenza esatta tra proteoma e genoma, in quanto il primo
nettamente superiore.
Due messaggeri stanno uscendo da RNApol diverse ma si trovano vicino (a livello di una zona del
nucleo, chiamata fattoria trascrizionale). In seguito all'azione di determinate proteine, durante lo
splicing dei due messaggeri, alcuni esoni di un RNA in sintesi si uniscono agli esoni di un altro
RNA in sintesi: si sta realizzando una reazione di transplicing. Esoni appartenenti a due geni
differenti possono cos mescolarsi tra loro producendo un messaggero il quale d luogo ad una
proteina che svolge una determinata funzione e possiede un'esatta controparte genica sul genoma. Il
meccanismo raramente e variamente combinatoriale e permette di riprodurre pi proteine a partire
da quei pochi geni che sono presenti nel genoma.
Un altro meccanismo che permette di ottenere pi proteine da un singolo gene il meccanismo
dello splicing alternativo. Pi grande un gene, pi esoni continente, pi va incontro a splicing
alternativo e pu produrre messaggeri diversi, tradotti in proteine differenti. Le proteine che si
possono generare da un gene che va incontro a splicing alternativo possono avere una funzione
simile, completamente diversa o addirittura antagonista. Di norma lo splicing alternativo avviene in
tipi cellulari diversi. Se un gene formato da soli tre esoni (molto piccolo) si pu osservare che gli
esoni si uniscono regolarmente tra loro secondo un meccanismo di splicing casuale. Vengono
prodotti il messaggero e la relativa proteina. Oppure il secondo esone pu essere bypassato, cio
eliminato come se fosse un introne unitamente all'introne 1 e all'introne 2. Il primo esone si legher
cos direttamente al terzo esone e si produrr una proteina pi piccola (che mancher della parte
centrale rispetto alla proteina intera) e ovviamente sar diversa, svolger una funzione differente.
Oppure pu succedere che una porzione di introne, ad esempio del primo introne, venga ritenuta. E
se la porzione dell'introne in frame con il primo ed il secondo esone, cio i codoni non presentano
alterazioni (quindi anche la sequenza di lettura rimane quella corretta), si produrr un messaggio
produttivo che dar luogo ad una proteina che conterr un tratto con degli amminoacidi in pi che le
permetteranno di funzionare diversamente. Nell'altro caso, addirittura un introne pu essere
interamente ritenuto se tutta la sequenza in frame con i due esoni adiacenti, e funge anch'esso da
esone. Si produrr un messaggero ancora pi grande in grado di essere tradotto in una proteina pi
grande rispetto a quella attesa, la quale, con il suo fonding, con il suo avvolgimento, in grado di
svolgere una funzione diversa. Oppure pu essere eliminato il terzo esone. Il messaggero risultante
sar formato dal primo e dal 2 esone. Di nuovo, una proteina pi piccola svolger una funzione
diversa. Quindi in pratica da un gene formato da tre esoni e due introni, si pu ottenere un totale di
cinque messaggeri diversi, e quindi cinque proteine diverse. In conclusione, l'introne funziona da
materiale informativo se in frame.
Come detto precedentemente, la parte cruciale per la trascrizione la fase di pre-inizio, dove
l'RNApol 2 con i fattori di trascrizione basali in forma oloenzimatica, si va a posizionare a livello
della TATA box del consenso basale. Al complesso di pre-inizio si legano altri fattori che rendono la
trascrizione pi efficiente, che conoscono il consenso TATA box, GC box ma, sopratutto, quelle che
riconoscono gli enhancer o i silencer. Tutta la componente fattoriale che permette alla RNApol di
partire ad una velocit pi o meno grande o di restare ferma sul promotore, rappresenta il primo
meccanismo di controllo dell'espressione genica negli eucarioti. Il secondo meccanismo accade a
livello dello splicing mediante lo splicing alternativo errato, al quale vanno incontro tutti i geni,
anche quelli che nomralmente non vanno incontro a splicing. In che cosa consiste? Si supponga che
nel momento in cui l'RNApol parte ad alta velocit, cominci a trascrivere una quantit di messaggi
che nel momento funzionale successivo metabolico della cellula non sono necessari. La cellula ha
innescato la trascrizione di una grande quantit di messaggi ed ha la necessit di ridurne la quantit
perch sono troppi. Allora ricorre allo splicing alternativo errato, ossia l'innesco dei processi di
splicing alternativo ma fa in modo che un esone staccato si vada a legare con un altro esone ma non

a livello del primo nucleotide di questo esone, magari al secondo oppure all'ultimo nucleotide
dell'introne: in pratica o ritiene o elimina un nucleotide. C' un nucleotide in pi o in meno rispetto
al normale. L'alterazione del frame, cio dello schema di lettura, comporta nel giro di meno di 100
nucleotidi, la comparsa di uno STOP codon prematuro. Nella cellula sono presenti dei meccanismi
di recente scoperta che hanno il compito di degradare i messaggeri con STOP codon prematuri. Cos
facendo, la quantit di messaggeri che sono in eccesso e che contengono uno STOP codon
prematuro sono destinati ad essere degradati, quindi non lasciano il nucleo. La cellula ha cos risolto
il problema dell'eccessiva sintesi dei messaggeri, ha ridotto drasticamente la quantit di mRNA e, di
conseguenza, meno messaggeri maturi integri saranno disponibili per passare dal nucleo al
citoplasma. I messaggeri che possiedono lo STOP codon prematuro provocato dallo splicing
alternativo errato sono destinati ad essere degradati.
I mitocondri sono sede di numerosi meccanismi, vengono considerati dei batteri ancestrali che sono
stati inglobati dalla cellula ancestrale (ne nata una simbiosi) ed hanno dato luogo a delle cellule
eucariote attuali, quindi molto robuste e in grado di produrre una grande quantit di proteine. Anche
i mitocondri hanno il loro DNA ed hanno i loro geni ed i loro ribosomi per la traduzione dei loro
messaggeri che derivano dai loro geni: i mitocondri hanno la capacit di riprodursi come le cellule
batteriche, quindi di replicare il loro DNA con modalit diverse rispetto le normali cellule
procariotiche. Inoltre hanno un corredo genetico diverso [se tra le soluzioni di un quiz c' scritto il
codice genetico sempre universale, la risposta deve scartata, perch non universale]. Anche in
alcuni casi i cloroplasti hanno codice genetico differente dalle cellule convenzionali.
I geni contenuti nel DNA mitocondriale sono circa una 30. Hanno la necessit di essere trascritti e
quindi occorre una RNApol in grado di assolvere il compito. Tale RNApol esiste e si chiama RNApolimerasi mitocondriale. Al contrario di quanto si possa attendere, il gene per l'RNApol
mitocondriale non presente nel genoma dei mitocondri, presente nel genoma umano,
precisamente su un tratto del cromosoma 19.
Il gene per l'RNApol mitocondriale viene trascritto, maturato e regolarmente tradotto nel
citoplasma. I primi 40 (circa) amminoacidi ammino-terminali costituiscono un segnale, detto
segnale di localizzazione mitocondriale, grazie al quale l'intera proteina, una volta che fuoriesce
dai ribosomi, entra direttamente nei mitocondri. Nei mitocondri la sequenza che indirizza le
proteine prodotte nel citoplasma cellulare ai mitocondri contengono un apposito segnale che
permette loro l'ingresso all'interno del mitocondrio. Tra l'altro un segnale molto particolare. Alla
fine, la proteina finisce nella matrice mitocondriale. Se il segnale viene tagliato da alcune protesi
libere, il significato cambia e la proteina pu essere indirizzata in un altro distretto dello stesso
mitocondrio. quel che accade alle proteine della catena respiratoria.
La mtRNApol svolge due funzioni all'interno del mitocondrio: trascrive quei pochi geni presenti
nel DNA mitocondriale; funge da primasi per la replicazione dell'mtDNA, cio sintetizza anche il
primer affinch si possa avere la sintesi dell'mtDNA, quindi la divisione dei mitocondri stessi.
Cosa stato scoperto di recente? Questa scoperta risale al 2005 ed ancora gli articoli a proposito
sono solamente 12. Mentre alcuni ricercatori stavano testando con cellule in coltura il veleno amanitina, che deriva dal fungo Amanita falloide. L-amanitina un potente inibitore
dellRNApol. In particolare:
inibisce fortemente lRNApol (in presenza della tossina, la trascrizione dei geni
completamente bloccata, per questa la cellula muore);
inibisce parzialmente lRNApol 3;
non ha alcuna influenza sullRNApol 1, per cui gli altri rRNA vengono regolarmente
trascritti.
stato scoperto che quando aggiungevano alla coltura di cellule l'-amanitina, si aspettavano che
la cellula schiattasse allistante. Ci non accadeva. Le cellule continuavano a vivere per un certo
periodo. Se si cambiava il mezzo di coltura, eliminando l-amanitina, le cellule riprendevano a
svolgere il loro metabolismo come se nulla fosse successo; se l-amanitina rimaneva molto a lungo
nel mezzo di coltura, le cellule, dopo un lungo periodo, giungevano a morte. Le osservazioni non

concordavano con le aspettative: se viene bloccata lRNA pol 2, la cellula deve morire. Si scopr che
era presente una quarta RNApol, insensibile all-amanitina, in grado di trascrivere quei messaggeri
le cui proteine permettevano alla cellula di sopravvivere a livello basale per un determinato periodo
di tempo. Lo stesso vale per lorganismo: se un soggetto si avvelenato mangiando questo fungo,
non muore subito ma dopo un certo periodo di tempo, perch protetto dallRNApol 4. Se viene
sottoposto a dialisi per eliminare il veleno, il soggetto pu sopravvivere, a meno che non ci siano
state complicazioni serie.
Da dove arriva l'RNApol 4? Oggi si sa che questa uninsolita isoforma di splicing alternativo del
gene che codifica per lmtRNApol. Che cosa succede? Avviene un meccanismo di splicing
alternativo per cui una parte del primo introne viene ritenuta e quindi si forma un messaggio pi
grande. Si ricordi che tutto il primo esone codifica per la sequenza di localizzazione mitocondriale.
Ci si aspetterebbe una proteina pi grande. In realt lRNApol 4 una proteina molto pi piccola
rispetto allRNApol mitocondriale perch la parte del primo introne, ritenuto col meccanismo di
splicing alternativo, contiene in s ben tre STOP codon prematuri. Quindi, quando il ribosoma legge
in prossimit del primo esone, viene a contatto con gli STOP codon prematuri che si trovano
allinterno del messaggero. Anzich usare il codone di start convenzionale, il ribosoma scivola
lungo tutto il primo esone, shifta completamente lintrone ritenuto, scivola sul secondo esone e poi
si va a localizzare allinterno di un AUG che si trova alla fine del terzo esone. Di conseguenza viene
prodotta una proteina pi corta che tiene in se i siti per fungere da RNApol monomerica, del tutto
identica a quella mitocondriale, solo che non arriver mai ai mitocondri ed avr ben 225
amminoacidi in meno rispetto allRNA pol mitocondriale. Di conseguenza rimane nel nucleo. Qui
svolge unattivit ancora sconosciuta.
Secondo un recente articolo, si osservato che questa RNApol usa fattori di trascrizione
completamente diversi rispetto alla 2 e sembra trascrivere alcune proteine dei muscoli. La domanda
quale ruolo possa svolgere nelle cellule tumorali. Se dovesse essere maggiormente prodotta e
dovesse coadiuvare fortemente la RNApol 2 per la trascrizione di quei geni che la rendono attiva
dal punto di vista metabolico e riproduttivo, esisterebbe unaltra arma per poter combattere cellule
che definire indesiderate troppo poco.
Si concluda il discorso circa lo splicing. In alcuni casi, i siti di splicing sono diversi da quelli
analizzati. In alcuni introni il sito di splicing al 5 A-U anzich G-U e al 3 A-C anzich A-U.
Tali introni vengono pertanto definiti ATAC. Lo splicing avviene con le stesse modalit per,
essendo diversi i siti di splicing, interverranno degli snRNA differenti: al posto di U1 interviene
U11, al posto di U2 interviene U12. Per il resto U4-U6 ed U5 sono uguali. [Se si domanda i siti di
splicing degli introni sono sempre uguali?, la risposta no, perch esistono gli introni ATAC).

RNA editing
Si voglia dissertare circa lRNA editing, altro meccanismo che permette di ottenere proteine
diverse dallo stesso messaggio. RNA editing significa che un messaggio maturo pu essere editato
dalla cellula modificando le basi. Se si modifica il messaggio del messaggero, si produce una
proteina diversa. Ci sono tanti meccanismi che portano alla produzione di messaggi differenti. Se ne
prenda in esempio uno: c' gene che codifica per una proteina, apolipoproteina B, fondamentale
per il trasporto dei grassi nel sangue. Questo gene viene espresso solo da due tipo cellulari: dagli
epatociti e dagli enterociti. Nel fegato viene prodotta la proteina intera, chiamata proteina B100 (che
sta per 100%); nellenterocita invece viene prodotta sempre dallo stesso gene una proteina diversa e
pi corta, la proteina B48 (48%).
Perch? Nellenterocita presente lenzima che si chiama citidina-deaminasi. Quello che
avverrebbe normalmente mediante molecole di acqua qua viene catalizzato enzimaticamente. Con
la deaminazione della citosina, questa si trasforma in uracile. Cambiando il nucleotide cambia il
messaggio. Il gene intero codifica per la proteina apolipoproteina B100. Nell'mRNA gi splicingato,
in un punto quasi vicino alla met, c CAA (glutammina). La citosina della sequenza, negli
enterociti, viene sottoposta allazione della citidina-deaminasi e trasformata in uracile. Il codone

diventa UAA, un codone di stop. Ci sono dei meccanismi che impediscono la degradazione del
messaggio con uno stop codon prematuro.
Viene cos prodotta la proteina B48 che serve allenterocita per veicolare i grassi alimentari e
formare i pilomicroni. Il fegato, invece, con la proteina intera, veicola le proteine LDL per
trasformarle in colesterolo. sempre lo stesso gene per, mentre nel fegato il meccanismo di RNA
editing non avviene e riproduce la proteina intera, nellenterocita si produce una proteina pi corta
con una funzione differente rispetto la proteina intera.

Traduzione
Si analizzi l'evento della traduzione. La traduzione avviene in appositi apparati, i ribosomi, i quali
sono costituiti da rRNA con prevalente funzione strutturale, e da proteine che svolgono attivamente
la loro funzione nel creare le cavit fondamentali affinch possa avvenire il processo di conversione
del messaggio molecolare contenuto nei codoni in amminoacidi, cio il messaggio chimico
rappresentato in una sequenza degli amminoacidi e quindi nella proteina.
Anche se i ribosomi sono formati da rRNA e da proteine ribosomiali diversi, assumono la stessa
conformazione tridimensionale, sia nei procarioti sia negli eucarioti. Nei procarioti, quando il
ribosoma sta funzionando, intero ed ha un coefficiente di sedimentazione 70S. formato da due
subunit, una maggiore ed una minore: la maggiore di 50S, la minore di 30S. La maggiore
formata dall'rRNA batterico 5S, dall'rRNA 23S e da circa 34 proteine, delle quali nessuna ha attivit
enzimatica. Queste proteine vengono indicate con i numeri arabi da 1 a 34 (circa) preceduti dalla
lettere L (Large). Se ci si riferisce alla proteina L24, questa corrisponde alla 24a proteina della
subunit maggiore del ribosoma batterico. La subunit minore formata dall'rRNA 16s e da circa
21 proteine. Anche in questo caso le proteina non hanno alcuna attivit enzimatica. Le proteine
della subunit minore vengono indicate con i numeri arabi da 1 a 21 preceduti dalla lettere S
(Small).
Il ribosoma eucariote un pochino pi grande, per la conformazione tridimensionale sempre la
stessa. Ha un coefficiente di sedimentazione 80S e due subunit: quella maggiore di 60S e quella
minore di 40s. La subunit maggiore formata da tre rRNAe da 52 proteine: il 5S (trascritto
dall'RNApol 3), il 5,8S ed il 28S (il pi grande, simile al 23S nei procarioti). I componenti proteici
vengono indicati con i numeri preceduti dalla lettera L (Large), alla quale preceduta la lettera e
minuscola (eukaryotic). Per cui, Se ci si riferisce alla proteina eL24, questa corrisponde alla 24a
proteina della subunit maggiore del ribosoma eucariote. La subunit minore formata dall'rRNA
18S e da circa 33 proteine. Anche queste si indicano con numeri arabi, preceduti dalla sigle eS
(eukaryotic small).
L'rRNA 28S eucariote e l'rRNA 23S eucariote sono molto grandi e nelle proteine sono presenti
diverse regioni. La maggior parte di queste regioni sono strutturali, cio partecipano, assieme agli
altri rRNA, a costruire la struttura della subunit maggiore. Due regioni hanno attivit
riboenzimatica. Una di queste, crea un centro che si chiama centro della peptidiltransferasi ed
quello che catalizza il legame peptidico tra gli amminoacidi che vengono trasportati dai transfert.
Quindi non ci sono proteine esterne che catalizzano il legame peptidico tra gli amminoacidi. lo
stesso ribosoma che determina la produzione delle proteine mediante un'attivit ribozimica, e quindi
l'aggancio degli amminoacidi tra di loro. Il secondo sito riboenzimatico serve per tutte quelle
proteine che sono coinvolte nel regolare in modo molto accurato il processo di traduzione, in modo
tale che il messaggio presente nell'mRNA venga trasformato rigorosamente con la massima fedelt
in una corrispondente sequenza di amminoacidi. Il funzionamento di questi particolari fattori della
traduzione dipende strettamente da tale centro ribozimico che risiede sempre nell'rRNA pi grande.
Anche la traduzione avviene in quattro fasi: una fase di pre-inizio che sempre la fase critica; una
fase d'inizio che anche in questo caso un flash; una fase di allungamento molto accurata che una
fase ripetitiva; infine una fase di terminazione. Per quanto riguarda la fase di pre-inizio, ci sono
delle piccolissime differenze tra procarioti ed eucarioti. La fase di allungamento identica sia nei
procarioti sia negli eucarioti . Per quanto riguarda la fase di terminazione, fino a poco tempo fa si

pensava che avvenisse allo stesso modo. Nei procarioti per un poco pi articolata perch avviene
in pi tappe, fino alla separazione delle due subunit che hanno funzionato, mentre negli eucarioti
avviene in un unico step molto particolare, dove sono coinvolte le proteine PABP di tipo C che
legano la coda di poli-A dei messaggeri; una terminazione strettamente associata al meccanismo
che ha il compito di togliere dalla circolazione tutti i messaggeri che hanno uno STOP codon
prematuro.
Il legame peptidico un legame carbammidico. Qual la particolarit? un legame parzialmente
doppio: c' risonanza. Quindi gli amminoacidi che vengono agganciati fra loro non possono ruotare
uno intorno all'altro. Questa piccolezza una condizione fondamentale per la caratteristica
funzionale delle proteine: grazie a questo meccanismo una proteina, quando nasce, nasce rigida
come fosse una molla e una indi ha le necessita di scaricare questa energia di rigidit ripiegandosi
su se stessa a formare delle strutture secondarie e terziarie, a volte anche molto complesse che
danno ragione della versatilit delle proteine in termini funzionali.
Il ribosoma completo ha tre cavit principali dove avvengono tutti i meccanismi che permettono la
traduzione stessa del messaggio molecolare di una proteina. Un primo sito verso l'estremit a
destra del ribosoma, che si chiama sito A (aminoacidico). La maggior parte del sito A
localizzavate sulla subunit maggiore ma una piccola parte localizzata sulla subunit minore.
Questa piccola parte quella dove avviene proprio la conversione del messaggio e sia chiama
centro di decodificazine. Ovviamente il sito A diventa reale solo quando le due subunit sono
unite; se sono staccate non si pu parlare di sito A ma di porzione del sito A sulla subunit maggiore
e di porzione di sito A sulla subunit minore. Poi al centro c' il sito P (peptidico), anche questo per
la maggior parte presente a carico della subunit maggiore ed una piccola porzione presente a
livello della subunit minore. Infine il sito E o di eliminazione, ancora maggiormente presente sulla
subunit maggiore e una piccola parte sulla subunit minore. Tra il sito A e sito P, l'rRNA maggiore
crea il centro della peptidiltransferasi per catalizzare la formazione del legame peptidico tra gli
amminoacidi. Mentre sopra il sito A (e comunque in contatto) presente un altro sito catalitico
ribozimico molto importante per regolare e rendere efficiente la reazione di traduzione, il quale
prende il nome di legame dei fattori (fattori della traduzione). Il sito sar implicato durante la fase
di pre-inizio, inizio, allungamento e di terminazione. La porzione che si trova nel sito A sulla
subunit minore si chiama centro di decodificazione. a questo livello che avviene la decodifica
del messaggio biologico nel messaggio chimico rappresentato dalla proteina., perch va a legare il
transfert con il suo anticodone e, portando l'amminoacido, lo esibisce alla proteina in sintesi.
Come avviene la fase di pre-inizio nei procarioti? I transfert carichi che fuoriescono dalla sintetasi
o amminoacil-trans-tRNA- sintetasi, non sono mai liberi nel citoplasma, n nelle cellule procarioti
n eucarioti, ma vengono subito agganciati da un fattore di allungamento della traduzione. Quindi
tutti i transfert vengono agganciati dai fattori di allungamento della traduzione tranne uno che deve
essere agganciato da un fattore d'inizio. Questo non deve essere riconosciuto dai fattori di
allungamento e possiede una modifica. Nel primo caso, nei procarioti, il codone di start sempre lo
stesso nella maggior parte dei casi, ed il codone AUG che codifica per la metionina. Ovviamente,
anche all'interno di un messaggio molecolare, e quindi di un messaggero, ci sono degli AUG che
codificano per le metionine interne. Pero la metionina iniziale che poi destinata ad essere rimossa
da tutte le proteine, sia nei procarioti sia negli eucarioti, deve avere una particolarit perch questa
metionina e il transfert che la trasporta devono essere diversi rispetto alle metionina incorporata
all'interno delle proteine. Ed in effetti questa metionina, definita iniziale, o meglio il relativo
transfert che viene indicato come tRNA iniziatore, modificata, ossia una metionina la quale sul
gruppo amminico in alfa contiene un gruppo formile, e quindi una formil-metionina, detta anche
f-metionina. La modifica a carico della metionina permette al transfert che la trasporta di non essere
riconosciuta dai fattori di allungamento ma di essere riconosciuta dal fattore d'inizio, proprio perch
deve iniziare e deve essere il primo amminoacido della traduzione.
Negli eucarioti la metionina normale ma la modifica risiede nel transfert iniziatore. La modifica
consiste nella fosforilazione dell'OH in 2 del nucleotide LXIV del transfert iniziatore. Quindi la
fosforilazione del transfert che trasporta negli eucarioti una metionina normale, permette di non

essere riconosciuto dai fattori di allungamento ma dai fattori d'inizio che quindi lo catturano e lo
portano a livello della subunit minore del ribosoma affinch abbia inizio il processo di traduzione.
Quindi la modifica sulla metionina nei procarioti e sul transfert sugli eucarioti.
Nei procarioti la fase di pre-inizio mediata da tre soli fattori, da tre proteine che prendono il nome
di IF (inizial factor): IF1, IF2, IF3. Sono uguali negli eucarioti. Che funzione ha il fattore IF3? Si
lega sempre sulla subunit minore a livello di quello che sar il sito E ed ha una funzione antiassociativa: finch questo fattore sar presente sulla subunit minore, quella maggiore non avr
nessuna possibilit di agganciare la minore. Questo perch necessario che nella subunit minore
avvenga il pre-assemblaggio di tutto ci che occorre per l'inizio della traduzione. Il fattore IF1 va a
localizzarsi nel centro di decodificazione, mascherando il secondo codone in modo tale che dei
transfert che si trovano in circolazione non vadano a legarlo per non rovinare il processo di preassemblaggio, di pre-inizio del processo. Il terzo fattore, la proteina IF2, una proteina speciale
sempre presente durante l'evento di traduzione. una proteina G, le quali sono proteine che
idrolizzano molecole di GTP, una molecola energetica che la cella preferisce utilizzare per il
processo di traduzione. Le proteine G (come IF2) si chiamano guanosil-trifosfatasi.
Inizialmente IF2 inattiva, si trova in una ben determinata conformazione perch si porta sempre
dietro il suo substrato, il GTP. In tale stato, ha la capacit di riconoscere il transfert il quale
modificato per la presenza di un gruppo formile sulla metionina. Catturato l'f-Met-tRNA, lo
trasporta a livello de sito P.
Il messaggero arriva per primo sulla subunit minore. Quindi la subunit minore, la quale legata a
IF3 (fondamentale) quando il ribosoma non sta lavorando per impedire che si leghi alla subunit
maggiore, va ad agganciare il messaggero appena fuoriesce dalla RNApol. E come fa ad
agganciarlo? Lo aggancia perch sull'mRNA, prima dello start, presente una sequenza che
perfettamente complementare, che si trova nella parte 3' terminale dell'RNA 16S della subunit
minore e che si chiama sequenza di Shine-Dalgarno. Nei procarioti, tramite tale sequenza, il
messaggero viene legato con dei legami a idrogeno sulla subunit minore e l'interazione fa s che il
codone di start si trovi spontaneamente a livello di quella porzione della subunit minore che
successivamente dar luogo al sito P.
Il codone AUG si trova a livello del futuro sito P. Il secondo codone si trova sul futuro sito A, cio
il centro di decodificazine. Il fattore IF1 va a mascherare il sito A per impedire che qualche transfert
vagante possa rovinare il pre-assemblaggio. Dopo, IF2-GTP va a catturare la f-Met-tRNA,
formando un complesso ternario, e va a localizzare questo transfert iniziatore a livello del sito P,
dove c' gi il messaggero con il codone di start. Il tRNA iniziatore ha un anticocone in grado di
formare subito legami a idrogeno con il codone di start - condizione essenziale per il
proseguimento delle reazioni di traduzione. Un meccanismo inverso avviene quando la traduzione
termina.
Quando si formano i primi legami a idrogeno codone-anticocone sulla subunit minore, la subunit
minore subisce una modifica conformazionale. E se subisce una modifica conformazionale, i gruppi
chimici che erano esposti a livello del sito E e che tenevano uniti il fattore IF3, vengono nascosti.
Quindi, con la formazione dei primi legami a idrogeno codone-anticocone e con il cambio
confomazionale, IF3 perde affinit per la subunit minore e stacca e vien meno dunque l'azione
antiassociativa. La subunit maggiore cos si pu subito legare con la subunit minore. Qua finisce
la fase di pre-inizio e si ha la fase d'inizio.
Quando si viene a formare il ribosoma completo, IF2 inattivo, che porta GTP, prende subito
contatto con il centro ribozimico speciale, sopra il sito A, cio con il centro di legame dei fattori.
Questo centro ribozimico, da inattivo, diventa attivo, quindi IF2, da proteina inattiva, diventa
proteina attiva. E se diventa attiva, su chi esercita la sua attivit? Sul GTP, idrolizzandolo a GDP.
IF2 attivo legato a GDP perde affinit sia per il transfert sia per il ribosoma, e si stacca, portandosi
dietro IF1 con il quale precedentemente aveva preso contatto. Tutto ci solo l'inizio.
Nel momento in cui si ha il passaggio dalla fase di inizio alla fase di allungamento (cio si
allontanano sia IF2 sia IF1 in seguito all'idrolisi di GTP), il ribosoma intero, anche negli eucarioti,
in ci sar un sito E libero, un sito P collegato ai transfert portanti la metionina (in questo caso

formilata, negli eucarioti normale), ed un sito A libero dove viene esibito il secondo codone che
adesso pu essere agganciato dal tRNA corrispondente che porta il corretto amminoacido, il quale
pu essere legato alla metionina iniziale.
Lezione XI

18-05-2012

Traduzione eucariotica
Negli eucarioti il processo della traduzione non tanto differente rispetto a quello dei procarioti. Il
messaggero, prima maturato nel nucleo, deve essere traslocato nel citosol e, essendo RNA, va
incontro a strutture secondarie. Ci non utile ai fini della traduzione e deve quindi essere
rigorosamente lineare. Affinch ci accada, occorrono fattori in grado di mantenere lineare il
messaggero.
Il messaggero arriva nel complesso di preinizio (arriva per ultimo in quanto prima viene assemblata
la subunit minore del ribosoma). I fattori di inizio negli eucarioti sono tanti, raggiungono la
trentina, e sono proteine multifunzionali con pi subunit. Il primo un fattore detto eIF3 (e sta per
eucarioti) e si lega a livello del sito E. Ha azione anti-associativa. Quindi, fin quando c questo
fattore, le due subunit restano separate. Poi c il fattore eIF1 che si localizza a livello del centro di
decodificazione per mascherare il secondo codone impedendo ai tRNA vaganti di agganciare il
codone e rovinare lassemblaggio del ribosoma. eIF2 una guanosil-trifosfatasi inattiva e viaggia
associata al substrato che il GTP. Ha il compito di riconoscere il tRNA iniziatore che diverso dai
transfert che sono riconosciuti dai fattori di allungamento. La modificazione negli eucarioti, in cui
la metionina normale, la modifica a livello del transfert e precisamente a livello del LXIV
nucleotide fosforilato. Impedisce il riconoscimento dei fattori di allungamento, mentre consente il
riconoscimento del fattore eIF2 di inizio. Quindi eIF2 riconosce il transfert con la metionina
normale e lo va a localizzare a livello del sito, per ancora il messaggero non arrivato.
Un'altra guanosil-trifosfatasi inattiva eF25b che aiuta eIF2 a mantenere in sede il tRNA iniziatore
trasportato da eIF2. Questi preassemblano la subunit minore del ribosoma per linizio della
traduzione. In assenza dell'mRNA si forma il complesso iniziatore 43S. In effetti negli eucarioti la
subunit minore 40S non si trova mai se non appena questa viene sintetizzata e fa ingresso nel
citoplasma dal nucleo al ctosol mediante il complesso del poro nucleare. Quindi nel citoplasma ci
sar sempre la subunit maggiore 60S e la subunit minore 43S gi preassemblata e pronta per la
traduzione. Dallaltro lato arriva l'mRNA che riconosciuto dai fattori che lo devono trasportare
alla sub 43S. Questo fattore eIF4f ed diviso in tre subunit legate fra loro linearmente:
la subunit E: riconosce il cappuccio in 5' e le sue modifiche;
le subunit C e A: si legano al tratto 5' non tradotto del messaggero.
EF4f, grazie ai propri gruppi chimici, riconosce i gruppi chimici esposti dal complesso 43S; quindi
il messaggero viene portato a livello della subunit 43S. Al contempo il messaggero presenta
strutture secondarie che devono essere eliminate grazie alla rottura dei legami a idrogeno e a questo
ci pensa eIF4b che un elicasi: idrollizza ATP, rompe i legami a idrogeno del messaggero e lo
linearizza, eliminando le strutture secondarie. Questo fattore accompagna il messaggero per tutta la
durata della traduzione poich, ogni qual volta che il ribosoma incontra una struttura secondaria,
eIF4b idrolizza ATP e linearizza il messaggero. Quindi eIF4b agisce nel processo di inizio e di
allungamento, distruggendo le strutture secondarie.
A questo punto arriva l'mRNA ma lanticodone del tRNA iniziatore si trova a livello di nucleotidi
diversi del codone di start. Quindi, mentre nei procarioti grazie alla sequenza di Shine-Dalgano il
legame mRNA subunit minore determinava la presenza dello start codon a livello del sito P e
quindi si apriva la sequenza di lettura, negli eucarioti ci non accade: la subunit minore deve
ricercare lo start codon (codone AUG) in modo che si complementarizzi con lanticodone del
transfert iniziatore e apra la sequenza di lettura. La subunit 43S attua un processo di scansione

dell'mRNA durante il quale i fattori che hanno portato l'mRNA nella subunit minore rimangono in
essa. Lo start codon si trova allesterno, l'mRNA scorre fin quando lo start codon raggiunge il sito P.
Qui lanticodone former legami a idrogeno con il codone di start, bloccando l'mRNA, e si apre la
sequenza di lettura. La parte iniziale non tradotta viene staccata dal ribosoma e rimangono in essa
solo i codoni che devono essere copiati.
Coma fa la subunit 43S a riconoscere lo start codon? Nella regione 5'UTR non ci sono molti
AUG: probabile che il primo AUG che si incontra sia quello corretto(questo nei vertebrati, uomo
compreso). Nei vertebrati inferiori lo start codon si trova a livello della sequenza di Kozak in cui il
primo codone del secondo nucleotide una guanina. Nei geni umani per il secondo nucleotide
raramente una guanina. Quindi nelluomo non la sequenza di Kozak che permette alla subunit
minore di individuare il codone di start e aprire la sequenza di lettura, ma semplicemente il primo
codone di start che incontra.
La RNA-polimersai 4 unisoforma di splicing alternativo della RNA-polimerasi mitocondriale.
insolito che un piccolo tratto di introne viene tenuto nel messaggero; in questo caso, poich lo stop
codon vicino allo start, la subunit 43S non lo accetta come un vero start e quindi continua la
scansione. Subito dopo l'introne, gi dal XX nucleotide ci sono degli start codon, addirittura nel
terzo ci sono ben 4 start codon, per il ribosoma si posiziona sullultimo. Quindi scivola sullultimo
start codon dellesone 3 e tutti gli start codon precedenti a quello non sono allinterno della
sequenza di Kozak, mentre lultimo si trova allinterno della sequenza. Quindi, quando la subunit
43S del ribosoma delluomo non accetta l'mRNA per la presenza di stop codon prematuri, la
scansione ma alla fine disorientato e si ferma dove c uno start codon allinterno di una sequenza
di Kozak, come avviene ne vertebrati inferiori. Si viene a formare una pi piccola RNApol
mitocondriale pur essendoci a monte codoni di start produttivi, quindi uno scivolamento forzato e,
se non fosse per lo start codon che si trova allinterno della sequenza di Kozak, probabilmente il
messaggero non sarebbe mai tradotto.
Una volta che si verifica laggancio tra il tRNA iniziatore e lo start codon, seguono una serie di
eventi uguali a quelli visti nei procarioti. La formazione dei primi legami codone anticodone
provocano un cambiamento conformazionale della subunit minore, per cui i gruppi chimici
precedentemente esposti ora vengono nascosti. eIF3 ma anche i fattori che hanno portato il
messaggero sulla subunit minore (eIF4f) perdono affinit per il ribosoma e si staccano. Quindi la
parte in 5' UTR del messaggero esce dal ribosoma ed eIF3 va fuori. Non essendoci pi lazione
anti-associativa, la subunit minore si lega alla subunit maggiore, formando il ribosoma completo
e si ha la fase di inizio. eIF2 ed eIF5B entrano in contatto con il centro di legame dei fattori. eIF5b
cambia conformazione, idrolizza GTP, diventa attivo e perde affinit col ribosoma e stacca
contemporaneamente eIF1. eIF2 entra in contatto con il centro di legame dei fattori, eIF2 cambia
conformazione, idrolizza GTP, perde affinit e si stacca. Con lidrolisi di due GTP si ha la ripulitura
del ribosoma gi assemblato da parte dei fattori. Questa la fase di inizio.
Quando tutti i fattori si sono staccati, la situazione identica a quella nei procarioti (sito E vuoto;
sito P con tRNA iniziatore legato allo start codon e che porta la metionina iniziale e un sito A libero
dove viene esibito il secondo codone pronto per essere agganciato da un apposito transfert durante
lallungamento). Sia negli eucarioti sia nei procarioti, la fase di allungamento uguale con gli stessi
sistemi di controllo con fattori di allungamento che dal punto di vista proteico sono identici e
svolgono la stessa funzione. Linizio un flash con differenza, rispetto ai procarioti, durante
lassemblaggio del complesso di preinizio. Ci pu essere un quiz che dice quante molecole spende
un ribosoma spende per sintetizzare una proteina lunga un certo numero di amminoacidi? Si deve
tener conto:
ATP consumato per caricare lamminoacido su transfert (per 100 amminoacidi bisognano
100 ATP);
nel caso degli eucarioti, per introdurre il primo amminoacido si utilizzano due molecole di
GTP, nei procarioti si utilizza una sola molecola GTP;
nella fase di allungamento non verranno addizionati 100 amminoacidi ma 99 che,
addizzionati alla metionina, sono 100.

Cosa avviene alla subunit G dellestremit 5' UTR del messaggero? Forma legami con proteine
che recidono la coda di poli-A (PABP di tipo C). Queste restano sempre rigorosamente legate al
messaggero stabilizzando la sua linearit. Dall'unione tra le proteine PABP e la subunit G del
fattore eIF4F si viene a formare una struttura del messaggero ad anello per cui pi ribosomi
possono agganciare lo stesso messaggio e tradurlo. In pratica si viene a formare il poliribosoma
grazie ai legami della subunit G del fattore eIF4F e le proteine PABP della coda di poli-A. Inoltre
sembra che quando il ribosoma termina la traduzione poich ha raggiunto un codone di stop
normale, la subunit minore viene subito agganciata per formare il complesso 43S e le stesse sono
agevolate a legare lo stesso mRNA piuttosto che un altro. In questo modo si accellera la produzione
di una proteina codificata da quel mRNA.
Durante la fase di allungamento, ci sono fattori che intervengono nel processo garantendo assieme
al ribosoma il corretto ingresso dellamminoacido. Qui ci sono dei meccanismi di controllo che
devono essere precisi per permettere lentrata dellamminoacido specifico codificato dal codone
dell'mRNA. Sia nei procarioti sia negli eucarioti avviene la stessa cosa: nei primi sono due i fattori
di allungamento, EFTU, dove EF sta per elongation factor, e EFG, detto traslocasi; nei secondi vi
sono proteine diverse che svolgono la stessa funzione, eEF1 (corrisponde a EFTU), ed eEF2
(corrisponde a EFG), entrambe formate da pi subunit. La subunit del fattore eEF1
particolarmente manipolata dalle tecniche di biologia molecolare.
Ci sono tre meccanismi di controllo per lingresso del corretto amminoacido affinch la traduzione
avvenga in modo spedito e specifico. EFTU o eEF1 negli eucarioti riconoscono e legano i transfert
liberi e carichi nel citopalsma, i quali sono sempre legati ai fattori suddetti, che sono guanosiltrifosfatasi inattive e sono legati al GTP. Quando si aggiungono al transfert, formano un complesso
ternario (EFTU-GTP-aa-tRNA). Il transfert viene legato dal lato dellamminoacido, cio dalla parte
3' terminale. Ovviamente non pu essere legato dalla parte dellanticodone, altrimenti sarebbe
mascherato. Il legame in 3' terminale ha significato specifico: lamminoacido ha il gruppo
carbossilico legato covalentemente al transfert attraverso lOH in 2' o lOH in 3' dell'adenina che fa
parte della sequenza CCA a livello del 3' di tutti i transfert. Il gruppo carbossilico cos impegnato
nel legame covalente con il transfert. Il gruppo amminico importante per la reazione pepditiltrasferasica, cio dellaggancio tra l'amminoacido legato al tRNA e l'amminoacido della sequenza
peptidica della proteina in sintesi. Il gruppo amminico scomodo se il transfert non si trova nel sito
A, quindi il gruppo amminico deve essere mascherato.
I ribosomi sono continuamente bombardati da transfert carichi. Se il gruppo amminico non fosse
mascherato, sicuramente il transfert andrebbe a sbattere nel centro pepditil-trasferasico e, se fosse
presente un gruppo amminico, il centro ribozimico catalizzerebbe la reazione poich non fa
differenza tra gruppi amminico. Il transfert per si deve allineare con quello presente nel sito P il
quale catalizzerebbe la reazione. In questo caso la proteina in crescita verrebbe caricata su un
transfert vagante rovinando la sintesi proteica. Quindi, se il gruppo amminico non fosse mascherato,
la sintesi proteica sarebbe possibile. Questo legame tra il fattore EFTU e il transfert carico ha lo
scopo di mascherare il gruppo amminico affinch il processo di traduzione possa essere realizzato.
Il sito in attesa che qualche transfert entri. Entra il transfert corretto formando legame codone
anticodone. Anche se lanticodone del transfert che entra quello giusto, in grado di
complementarizzarsi col codone che a livello del sito A, lenergia di legame tra le basi non
sufficiente per il legame codone anticodone. Il transfert resta cos alzato e, di conseguenza, EFTU
resta al di fuori del ribosoma ma, affinch tutto prosegua, necessario che EFTU prenda contatto
col ribosoma e qui v' il secondo meccanismo di controllo. Se lanticodone si complementarizza
perfettamente col codone a livello del sito A, a livello dell'rRNA 16S, proprio a livello del centro di
decodificazione, ma anche nell'rRNA 18S nel caso dei ribosomi eucariotici, ci sono due adenine
adiacienti: se si viene a formare una doppia elica corretta codone anticodone, le adenine che si
trovano sotto, possono formare legami a idrogeno con i gruppi chimici laterali delle basi, sia del
codone sia dellanticodone, danno energia addizionale e, se il legame codone anticodone di
maggiore energia, questi si avvicinano di pi. Quindi se il codone corretto e se le due adenine

possono formare legami con i gruppi chimici laterali residui dellanticodone, lanticodone scende di
pi verso nel sito A ed EFTU pu prendere contatto col ribosoma. Se invece l'anticodone di un
tRNA errato forma dei legami a idrogeno con il codone, lenergia minore, quindi lanticodone
resta pi alto e le due adenine non possono dare la giusta energia addizionale. Di conseguenza, il
tRNA lascia il sito A per cederlo ad un transfert corretto. Nel momento in cui il transfert scende nel
sito A poich corretto, grazie alle due adenine che eseguono il controllo, EFTU prende contatto col
ribosoma, idrolizza GTP e si stacca dal ribosoma.
Terzo meccanismo di controllo: quando EFTU se ne va, lamminoacido deve essere trasportato nel
centro pepditil-transferasico affinch possa essere incorporato nella proteina in crescita. Il tRNA
deve cos ruotare di 180. La rotazione ha una duplice funzione:
portare lamminoacido nel centro pepditil-transferasico;
se il tRNA legato al codone tramite legame a idrogeno, per ruotare di 180 deve essere
legato saldamente al codone, quindi questa rotazione, detta accomodamento, pu avvenire
solo se lanticodone quello corretto; se quello corretto il transfert si gira poich ben
agganciato ed esibisce il suo amminoacido al centro pepditil-trasferasico; se qual cosa nel
secondo meccanismo di controllo non andato per il verso giusto e quindi il transfert non
quello corretto (quindi sceso sufficientemente nel sito A e ha provocato lo spostamento del
fattore EFTU), il transfer non sopporter laccomodamento perch non avr lenergia
necessaria per rimanere legato al codone, viene a mancare lenergia e quindi si stacca.
In questo meccanismo di controllo nessun transfert errato pu essere incorporato. Nessun
amminoacido non codificato dal messaggero pu essere incorporato nella catena polipeptidica in
crescita. Il gruppo amminico dell'amminoacido innesca la reazione sul gruppo acilico e quindi il
centro ribozimico stacca la proteina del transfert del sito P e la aggancia al gruppo amminico
dellamminoacido posto sul sito A. Quindi il transfert a livello del sito P viene scaricato per poi
uscire ed entrare in una nuova sintetasi per essere caricato. Il transfer che contiene almeno un
dipeptide, richiama il fattore di allungamento EFG o traslocasi, che una guanosil-trifosfatasi
inattiva con GTP, e, nel momento in cui entra nel sito A, non riesce a scendere nel sito di
decodificazione, prende contatto con il centro dei legami dei fattori e diviene attiva, cambiando
conformazione e idrolizzando GTP. Solo cos lenergia libera pu far cambiare nuovamente
conformazione. L'EFG-GDP scendere nel centro pepditil-transferasico e spinge il transfert con la
sua proteina dal sito A al sito P, mentre il transfert che era nel sito P va nel sito E, rompe i legami a
idrogeno e fuoriesce per essere ricaricato (processo di traslocazione). Di conseguenza, scivolando
di codone, nel sito A ci sar il codone successivo, un'altre situazione di partenza: sito E libero; sito P
con il transfert con la proteina ora pi lunga di un amminoacido; sito A libero che esibisce il
successivo codone per essere agganciato dal successivo transfert.
Per ogni incorporazione di un amminoacido vengono spesi 2 GTP. Si procede fin quando nel sito A
compare il codone di stop e sono UAA,UGA e UAG. In effetti il codone di stop in tutti gli
organismi UAA perch non pu essere mai by-passato. Negli eucarioti ci sono 21 amminoacidi
proteici perch c la selenocisteina. Il codone che codifica per la seleniocisteina UGA. Nei
procarioti, ci sono 22 amminoacidi proteici. Alla selenocisteina va aggiunta la pirrolisina che
codificata da UAG. Entrambi gli amminoacidi sono sintetizzati al momento, cio inducibili e
vengono sintetizzati anche i relativi transfert. Se non ci sono transfert ma ci sono gli amminoacidi, i
codoni UGA e UAG fungono da segnale di stop.
Quando nel sito A compare un codone di stop, ci sar un transfert che si complementarizza con il
codone di stop poich ci sar il secondo e il terzo meccanismo di controllo che non consentono
lingresso ai transfert non corretti. Si avr un blocco della traduzione, il ribosoma non scorrer il
messaggero e questo blocco richiama fattori di rilascio perch permettono il rilascio della proteina
neosintetizzata. I fattori di rilascio si dividono in fattori di rilascio di classe 1 e fattori di rilascio
di classe 2. Nei procarioti ci sono:
due fattori di classe 1, proteine in grado di legare le basi del codone di stop, dette releasing
factor. RF1 riconosce UAG e UAA ed RF2 riconosce UGA e UAA;

un solo fattore di classe 2 detto RF3.

Nei procarioti, RF1 e RF2 hanno due domini uguali: il primo detto anticodone peptidico o SPF,
costituito da serina, prolina e fenilalanina. Questi si avvicinano al centro di decodificazione e
lanticodone peptidico forma legami a idrogeno col codone di stop. Laltro dominio detto GGQ
(glicina, glicina e glutammina). La glutammina ha un azoto laterale libero che pu ingannare il
centro della pepditil-transferasi. Questo azoto non si trova in posizione e quindi la proteina non
pu essere legata con legame peptidico. Nel momento in cui il ribosoma si trova nel codone di stop
e quindi staziona perch non ci son transfert in grado di legarlo, ecco che uno dei due fattori di
rilascio di classe 1 si va a posizionare nel sito A e lanticodone peptidico o SPF forma legami a
idrogeno con le basi dellanticodone. Appena il fattore entra, GGQ si trova nel sito A ma, nel
momento in cui si formano i legami tra lanticodone peptidico e le basi del codone di stop, il fattore
di classe 1 cambia conformazione e GGQ viene spinto nel centro della peptidiltrasferasico. Quindi,
grazie ai legami anticodone peptidico codone di stop, GGQ prende contatto con il centro pepditltrasferasico. Lazoto laterale della glutammina inganna il centro peptidil-trasferasico, nel senso che
innesca la reazione e quindi in grado di idrolizzare il legame acilico (estereo) tra il gruppo COOH
dellultimo amminoacido incorporato e il transfert presente nel sito P. Dovrebbe seguire la seconda
reazione che forma il legame peptidico ma non pu avvenire perch il gruppo amminico in , di
conseguenza la prima reazione di taglio avviene (la proteina viene staccata dal transfert) ma la
seconda non avviene perch manca il gruppo amminico in . La pepditil-transferasi non pu fare
altro che cedere il gruppo COOH appena staccato ad una molecola di acqua ed ecco che la proteina
viene rilasciata a seconda del proprio destino, quindi verr immessa nel citoplasma; raggiunger il
sistema membranoso; i mitocondri; i perossisomi; altre destinazioni in base al segnale di
localizzazione.
avvenuto il rilascio della proteina. Il ribosoma rimane bloccato con RF1 di classe 1 che ha
ingannato la pepditil-transferasi ed ha rilasciato la proteina nel sito A. Il transfert che conteneva la
proteina rimane agganciato al codone mentre laltro sta uscendo. Arriva RF di classe 2, cio RF3, la
cui funzione quella di staccare dal sito A il fattore di rilascio di classe 1 che ha appena provocato il
rilascio della proteina. RF 3 libera il sito A. Come? Idrolizza GTP. RF3 una proteina guanosiltrifosfatasi attiva (contiene GDP) e, in tali condizioni, non ha affinit per il ribosoma a meno che
non ci sia il fattore di rilascio di classe 1: infatti solo in questo caso RF3 si avvicina al ribosoma ma,
nel momento in cui prende contatto con il ribosoma, diventa inattiva, ovverosia cambia
conformazione da GDP a GTP. Di conseguenza, rilascia GDP e acquisisce GTP, e laffinit per il
ribosoma massima. RF3, dopo essere diventato inattivo, scaccia RF1 facendolo staccare dal sito,
prendendo il suo posto nel sito A. Ha cos espletato la propria funzione, cio far uscire il fattore di
rilascio di classe 1. RF3 una guanosil-trifosfatasi inattiva con GTP. Il centro di legame di fattori
cambia conformazione da inattivo diviene attivo, quindi RF3, legato a GTP, perde affinit dal
ribosoma, si stacca e lascia il sito a libero.
Nei procarioti v' un altro problema: lanticodone del transfert su cui era localizzata la proteina,
ancora legato tramite legame a idrogeno al suo codone e il transfert si trova nella subunit
maggiore. Il suo anticodone legato al codone si trovano nella sub unit minore, quindi ancora
subunit maggiore e minore sono legati insieme. Inoltre c il messaggero, quindi sono necessari dei
fattori che dividono le due subunit: questi fattori sono fattori di riciclo dei ribosomi o RRF.
Come trova il sito A libero? Liberato da RF1, il fattore RRF si lega al sito prendendo contatto col
codone di stop. RRF inganna un fattore di allungamento poich emula un transfert contenente
almeno un dipeptide che richiama la traslocasi EFG. La traslocasi, pensando che che ci sia un
transfert con una proteina, si localizza a livello del sito P ed esegue la sua attivit come se fosse
lallungamento: prende contatto con il centro dei legami dei fattori, idrolizza GTP e lenergia viene
utilizzata per cambiare conformazione per scendere nel centro di decodificazione dove il fattore di
riciclo ha contatti con il codone di stop. Quindi sposta i tre nucleotidi al codone di stop e il fattore di
riciclo, che in questo caso non si trova pi nel sito A ma nel sito P in cui prima c'era il transfert,
sposta il tRNA dal sito P al sito E, rompendo i legami a idrogeno col codone e fuoriesce. Con questo

spostamento non solo si avr lallontanamento del transfert scarico ma anche la rottura degli ultimi
legami idrogeno codone anticodone.
La subunit minore ricambia conformazione, riespone i gruppi chimici che tenevano il fattore
antiassociativo di inizio che IF3 che si lega ai gruppi sulla subunit minore del ribosoma. Quindi
scaccia via la subunit maggiore, provocando la separazione delle due subunit. La subunit minore
dissociata la situazione di partenza.
Negli eucarioti? Come avviene il rilascio di una proteina? Fino al 2010 si pensava che anche negli
eucarioti avvenisse un meccanismo di terminazione della traduzione del tutto simile ai procarioti.
Nel 2010 fu scoperto che il meccanismo diverso ed legato ad eliminare messaggeri stop codon
prematuri presenti nel genoma derivanti da mutazioni, quindi che possono provocare patologie
dovute alla presenza sull'mRNA di stop codon prematuri. Lo stop codon prematuro pu derivare da
altri meccanismi o da danni che il messaggero subisce o per splicing alternativo. Le due subunit
del ribosoma si assemblano nel nucleolo, poi fuoriescono. La subunit maggiore subisce un
ulteriore grado di maturazione nel citoplasma mentre la subunit minore gi matura quando
fuoriesce dal nucleo. Nel nucleo la subunit maggiore inattiva.
Mangiarotti, professore presso luniversit di Torino, che negli anni '60 aveva lavorato con Watson,
scopr che nel nucleo si assemblano i ribosomi che scansionano il messaggero e quindi peno che
pu avvenire la traduzione nucleare. Non si deve pensare ad una traduzione produttiva. Nel nucleo
c un controllore del messaggero che ha il compito di controllare la correttezza del messaggero ma
allo stato attuale non c' nessuna prova che avvenga la traduzione produttiva. Dagli studi condotti
da Mangiarotti che nel nucleo si assemblano ribosomi con la subunit maggiore immatura e questi
ribosomi hanno il compito di scansionare il messaggio senza produrre la proteina. Questo
rappresenta il terzo punto di controllo che controlla la correttezza del messaggero anche in termine
di quantit. Quindi controlla lespressione genica.
Negli eucarioti c' un solo fattore di rilascio di classe 1, l'eRF1 che riconosce tutti e tre codoni di
stop, ed un fattore di rilascio di classe 2, eRF3. stato osservato che tutte e due sono sono in grado
di provocare il rilascio della proteina negli eucarioti. Quindi, quando compare uno stop codon nel
sito A, eRF1, tramite l'anticodone peptidico, va a legare il codone di stop, cambia conformazione ed
espone gruppi chimici per i fattori di classe 2, eRF3-GTP. Questo si lega a eRF 1 e sporge nel sito A
in attesa che qualcuno lo possa legare. Sono due le proteine che lo possono legare e provocare due
meccanismi differenti. La proteina chiave nella terminazione normale della traduzione la proteina
PABP di tipo C, la quale ha un suo dominio ad incastro che in grado di legarsi con eRF3 poich
in prossimit dello stop codon normale c la coda della poli-A che si muove in tutte le direzioni.
eRF1 ed eRF3 aspettano che la coda sbatta sul ribosoma e una proteina PABP di tipo C agganci
eRF3: si ha idrolisi di nucleotidi guanidilici e si presuppone che contemporaneamente si abbia il
rilascio della proteina. La subunit minore cambia conformazione, eRF3 giunge nell'apparato di
traduzione e le due subunit si separano.
Si proposto un modello unificato, modello che permette di degradare e messaggeri con stop
codon prematuri che sono indesiderati della cellula, e mRNA in cui v' una mutazione che trasforma
stop codon in codone codificante. La traduzione continua fino a tradurre la coda di poli-A. Si avr
una proteina pi lunga con una coda di polisina, codificata da poli-A. Il fattore sky-7 apre
forzatamente le due subunit del ribosoma (con l'aiuto dell'arrivo di eIF3) per riciclarle e si porta
dietro una particella esosoma al cui interno vi sono enzimi per la degradatazione. Inoltre la coda di
polilisina rende la coda instabile, una proteasi degrader la proteina, che pi lunga e tossica per la
cellula.

Lezione XII

21/05/2012

Sistema NMD ed altri sistemi di controllo


A proposito della traduzione negli eucarioti, al contrario di quanto si osserva nei procarioti, i due
fattori di rilascio di classe 1 e di classe 2, eRF1 ed eRF3, si agganciano uno con l'altro e al primo
codone di stop e fanno in modo che eRF3 sporga dal sito del ribosoma, in attesa di poter essere
legato da una proteina specifica che ha un sito in grado di prendere dei contatti deboli ma specifici
con esso. Una di queste proteine la proteina PABP di tipo C, presente a livello della coda di poliA. Quando avviene l'interazione PABP di tipo C con il ribosoma, viene idrolizzat almeno una
molecola di ATP e si verifica contemporaneamente il rilascio della proteina e la separazione delle
due subunit del ribosoma. In questo modo potranno essere riciclate.
Diversamente da quanto espresso sopra, il fattore eRS3 pu essere agganciato da un'altra proteina,
proteina UPF1 (dove UPF sta per Up-Stream Transcript). Si sapeva gi da molto tempo che quando
ci sono messaggeri con degli stop codon prematuri, detti PTC (Prematur Terminal Codon), la
relativa proteina, nella stragrande maggioranza dei casi, non veniva prodotta, con conseguente
comparsa di anomalie genetiche, anche molto gravi (si veda la distrofia muscolare di Duchenne,
alcune forme di fibrosi cistica). Nelle talassemie, che sono molto frequenti anche nella popolazione
mediterranea, si osservava che il messaggero veniva regolarmente trascritto ma poi alla fine
scompariva. Quindi si riteneva che in qualche modo ci fosse, a livello nucleare, una sorta di
controllore che oggi si sa essere sulla base degli esperimenti di Mangiarotti, un ribosoma immaturo
che scansiona e controlla la bont di questi messaggeri. Il controllore in grado di distruggere i
messaggeri con stop codon prematuri.
Lo stop codon prematuro potrebbe essere anche molto dannoso per la cellula in quanto, producendo
una proteina tronca, nella maggior parte dei casi questa potrebbe essere fortemente tossica per la
cellula. Ad esempio, in alcune forme di talassemie, porzioni di catene globiniche si dispongono ben
compattati alla periferia della cellula, ledendo gravemente l'integrit della membrana cellulare
provocando la lisi delle cellule, con conseguente modifica emolitica. In altri casi si sa che
comunque una proteina in relazione a quanto grande, pu anche funzionare per di questo i
sistemi biologici non ne tengono conto e intanto, quando ci sono stop codon prematuri,
indipendentemente dalla loro origine, vengono scatenati alcuni sistemi che hanno il compito di
degradare prontamente nel nucleo ma anche nel citoplasma i messaggeri con PTC.
Ad esempio, delle catene che si assemblano in immunoglobuline, quindi da un carico di geni che
codificano per le Ige, avevano particolari reazioni di combinazione con conseguente produzione di
proteine che dovrebbero difendere l'organismo. Quindi inevitabile che i messaggeri con uno stop
codon prematuro a carico dei geni dei messaggeri delle Ige, l'organismo non le tolleri. Si pensi solo
al fatto che ci sono delle malattie dovute al sistema immunitario, le malattie autoimmuni, che sono
veramente molto disastrose e in buona parte dei casi, portano l'individuo a morte. Quindi il sistema
ha il compito di eliminare i messaggeri con stop codon prematuri.
Prima della scoperta di questo sistema, si pensava che fosse il nucleo che in qualche modo
sconosciuto si preoccupava della loro eliminazione o che il ribosoma a livello citoplasma si
rifiutasse di tradurre messaggeri con stop codon prematuri. Studiando sui nematodi, alcuni
ricercatori hanno scoperto certe proteine di cui non si conosceva e non si riusciva a capire la
funzione. Queste proteine erano pi corte nei sistemi che riguardavano il corretto sviluppo delle
code. Avevano osservato che se le determinavano il knock out (eliminazione del gene di una di
queste proteine), i nematodi non si sviluppano correttamente, soprattutto a carico delle code.
Successivamente, tre proteine simili sono state scoperte nel lievito, ma solo tre. Nel lievito, essendo
una cellula molto semplice, si scopr che queste proteine in effetti erano coinvolte in quei
messaggeri che possedevano stop codon prematuri. Si inizi a studiare apertamente la problematica
del discorso dei messaggeri con stop codon prematuri. Alla fine si scopr che tutti gli animali, dal
lievito all'uomo, possiedono delle proteine in grado di eliminare dei messaggeri stop codon
prematuri direttamente nel nucleo e se, qualcuno scappa, pure nel citoplasma, indipendentemente

dalla loro origine. Cio o sono messaggeri che vengono trascritti cos perch lo stop codon
prematuro presente nel gene del DNA, o sono messaggeri che vengono danneggiati o derivano dal
secondo meccanismo dell'espressione genica o dallo splicing alternativo errato. O ancora, per altre
ragioni, questi sistemi determinano la rapida degradazione dei messaggeri.
Man mano che si studi, si vide che gli intimi meccanismi, a partire dal lievito fino all'uomo, sono
in effetti un pochino differenti. Per cui impossibile studiare il meccanismi con precisione in tutti
gli organismi in cui stato studiato. Nel 2010 un'associazione di biologi molecolari, che la pi
accreditata a livello mondiale, decise di improntare un modello, detto modello unificato del sistema
NMD e che, in pratica, il modello che d un'idea molto chiara di come pu avvenire la
degradazione dei messaggeri con stop codon prematuri, e pu essere applicato virtualmente a tutte
le cellule, quindi a tutti gli eucarioti. In effetti, per, non avviene cos in nessuna cellula perch
ciascuna avr delle piccole differenze che la renderanno propria. Inoltre, dal lievito all'uomo ci sono
tantissime altre proteine che sono coinvolte nel sistema.
Le proteine chiave di questo meccanismo sono 7, individuate per la prima volta nei nematodi. I
biologi molecolari hanno dato dei nomi che sono in parte relativi al lievito e in parte relativi ai
nematodi, quindi creano un pochino di confusione. Il sistema si chiama sistema NMD (Non sense
Mediated mRNA- Decay, cio degradazione dell'mRNA mediato dalla presenza di uno stop codon
prematuro). Nei nematodi le relative proteine sono SMG, numerate con i numeri arabi da 1a 7. Nel
lievito ce ne sono tre e vengono dette UPF1, 2, 3. Successivamente si scopr che SMG2 del
nematode ha la stessa precisa sequenza della proteina UPF1 del lievito. Lo stesso vale per SMG3,
che ha la stessa sequenza del UPF2 del lievito, cos come SMG4 ha la stessa sequenza di UPF3 del
lievito. Per non creare confusione, hanno cercato di mescolare i nomi del lievito con i nomi dei
nematodi. Quindi, quando si parla delle 7 proteine umane, si tenga conto che ce ne sono almeno
un'altra decina coinvolte nel sistema NMD, per quelle chiave (per poter parlare del sistema
unificato) sono anche qua 7.
La prima proteina in assoluto la proteina SMG1, del tutto identica a quella del nematode ed una
chinasi (le chinasi sono in grado di trasferire gruppi fosfato da molecole di ATP a livello di residui
amminoacidici di proteine in grado di ospitarli; gli amminoacidi in grado di ospitare il gruppo
fosfato sono tre e cio amminoacidi con un OH libero, la serina, la treonina e tirosina). Poi la
proteina UPF1, che la proteina chiave del sistema NMD, e pu agire sicuramente in
collaborazione con altre proteine UPF, potenziando fortemente il sistema stesso ma pu anche agire
da sola. Ci sono poi altre tre proteine fondamentali, che sono SMG 5,6,7. Queste tre proteine sono,
al contrario della prima, delle fosfatasi, cio in grado di eliminare il gruppo fosfato presente sul
residui di treonina, serina e tirosina, liberando la proteina. Quando una proteina viene fosforilata,
cambia conformazione e passa da attiva ad inattiva; al contrario, quando avviene la
defosforilazione, se poca l'affinit per una determinata superficie, la proteina diventa pi affine.
Quindi la defosforilazione ha un effetto opposto alla fosforilazione. La fosforilazione uno degli
interruttori molecolari pi importanti per la traduzione dei diversi segnali.
Si supponga che debba essere tradotto un messaggero con uno stop codon prematuro. Nel momento
in cui il messaggero arriva sullo stop codon premuro, cosa succede? Si ferma, perch non ci sono
transfert in grado di complementarizzarsi con il codone di stop e al loro posto viene attivatodenaturato l'unico fattore di rilascio degli eucarioti che in grado di riconoscere tutti e tre i codoni
di stop. Arriva quindi eRF1 che, con il suo anticocone peptidico, si lega al codone di stop
prematuro, cambia conformazione e richiama a sua volta il fattore di rilascio di classe 2, che in
questo caso eRF3, probabilmente legato al GTP. eRF3 sporge dal sito A del ribosoma e deve
essere agganciato o dalla proteina PABP (determinando una normale terminazione della traduzione)
oppure pu essere agganciato dalla proteina UPF1. Infatti la proteina PABP e la proteina UPF1
competono tra di loro per agganciare eRF3 che sporge nel sito A. Ora, se lo stop codon prematuro si
trova distante dalla coda di pola-A e quindi dalle proteine PABP, inevitabile che UPF1, che
sparso in tutto il citoplasma e anche nel nucleo trattandosi di una piccola proteina, ha un vantaggio
maggiore nel legare eRF3, al contrario di come avviene in uno stop codon normale che molto
vicino alla coda. Quindi, in questo caso, le proteine PABP sono pi avvantaggiate ad agganciare per

primo eRF3. Se invece lo stop codon si trova pi lontano dalla coda (come per esempio al centro
del messaggero), inevitabile che UPF1 arriva per primo ed aggancia per primo eRF3. Il suo
legame inizialmente a bassa affinit. UPF1 per viaggia sempre accoppiato a SNG1, che una
chinasi in grado di fosforilarlo. Quindi, appena legate a eRF3, la chinasi SNG1 determina la
fosforilazione di UPF1, la quale, fosforilata, diventa fortemente affine per eRF3 e non si stacca per
alcun motivo. Resta praticamente un legame molto stabile, nessuno sar pi in grado di scalzarlo da
eRF3. Allora UPF1 fosforilata scende come se pendesse, legata ad eRF3 nel centro del sito P dove
c' legame codone anticodone. Scende nel centro di decodificazione dove c' il codone di stop ma
affianco ci sar il transfert che porta la proteina ancora incompleta e dove ancora il transfer legato
al codone che precede il codone di stop prematuro. Ora, UPF1 fosforilata diventa una
adenosintrifosfatasi, un enzima in grado di idrolizzare molecolare ATP ed un po' in grado di
funzionare come una elicasi. Quindi che cosa fa a livello del centro di decodificazione? Idrolizza
molecole di ATP ad ADP e l'energia che si libera serve per rompere i legami idrogeno tra codone ed
anticodone del transfert che porta la proteina tronca. Il transfert viene liberato, conseguentemente
poi, se la proteina stabile, subir un processo di degradazione. Ma comunque UPF1 riuscito a
separare le due subunit del ribosoma perch, rompendo quelli che sono gli ultimi legami a
idrogeno codone anticodone, provoca un ricambio conformazionale della subunit minore, arriva
eRF3 che si lega a livello del sito E separando le due subunit ribosomiche e liberando il
messaggero con lo stop codon prematuro. Nel momento in cui l'mRNA si libera, gli altri tre enzimi
(SNG5, 6, 7), che sono delle fosfatasi, accorrono per defosforilare UPF1, in modo tale che torni
nuovamente una proteina in grado di ripetere un ciclo su di un altro ribosoma.
UPF1 una proteina che viene ripetutamente riciclata. Per una di queste fosfatasi la sette viaggia
accoppiata all'esosoma. L'esosoma un particolare microrganulo che contiene gli enzimi per
degradare il messaggero, precisamente contiene l'enzima di deadenilazione che, indipendentemente
dalla presenza delle proteine PABP, va ad eliminare tutte le adenine della coda di poli-A. Contiene
anche l'enzima di decapping, uno speciale enzima capace di idrolizzare tutti i legami anidridici tra il
cappuccio e il primo nucleotide del messaggero. Contiene le esonucleasi con orientamento 3'-5' e 5'3', per cui, proteggendo il messaggero con lo stop codon prematuro sia al 5' mediante l'eliminazione
del cappuccio sia al 3' mediante l'eliminazione della coda, le esonucleasi possono degradarlo in tutti
e due i sensi e toglierlo completamente dalla circolazione. Questo il meccanismo unificato che
pu essere applicato virtualmente a tutti gli organismi. Poi ognuno avr qualche piccola differenza
che lo distingue dal modello unificato.
Lo splicing serve ad unire insieme gli esoni ed ogni volta che ci accade, la cellula deposita
lievemente pi a monte della giunzione di splicing (circa 20 nucleotidi pi a monte) quattro proteine
standard. Tutti i vari processi in cui va incontro il messaggero (dai meccanismi dell'esporto, che
sono molto complicati, ai meccanismi che tendono ad avvicinarlo al ribosoma preassemblato etc),
sono accompagnati da proteine vanno e vengono a livello della quattro standard, che costituiscono il
complesso di giunzione degli esoni o complesso EJC. Tra queste c' una proteina che si chiama
Y14 che lega sempre la proteina UPF3, quindi sempre presente sul messaggero fin dalla seconda
maturazione (quando cio avviene lo splicing e vengono eliminati gli introni). La proteina UPF3 ha
dei domini in grado di legare con una forza elevata UPF2, ed il complesso UPF3 ed UPF2 ha una
grandissima affinit per UPF1. L dove c' UPF2 legato UPF3, UPF 1 ci arriva istantaneamente
anche se l vicino ci sono delle proteine PABP che dovrebbero essere pi veloci (in presenza di
UPF2 ed UPF3, UPF1 pi veloce delle proteine PABP di tipo C). Se durante la traduzione succede
che il ribosoma scorre lungo il messaggero, nel momento in cui incontra un complesso EJC, il
complesso si stacca, lascia passare il ribosoma e si riassembla nuovamente sulle stesse sequenze del
messaggero, dietro il ribosoma, e cos di seguito fino alla fine. stato scoperto che quando c' uno
stop codon prematuro che si trova anteriormente al complesso EJC (ma non molto distante), nel
momento in cui il ribosoma stalla su questo codone di stop prematuro e davanti c' il complesso
NMD, non pu essere mai bypassato, come avviene, ad esempio, ai messaggeri alterati delle
immunoglobuline. Nel momento in cui si assembla il tutto, anche se dovessero esserci vicine delle
proteine PABP di tipo C, c' UPF3 a livello del complesso EJC che ha richiamato UPF2 che a sua

volta richiama UPF1. Da un lato si lega ad UPF1 mentre dall'altro aggancia immediatamente eRF3.
Il sistema in NMD avvenente istantaneamente e il messaggero viene degradato e anche la proteina
subisce un processo di degradazione. Quindi, se presente un complesso EJC, il sistema in NMD
non pu essere in qualcun modo bypassato, cosa che si pensava in precedenza. Il sistema in NMD
pu avvenire sempre, o c' o non c' il complesso EJC. In questo caso il complesso EJC si comporta
da amplificatore del sistema in NMD. Se c' il complesso EJC, il sistema in NMD avviene, ci
raggiunge un'efficienza almeno 100 volte superiore rispetto ad uno stop codon con un sistema in
NMD di in assenza del complesso EJC. Per questo non vuole dire che il sistema NMD non
avviene nei messaggeri i cui stop codon si trovano distanti dal complesso EJC: in ogni caso il
sistema NMD pu sempre avvenire.
Bisogna fare due considerazioni. Intanto, in assenza del complesso EJC, se c' uno stop codon
prematuro, pu succedere che la coda, praticamente una bandiera ai 4 venti, possa (anche se con
una probabilit nettamene inferiore) portare a livello di eRF3, bloccato sullo stop codon prematuro,
una proteina PABP di tipo C. In questo caso, anche se c' uno stop codon prematuro, UPF1 non
riesce ad agganciarlo perch la proteina PABP molto pi forte, cio lo lega con maggiore affinit.
Si avr cos una terminazione normale della traduzione con conseguente conservazione del
messaggero. La proteina comunque tronca e, se in grado di funzionare, sar di ausilio alla
cellula; se invece tossica, la porter a morte. Quindi, in termini di probabilit, il sistema in NMD
potrebbe essere bypassato, in genere dipende dalla posizione. Se questo stop codon prematuro si
trova all'inizio del messaggero, allora si ha una maggiore probabilit che possa essere bypassato
perch arrivano prima le proteine PABP, perch sono in vicinanza ed hanno la forma di anello. Sia
all'inizio sia alla fine del messaggero le proteine PABP sono l vicino. Se invece lo stop codon
prematuro si trova al centro del messaggero, lontano dalle proteine PABP, allora si ha una maggiore
probabilit che avvenga un sistema in NMD. solo una questione di probabilit. Non detto che
una proteina PABP vada ad agganciare eRF3, anche se lo stop codon denaturo si trova al centro del
messaggero. A livello dello stop codon normale si deve legare una proteine PABP per determinare
una terminazione normale della traduzione. Sicuramente v' un'elevatissima probabilit che a legare
eRF3 siano le proteine PABP di tipo C. Ma pu succedere che accidentalmente la proteina PABP sia
in ritardo e che UPF1 arrivi prima, provocando il rilascio della proteina, anche se normale; ne
provocher la degradazione pur essendo un messaggero normale.
Si ritiene in effetti che il normale turn over per un determinato messaggero all'interno del
citoplasma sia proprio dovuto alla proteine UPF1 e quindi al caso. Un messaggero che deve essere
tradotto per 5 minuti consecutivi in media, non detto che tutto i messaggeri dello stesso tipo
rispettino questi 5 minuti. In alcuni casi, questi 5 minuti possono diventare anche 10 minuti o 30
secondi. Ad ogni ciclo traduzionale, devono essere le proteine PABP di tipo C a legare eRF3, che
provoca il rilascio della proteina e lo sgancio normale del messaggero che verr poi agganciato da
altri ribosomi. Per il caso che determina se eRF3 si sar agganciata da una PABP o da UPF1.
Quindi, un messaggero potrebbe essere agganciato per molto pi tempo dalla proteina PABP e
quindi essere tradotto nel citoplasma per molto pi tempo, la sua stabilit aumenta oltre la media.
Oppure pu anche darsi che accidentalmente un messaggero fresco fresco, giungendo a livello dello
stop codon normale, il suo eRF3 venga subito agganciato dal UPF 1 e non dalle PABP, quindi
determina la traduzione di una sola proteina e poi l'mRNA viene completamente degradato. Quindi
tutto dovuto al caso. La stabilita puramente casuale. Un altro meccanismo in grado di bloccare
il messaggero se questo rimane a lungo nel citoplasma, cio se non viene degradato secondo quelli
che sono i tempi richiesti dalla cellula.
A proposito della terminazione della trascrizione negli eucarioti, c' una particolare sequenza che si
chiama segnale di poli-A (AAATAAA) sul DNA. Nei diversi geni c' una sola sequenza di
poliadenilazione o possono essercene di pi? Alcuni messaggeri ne hanno una sola che significa
tanto; altri messaggeri ne hanno altre un poco pi a valle. Possono valere due, tre o anche pi di tre.
In questo caso, l'RNApol ci passa sopra e trascrive nel messaggero questi segnali di poli-A. Quali di
questi segnali sar utilizzato dai fattori taglio e di poliadenilazione per tagliare il messaggero e
aggiungere la coda di poli-a? strettamente associato al sistema in NMD, come se il gene avesse

in se stesso intrinseco la capacita di regolare se stesso sulla base delle necessit metaboliche della
cellula. Se viene utilizzato il primo segnale di poli-A, ci sar un messaggero con un 5' non tradotto
pi corto, dopo ci sar subito la coda. Se viene utilizzato il secondo segnale di poli-A, si avr un
messaggero che pi lungo nella sua parte 3' non tradotta e, dopo, la coda. Quindi la coda sar pi
distante dallo stop codon. Se si utilizza il terzo segnalo di poli-A, si avr una sequenza 5' non
tradotta pi lunga e dopo ci sar la coda. Quindi la coda sar ancora pi lontana dallo stop codon
normale. E allora, alla fine, il corpo del messaggero sempre lo stesso di una sequenza codificata.
Quando si hanno i tre messaggeri nel citoplasma, sar pi stabile quello che avr il 3' non tradotto e
quindi una coda pi vicina al codone di stop, oppure quello che avr al 3' non tradotto pi l'unico e
quindi una coda di poli-A dallo stop codon normale? pi stabile quello pi corto. Certamente
meno stabile quello pi lungo. In quello pi corto la coda di poli-A e quindi le proteine PABP sono
vicinissime allo stop codon normale e quindi avr molta pi probabilit che la proteina PABP possa
incontrare eRF3. Mentre se si ha un messaggero con una coda di poli-A pi lontana dallo stop
codon normale, le probabilit che queste code vadano a sbattere contro il ribosoma e quindi a
portare una proteina PABP di tipo C, sono nettamente ridotte. Sicuramente il messaggero meno
stabile. Dopo un paio di cicli di traduzione, sar degradato perch la proteina eRF3 sar sicuramente
agganciata da UPF1.
C' un altro modo per bypassare il sistema in NMD? :Lo stop codon prematuro pu essere uno dei
tre codoni di stop. Certamente, se c' UAA non potr essere diversamente bypassato. Negli
eucarioti, se c' UGA e se c' in circolazione sia il transfert sia la selenocisteina anche a abbassa
concentrazione, la presenza di quest'ultima potrebbe bypassare il sistema in NMD e quindi produrre
una proteina normale che al posto dell'amminoacido che ci dovrebbe essere, avrebbe una
selenocisteina. La SeCys, pur essendo un amminoacido molto reattivo, potrebbe far funzionare
molto bene la proteina.
Ora, sin dal 2007 era partito un programma internazionale allo scopo di creare un farmaco in grado
di bypassare il sistema in NMD indipendentemente dallo stop codon prematuro e dalla sua
posizione, in grado invece di non influenzare il codone di stop normale. Alcuni studiosi di una casa
farmaceutica americana pensavano di aver risolto il problema. Perch sin dalla scoperta del sistema
in NMD, una decima di anni fa, si anche scoperto che se alla cellula vengono somministrati degli
antibiotici ad elevatissima concentrazione, questi sono in grado di confondere il sistema in NMD e
quindi di bypassarlo, permettendo a livello dello stop codon prematuro l'introduzione forzata di un
amminoacido qualsiasi, quindi la produzione di una proteina normale. Questa casa farmaceutica ha
studiato una molecola che ha poi chiamato "atallulan". Si pensava che questa molecola potesse fare
miracoli perch, in sua presenza, UPF1 non solo non in grado di legare il codone di stop e
neanche le proteine PABP, ma addirittura il ribosoma forzato ad inserire l'amminoacido. E in
genere l'amminoacido che viene inserito proprio quello che doveva essere inserito se non ci fosse
stato lo stop codon prematuro. Quindi la produzione della proteina perfettamente eguale, come se
non ci fosse stato lo stop codon prematuro. Le prime sperimentazioni sono state condotte su
bambini che mostravano la distrofia muscolare di Duchenne. Questa una tipica patologia dovuta
allo stop codon prematuro e, poich il sistema in NMD non viene assolutamente bypassato, vi
assenza di messaggero, assenza di proteina. Lo studio stato esteso ad alcune alterazioni del fattore
8 della coagulazione che sono molto importanti, ed anche ad alcuni alterazioni da stop codon
prematuro che provocano la fibrosi cistica. Queste tre malattie sono state studiate mediante dei trial
clinici che sono partiti in America, sono approdati in Europa ma in Italia non sono mai arrivati.
Sono stati anche arruolati dei soggetti normali per vedere se effettivamente il farmaco creasse dei
problemi a carico dei stop codon normali. E sia in coltura sia nell'organismo umano volontario, si
dimostrato che il farmaco non influenza la corretta funzionalit dello stop codon normale. Gli studi
sono andati avanti ma sono stati interrotti nel 2011 perch la casa farmaceutica ritiene di poter
sintetizzare una molecola pi efficace in quanto le sperimentazioni di questi bambini non andata a
buon fine. Mentre sta continuando alla grande lo studio sul fattore 8 e sulla fibrosi cistica, dando
dei risultato molto incoraggianti. Questo farmaco un giorno potrebbe permettere di curare ben oltre
2000 malattie generiche dovute a stop codon prematuro. Perch non ha funzionato nel caso della

distrofia muscolare e ci sono risultati incoraggianti nelle altre patologie? Nei bambini la distrofia
diagnosticata, a meno che i genitori non sappiano di essere portatori, quando il bambino deve
camminare e in realt non si mette in piedi, o poco tempo prima che si ha una muscolatura non
corretta. Quindi la sperimentazione sui bambini stata fatta su bambini gi sulla sedia a rotelle, non
neonati (sarebbe stata pi efficace). Anche se si riuscisse a sintetizzare una piccola quantit di
distrofina, non sufficiente a localizzarsi a livello della muscolatura l dove deve localizzarsi e
svolgere la corretta funzione. Il farmaco potrebbe funzionare anche nel caso della distrofia, solo che
la distrofina o si accumulata peggiorando la situazione o il tessuto muscolare non stato in grado
di utilizzarlo come avrebbe dovuto. Se la sperimentazione fosse stata fatta sui neonati alla diagnosi
immediata, sicuramente la distrofina prodotta grazie al farmaco avrebbe dato i suoi frutti.
Probabilmente sar possibile guarire i bambini affetti da distrofia se verranno trattati alla prima
diagnosi o addirittura se ci si aspetta che il nascituro non sar in grado di produrre distrofina. Cos
alla nascita si potrebbe somministrare tale farmaco. Per le altre patologie, sembra stia funzionando
bene. Questo meccanismo di recente scoperta potrebbe eventualmente combattere una notevole
quantit di malattie degenerative, compresi i tumori.
Circa una ventina di anni fa, alcuni botanici hanno individuato nelle cellule delle piante dei piccoli
RNA a doppio filamento e non riuscirono a capire perch la cellula ne determinasse la trascrizione e
la maturazione, n quale potesse essere la loro funzione. Pubblicarono gli articoli per questi non
furono compresi come spesso accade dalla comunit scientifica. Per un lungo periodo questi articoli
restarono nel limbo, ignorati. Se nonch, intorno al 2000, alcuni autori che poi ebbero il nobel per la
fisiologia, scoprirono questi RNA a doppio filamento nelle cellule animali, anche nel lievito, e
cominciarono a chiedersi ed a sperimentare quali fossero le loro funzioni. Le cellule, per controllare
l'espressione di una grande quantit di geni, comprese i tessuti che producono le cellule
germinative, possiedono una grande quantit di strutture a simil funzione.
Si scoperto che nel genoma umano sono presente dei geni che possono essere isolati in zone
lontane da dove si trovano i geni che codificano per gli altri RNA. Oppure posso essere racchiusi in
cluster, pi geni uniti insieme. Oppure addirittura anche un introne pu funzionare. Allora, i geni
che codificano per questi particolari RNA, sono detti geni MIR e vengono indicati con i numeri
arabi: MIR1, MIR2, etc. Quelli che non sono contenuti nei cluster, vengono indicati sempre con lo
stesso numero a cui si giunge una determinata lettera. Per esempio il gene MIR19 esiste come MIR
19a, b, c... e sono contemporaneamente presenti tre geni dello stesso cluster. Allo stato attuale, il
database, che si chiama MIR base, racchiude tutti questi geni umani che codificano per questi
particolari RNA che si chiamano microRNA. Sono stati aggiunti circa 3500 microRNA. I pi
studiati sono circa un migliaio. Questi geni vengono trascritti quasi totalmente dalla RNApol 3.
Invece ci sono dei geni che codificano per le proteine ed alcuni degli introni di questi geni, una
volta rimossi funzionano da precursori di microRNA. Il gene, in questo caso, prende il nome di
mirtrone e risiede proprio all'interno dell'introne. Vengono sempre degradati ma vengono a volte
rielaborati, trasformati in altri RNA e maturati in microRNA che, a quanto pare, agiscono sullo
stesso messaggero da dove sono stati rimossi.
C' il gene MIR che viene trascritto dalla RNApol 3 e produce un RNA a singolo filamento. Per
l'RNA a singolo filamento presenter alle estremit 3' - 5' delle sequenze complementari (non tutte)
e quindi si viene subito a generare una struttura dove si trova un'ansa ed un lungo tratto a doppio
filamento contenente dei mismatch alla fine, sia in 3' sia 5', pi o meno lunghi, e terminano a
singolo filamento perch non sono complementari. Questa struttura prende il nome pri-microRNA,
e sta per microRNA primario. Il microRNA primario viene sottoposto ad un processo di
maturazione nucleare dove esistono due distinte proteine: una un enzima ed una ribonucleasi di
tipo 3; l'altra una proteina di riconoscimento. Il complesso si chiama DROSHA-PASHA. La
ribonucleasi 3, cio l'enzima, detto DROSHA, la proteina di riconoscimento si chiama PASHA.
IGCR8 l'omologa proteina nel lievito. Quando si parla del microprocessore umano, si deve
parlare del microprocessore DROSHA-PASHA. PASHA va a riconoscere nel microRNA i due
filamenti non complementari, quindi che sporgono al 3' ed al 5'. Si va ad agganciare proprio al
confine tra la porzione libera e la porzione che comincia il doppio filamento, sia su uno sia sull'altro

filamento. Quindi due proteine PASHA riconoscono i due filamenti, vi si legano e cambiano
conformazione esponendo nuovi gruppi chimici e richiamando l'enzima DROSHA. Due enzimi
DROSHA, uno per filamento, provocano il taglio a livello dello stelo a circa 11 nucleotidi a monte
dal confine doppio filamento filamento libero. I due enzimi eseguono il taglio in modo svasato
perch il filamento al 5' risulter poi pi corto, hanno addirittura tagliato un mismatch, cio si sono
spinti molto nel tagliare. Ne risulta una nuova struttura in cui il 5' pi corto di due nucleotidi
rispetto al 3'. In pratica, il 3' protrude di due nucleotidi e questi sono molto importanti, vengono
selezionati dal microprocessore sulla base dell'intera struttura del doppio filamento. Questo stato
valutato sperimentalmente transfettando nelle cellule le stesse strutture che protrudono con
nucleotidi a caso. Il microprocessore successivo non li accettano e quindi non funzionano. Sembra
proprio che questi due nucleotidi vengano lasciati protrundenti sulla base dell'intera struttura, come
se facesse una sorta di calcolo particolare nell'intera struttura dell'RNA. Allora, dopo l'azione di
DROSHA-PASHA il precursore che rimane si chiama microRNA precursore. Il pre-microRNA
viene agganciato dall'esportina 5 e, attraverso un complesso RAN-GTP fa la sua comparsa nel
citoplasma dove presente un altro microprocessore che, al contrario di DROSHA-PASHA, un'
unica proteina multifunzionale con molti domini in grado di riconoscere il pre-microRNA e
tagliarlo in pi punti. Questo microprocessore citoplasmatico si chiama dicer, ossia un processore
che taglia a dadi. Dicer ha un particolare dominio detto PAZ. Tramite il dominio PAZ, dicer in
grado di riconoscere i due nucleotidi protrudenti che alla fine riflettono l'intera struttura. Per cui, se
questi due nucleotidi protrudenti non sono quelli corretti, dicer non li riconosce e neanche le
proteine successive che contengono il dominio PAZ. Su di loro non potr mai funzionare. Il domino
PAZ si lega a questi due nucleotidi protrudenti e, mediante questi domini che sono sempre delle
ribonucleasi di tipo 3, va a tagliare questo microRNA in modo tale da protrarre al fine un
microRNA maturo della lunghezza di 19-21 nucleotidi a doppio filamento in cui c' sempre almeno
un mismatch.
In 3' sia di un filamento sia dell'altro, ci sono due nucleotidi protrudenti che devono essere quelli e
non altri. Il microRNA maturo, con il suo mismatch, viene riconosciuto da una famiglia di proteine,
anche questa di nuova scoperta. Le proteine si chiamano argonaute o, pi brevemente, proteine
AGO. Nell'uomo se ne conoscono 4 tipi diversi, per la funzione nota solo quella di AGO 1 e 2.
Di AGO 3 e 4 non si sa nulla. Tutte queste proteine si agganciano al microRNA e la pi grande
AGO 2. In particolare, AGO 1 si lega ad una estremit, un'altra AGO 1 si lega l'altra estremit e
dentro ci sar AGO 2. AGO 3 e 4 si associano ad AGO 2. Avvengono ora modifiche che formano
ilcomplesso microrisk inattivo, dove risk sta per microRNA che induce l'interferenza sui
messaggeri, ossia il blocco della traduzione. In particolare, cos assemblato il doppio filamento il
complesso microrisk inattivo. In questo complesso si verificano tutta una serie di modifiche
termodinamiche con idrolisi di ATP, per cui uno dei due filamenti viene eliminato o degradato e dei
due filamenti del microrisk, ne rimane solamente uno. Ed allora, il filamento che viene degradato e
deve funzionare si dice filamento passeggero mentre il filamento che rimane proteina AGO e che
poi funzioner detto filamento guida. In questo modo si forma il complesso microrisk attivo.
Come agisce il complesso micro RISK attivo? Dopo lo stop codon c' un tratto pi o meno lungo 5'
UTR. Poi c' la coda. A livello della sequenza 5' UTR ci sono delle particolari sequenze che si
chiamano MRE, ossia elementi di risposta ai microRNA. In uno stesso messaggero, ci possono
essere pi NRME per lo stesso microRNA o per microRNA diversi. Il messaggero pu essere
regolato da diversi microRNA. In modo particolare, se il mismatch si trova pi al 3' del messaggero,
quindi pi al 5' del filamento guida, questa porzione dove c' il mismatch si chiamer sequenza
SEED. Nel momento in cui il filamento guida in grado di complementarizzarsi con il messaggero
e la sequenza SEED si trova spostata pi al 3' del messaggero, il complesso microrisk funziona.
Come funziona? In due modo distinti. AGO 2 presenta un sito che molto simile a quello del
fattore E che riconosce il cappuccio e autonomamente pu far s che il cappuccio si possa
agganciare direttamente ad AGO 2. Il cappuccio, quindi, viene sequestrato dai fattori di inizio della
traduzione e portato sul complesso microrisk. In questo caso, senza danneggiare il messaggero, la
cellula ha la possibilit, facendo venir meno il cappuccio ai fatti di inizio della traduzione, di

bloccare la traduzione del messaggero con conseguente abbassamento della relativa proteina.
Oppure pu essere la proteina AGO1 che, valendosi di un'altra proteine accessoria, EIFG, in
grado di catturare il cappuccio perch EIFG ha un'affinit nei confronti del cappuccio nettamente
superiore rispetto alla subunit E del fattore eIF4f della traduzione. Quindi, da un lato cattura il
cappuccio perch ha grande affinit per questo, dall'altro lato ha grande affinit per AGO 1. La
proteina accessoria sar quella che far da tramite e anche in questo caso il cappuccio, tramite la
proteina EIFG, andr indirettamente a finire sul complesso microrisk presente sull'mRNA e
sequestrer il cappuccio. AGO 2 lo sequestra direttamente, AGO 1 sequestra il cappuccio
indirettamente mediante mela proteina EIFG.
Che cosa si produce? Si produce il blocco del messaggero che viene racchiuso nei corpi P e pu
restare la per tutto il tempo che la cellula necessita. Quindi i livelli della relativa proteina si
abbassano notevolmente. Ma se si arriva ad un punto tale che i livelli della proteina devono
aumentare rapidamente, la cellula ha la capacit di disassemblare rapidamente il complesso
microrisk, il cappuccio viene cos liberato e di conseguenza pu rientrare nuovamente nel punto
tradizionale. Quindi i livelli della relativa proteina possono aumentare. Questo il 4 meccanismo
di controllo dell'espressione genica recentemente scoperto.
I microRNA sono per molto piccoli quando sono attivi e possono anche andare a localizzarsi nel
nucleo. E nel nucleo svolgono un'altra funzione di interferenza che la seconda. Che cosa fanno?
Da un lato vanno a legarsi al messaggero in crescita, destabilizzandone la maturazione; dall'altro
AGO 1 ha la capacit di richiamare tutti gli enzimi epigenetici, quelli che provocano
eterocromatinizzazione, e va a provocare l'eterocromatinizzazione locale solo di quel gene. Quindi,
quando un gene sottoposto all'interferenza del DNA, la cellula si avvale solamente del messaggero
che c' nel citoplasma, per il resto va a bloccare tutto. Si avr cos un silenziamento molto preciso.
Anche nelle piante il meccanismo diverso ed il terzo. Nelle piante non ci sono mismatch, i
microRNA effettivamente sono complementari alla sequenza MRE del messaggero. In questo AGO
2 funziona da ribonucleasi di tipo H e quindi provocher un taglio del messaggero tra il decimo e
l'undicesimo nucleotide del filamento guida. Quindi rompe il messaggero mentre il filamento guida
rimane intatto e pu svolgere una nuova funzione. Quando avviene un taglio, ci sono un 3' OH ed
un 5' monofostato. Cio i due tratti di messaggero cos rotti sono vulnerabili all'azione dello
esonucleasi. Queste attaccano da entrambi i lati i due filamenti che derivano dal taglio
endonucleotidico tramite AGO 2 e iniziano a degradare il messaggero, togliendolo dalla
circolazione. Quindi, in effetti non si ha un blocco della traduzione ma si ha la degradazione del
messaggero. Anche nelle cellule umane pu avvenire una cosa del genere, per da parte di RNA che
hanno una struttura molto simile ai pre-microRNA, cio quelli che fanno la loro comparsa nel
citoplasma, che per non hanno un mismatch, cio sono perfettamente complementari. Questi RNA
che provengono dall'esterno e sono portati da virus o altri componenti vengono detti short
interference RNA (ShRNA). Anche questi hanno i nucleotidi protrudenti al 3', quindi vengono
riconosciuti da dicer. Questo taglia, come ha fatto per i microRNA, anche gli ShRNA., producendo
degli RNA a doppio filamento senza mismatch e sempre aventi due nucleotidi protrudenti al 3'. La
loro lunghezza varia tra 21 e 23 nucleotidi. Il resto degli eventi uguale a quello dei microRNA,
cio i tratti protrudenti vengono riconosciuti dal dominio PAZ delle proteine AGO 2 e quindi si
assembla anche in questo caso il complesso AGO 1, 2, 3, 4, formando il complesso che si chiama
semplicemente RISK che funziona esattamente come se fosse un microrisk. Avverr la stessa cosa e
ci sar una sequenza NRE cui il filamento guida andr a complementarizzarsi.
L'unico problema nell'uomo: c' la complementariet ma non il mismatch e quindi si parla di
piccoli RNA interference e non di microRNA. AGO 2 non andr a tagliare a l'RNA ma richiamer
l'esosoma. Sar quindi l'esosoma stesso che con i sui enzimi di decapping, di deadenilazione e con
le esonucleasi, andr a degradare completamente il messaggero. Quindi, quando agiscono gli
shRNA, si avr una degradazione del messaggero. Solo i microRNA provocano il blocco. Ma
nell'uomo, in oltre l'80% dei casi, si avr l'azione di un microRNA, solo in una limitatissima
percentuale di casi si avr l'azione di RNA provenienti dall'esterno e quindi in grado di degradare il
messaggero. Il meccanismo pi importante quello dei microRNA.

Di recente stato scoperto che tessuti che subiscono un danno, come in caso d'infarto del
miocardio, sono in grado di emettere nella circolazione sanguigna degli esosomi, contenti all'interno
pre-microRNA destinati ad altri tessuti. Si ritiene che questo meccanismo sia un nuovo meccanismo
di comunicazione tra le cellule di tessuti diversi. In questo caso, anche i tessuti normali si
scambiamo esosomi con pre-microRNA. Quindi questo scambio di messaggi fra le cellule dei
tessuti una sorta di comunicazione che permette alle cellule di comunicare il buono stato di salute.
Ma se un tessuto subisce un danno, inizia ad inviare segnali ad altre cellule (non si sa ancora quali
per, purtroppo). Sicuramente, una di queste la cellula epatica. I messaggi di aiuto cercano di
bloccare dei messaggeri per impedire che venga prodotta una proteina che in quel momento o in
quel tessuto pu essere pi nociva. Al contrario, i messaggi cercano di bloccare dei microRNA
funzionanti in modo tale da sbloccare dei messaggeri e produrre determinate proteine che possono
essere messe in circolo e possono essere di aiuto a quel determinato tessuto per risolvere gli stessi
problemi. Allo stato attuale si sta studiando molto nel cancro, perch si sa che le cellule
cancerogene mandano in circolo una grande quantit di microRNA negli esosomi. Ma non si sa
ancora a che scopo, perch non si sa qual la cellula a cui vengono destinata i microRNA. Quindi
non si sa se il tumore furbescamente mandi agli altri tessuti microRNA che bloccano gli RNA
messaggeri grazie ai quali pu farsi strada e quindi espandersi. Oppure sono dei microRNA tramite i
quali il tessuto che sta per essere invaso da tumore chiede aiuto al resto degli altri tessuti in modo
tale che il tumore stesso venga bloccato. Una cosa hanno in comune le cellule tumorali, il blocco
delle vie apoptotiche. Oggi c' la possibilit di costruire in laboratorio fedelmente dei microRNA, in
grado di agire su tutti i messaggeri d'interesse e gi si sa quali sono le proteine che usano il tumore
per bloccare la via apoptotiche. Se si riuscisse a costruire un esosoma specifico per un determinato
tumore e per un determinato stadio, si potr costruire un esosoma molto facilmente in laboratorio,
infilarci dentro dei microRNA d'interesse e, anche attraverso un normale corrente circolatorio, farlo
captare direttamente dalla cellula tumorale. In questo caso, nel citoplasma il pre-microRNA
verrebbe subito trasformati in microRNA da dicer della cellula tumorale e il relativo filamento
guida andrebbe a bloccare o addirittura, se si usano degli shRNA, a degradare il messaggero di
quella proteina anti-apoptotica. Senza la proteina anti-apoptotica, la cellula tumorale va subito in
apoptosi, che quello che si desidera. Se si riuscisse a trovare il modo, bisognerebbe individuare
sulla superficie di un tumore in un determinato stadio una proteina tipica solo di quella cellula, si
potrebbe sicuramente costruire il relativo esosoma e andare a dare una mazzata alle cellule tumorali
mandandole in apoptosi. Gli RNA di interferenza sono quindi uno strumento molto grande.

Struttura del nucleo


Nel nucleo il DNA racchiuso in regioni discrete che si chiamano territori cromosomici che
contengono sempre lo stesso DNA. Il DNA si trova sotto forma di cromatina condensata o
decondensata o sotto forma di cromosoma. Quando la cellula in interfase e sta regolarmente
funzionando, gli occhielli cromatinici partono dai i diversi territori cromosomici per giungere tutti
nella stessa regione, dove presente una determinata RNApol pre-assemblata che andr a
trascrivere questi geni ad una determinata velocit sulla base dei fattori di trascrizione inducibili che
si associamo al complesso RNApol. La regione del nucleo dove occhielli di cromatina provenienti
da pi cromosomi, non dal primo cromosoma, che stanno per essere trascritti, prende il nome di
fattoria tradizionale. Il nucleo costellato di fattorie trascrizionali.
Sulla base delle moderne tecniche dell'immaging molecolare che consente di guardare i vari
componenti del nucleo con delle sostanze fluorescenti, stato possibile individuare nel nucleo delle
regioni. Non sono organuli perch non sono limitati da membrana e, siccome contengono una
particole struttura proteica che permette loro di contenere a loro volta un'altra molecola importante
per le attivit nucleari, hanno un loro preciso nome. Il primo di tutti il nucleolo - il nucleo ha una
fattoria trascrizionale dedita alla produzione di RNA ribosomiali. Poi i corpi di Cajal, poi i corpi
di PML, gli spicols e i paraspicols, il dominio PT e i corpi di taglio.

Attraverso l'imaging molecolare si vedono le zone eucromatiniche ed eterocromatiniche, i territori


cromosomici e tutti gli altri componenti. Il nucleolo contiene la RNApol 1 e i relativi geni, gli RNA
che vengono trascritti sotto forma di primari trascritti. Gli RNA che stanno per essere maturati, cio
tagliati da diversi RNA ribosomiali e i ribosomi di pre-assemblaggio. Riguardo al nucleolo, le
componenti distinte sono i centri fibrillari che rappresentano i filamenti di DNA. La componente
densa fibrillare rappresentata dall'RNApol 1, dai filamenti di RNA, e dall'RNA in sintesi. La
componente granulare rappresentata dalle subunit ribosomiali che stanno per essere assemblate.
I copri di Cajal, scoperti oltre 100 anni fa da Cajal, sono anche detti coiled bodies perch
contengono due proteine strutturali, la proteina coleidina e la proteina flash che servono a
costruire i corpi di Cajal. Un loro particolare disassemblaggio porta la completa disgregazione dei
corpi di Cajal. A che cosa servono? A livello di questi corpi si verifica la maturazione dei piccoli
RNA nucleari per lo splicing e la maturazione dei messaggeri per le proteine istoniche.
I corpi nucleari di PLM che erano stati individuati la prima volta nella leucemia promielocitica,
presente in tutte le cellule. Contengono delle praticoli proteine, dette proteine PLM o proteine della
leucemia promielocitica. La rimozione di questa proteina provoca anche in questo caso la
degradazione dei corpi PLM. Ci sono molte proteine che hanno la funzione di oncesoppressori e
quindi molto probabile (anche se la loro funzione non ancora chiara) che rappresentino un
serbatoio di proteine che possono proteggere il genoma dall'oncogenesi.
Gli spicols e paraspicols sono indistinguibili solo che contengono delle proteine diverse. Dei
paraspicols la funzione ignota. Per quanto riguarda i spicols, si sa che rappresentato una sorta di
magazzino di tutte le proteine e i ribozimi dello splicing. Infatti, mediante fosforilazione, queste
proteine possono lasciare gli spicols e arrivare ai siti di splicing dove avviene la mutarazione del
messaggero. Mediante defosforilazione, possono tornare nuovamente negli spicols. Ci sono degli
spicols molto grandi quando la cellula trascrizionalmente inattiva o poco attiva, e degli spicols
molto piccoli quando la cellula trascrizionalmente molto attiva perch ovviamente ha bisogno di
molti di questi componenti per distribuire il processo di splicing. Quindi in pratica serbatoio
immediatamente disponibile di tutti i componenti dello splicing. Se sono necessari, vengono
fosforilati e arrivano ai siti di splicing, se sono defosforilati tornano indietro ad accumularsi in
attesa che la cellula li possa utilizzare quando necessario.
I domini PT sono praticamente dei serbatoio di fattori di trascrizione, soprattutto quelli importanti
per far partire con una certa efficienza la trascrizione.
Ed infine, i corpi di taglio che si trovano durante la terminazione della trascrizione. I fattori di
taglio sono CstP e CtpF. Quindi, questi corpi rappresentano un serbatoio per questi fattori che
devono legarsi alla coda RNApol 2 fosforilata sulla serina 2. Determinano la conseguente poli
adenilazione e, ovviamente, la terminazione della trascrizione. Quindi, se la trascrizione lenta,
questi corpi sono abbastanza consistenti perch contengono molti di questi fattori. Se la trascrizione
molto attiva, questi corpi sono molto piccoli perch in questo caso i relativi fattori sono agganciati
alla RNApol 2.