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LA BIOLOGA CELULAR DE ADN METILACIN EN MAMFEROS

RESUMEN
En esta revisin, vamos a ofrecer un breve recordatorio de los fenmenos epigenticos en general, y la
metilacin del ADN en particular. A continuacin, se subrayan las caractersticas de la organizacin in vivo del
genoma que limitan la aplicabilidad de los resultados in vitro. Nosotros utilizaremos varios ejemplos para
sealar las conexiones entre la metilacin del ADN y la arquitectura nuclear. Finalmente, vamos a esbozar
algunas de las esperanzas y desafos para la investigacin futura en el campo. El estudio de la metilacin del
ADN, sus efectores, y sus roles, ilustra la complementariedad de enfoques in vitro y la biologa celular.
1. Introduccin
1.1. La metilacin del ADN es una marca
epigentica esencial que controla la
expresin de genes
2. La metilacin del ADN es una arquetpica
marca epigentica Est a cargo del
material gentico, pero no influye en su
secuencia. Puede regular las actividades
genmicas, y puede ser mantenida a
travs de la mitosis y la meiosis.
3. La metilacin del ADN es esencial en los
mamferos: su prdida conduce a la
detencin del crecimiento o apoptosis en
las clulas normales as como en lneas
de cncer].La presencia de la metilacin
del ADN es absolutamente requerida
para el desarrollo embrionario en ratn.
El papel clave de la metilacin del ADN
es el control de la expresin gnica, y
secuencias metiladas sufren represin
transcriptional.
4. Aqu vamos a revisar los hallazgos
recientes y conceptos sobre el control de
la expresin gnica mediante la
metilacin del ADN, con nfasis en los
aspectos biolgicos celulares y una
restriccin a las clulas de mamferos.
Nosotros estableceremos primero el
fondo con algunos recordatorios acerca
de los actores, los efectores y los
objetivos de la metilacin del ADN.
5.

Las protenas que se instalan e


interpretan la metilacin del ADN

6. El ADN de los mamferos puede ser


metilado en las citosinas dentro de los

dinucletidos CpG (Fig.1).Los grupos


metilo aadidos sobresalen en el surco
mayor del ADN. Cuando el ADN est
metilado simtricamente, ambos metilos
se enfrentan a la misma direccin y estn
cerca uno del otro. La adicin de grupos
metilo cambia las caractersticas
biofsicas del ADN y tiene dos efectos:
inhibe el reconocimiento de ADN por
algunas protenas y permite la unin de
los dems.
7. La modificacin es provocada por
enzimas llamadas metiltransferasas de
ADN (DNMTs).Hay tres de tales enzimas
en los mamferos: DNMT1, DNMT3a, y
DNMT3b. Tabla 1). DNMT3L es
estructuralmente relacionada, pero es
catalticamente inactiva y sirve como un
cofactor para DNMT3a y DNMT3b.La
protena DNMT2 tambin tiene similitud
de secuencia con estas enzimas, pero su
funcin es bastante diferente; no se
discutir aqu. Amplios estudios de
enzimologa han arrojado informacin
importante sobre la funcin de estas
enzimas. Notablemente, se encontr que
DNMT1 tiene actividad preferencial para
ADN hemimetilado sobre ADN no
metilado. Parece probable que, la
mayora de las veces, DNMT3a y
DNMT3b, ayudados por DNMT3L,
establecieron las nuevas huellas de ADN
previamente desnudo. Para ello se les
llama "de novo" metiltransferasas.
Despus de la replicacin del ADN, el
ADN metilado se convierte en
hemimetilado y DNMT1 sera el actor
principal hacindolo totalmente metilado

de nuevo. Por lo tanto, se llama la


enzima "mantenimiento" (Tabla 1).Esta
ligeramente sobre-simplificada imagen
ser suficiente para nuestro propsito

aqu, pero excelentes crticas detalladas


son disponibles para completar los
detalles.
8.

9.
10.
11. Fig. 1. La metilacin de las citosinas. (A) La naturaleza qumica de la metilacin del ADN. Bosquejo
de una citosina y su contraparte modificada. (B) Los grupos metilo en citosinas modificadas son
accesibles en el surco mayor.Las dos hebras de la hlice de ADN son de color azul y prpura, y los
grupos metilo se destacan en rojo. Dos vistas del mismo ADN se muestran, se diferencian por una
rotacin de 90.
12. La marca de metilo se traducida en la
represin transcripcional por la accin de
protenas que reconocen ADN metilado e
inhiben la expresin del gen mediante la

creacin de la estructura de cromatina


represiva. Tres familias de protenas
reconocen
especficamente
ADN
metilado. (Tabla 1).La primera familia

contiene MBD1, MBD2, MBD4 y MeCP2;


estas protenas comparten un dominio
vinculante de ADN relacionado llamado
dominio metil-vinculante (MBD). La
segunda familia contiene las protenas de
dedos de ZINC Kaiso, ZBTB4 y
ZBTB38. Estas
protenas
son
bifuncionales: se unen al ADN metilado,
pero tambin a algunas secuencias de
consenso no metiladas. Finalmente la
tercera familia comprende UHRF1 y
UHRF2 (tambin conocido como ICBP90
y NIRF), que se unen a travs de su ADN
metilado a travs de sus SET-y-RINGdedos-Asociados (SRA) de dominio.
13. Una pregunta importante, discutida
ampliamente en una reciente revisin
excelente es el de la redundancia entre
protenas metil-vinculantes Su grado de
especificidad de secuencia pobremente
caracterizada, y no est claro si todos
ellos pueden obligar al misma loci
objetivo, o si tienen objetivos distintos.
Incluso si las protenas comparten
algunos
objetivos,
podran
ser
funcionalmente diferente por otras
razones. Por ejemplo, podran tener
afinidades
de
ADN
vinculante
diferentes .Adems, las diferentes
protenas podran expresarse en
diferentes
momentos
o
lugares. Finalmente
podran
tener
diferentes protenas o nucletidos
interactores que posiblemente ellos
podran
reclutar
a
diferentes
compartimentos del ncleo.
14. Los objetivos de la metilacin del ADN
difieren en clulas normales y
cancerosas
15. En las clulas normales, tres tipos
principales de objetivos son reprimidos
por la metilacin del ADN (Fig.
2).Primero:
Genes
parentalmente
impresos, es decir, los genes que se

expresan
diferencialmente
del
cromosoma maternal y la paterna
cromosoma: Ellos son los principales
reguladores de desarrollo embrinico y
vida adulta. En la mayora de los casos el
alelo inactivo est marcada por la
metilacin del ADN, y la expresin
monoallica se pierde en ausencia de
metilacin. Como una acotacin, la data
reciente indica que muchos genes
pueden expresarse monoallicamente en
las clulas somticas, pero an no est
claro si esto depende en absoluto de la
metilacin del ADN].Segundo: los
transposones y otras secuencias
repetidas que constituyen una gran
fraccin del genoma de los mamferos.
Tercero: un nmero de genes estn
metilados en una manera especfica de
tejido. Un subconjunto interesante de
ellos son el cncer/ antgenos de
testculo (C / T), que son no metilados y
expresados en el testculo, y metilados y
reprimidos en todos los dems tejidos.
16. La metilacin del ADN est desregulada
en el cncer (Fig.2).Las clulas
tumorales a menudo tienen un patrn
anormal de la metilacin del ADN donde
algunos genes supresores de tumores
son metilados e inactivos. Por el
contrario,
algunas
secuencias
normalmente metiladas, tales como ADN
repetido, genes impresos, y C/T
antgenos, pueden llegar a ser
desmetilados (Fig. 2). Metilacin del ADN
anormal es un evento causal temprano
durante la transformacin celular.
Agentes desmetilantes se pueden
restablecer la expresin de los genes
supresores de tumores silenciados y han
sido aprobados para uso clnico contra
algunas leucemias.
17.

18.
19. Fig. 2. El loci que se somete a la metilacin del ADN en mamferos. Al menos tres tipos diferentes de
loci pueden ser metilados en las clulas normales (mitad izquierda de la figura).Genes supresores de
tumores, as como la gran mayora de los genes con un promotor isla CpG, no son metilados. En las
clulas tumorales (media derecha), las secuencias repetidas se convierten en desmetiladas, los
genes impresos se convierten de forma desmetilados aberrantemente (o metilados en ambos alelos,
una situacin no representado aqu). Algunos genes que eran no metilados pueden llegar a ser
metilados y transcripcionalmente silenciados, y esta es una causa frecuente para la inactivacin de
genes supresores de tumores. Finalmente algunos genes que estaban metilados pierden la marca,
como el cncer/testculo (C / T) antgenos.
20. En experimentos in vitro no se
reproducen algunas propiedades del
ncleo
21. En el trabajo in vitro ha sido crucial en la
elaboracin de los diferentes elementos
de regulacin del gen por metilacin del
ADN. Se ha dado informacin sobre los
mecanismos de metilacin del ADN, las
propiedades de unin de protenas metilvinculantes, y la forma en que estos
factores regulan la expresin gnica.
22. Sin embargo debemos tener en cuenta
que el interior del ncleo se diferencia de
un tubo de ensayo en varios aspectos
importantes. Mencionaremos
tres. Primero, el entorno nuclear est
densamente lleno de macromolculas. La

concentracin de protena en algunos


compartimentos est estimado en 500
mg / ml, y esta aglomeracin
macromolecular tiene algunos efectos
cinticos y termodinmicos que por lo
general no se tienen en cuenta in vitro. El
hacinamiento es un serio obstculo a las
reacciones de difusin impulsadas, y las
constantes cinticas medidas in vitro casi
siempre descuidan este factor. Esta
barrera a la difusin puede ser una razn
por el reclutamiento de protenas es un
tema tan frecuentemente recurrente
.Ilustramos esta idea con el ejemplo de
DNMT1 en la seccin 7.
23. Un segundo tema clave es que las
protenas nucleares no se distribuyen
homogneamente; muchas protenas son
encontrados en cuerpos nucleares como

el resultado de interacciones homo y


heterotpicas. Esto
puede
tener
consecuencias positivas o negativas en
su actividad. En algunos casos, como en
las fbricas de transcripcin, los cuerpos
nucleares son sitios de concentracin de
protenas activas. En otros casos, los
cuerpos nucleares son los sitios de
almacenamiento de los que las protenas
tienen que ser liberados para alcanzar su
objetivo. Una consecuencia significante
es que la actividad de una protena
puede ser regulada directamente dentro
o fuera de un rea dada del ncleo. Esta
es una interesante extensin de la
regulacin de la protena por ncleo
citoplasmtico yendo y viniendo.
24. Tabla 1
25. Las protenas implicadas en la creacin
y la interpretacin de la marca de
metilacin

32. DN
MT3
b

33.

34.

35. MB
D

36. Zinc dedo

37. SRA

38. MeC
P2

39. Kaiso

40. UHR
F1

41. MB
D1

42. ZBTB4

43. UHR
F2

44. MB
D2

45. ZBTB38

46.

48.

49.

26. De
novo

27. Mantenimient
o

28. Cofa
ctor

47. MB
D4

29. DN
MT3
a

30. DNMT1

31. DN
MT3
L

50. Panel superior: las enzimas que metilan


ADN en mamferos.
51. Panel inferior: las tres familias de
protenas que se unen el ADN metilado
en los mamferos.

52.

53. En tercer lugar, el genoma no est


dispuesto de forma homognea y no
todos los genes son igualmente
accesibles a los reguladores de
protenas. Los cromosomas ocupan
territorios
dan
en
el
espacio
nuclear. Tienen un interior y una
superficie, aumentada por bucles
extruidos y canales como invaginaciones.
54. Muchas de estas caractersticas son
dinmicas. Los
cuerpos
proteicos
nucleares son entidades estables pero
las protenas que las constituyen estn
en reflujo. Los cuerpos se mueven a s
mismos en el ncleo, y esto puede ser un
mecanismo para escanear el genoma.
Los cromosomas tambin son mviles a
s mismos, sin embargo, su velocidad y el
alcance de la difusin son mucho inferior
a la de los cuerpos nucleares.
Movimientos de menor escala, como la

extrusin de un bucle de cromatina


pueden tener un significado ms
funcional.
55. Los hechos presentados en esta seccin
nos
llevan
a
una
conclusin
importante. La
regulacin
gnica
depende de las interacciones protenaADN. Estas pueden ser fcilmente
modeladas in vitro, donde los nicos
parmetros
relevantes
son
las
concentraciones de los interactores y las
constantes de unin. Todava la situacin
en
las
clulas
vivas
es
considerablemente ms compleja: la
organizacin del ncleo es tal que las
interacciones de gran escala tambin
deben tenerse en cuenta. Una dificultad
aadida es su naturaleza dinmica, la
investigacin de lo que exige enfoques
tcnicos adecuados, como veremos ms
adelante.

56.
57. Fig. 3. Diferentes parmetros regulan las interacciones de protena ADN in vitro e in vivo. (A) in vitro,
la interaccin involucra slo dos actores, y se determina slo por su concentracin y unin afinidad.
(B) En el ncleo de una clula, la situacin es mucho ms compleja. La protena de unin al ADN
puede interactuar con organismos o puntos de referencia nucleares, como la envoltura nuclear o el
nuclolo. El locus de ADN es parte de un cromosoma y puede ser ms o menos accesible a la
protena.
58. Kaiso: un ejemplo de regulacin por ir
y venir nucleo-citoplsmico
59. La distribucin nucleo/citoplasmica de
Kaiso es variable, y responde a las
seales intracelulares. De hecho, la
activacin de la va Wnt se correlaciona
con un movimiento de Kaiso fuera del
ncleo y en l. La posibilidad de que la
va Wnt podra, a travs de su accin
sobre Kaiso, regular la expresin de
genes metilados es tentadora pero an
no ha sido confirmada. Por ejemplo,
todava no se sabe si la piscina de Kaiso
que lanzaderas en y fuera del ncleo es
la piscina que se dedica a la unin de

ADN metilado. Es posible que la


poblacin de unin-metil es inmvil,
mientras que la fraccin que se une al
ADN no metilado es mvil. La generacin
de mutantes de Kaiso iones de
separacin de func, que podran obligar a
un tipo de objetivo, pero no el otro, sera
til para responder a esta pregunta.
60. Los ratones knock-out Kaiso muestran
ningn fenotipo obvio, ni la reactivacin
de los kaiso genes diana. Esto sugiere
que en otras protenas tienen funciones
superpuestas; ZBTB4 y / o ZBTB38 son
los candidatos ms probables. Este
posible solapamiento funcional sugiere
que estas dos protenas pueden ser

reguladas de una manera similar, pero


esto an no ha sido reportado.
61. En contraste con Kaiso, las protenas
MBD parecen ser constitutivamente
nuclear. Los detalles relativos a su
localizacin en una resolucin ms alta
son escasos, sin embargo. Sumoylacion,
que es conocida para regular la
distribucin subnuclear en algunas
protenas, ocurre en MBD1 pero no tiene
efecto sobre su localizacin. En las
clulas de ratn, las protenas MBD
transfectadas son reclutadas para los
cromocentros, es decir, los grupos de
heterocromatina pericntrica que son
densamente metilado. Este es tambin el
caso para ZBTB4 (Fig.4), pero se debe
tener cuidado en la interpretacin de
estos experimentos, como protenas
transfectadas
son
generalmente
sobreexpresadas
y
no
reflejan
necesariamente el comportamiento de
las protenas endgenas. No hay
cromocentros en las clulas humanas, en
las que los MBDs parecen ser protenas
nucleares difusas. Algunas preguntas son
sin resolver. Genes activos tienden a

localizarse en "fbricas de transcripcin",


mientras que los genes reprimidos por
las protenas Polycomb son reclutados
para "cuerpos Polycomb".Qu pasa con
los genes metilados? Se ha propuesto
una relacin mecanicista entre la
represin Polycomb y la metilacin del
ADN, pero los genes metilados, y las
protenas MBD, no se sabe que
colocalizar con cuerpos Polycomb. La
presencia de protenas no unidas, que
vamos a mencionar en la siguiente
seccin, puede ocultar la existencia de
enriquecimientos subnucleares de las
diferentes protenas de unin-metil.
62. Ms en general, no est claro si los
resultados de metilacin en la represin
de genes, ya que arrastra al locus a un
ambiente represivo, o porque se remueve
de un ambiente permisivo, o ambos, o
ninguno. Teniendo una mejor idea de
donde las protenas de union-metil
localizar en relacin con las estructuras
nucleares sera ayudar a responder esta
pregunta.
63.

64.
65. Fig. 4. La localizacin de la protena de unin-metil ZBTB4 en clulas de ratn. (A) Fibroblastos de
ratn 3T3 fueron transfectados transitoriamente con un vector de expresin para ZBTB4 fusionado a

la protena verde fluorescente GFP. Panel superior: el ncleo, se tieron con DAPI. Panel inferior: la
seal de fluorescencia verde, que colocalizacon los focos DAPI-denso.(B) Esquema interpretativo.
Los focos DAPI denso, conocidos como chromocentros, corresponden a la agrupacin de
pericentromricas repeticiones (flechas) de varios cromosomas. Estas repeticiones estn
fuertemente metilados (crculos rojos).
66. Queda mucho por aprender acerca de
la dinmica de las protenas de metilunin
67. La dinmica in vivo de algunas
heterocromatina de protenas ha sido
bien estudiada. el trabajo en HP1 produjo
el sorprendente resultado de que, a
pesar de que la heterocromatina es
funcionalmente estable, las protenas de
heterocromatina mismas estn en un
rpido reflujo: se intercambian en un de
los dominios de la cromatina fuera
rpidamente. Para HP1, 50% recobraron
despus fotoblanqueadorr de las
regiones heterochromaticas ocurrieron en
alrededor de 2,5 s. El conocimiento de
estos
parmetros
cinticos
da
informacin sobre el mecanismo por el
cual estas protenas actan, y los
posibles medios por los cuales pueden
ser reguladas.
68. Por el contrario, se sabe relativamente
poco sobre la dinmica de las protenas
de unin de metilo.
69. La excepcin es MeCP2, que ha sido
estudiado por FRAP (Fluorescencia de
recuperacin Despus Photobleaching)
en clulas de ratn vivo. Dos poblaciones
de MeCP2 puede ser identificadas. Una,
localizada en el nucleoplasma, es
altamente dinmica con un t1 / 2 de 0,1
s, lo que sugiere que hay una piscina de
protena no unida. La segunda poblacin
se une a los cromocentros. All, su
tiempo de residencia es mayor (t1 / 2 =
25 ss, coherente con los informes
anteriores. Esto es mucho ms largo que
el tiempo de residencia de HP1, y puede
reflejar interacciones adicionales que
retienen la protena de la cromatina. El
otro MBDs no se ha estudiado de manera
similar y, a lo mejor de nuestro
conocimiento, no hay informacin an

publicada respecto UHRF1, UHRF2, o


las protenas dedo de zinc Kaiso, ZBTB4
y ZBTB38.
70. Los resultados de los experimentos de
inmunofluorescencia realizados sobre
clulas fijadas estn disponibles para
casi todas estas protenas, pero slo
proporcionan una instantnea de la
distribucin de la protena en un
momento dado. Ellos no nos informan
acerca de la dinmica: la misma imagen
de inmunoflorescencia en realidad podra
reflejar dos situaciones muy diferentes.
Una situacin muy dinmica, con la
asociacin y disociacin rpida, le dara
la misma apariencia como una situacin
muy esttica en el que el movimiento es
raro. Estas dos situaciones extremas
imponen muy diferentes caractersticas
en el camino de las protenas pueden
actuar y pueden ser regulados.
71. El reclutamiento de DNMT1 para la
replicacin del ADN y la represin
transcripcional
72. A fin de mantener la informacin
epigentica, las marcas de metilacin del
ADN tienen que ser reproducidas
despus de cada ronda de replicacin del
ADN. Un enlace entre la replicacin y la
maquinaria de ADN metilacin se
encontr desde el principio, cuando se
hizo evidente que DNMT1 interacta
directamente con el PCNA pinza
deslizante. Tambin se encontr que
DNMT1 colocaliza con la maquinaria de
replicacin en la fase S, y esto dio lugar a
un modelo en el que el ADN fue
remetilado por DNMT1 simultneamente
para su sntesis Fig. 5 panel
izquierdo).Sin
embargo,
estudios
cinticos ms tarde dejaron en claro que
la velocidad de la metilacin del ADN es

mucho menor que la velocidad de


replicacin de ADN, lo que puso en duda
la validez de este modelo simple. Esto
produjo una imagen refinada, en el que
se supone DNMT1 para ser cargada en
el ADN por el tenedor de replicacin en
movimiento, y luego para remetilar el
ADN a su propia velocidad (Fig. 5, panel
derecho).
73. Este modelo es probablemente cierto,
pero incompleto. De hecho, DNMT1
puede cargarse en la cromatina fuera de
la fase S.Adems, la regin PCNA-que
interacta de DNMT1 se puede quitar sin
consecuencias
importantes
para
remetilacin del ADN. El eslabn perdido
para DNMT1 focalizacin fue identificado
recientemente
en
dos
artculos
independientes. La protena de uninmetil UHRF1 fue demostrada que i) se
unen hemimetilado ADN ii) reclutar
DNMT1 y iii) sea necesario para el
mantenimiento de las marcas de metilo.
Es probable que la mayora de las
molculas de DNMT1 son llevados a los
sitios hemimetilados a travs de UHRF1,
como se representa en Fig 5.
74. Cabe destacar que, a pesar de que
DNMT1 tiene afinidad clara y actividad en
los sitios hemimetilados in vitro, esto no
es suficiente para apuntar a estos sitios
in vivo. La afinidad de la protena por sus
sitios puede ser demasiado baja en
relacin a sus concentraciones o los
obstculos a la difusin podr ser
demasiado grande, o ambos. En
cualquier caso, esta es una ilustracin

interesante del principio descrito en Fig.


4.
75. Mientras que la reproduccin de las
marcas por DNMT1 est relativamente
bien entendido, se sabe poco sobre los
mecanismos por los cuales DNMT3a y
DNMT3b establecen sus huellas en loci
dado. Las enzimas tienen algn grado de
secuencia especfica hacia los regmenes
especficos de CpG y una preferencia por
las regiones que carecen de marcas
eucromatina, pero los mecanismos de
focalizacin adicionales es probable que
existan.Uno aspecto de la regulacin
puede ser que algunas regiones se
hacen accesibles a, o estn protegidos
de las enzimas por sus respectivos
localizacin en el espacio nuclear, pero
esto an no se ha demostrado.
76. El
reclutamiento
de
ADN
metiltransferasas tambin se produce en
el
contexto
de
la
regulacin
transcriptional.DNMT1 sirve como un
corepresor para ciertos factores de
transcripcin, tales como p53 y Daxx. La
protena heterocromatina HP1, que es un
represor global, tambin recluta
DNMT1. C-myc reprime algunos de sus
genes diana mediante la contratacin de
DNMT3a. Inhibicin transcripcional en
todos estos casos resulta en la metilacin
del ADN y puede causar una represin
que es ms estable que la que se obtiene
por solamente modificaciones de
histonas. De nuevo, no est claro si la
metilacin provoca sistemticamente el
locus diana para unirse a una zona
heterocromtica de ncleo.

77.

78.
79. Fig. 5. Dos eventos de reclutamiento aseguran la confianza de remetilacin ADN despus de la
replicacin. El panel izquierdo. A. Como se replica el ADN, los sitios que fueron metilados
previamente simtricamente (crculo rojo lleno) se convierten en hemimetilado (rojo semicrculo). El
DNMT1 ADN metiltransferasa interacta con la protena PCNA de replicacin, que se desliza a lo
largo del ADN. B. A medida que el tenedor de replicacin avanza, DNMT1 se transfiere a los sitios
hemimetilados, y nueva protena se carga sobre PCNA. C. DNMT1 remetila el sitio hemimetilado se
ve obligado a D. Por ltimo, la carga DNMT1 puede realizar un seguimiento a lo largo del genoma
para remetilar sitios que han sido ignorados. Panel derecho. Un segundo mecanismo para la
orientacin DNMT1 a los sitios hemimetilados no depende de la replicacin del ADN (A). En su lugar,
se trata de la protena UHRF1, que tiene especfica afinidad para los sitios hemimetilados (B), y que
puede reclutar directamente DNMT1 (C).UHRF1 ya no interacta con los sitios totalmente metilados
recreados por DNMT1 (D).
80. 8. Es MeCP2 un componente
estructural del ncleo en clulas
diferenciadas?
81. La cantidad de MeCP2 en las clulas
aumenta a medida que se diferencian, y
alcanza niveles sorprendentemente
altos. Se ha estimado que hay un
promedio de 6 10 6 molculas de

MeCP2 por clula cerebral. Esto se


acerca a la cifra estimada de
nucleosomas en las clulas, que es 3
10 7.Si MeCP2 se une slo nucleosomas
en
heterocromatina,
y
si
la
heterocromatina es estimada para
constituir un tercio del genoma, entonces
hay casi una molcula de MeCP2 para
cada nucleosoma heterocromtico. Esto

plantea la posibilidad de que MeCP2,


adems de, o quizs en lugar de, al ser
un represor transcripcional del gen
especfico podra funcionar como un
componente estructural del ncleo en las
neuronas. En este sentido, podra
presentar un papel similar al de SATB1.
Esta protena es un componente
estructural de los ncleos en los linajes
linfocticos, donde se regula la expresin
de muchos genes.
82. La falta de MeCP2 en las neuronas
causa
el
sndrome
de
Rett.
Curiosamente, los sntomas se pueden
revertir en ratones mediante la
reintroduccin de una copia activa de
MeCP2. La
hiptesis
ms
frecuentemente utilizada para explicar el
sndrome es que la falta de MeCP2
conduce a la inappropriada reexpresin
de algunos genes metilados, que
entonces altera la funcin neuronal.
Curiosamente, sin embargo, slo un
puado de genes han demostrado ser
reprimidos por MeCP2 en las neuronas
de una manera dependiente de la
metilacin, y que probablemente no dar
cuenta del estricto fenotipo observado.
Como una explicacin alternativa,
MeCP2 ha sido reportado para Sin
embargo MeCP2 no se ha observado a
ser un componente estequiomtrico de
spliceosomas, al menos en clulas
cultivadas. Una tercera posibilidad sera
que MeCP2 efectivamente desempea el
papel de un andamio. La falta de MeCP2
podra dar lugar a un debilitamiento
estructural de la arquitectura nuclear, y /
o un aflojamiento global del programa
transcripcional de las neuronas. Nei
alteracin del ther podra ser
diagnosticado con claridad utilizando los
mtodos
empleados
actualmente
(microarrays y la expresin diferencial).
Debido mRNA de empalme est
ntimamente ligada a las exportaciones
nucleares, defectos estructurales en la
ausencia de MeCP2 tambin podran
explicar la licing anomalas observadas s
p. Si esta situacin fuera cierto, sera

presentar un interesante paralelo a las


enfermedades humanas denominadas
"laminopathies", en el que las mutaciones
de las lminas afectan a la estructura del
ncleo y dar lugar a fenotipos severos.
83. La posibilidad de que MeCP2 podra ser
un andamio que une nucloeosomas con
el apoyo de algunos experimentos
bioqumicos. Tambin es coherente con
el hecho de que MeCP2 sobreexpresin
causa cromocentros de clster. Sin
embargo, parece que conflicto con otras
dos piezas de datos. En primer lugar, las
neuronas que carecen de MeCP2 tienen
un ncleo morfolgicamente normal. Esto
contrasta con los ncleos de pacientes
laminopathy, que son deformes. Por
supuesto, la morfologa es una lectura
gruesa que puede no reflejar defectos
sutiles. Una segunda observacin es el
hecho mencionado anteriormente de que
MeC P2 es bastante mvil en la
clula.MeCP2 parece comportarse de
forma dinmica difcil de conciliar con la
idea de que puede ser un componente
estructural. Una advertencia de los
estudios in vivo, sin embargo, es que se
realizaron utilizando fibroblastos, no
neuronas.
84. 9. Desafos tcnicos y avances
85. Como para muchos otros campos,
nuestra comprensin de la metilacin del
ADN en el contexto del ncleo depende
crticamente de las herramientas que
tenemos.
86. Imgenes de clulas vivas ha arrojado
datos que era imposible de obtener por el
estudio de las clulas fijas. Los DNMTs y
MeCP2 se han estudiado bien en clulas
vivas, y espero que los dems protenas
de
metil-unin
tambin
sern
investigados por estos mtodos. Para ser
significado mximo, un estudio debe usar
clulas en las que las protenas
fluorescentes se expres a niveles ms
bajos que la contraparte endgeno, a fin

de no interferir con su distribucin.


Adems, esto debe hacerse en un tipo
celular fisiolgicamente relevante. Esto
se puede hacer por transfeccin estable
y seleccin de clones, o, idealmente, por
fusin ga fluorescente etiqueta para la
protena endgena por recombinacin
homloga (knock-in).Estos requisitos
pueden ser dificultades para cumplir,
pero la recompensa puede ser grande.
87. Microscopa no es la nica manera para
examinar
la
arquitectura
del
ncleo. Enfoques en Biologa molecular
han sido muy fructfera tambin. La
identificacin de secuencias metiladas ha
sido facilitado en gran medida por una
variante
de
la
cromatina
inmunoprecipitacin llamado MeDIP.
Otras tcnicas dan una idea de la posible
disposicin 3D de estos loci. La tcnica
DamID es un enfoque elegante para
mapear la organizacin de loci con
respecto a estructuras- nuclear El
Chromo algunos Capture Conformacin
(3C) ensayo tambin es de gran alcance,
especialmente en combinacin con el
uso de microarrays. Podemos estar
seguros de que el uso generalizado de
estas tcnicas en los sistemas celulares
bien caracterizadas mejorar en gran
medida nuestra comprensin de la
arquitectura de loci metilado.
88. 10. Preguntas para el futuro
89. La arquitectura del ncleo es un
parmetro clave para la funcin del
genoma. Uno de los elementos que
regula la expresin gnica es la
metilacin del ADN. Cmo se vincula
con la organizacin de tres dimensiones
del
ncleo
est
parcialmente
comprendido en el mejor, y permanecen
muchas preguntas. Son loci metilados
reclutados a una fi co compartimento
represiva especfico, o son tirados fuera
de las regiones permisivos? Los genes

se vuelven metilado slo porque su


ubicacin o su organizacin de
cromatina, los hace accesibles a
metiltransferasas ?Por el contrario, son
los genes protegidos contra la metilacin
porque estn "en el lugar correcto en el
momento correcto"? Aisladores delimitar
regiones
eucromticas
y
heterocromticas, y tienen fuertes
vnculos con la methyla ADN. Cmo
funcionan en el espacio y el tiempo?
90. El patrn correcto de la metilacin del
ADN en los genes, incluyendo aquellos
que estn impresos por sus padres, es
fundamental para el desarrollo de
embriones
unificacin
de
los
mamferos. Este patrn se somete a
medidas de remodelacin dramticos en
el vulo fecundado y en las clulas
germinales. Cmo se conecta a la
arquitectura de la cromatina, que est en
flujo al mismo tiempo tambin? La
expresin de protenas MBD, y la
distribucin de los cromocentros
metilados, son dinmicos durante el
desarrollo, pero que slo responden a la
diferenciacin, o es lo que realmente
impulsar el cambio, actuando sobre la
expresin de genes? Las diferentes
clulas de nuestro b odies tienen
diferentes epigenomas. Son aquellas
dictadas
por
sus
diferentes
organizaciones nucleares? Una pregunta
similar se aplica a las clulas
cancerosas, como opuesto a unas
normales.
91. Por ltimo, y lo ms intrigante, qu pasa
con la desmetilacin del ADN? Esto se
ha demostrado que se producen, al
menos en lneas celulares, y la reaccin
puede ser reconstituida in vitro. Cundo
y dnde esto tiene lugar en el
ncleo? Afortunadamente, no hay falta
de preguntas interesantes para el futuro.
92.